專利名稱：基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及哺乳動物補體介導(dǎo)疾病和炎癥的治療。發(fā)明背景炎癥是局部保護(hù)反應(yīng)，由損傷引起，用來除滅，稀釋或阻塞有害試劑和損傷組織。它包括復(fù)雜的一系列反應(yīng)，包括動脈、毛細(xì)管、小靜脈的擴張，伴隨著增加的血管滲透性，增加的血液流速，和體液及血漿蛋白質(zhì)的滲出。這些過程經(jīng)常很快接著白細(xì)胞對血管內(nèi)壁的粘連，接著是細(xì)胞流入周圍組織。
已證明抗外源物質(zhì)的主要免疫防御機理的補體系統(tǒng)影響每一構(gòu)成炎癥應(yīng)答的因子。通常補體包括一套減少組織和血液中微生物和其它抗原的蛋白質(zhì)。這一任務(wù)或者通過單獨的補體成分或者通過補體成分與抗體或與表達(dá)補體受體的細(xì)胞共同作用來完成。更特別地，該系統(tǒng)由大約30種血漿蛋白，其相應(yīng)的細(xì)胞受體和幾種膜調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組成。Kinoshita，Immunology Today，12291-300(1991)。補體系統(tǒng)的激活作用，例如抗原-抗體復(fù)合物或細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)對補體系統(tǒng)的激活作用，觸發(fā)補體成分蛋白酶裂的裂解和裝配蛋白發(fā)生的放大級聯(lián)，其最終導(dǎo)致外源抗體的消滅和最終減少。Muller-Eberhard，Annu.Rev.Biochem，57321-347(1988)。
補體系統(tǒng)激活作用產(chǎn)生幾種生物活性肽。含有74個氨基酸且Mr為11000的糖蛋白C5a是由補體的第五成分C5的N-末端通過C5轉(zhuǎn)化酶的蛋白酶解的裂解而產(chǎn)生的。Nilsson等，J.Immunol.114815-822(1975)。C5a生物性質(zhì)蔓延急性和慢性炎癥過程中所涉及的大量細(xì)胞和組織。Hugli，CRC Crit.Rev.Immunol.，1321-366(1981)。這些性質(zhì)中的許多是有利于免疫的。已發(fā)現(xiàn)C5a介導(dǎo)應(yīng)答各種病理狀態(tài)的宿主防御機理。C5a參與一般與炎性反應(yīng)相關(guān)的多種特異生物功能，例如平滑肌收縮，血管滲透性的增強，當(dāng)注入人皮膚時風(fēng)塊和潮紅的產(chǎn)生，組胺由肥大細(xì)胞釋放，誘發(fā)氧化性爆發(fā)集落和溶酶體酶自多形核白細(xì)胞(PMNLs)釋放。C5a刺激來自每種循環(huán)白血細(xì)胞的可測反應(yīng)，包括嗜堿性白細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞，單核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞。Hugli，上文；Bautsch等，Immunobiol，18541-52(1992)。還進(jìn)一步證明C5a是一潛在的化學(xué)引誘物。Fernandez等，J.Immunol.120109-115(1978)。這種蛋白質(zhì)是引誘PMNLs如炎性位點噬細(xì)胞的中樞刺激物。
當(dāng)補體定向于抗一合適的靶物如侵入微生物或腫瘤細(xì)胞時是有益的，但如果激活不得當(dāng)，則有明顯致病潛力。過敏毒素，例如C5a，在一些炎性疾病如成年人呼吸窘迫綜合癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機理中作為致病和惡化因子。Bautsch等，Biochem.J.288261-266(1992)；Haslett等，J.Immunol.1423510-3517(1989)。特別是，患者體內(nèi)可檢測到組織中C5a的異常存在會引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，和非賁門肺水腫。Hammerschmidt，J.Amer.Med.Soc. 244199-(1980)。已發(fā)現(xiàn)C5a是由憑借包括炎性白細(xì)胞的募集現(xiàn)象和刺激作用以及抗體產(chǎn)生的加強的增加活性的補體激活產(chǎn)生的主要炎性間介器。參見Mollison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86292-296(1989)。
假設(shè)炎癥的體內(nèi)或藥理學(xué)控制是依賴于趨化性的調(diào)制。已認(rèn)識到有三種抑制作用的水準(zhǔn)發(fā)生，它們是(1)對趨化性刺激物應(yīng)答的白細(xì)胞的抑制作用；(2)防止化學(xué)吸引素產(chǎn)生；和(3)化學(xué)吸引素的失活。另外，因為C5a通過與一些人細(xì)胞如嗜中性白細(xì)胞，嗜酸性白細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的特異C5a受體結(jié)合而產(chǎn)生各種功能，C5a介導(dǎo)趨化性的抑制作用，特別是C5a受體拮抗劑的設(shè)計已引起相當(dāng)?shù)年P(guān)注。
Cleary等人在U.S.4772584中公開了由鏈球菌A屬分離的肽，它通過從C5a C-末端切割六個氨基酸肽來抑制C5a對PMNLs的結(jié)合。Hahn在U.S.4692511中公開了C5a的肽受體拮抗劑，它含有必需的核心四肽Tyr-Asp-Gly-Ala(SEQID NO.1)或Asp-Gly-Ala-Tyr(SEQ ID NO.2)，或核心三肽Asp-Gly-Ala，它具有C5a阻斷活性。
Abbott Laboratories在U.S.5190922，WO 90/09162和92/11858公開了各種寡肽，其與C5a受體結(jié)合并且主旨調(diào)整過敏毒素活性。但是，這些分子中的一些被證明保持明顯的激動劑活性。參見Mollison等人在Progress in InflammationResearch and Therapy，Birkhauser Verlag，Basel，(1991)，pp.17-21中的“C5a Structural Requirements for Neutrophil Receptor Interaction”，Kawai等，J.Med.Chem.35220-223(1992)；Kawai等，J.Med.Chem.342068-2071(1991)；和Or等J.Med.Chem.35402-406(1992)。因此非常需要基本上無激動劑活性的有潛力和治療效果的C5a受體拮抗劑。發(fā)明概要本發(fā)明的一個方面涉及人C5a肽類似物，它是C5a受體拮抗劑且基本上不具有過敏毒素和激動劑活性，這種類似物的衍生物，以及類似物及衍生物的二聚體形式。編碼肽(即其類似物及其衍生物)的DNA分子，質(zhì)粒，載體和DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并且也提供了制備C5a類似物的方法。
含C5a類似物，其衍生物或二聚物的藥物制劑被有益地應(yīng)用在治療哺乳動物的C5a介導(dǎo)炎性癥狀和疾病的方法中，并且作為防止這種炎癥的預(yù)防劑。
本發(fā)明的另一方面涉及特異于C5a類似物及其衍生物的抗體，它基本上不具有與人C5a的交叉反應(yīng)活性。這些抗體被用來檢測或計量受治療者(預(yù)先給藥相同物質(zhì))體內(nèi)循環(huán)C5a類似物和衍生物，以及用來改變，例如中和，體內(nèi)C5a類似物和衍生物的活件。附圖簡要說明

圖1是說明通過寡核苷酸偶聯(lián)合成編碼人C5a合成基因的流程圖；圖2是pB-6/C5a質(zhì)粒圖譜。優(yōu)選實例的詳細(xì)說明本發(fā)明C5a肽類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑。術(shù)語“C5a受體”在本領(lǐng)域公知是指C5a，其去ArgC5a降解產(chǎn)物，和本發(fā)明拮抗劑與之結(jié)合的人血細(xì)胞如PMNLs和單核細(xì)胞表面上的位點。參見例如U.S.5177190；和Oppermann等，J.Immunol.151(7)3785-3794(1993)。C5a通過羧肽酶B-類酶在人血清中酶促轉(zhuǎn)化為去ArgC5a，去ArgC5a是人體內(nèi)主要生理終產(chǎn)物。Chenoweth等，Md.Immunol.17151-161(1980)。
術(shù)語“拮抗劑”是指馬上公開的肽是C5a抑制劑。即它們阻礙C5a對C5a受體的結(jié)合。盡管不趨向于結(jié)合任何特別理論，申請人相信C5a類似物是C5a競爭抑制劑，它們與C5a競爭與C5a受體結(jié)合。
本發(fā)明C5a類似物的拮抗作用可以以Seligmann等人在Agents and Action21375-378(1987)中公開的，實施例7詳細(xì)描述的鈣升高測定中的IC50進(jìn)行定量測定。IC50定義為100pM人C5a攻擊劑量后通過擁有C5a受體的PMNLs抑制50％鈣離子細(xì)胞內(nèi)活動化的C5a類似物濃度，本發(fā)明C5a受體拮抗劑具有Seligmann等公開的鈣升高測定中不大于大約2.0×10-6M的IC50值。
詞組“基本上沒有過敏毒素活性”或“基本上沒有激動劑活性”指C5a類似物(下文與C5a受體拮抗劑交互換使用)與受體的結(jié)合沒有導(dǎo)致內(nèi)源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生，這種信號最終產(chǎn)生一般與C5a與其受體結(jié)合而引起的過敏毒素誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的生理反應(yīng)如噬細(xì)胞激活，平滑肌收縮，血管滲透性增加，炎性介體如組胺，前列腺素，凝血烷，白三烯，白介素(IL)-1，IL-6和IL-8的過量產(chǎn)生。參見Hugli等，CRC Crit，Rev.Immunol.1321-326(1981)和PCT WO92/10205。這些性質(zhì)的定量測定也可以應(yīng)用Seligmann等上文所公開的，并在實施例7中說明的鈣升高測定而獲得。EC50是激動活性的量度。為本發(fā)明目的，EC50是產(chǎn)生最大應(yīng)答(由相同C5a類似物引起)50％的C5a類似物的濃度。申請人在相同鈣升高測定中，在本發(fā)明C5a類似物濃度至少是大約8.0×10-7M，優(yōu)選至少大約3.0×10-6M時未檢測到激動劑活性。本發(fā)明C5a類似物是那些在C5a類似物濃度至少約8.0×10-7M，且優(yōu)選至少大約3.0×10-6M的Seligmann鈣升高測定中不能測得EC50的化合物，因為在該測定中不能檢測到應(yīng)答。
C5a是-74氨基酸肽，其序列公開于Fernandez等，J.Biol.Chem.2536955-6964(1978)。在推導(dǎo)的核酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建的合成基因公開于Mandecki等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 823543-3547(1985)和Davidow等人的U.S.4937189。Fernandez公開的C5a氨基酸序列，和Davidow等公開的相應(yīng)的合成核苷酸序列列于下面表1。
表11 2 3 4 5 6 7 8 9 10EcoRIthr leu gln lys lys ile glu glu ile ala(SEQ. ID. NO. 3)AATTCT ATG ACT CTG CAA AAG AAG ATC GAA GAA ATC GCTGA TAC TGA GAC GTT TTC TTC TAG CTT CTT TAG CGA(SEQ. ID. NO. 4)11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23ala lys tyr lys his ser val val lys lys cys cys tyrGCT AAG TAC AAG CAC TCC GTC GTT AAG AAG TGT TGT TACCGA TTC ATG TTC GTG AGG CAG CAA TTC TTC ACA ACA ATG24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36asp gly ala cys val ash ash asp glu thr cys glu glnGAT GGT GCA TGC GTC AAC AAC GAC GAA ACC TGT GAA CAACTA CCA CGT ACG CAG TTG TTG CTG CTT TGG ACA CTT GTT37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49arg ala ala arg ile ser leu gly pro arg cys ile lysCGA GCT GCT CGT ATT TCT CTG GGC CCT CGC TGT ATC AAGGCT CGA CGA GCA TAA AGA GAC CCG GGA GCG ACA TAG TTC50 51 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62ala phe thr glu cys cys val val ala ser gln leu argGCT TTC ACT GAA TGT TGT GTT GTC GCT TCC CAA CTG CGCCGA AAG TGA CTT ACA ACA CAA CAG CGA AGG GTT GAC CCG63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74ala asn ile ser his lys asp met gln leu gly arg stopHindIIIGCT AAC ATT TCT CAC AAG GAC ATG CAA CTC GGC CGC TAA ACGA TTG TAA AGA GTG TTC CTG TAC GTT GAG CCG GCG ATT TTCGA
申請人出人意料地驚奇地發(fā)現(xiàn)通過誘變編碼C-末端區(qū)，即人C5a(下文與“C5a(1-74)”互換使用)的氨基酸64-74合成C5a基因的部分而產(chǎn)生的人C5a的一些類似物，具有與C5a明顯不同的性質(zhì)。即它們具有極好的拮抗性質(zhì)而基本上沒有激動劑活性。特別地，本發(fā)明C5a類似物定義在C5a(1-74)C-末端區(qū)修飾和突變兩個方面中，N′-Asn-Ile-Ser-His-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-(64)(65)(66)(67)(68)(69)(70)(71)(72)Gly-Arg-C′(SEQ ID NO.5)，(73)(74)(C5a(1-74)的氨基酸64-74)。首先至少截短至Leu(72)；即去除Gly(73)和Arg(74)殘基。其次在該區(qū)中至少一個半胱氨酸被取代，前提是該肽的末端氨基酸(即C-末端)是半胱氨酸，且C-末端半胱氨酸的巰基(SH)處于還原態(tài)(即具有自由巰基)，或處于能自發(fā)轉(zhuǎn)化或?qū)⒁晦D(zhuǎn)化為自由巰基狀態(tài)。
在一個優(yōu)選實例中，2至最多6個C-末端氨基酸從C5a(1-74)截短。因此N-末端63氨基酸區(qū)保持完整，只有一個半胱氨酸被取代的情況下，各相應(yīng)實例可以設(shè)計如下C5a(1-72，Leu72Cys)，C5a(1-71，Gln71Cys)，C5a(1-70，Met70Lys)，C5a(1-69，Asp69Cys)和C5a(1-68，Lys68Cys)。在一個更優(yōu)選的實例中，C-末端被截短為Met70，Gln71或Leu72，包括相應(yīng)于前三個設(shè)計實例。最優(yōu)選的實例為C5a(1-71，Gln71Cys)。
C-末端區(qū)能進(jìn)一步被在N-末端截短至Lys68，其相應(yīng)于各設(shè)計的實例C5a(1-67，His67Cys)，C5a(1-66，Ser66Cys)，C5a(1-65，Ile65Cys)和C5a(1-64，Asn64Cys)，前提是所得C5a類似物具有上述必需的拮抗劑性質(zhì)(IC50不大于大約2.0×10-6M)且基本上不具有過敏毒素或激動劑活性(在至少3.0×10-6M C5a類似物濃度下不能測得EC50值)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知人C5a類似物不包括特異于C5a或C5a受體上位點的抗體。
這里所說明的人C5a類似物的衍生物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些包括在N-末端63氨基酸區(qū)(C5a(1-74)氨基酸1-63)的修飾如點突變，取代，增加和缺失，Carney等，Protein Science 21391-1399(1993)，以及如此誘變的C-末端區(qū)的進(jìn)一步氨基酸取代。修飾的類型和程度并不重要，只要所得衍生物保持如上所述的基本上無激動劑活性的C5a受體拮抗性。例如C5a(1-74)N-末端區(qū)的Cys27殘基可以被改為例如絲氨酸殘基，以減少再折疊過程中的重雜性。因此在一更優(yōu)選實例中，C5a類似物衍生物被設(shè)計為C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)。N-末端也可以通過取代或增加變?yōu)榈鞍彼?，以使C5a類似物編碼基因在不同宿主細(xì)胞中表達(dá)。C-末端區(qū)進(jìn)一步改變的例子是苯基丙氨酸殘基取代天然的C5a(1-74)位的組氨酸。因此在最優(yōu)選實例中，C5a類似物衍生物被設(shè)計為C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)。
本發(fā)明C5a類似物(此后總起來指其類似物和衍生物)可以通過本領(lǐng)域各種標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，可以通過直接的化學(xué)合成制備，也可以通過于合適宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼肽的DNA分子即合成基因而制備?？捎蒀5a類似物氨基酸序列推斷的這些DNA分子也可通過已知技術(shù)制備。這些DNA可根據(jù)Narang，Tetrahedron393-22(1983)和EPA 146785；Mandecki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823543-3547(1985)(公開C5a編碼基因的化學(xué)合成)中公開的進(jìn)行化學(xué)合成。可以化學(xué)合成DNA分子片段再酶接。參見Volume 1，Chapter 8 ofCurrent Protocols in Molecular Biology，Ausubel等(Eds)，Wiley，NY(1990)。
編碼本發(fā)明C5a類似物的DNAs也可以通過編碼C5a已知合成的或天然基因的誘變制備，如Fernandez，Mandecki和Davidson所公開的。參見上文Ausubel等，Volum II，Chapter 15 of Maniatis等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和Mollison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86292-296(1989)。而且DNAs可以通過PCR技術(shù)制備。PCR Protocols，Innis等(Eds)，Aeademic Press，San Diego，CA(1990)。
編碼本發(fā)明C5a類似物的DNA分子被操作連接到已知調(diào)節(jié)序列上，例如啟動子，增強子，3’-非翻譯序列，和5’翻譯序列，例如信號和前導(dǎo)序列，然后根據(jù)本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)轉(zhuǎn)化到能表達(dá)這些基因的宿主細(xì)胞中。然后被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在適于拮抗劑編碼基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)。代表性的宿主細(xì)胞包括原核生物如大腸桿菌和芽胞桿菌屬，例如枯草芽胞桿菌；真核生物如絲狀真菌，例如黑曲霉；酵母，例如釀酒酵母，Pichia pastoris和Yarrowia lipolytica；桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系(Summers等，A Manual of Methods for Baculovirus Vectors andInsect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experiment Station(1987)；哺乳動物細(xì)胞系；和植物(J.Vandekercknove等，Bio/TECHNOLOGY7929-932(1989)。
C5a在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)方法一般也適合于C5a類似物基因表達(dá)。參見Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823543-3547(1985)；Mollison等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86292-296(1989)；和Bautsch等Immunobiol. 18541-52(1992)。選擇合適的調(diào)節(jié)序列如啟動子(例如T7聚合酶，UV5-D，色氨酸或乳糖)，核糖體結(jié)合位點，以及含轉(zhuǎn)錄終止位點的合適質(zhì)粒載體，例如pKK223-2，在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員水平之內(nèi)。為優(yōu)化在E.coli中的表達(dá)，應(yīng)該使用E.coli優(yōu)選的密碼子合成DNA分子，如Guoy等，Nucleic Acids Res. 107055-7074(1982)所公開的，并讓幾個限定內(nèi)切核酸酶位點易化合成DNA的鑒定和可能的DNA序列的突變。這一研究通過在直接和緊接著肽第一氨基酸三聯(lián)密碼子上游引入蛋白質(zhì)合成ATG起始密碼子而使C5a類似物直接表達(dá)。而且缺乏野生型細(xì)胞中存在的幾種蛋白酶中的一種的E.coli菌株，例如，lon，有利于增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量。Franke等，Meth.Enzymol.162653-658(1988)。
一般C5a類似物編碼基因可根據(jù)已知方法在酵母中表達(dá)。參見例如Romanos等，Yeast 8423-488(1992)；Section IV of Goeddel(Ed)，Meth.Enzymol. 185231-484(1990)；Davidow等，上文，和U.S.4775622。為優(yōu)化在酵母中的表達(dá)，應(yīng)該使用酵母優(yōu)選密碼子制備DNA分子，特別要避免內(nèi)源KEX2蛋白酶靶物的Arg-Arg對。使用與蛋氨酸相對的谷氨酰胺為N-末端，有利于從信號序列例如α-因子信號序列的蛋白水解裂解。進(jìn)一步優(yōu)選消除任何潛在糖基化位點，如本發(fā)明C5a受體拮抗劑各實例的64位的天冬氨酰。
本發(fā)明C5a類似物編碼基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)可根據(jù)已知方法進(jìn)行。參見Maniatis等上文中“Expression of Cloned Genes in MammalianCells”中的第16章。在人細(xì)胞中表達(dá)的有代表性的方法公開于Berg等，Bio/Techniques 14(6)972-978(1993)。合適的人細(xì)胞包括公眾可得到的細(xì)胞系如HeLA 3(ATCC CCL 2.2)和HEK 293(ATCC CRL 1573)。在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的表達(dá)公開于，例如，Asselbergs等，F(xiàn)ibrinolysis71-14(1993)。合適的卵巢細(xì)胞系包括CHO-K1(ATCC CCL 61)，BHK(ATCC CRL 6281)，BHK-21(ATCC 6281，CCL 10和CRL 8544)。有代表性的猴細(xì)胞是CV-1(ATCC CCL70)，COS-7(ATCC CRL1650)，和VERO細(xì)胞(ATCC CCL 81)。合適的鼠細(xì)胞系是C127(ATCC1804)。優(yōu)選的細(xì)胞系是二氫葉酸還原酶-陰性CHO(DHFR-minus CHO)細(xì)胞系，公開于Uriaub等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 774216-4220(1980)。非血清依賴細(xì)胞系是更優(yōu)選的。參見Kurano等，Bio/Technology 16245-258(1990)。在哺乳動物宿主中可生產(chǎn)糖基化或非糖基化形式的C5a類似物。
將由轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞分離的C5a類似物復(fù)性以保證生物活性，其中C-末端半胱氨酸是還原態(tài)的，即其含有一自由巰基，優(yōu)選使用常規(guī)一步法。申請人不可預(yù)料地發(fā)現(xiàn)以還原劑對氧化劑摩爾比為至少約100∶1至約500∶1，用氧化還原對處理改性C5a類似物會產(chǎn)生有還原態(tài)C-末端半胱氨酸的生物活性的C5a類似物。這一比例比已知比例(還原巰基與氧化巰基化合物優(yōu)選比例10∶1公開于Builder等U.S.4620948第17欄第43-45行)大大約10倍至大約50倍。根據(jù)這一方法，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞在足以引起C5a類似物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)后，與變性和增溶劑例如6M鹽酸胍混合，生產(chǎn)變性的C5a類似物，優(yōu)選進(jìn)一步用已知技術(shù)如超聲處理進(jìn)行破裂，F(xiàn)rench Press或DynoMill。然后如此混合或如此破裂的含有改性C5a類似物的細(xì)胞與氧化還原對按還原劑/氧化劑重量的摩爾比至少大約100∶1至大約500∶1，在合適條件下生產(chǎn)復(fù)性的，生物活性的C5a類似物。合適的氧化還原對包括半胱氨酸/胱氨酸和還原的谷胱甘肽/氧化的谷胱甘肽。也可以使用其它本領(lǐng)域熟知適合的氧化還原對。優(yōu)選谷胱甘肽氧化還原對。其它合適的條件包括pH6.5至7.5，優(yōu)選7.4。讓混合物在室溫放置足夠得到最大蛋白質(zhì)產(chǎn)量的一段時間。優(yōu)選時間為大約1/2小時至大約4小時。因此，這種方法不需要從細(xì)菌細(xì)胞中分離折射的包涵體(即被表達(dá)蛋白的不溶質(zhì))，然后還原C-末端半胱氨酸的巰基。
或者，可以根據(jù)如Builder等U.S.4620948中所公開的標(biāo)準(zhǔn)再折疊和純化方法將C5a類似物復(fù)性，例如，根據(jù)這些方法，C-末端半胱氨酸將是加合物形式，例如Cys-Cys，或Cys-谷胱甘肽。因此，該加合物必須被進(jìn)一步還原得到自由巰基。申請人發(fā)現(xiàn)這種公開的C5a類似物的加合物也象C5a受體拮抗劑一樣起作用，其基本上不具有這里所定義的激動劑活性，因此包括在本發(fā)明范圍中。但如果使用標(biāo)準(zhǔn)復(fù)性技術(shù)，需要進(jìn)一步的還原作用制備優(yōu)選實例。
復(fù)性后，C5a類似物可以被純化至所需程度。有代表性的純化方法包括超濾，滲濾，凝膠電泳，色譜方法，如離子交換色譜，顆粒排阻色譜法，HPLC，反相HPLC，用葡聚糖凝膠處理，透析，親和層析等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會理解能結(jié)合使用這些純化方法。
具有C-末端半胱氨酸殘基的C5a類似物可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被氧化生成二聚體。為制備這種二聚體，各單體(類似物)的C-末端半胱氨酸的巰基(-SH)被氧化生成二硫鍵。均二聚體和雜二聚體都包括在術(shù)語“二聚體”中。
本發(fā)明C5a類似物和二聚體在治療和預(yù)防有害癥狀或疾病中是有用的，其中涉及補體系統(tǒng)，特別是C5a和過敏毒素。當(dāng)對面臨C5a介導(dǎo)組織損傷和死亡的高危的任何哺乳動物患者，尤其是人給藥時，它們在治療上是最有效的。一般這些癥狀和疾病如炎癥疾病其中C5a是通過血清中蛋白水解而產(chǎn)生的。響應(yīng)于C5a類似物治療的有代表性的疾病包括肺炎，成年人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)；自發(fā)性肺纖維化，肺炎或肺損傷，慢性進(jìn)行性肺雙囊纖維化、棉屑肺，石棉引發(fā)的炎癥，心肌梗塞，心肌梗塞后的炎癥，局部缺血心損傷，肝硬變，原發(fā)性膽汁性肝硬變炎癥，慢性肝炎，胰腺炎，出血性胰腺炎，炎性腸炎，結(jié)腸炎，局部缺血性腦損傷，腦炎，腦膜炎中的顱神經(jīng)損傷，腦膜炎，眼色素層炎，普爾夏氏視網(wǎng)膜病，免疫復(fù)合物介導(dǎo)腎小球性腎炎，腎皮質(zhì)壞死癥，痛風(fēng)，脈管炎，血清病，血管水腫，重癥肌無力，全身性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，大皰性皮膚病，過敏性，牛皮癬，內(nèi)毒素休克，膿毒癥，嚴(yán)重外傷或燒傷。它們也可以在治療學(xué)上用來治療移植物排斥的患者，治療接受免疫抑制治療的患者或大量輸血的患者，治療那些建議藥物療法的患者，治療血液透析和白細(xì)胞除去法后有肺功能障礙的患者。
本發(fā)明類似物和二聚物進(jìn)一步具有作為預(yù)防劑的應(yīng)用于醫(yī)療，特別是預(yù)防再灌注例如局部缺血后再灌注和循環(huán)接觸藥物方法而引起的疾病，以及防止移植物排斥現(xiàn)象。在這種情況下，在已知引發(fā)炎癥或使已有炎癥惡化的癥狀之前或基本上同時適當(dāng)?shù)厥┯肅5a類似物。
本發(fā)明C5a類似物和其二聚物可通過蛋白質(zhì)藥物任何治療有效途徑給藥，例如非經(jīng)腸，鼻內(nèi)，直腸或口腔含化，以含有常規(guī)無毒藥用載體，輔劑和所期望的載體的劑量單位制劑給藥。術(shù)語“非經(jīng)腸”包括如皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，胸骨內(nèi)的，動脈內(nèi)注射和輸注技術(shù)的給藥方式。
本發(fā)明C5a類似物(和二聚體)的劑量可以改變以實現(xiàn)針對個別病人的滿意的治療效果。這將決定于例如個別拮抗劑的活性，給藥方式，要治療疾病的嚴(yán)重程度，以及患者的藥物條件。確定給定疾病和患者的治療有效劑量在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的水平之內(nèi)。通常，對哺乳動物宿主的日給藥量為每天大約每公斤體重給藥1μg至100mg的劑量水平。優(yōu)選每天大約0.1mg/kg至大約20mg/kg體重的劑量水平范圍。C5a類似物作為單一連續(xù)劑量長期時間周期對患者給藥，但是，如果需要，總有效劑量可以分成多種劑量，例如每天2至4分開劑量。
本發(fā)明C5a類似物(和二聚體)可以用已知藥用成分和制劑方法配制成組合物。參見例如Remington等，Pharmaceutical Science，15 th Ed.，Mack Pub.(Easton，PA)(1975)。非經(jīng)腸給藥合適的組合物包括藥用無菌水溶液或非水溶液，分散劑，懸浮劑或乳液，以及僅在使用前再溶解成無菌可注射液或分散劑的無菌粉末。合適的含水和非水載體，稀釋劑，溶劑或載劑代表性例子包括水，乙醇，多元醇，例如甘油，丙二醇，聚乙二醇，和其合適的混合物，蔬菜油，例如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。可以用各種方法保持流度，包括使用包衣材料如卵磷酯，所需顆粒大小的保持(分散劑的情況)，和表面活性劑。
本發(fā)明組合物也可以含有助劑，如保鮮劑，濕潤劑，乳化劑，分散劑，抗細(xì)菌和抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚和山梨酸，等滲劑如糖，氯化鈉或延遲吸收劑如一硬脂酸鋁和明膠。本發(fā)明受體拮抗劑也可以混合到緩慢或持續(xù)釋放或靶向釋放系統(tǒng)如聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體，和微球劑中。
可通過多種方法對注射制劑消毒，包括通過細(xì)菌截留過濾器的過濾作用，或通過使用之前混入能溶解或分散于無菌水或其它無菌注射基質(zhì)中的消毒固體組合物形式的消毒劑。
除C5a類似物和任何其它活性成分外，懸浮液可以含有懸浮劑如乙氧基化異硬脂基醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂，黃蓍膠和其混合物。
直腸或陰道給藥的組合物一般是栓劑形式，它可以通過混合本發(fā)明肽和合適的非刺激賦形劑或載體如可可脂，聚乙二醇或室溫下是固體但體溫時是液體的栓劑蠟混合，因此在直腸或陰道腔內(nèi)溶化并釋放受體拮抗劑。
眼科制劑，眼用軟膏，粉末和溶液也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備本發(fā)明C5a類似物和二聚物的特異性多克隆和單克隆抗體。通過注射C5a類似物-載體蛋白質(zhì)結(jié)合物到動物，例如兔，山羊，綿羊或馬中，產(chǎn)生抗C5a類似物抗體來產(chǎn)生多克隆抗體。參見，例如A.Johnstone和R.Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications.Oxford(1982)。根據(jù)公開于Kohler和Milstein，Nature 256495-97(1975)中公開的技術(shù)，可以制備本發(fā)明C5a類似物的特異性單克隆抗體。也參見Peters，J.H.，(eds)Monodonal Antibodies，Springer Verlag Berlin，Heidelberg，Germany(1992)。這些C5a類似物的特異性多克隆和單克隆抗體也基本上不具有與人C5a交叉反應(yīng)活性。術(shù)語“基本上不具有交叉反應(yīng)活性”指抗C5a類似物抗體具有非常低(可忽略)的與人C5a的交叉反應(yīng)活性，因此本發(fā)明C5a類似物測定在生物樣品中檢測不到內(nèi)源產(chǎn)生的C5a的干擾。
本發(fā)明C5a類似物特異性抗體特別用于檢測和定量事先用相同C5a類似物給藥的受治療者體內(nèi)的循環(huán)C5a類似物以及調(diào)整，例如，中和，循環(huán)C5a類似物的活性。能根據(jù)應(yīng)用抗體的標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)測定循環(huán)C5a類似物。通常由受治療者身上采取體液或組織樣品，然后在適合使類似物和抗體之間可檢測地生成免疫復(fù)合物的條件下，與對受治療者給藥的那種C5a類似物的特異性抗體反應(yīng)。這種免疫復(fù)合物的生成表示樣品中存在這種類似物。優(yōu)選在該種測定中使用血漿或血清樣品。但是也可以使用象例如PMNL’s某些血細(xì)胞組織?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的各種方法測定反應(yīng)的存在和/或反應(yīng)程度，例如放射免疫測定法，酶免疫測定法，熒光免疫測定法，熒光顯微術(shù)等等。適合的定性和定量免疫測定方法公開于J.Butler，Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay，CRC Press(1991)。
檢測循環(huán)C5a類似物的測定一般用來監(jiān)控治療期間類似物的水平。另外，本發(fā)明抗體能有益地用于藥物組合物，來調(diào)整或中和循環(huán)C5a類似物的活性。所用抗體的量將是類似物給藥量的等摩爾量?？梢詫κ苤委熣叻墙?jīng)腸給藥本發(fā)明組合物。在急癥情況下，靜脈內(nèi)給藥是特別優(yōu)選的。該抗體可以與藥用賦形劑，如鹽水或Ringer’s溶液一起配制成可注射形式單位劑量。
本發(fā)明將參照下面詳細(xì)的實施例做進(jìn)一步的說明。提供這些實施例只為說明的目的，除非其他說明并不起限制作用。實施例1編碼人C5a的基因合成人C5a基因用寡核苷酸偶聯(lián)而合成，這種合成基因的密碼子使用為大腸桿菌中最佳表達(dá)設(shè)計。合成方法在圖1中說明。它需要聚合5個N-末端殘基由Thr變?yōu)镸et的片段，因為AUG密碼子比任何其它的密碼子能給出更高的翻譯起始頻率。片段1編碼SD序列和合成基因的ATG起始密碼子。片段2-5編碼C5a基因。寡核苷酸的合成寡核苷酸通過固相亞磷酰胺方法在Gene Assembler(Pharmacia)上合成。通過用濃NH4OH在55℃保溫16小時，將全部的合成的寡核苷酸從固相載體上切割下來并去保護(hù)。然后寡核苷酸用制備凝膠電泳純化。所用內(nèi)烯酰胺濃度從寡核苷酸長度多于70個堿基時的10％至長度少于40個堿基寡核苷酸時的20％間變化。寡核苷酸在紫外燈下可見，并且從凝膠上切除主要的高分子量片段。膠條在試管中用玻璃棒破碎，并通過在3.0ml 0.1M，pH7.5的碳酸氫三乙胺(TEAB)中在37℃保溫16小時提取DNA。
用離心法去除凝膠殘余物，在SepPak C-18柱(Waters Associates)上進(jìn)行色譜分離寡核苷酸。用10ml乙腈，5ml含30％乙腈的50mM TEAB和10ml25mM TEAB連續(xù)洗滌，將柱預(yù)平衡。將寡核苷酸上柱，用10ml 25mM TEAB沖洗，并用5ml含50％乙腈的35.5mM TEAB從柱上洗脫。收集級分，在260nm吸收測定的含寡核苷酸的樣品在真空離心蒸發(fā)濃縮器(SpeedVac)(Savant)中干燥。寡核苷酸退火和偶聯(lián)退火前，每一寡核苷酸在5’端磷酸化。激酶反應(yīng)混合物含有1μg寡核苷酸，總體積為40μl，含12mM MgCl2，1mM DTT(二硫蘇糖醇)和2mM ATP的77mM pH7.5的TRIS。通過加入10單位T4多聚核苷酸激酶起動反應(yīng)，并使其在37℃進(jìn)行40分鐘。向每一激酶反應(yīng)中加入10μl無菌水并加入48μl互補寡核苷酸，在加熱器中在78℃混合并放置。關(guān)閉加熱器，使混合物冷卻至30℃。然后樣品再放于第二加熱器中在68℃加熱器分鐘，再關(guān)閉加熱器，使混合物冷卻至26℃。退火的基因片段用來在噬菌體M13mp18(NewEngland Biolabs)中裝配基因。在M13mp18中裝配C5a編碼基因的策略需要三個連接反應(yīng)循環(huán)。
合適的基因片段連接到M13mp18的每一連接反應(yīng)后，用連接的M13 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101。由重組體克隆分離M13噬菌體后進(jìn)行構(gòu)建的序列分析。最終C5a被克隆到M13mp18中，得到M13mp18/C5a(1-74)。接著C5a(1-74)基因亞克隆到pB-6載體上得pB-6/C5a(1-74)，其中pB-6載體由質(zhì)粒pTZ19R和pKK223-3衍生(兩者皆購自Pharmacia)，參見圖2。實施例2C5a基因的定點誘變使用寡核苷酸體外誘變系統(tǒng)方法2(Amersham)，含M13mp18/C5a(1-74)和誘變寡核苷酸的C5a的單鏈DNA，進(jìn)行定點誘變。按照生產(chǎn)者提供的方法，用誘變寡核苷酸ACGGTGCTTCTGTTAACA(SEQ ID NO.6)進(jìn)行C5a中Cys27Ser突變。用雙脫氧DNA序列測定分析4塊噬斑確定正確的Cys27Ser突變。由正確突變體克隆中的一個分離雙鏈DNA并且PstI和BamHI限制酶切。含有突變的230bp片段亞克隆到pB-6載體上。所得質(zhì)粒pB-6/C5a(1-74，C27S)，再通過雙脫氧方法測定序列以證明突變。實施例3C5a基因的盒式誘變用EcoRI和HindIII限制酶切質(zhì)粒pB-6/C5a(1-74，C27S)或pB-6/C5a(1-74)，并在也用相同酶限制酶切的載體pWCB中亞克隆，分別得到含編碼C5a(1-74，C27S)基因的質(zhì)粒pWCB112，和含編碼C5a(1-74)基因的pWCB100。然后這些質(zhì)粒用于盒式誘變中制備一系列新基因。用于盒式誘變的寡核苷酸用Applied Biosystems 381A DNA合成儀，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用固相亞磷酰胺化學(xué)法制備。
含大約60μg pWCB112的10μl TE與6μl 60U PVvu和3μl 60UHindHI(New England Biolabs)和10μl 10×高鹽緩沖液(1M NaCl，0.5M Tris/HCl，pH7.5，0.01M MgCl2，10mM DTT)和71μl ddH2O，總體積100μl的溶液混合。該溶液在37℃保溫16小時。這樣線性化的大約4.5kb的載體通過使用1％瓊脂糖凝膠的制備電泳純化，接著由切除的瓊脂糖凝膠切條上電洗脫DNA片段?；厥盏腄NA片段轉(zhuǎn)移到Eppendorf試管中，加入1ml無水乙醇，該試管在微量離心機中以14000rpm離心10分鐘。真空干燥DNA沉淀，接著將其溶解于40μl TE緩沖液(pH7.4的10mM Tris，HCl，含1mMEDTA)，得pWCB112/A。
單鏈寡核苷酸35bp-序列，5’CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA3’(SEQ ID NO.7)。和39bp-序列5’AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG3，(SEQ ID NO.8)，用制備電泳在8％聚丙烯酰胺凝膠上純化。電泳后用紫外燈照射顯示寡核苷酸，并且將合適的片段從凝膠上切割下來。凝膠切片在一試管中用玻璃棒破碎，通過在pH7.5的3.0ml 0.1M TEAB緩沖液中在37℃保溫16小時提取DNA。離心去除凝膠殘留物，并通過在SepPak C-18柱(WatersAssociates)上進(jìn)行色譜分離寡核苷酸。用10ml乙腈，5ml含35％乙腈的50mMTEAB和10ml 25mM TEAB連續(xù)沖洗將柱子預(yù)平衡。將寡核苷酸上柱，用10ml25mM TEAB沖洗，用5ml含50％乙腈的35.5mM TEAB從柱中洗脫。
收集級分，在260nM吸收測定的含寡核苷酸的那些級分在真空離心蒸發(fā)濃縮器中(Savant)干燥。通過混合等量的每種核苷酸和含有含0.01m MgCl2的0.05MTris/HCl，pH7.6的Klenow緩沖液，將樣品在95℃加熱10分鐘，然后在2小時期間內(nèi)冷卻至室溫，實現(xiàn)35和39bp寡核苷酸退火生成雙鏈DNA，連接到限制載體pWCB112/A中。使用載體3倍過量的插入片段，用1μl，2U T4 DNA；連接酶(BRL)將雙鏈DNA連接到限制的載體pWCB112上。反應(yīng)在4℃進(jìn)行17個小時。
應(yīng)用基本上相同的技術(shù)，只是使用不同的寡核苷酸，以及或者pWCB100或pWCB112，制備多種分子。列于下文的表2。表2由C5a(1-74)或C5a(1-74，C27S)基因的盒式誘變制備的C5a類似物。C5a類似物編號使用的寡核苷酸序列和被編碼的C5a類似物1. C5a(1-64，C27S，N64C)CTGCGTGCTTGCTA(SEQ.ID.NO.9)AGCTTAGCAAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.10)2. C5a(1-65，C27S，I65C)CTGCGTGCTAACTGCTA(SEQ.ID.NO.11)AGTTAGCAGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.12)3. C5a(1-66，C27S，S66C)CTGCGTGCTAACATCTGCTA(SEQ.ID.NO.13)AGCTTAGCAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.14)4. C5a(1-67，C27S，H67C)CTGCGTGCTAACATCTCTTGCTA(SEQ.ID.NO.15)AGCTTAGCAAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.16)5. C5a(1-68，C27S，K68C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACTGCTA(SEQ.ID.NO.17)AGCTTAGCAGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.18)6. C5a(1-69，C27S，D69C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAATGCTA(SEQ.ID.NO.19)AGCTTAGCATTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.20)7. C5a(1-70，C27S，M70C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACTGCTA(SEQ.ID.NO.21)AGCTTAGCAGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.22)8. C5a(1-71，C27S，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA(SEQ.ID.NO.23)AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.24)9. C5a(1-72，C27S，L72C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATGCTA(SEQ.ID.NO.25)AGCTTAGCATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ ID.NO.26)10. C5a(1-73，C27S，G73C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGTGCTAS(SEQ.ID.NO.27)AGCTTAGCACAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.28)11. C5a(1-74，C27S，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTCGTTA(SEQ.ID.NO.29)AGCTTAACGACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.30)12. C5a(1-73，C27S，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTTA(SEQ.ID.NO.31)AGCTTAACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.32)13. C5a(1-72，C27S，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGTA(SEQ.ID.NO.33)AGCTTACAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.34)14. C5a(1-74，R74C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGGGTTGCTA(SEQ.ID.NO.35)AGCTTAGCAACCCAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.36)15. C5a (1-71，C27S)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATA(SEQ.ID.NO.37)AGCTTATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.38)16. C5a(1-71，C27S，Q71D)CTGCGTCCTAACATCTCTCACAAAGACATGGACTA(SEQ.ID.NO.39)AGCTTAGTCCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.40)17. C5a(1-71，C27S，Q71S)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTCTTA(SEQ.ID.NO.41)AGCTTAAGACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.42)18. C5a(1-71，C27S，Q71H)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCACTA(SEQ.ID.NO.43)AGCTTAGTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.44)19. C5a(1-71，C27S，Q71R)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCGTTA(SEQ.ID.NO.45)AGCTTAACGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.46)20. C5a(1-71，C27S，Q71L)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCTGTA(SEQ.ID.NO.47)AGCTTACAGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.48)21. C5a(1-71，C27S，H67F，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTTTCAAAGACATGTGCTA(SEQ.ID.NO.49)
AGCTTAGCACATGTCTTTGAAAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.50)類似物10-20是激動劑，不在本發(fā)明范圍中。它們是為了對比的目的。類似物No.8二聚物形式的制備在下文實施例5c中進(jìn)行了說明。它被稱為類似物No.22。
編碼C5a類似物No.21多核苷酸的完整核苷酸序列列于下面表3。表3GAA-TTC-CCA-CTC-AAA-ATA-AGG-AGG-AAA-AAA-AAECOR1ATG-CTG-CAG-AAG-AAA-ATC-GAA-GAA-ATC-GCTSTARTGCT-AAG-TAC-AAA-CAC-TCT-GTT-GTT-AAA-AAATGC-TGC-TAC-GAC-GGT-GCT-TCT-GTT-AAC-AACHPA1GAC-GAA-ACT-TGC-GAA-CAG-CGT-GCT-GCT-CGTATC-TCT-CTG-GGC-CCG-CGT-TGC-ATC-AAA-GCAAPA1TTC-ACT-GAA-TGC-TGC-GTT-GTT-GCT-TCT-CAGPVU11CTG-CGT-GCT-AAC-ATC-TCT-TTC-AAA-GAC-ATGTGC-TAA-GCT-T(SEQ.ID.NO.51)HIND111但本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員懂得，由于基因編碼的簡并性，能制得很多多核苷酸編碼相同的C5a類似物。參見例如Watson等，Recombinant DNA，2nd Ed.，F(xiàn)reeman，N.Y.(1993)。實施例4C5a和C5a類似物在大腸桿菌中的表達(dá)為進(jìn)行表達(dá)，表1所列C5a類似物的合成基因亞克隆到pWCB載體上，pWCB是改變的表達(dá)載體pKK223-3(Pharmacia)，其BamHI位點缺失且PvuII位點變?yōu)镻vuI位點，并含有異丙基-硫-β-D-半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)的tac/啟動子，和氨芐青霉素抗性基因。大腸桿菌菌株LCIQ是公開于Goff等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 816647-6651(1984)中的菌株LC137(lon，htpR)的衍生物。其含有來自DH5αF’IQ(BRU實驗室)編碼lacIQ的F’因子，并且是表達(dá)質(zhì)粒的宿主。含有合適表達(dá)質(zhì)粒的E.coli LCIQ在30℃在LB肉湯中生長，直至達(dá)到OD550為1。用2.5mM終濃度的IPTG將培養(yǎng)物誘導(dǎo)3小時。離心收集細(xì)胞在使用前在-80℃下保存。實施例5aC5a和C5a類似物的重折疊和純化實施例4的冷凍E.coli細(xì)胞糊狀物等份在含6M鹽酸胍的緩沖液(5∶1 v∶w，緩沖液∶細(xì)胞糊狀物)中解凍之后，從其中分離重組蛋白質(zhì)。然后超聲處理使細(xì)胞破碎，產(chǎn)物用含有或者1mM半胱氨酸和1mM脫氨酸或1mM還原/氧化谷胱甘肽的pH8.0，50mM Tris/HCl緩沖液透析過夜以促進(jìn)復(fù)性作用。然后透析液通過加入6N HCl酸化至pH3。離心去除沉淀物，上清液在100，15微米，DeltaPak C18，反相HPLC柱(Waters)上，用存在0.1％TFA的水中的25％至35％乙腈的線性梯度純化30分鐘，在大約28％乙腈處由柱上洗脫出主要洗脫峰，收集并凍干。該級分含有重組C5a類似物的谷胱甘肽加合物(表中類似物5、7、8、9和21的加合物)，或C5a類似物的半胱氨酸加合物(表1中類似物No.8的加合物)。
大約0.002mmol C5a類似物半胱氨酸加合物的基因產(chǎn)物溶解在50ml pH7.4的Tris緩沖液中。加入0.02mmol DTT。4小時后，大約80％C-末端Cys-Cys連接被轉(zhuǎn)化為自由的半胱氨酸，并在C4，15微米，300，反相柱(Alltech)上用存在0.1％ TFA的水中的25至35％乙腈線性梯度純化產(chǎn)物30分鐘。凍干在大約29％乙腈處洗脫的含有產(chǎn)物的級分，然后在真空干燥下在4℃儲存。實施例5bC5a和C5a類似物的重折疊和純化實施例4的冷凍細(xì)胞E.coli糊狀物等份在含有6M鹽酸胍的緩沖液(5∶1 v∶w，緩沖液∶細(xì)胞糊狀物)中解凍后，從其中分離重組蛋白質(zhì)。然后通過超聲作用將細(xì)胞破碎，產(chǎn)物用含有1mM還原的/0.01mM氧化的谷胱甘肽的pH7.4，100mM Tris/HCl緩沖液稀釋20倍。4小時后，溶液通過加入6N HCl，酸化至pH3。離心去除沉淀物，上清液在100，15微米DeltaPak C18，反相柱(Waters)上，用存在0.1％ TFA的25至35％乙腈的線性梯度純化30分鐘。收集在大約30％乙腈處由柱上出來的主要洗脫峰，并凍干。這樣分離的C5a類似物具有含還原的巰基的C-末端半胱氨酸。實施例5c生成C5a類似物的二聚物在其C末端區(qū)含有游離巰基的C5a類似物從單體形式轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w形式。
根據(jù)實施例5b，用溶解在pH7.4，100mM Tris/HCl中的1mM還原的/0.01mM氧化的谷胱甘肽混合物，使實施例4從冷凍的E.coli糊狀物等份分離重組體蛋白質(zhì)重折疊。4小時后，加入6N HCl將溶液酸化至pH3。離心去除所得沉淀物，上清液吸收在用pH7.0，25mM緩沖液平衡的SP-Spherodex離子交換柱上。用pH7.0，25mM Tris沖洗柱子后，用含0.75M NaCl的pH7.0，25mMTris將C5a類似物從柱上洗脫下來。將部分純化的C5a類似物用甲酸調(diào)至pH3.0，用蒸餾水稀釋，得到傳導(dǎo)率為大約45mS/cm的蛋白質(zhì)溶液，并將其吸收在用含有0.6M NaCl，pH3.5，50mM甲酸平衡過的SP-High Performance離子交換柱上。用pH3.5，50mM甲酸緩沖液中0.6-1.0M NaCl線性梯度將C5a類似物從柱上洗脫下來。收集在大約0.725M NaCl處從柱上洗脫的主峰。這樣分離的C5a類似物具有含還原的巰基的C-末端半胱氨酸。用25％氨水溶液調(diào)節(jié)pH7.0，并儲存該溶液，使分子轉(zhuǎn)化為其二聚物形式。pH7.0，蛋白質(zhì)濃度大約0.3-0.6mg/ml并在4-8℃儲存，轉(zhuǎn)化作用至少是80％，在兩天內(nèi)完成。C5a類似物的二聚物形式最終在DeltaPak C18，100，15微米，反相HPLC柱(Waters)上，用存在0.1％ TFA的25％至40％乙腈線性梯度純化30分鐘。收集在大約33％乙腈處的柱的主要洗脫峰并凍干。這樣得到的分子是E.coli表達(dá)系統(tǒng)制備的C5a類似物的二聚物。實施例6受體結(jié)合測定進(jìn)行試驗測定C5a和C5a受體拮抗劑對C5a受體的親和性。按照Rollins等，J.Biol.Chem.263520-526(1988)的說明，并根據(jù)Braunwalder等，Mol.Immunol.29(11)，1319-1324(1992)中說明的進(jìn)行改進(jìn)的方法測定[125I]BH-標(biāo)記的C5a與PMNL膜的結(jié)合，[125I]BH-標(biāo)記的C5a按照Harris等，J.Receptor Res.11115-128(1991)的描述制備。PMNLs重新懸浮于Hanks平衡鹽溶液中，該溶液中無Ca++和Mg++，且含有pH7.3，10mM HEPES，2.5mM MgCl2，100單位/ml DNAse，0.1mM PMSF，10μg/ml抑蛋白酶肽(aprotonin)和10μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，然后在氮氣渦流容器(nitrogen cavitation bomb)中在100psi，4℃平穩(wěn)20分鐘。抽到含25mMEDTA和上述蛋白酶抑制劑的3體積0.5M KHCO3中后，用鑷子去除膠狀材料并將混合物以400xg在4℃離心10分鐘。所得上清液以50000xg在4℃離心60分鐘。將由代表200×106個細(xì)胞等份中得到的沉淀在-70℃保存。為進(jìn)行結(jié)合研究，這些膜以20×106個細(xì)胞/ml當(dāng)量再懸浮于含1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.1mM PMSF，0.1％桿菌肽和0.5％ BSA的pH7.3，50mM HEPES中，用相同緩沖液再稀釋1∶75后，向含有50μl[125I]BH-C5a(比放射性2200Ci/mmol，終濃度4.0PM)，和50μl緩沖液或C5a類似物的一式二份試驗試管中加入400μl這種懸浮液，在各種濃度下測定抑制劑性質(zhì)。
在10mM未標(biāo)記C5a存在下測定非特異結(jié)合。加入PMNL膜起動結(jié)合反應(yīng)，并在4℃持續(xù)120分鐘。通過使用Cell Harvester(Brandel，Gaithersburg，MD)，過0.05％ PEI(聚乙烯亞胺)預(yù)處理90分鐘的GF/C玻璃纖維濾膜(Whatman)的真空過濾作用被分離開被結(jié)合的和未被結(jié)合的放射活性。用3×5ml pH7.4冰冷卻的5mM Tris緩沖液沖洗濾膜，并在多孔Gamma計數(shù)器(Genesys)上計數(shù)。用非線性回歸方法，RS/1(Bolt，Beranek and Newman，Boston)分析數(shù)據(jù)，并用IC50值表達(dá)。按照應(yīng)用Cheng-Presoff等式以Ki值的形式給出下面表4中的結(jié)果。參見上文Braunwalder等人的文獻(xiàn)。表4C5a類似物受體結(jié)合研究C5a類似物 受體結(jié)合Ki(nM)9谷胱甘肽 1.858谷胱甘肽 1.77谷胱甘肽 7.28Cys 2.89 0.98 0.27 0.415*3.016*8.517*7.518*0.1519*0.3520*0.035210.1220.04C5a 0.0035*＝激動劑；左欄中序號指表1中的序號。
這些結(jié)果證明本發(fā)明C5a類似物用納摩爾Kis競爭性地取代了野生型C5a。本發(fā)明C5a類似物具有對C5a受體的親和性，如在上文Braunwalder等人文獻(xiàn)中公開的競爭性取代測定中測定的Ki少于大約1.0×10-8M，優(yōu)選少于大約2.0×10-9M，且更優(yōu)選小于大約1.0×10-10M(應(yīng)用放射配體，[125I]Bolton-Hunter標(biāo)記的C5a)。實施例7C5a誘導(dǎo)Ca++升高重組體人C5a溶解在含0.01％ Tween-20的Hanks緩沖液中，并在這種緩沖液中制備所有的C5a儲存稀釋劑。fura-2的乙酸甲酯(fura 2AM，MolecularProbes)溶解在DMSO中。嗜中性白細(xì)胞通過在6％ hetastarch(HESPAN，Dupont，Waukegan，IL)中沉降從人外周血中純化出來，然后進(jìn)行對流淘析，如Chapman-Kirkland等，J.Immunol.Meth. 14295-104(1991)中所說明的。純化的細(xì)胞(2×106/m)與0.2μM fura-2AM混合，并在沒有鈣或鎂的HEPES緩沖的Hanks溶液中在37℃保溫30分鐘。測定前15分鐘，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到帶攪拌棒的彎管中并加入1mM的鈣。攪拌下將細(xì)胞懸浮液在37℃保溫。細(xì)胞純化5小時內(nèi)終止測定，并且周期性地獲得標(biāo)準(zhǔn)受控應(yīng)答，以確保在實驗期間細(xì)胞應(yīng)答不發(fā)生變化。用SLM 8000分光熒光計(SLM-Aminco Instruments，Urbana，IL)測定熒光量。將彎管放于熒光儀中，得到10秒基線后，加入將要測定其拮抗劑性質(zhì)的C5a受體拮抗劑，測定340nm/380nm(510nm發(fā)射)熒光激發(fā)比的任何變化。加入類似物后40秒，加入攻擊劑量的C5a至100pM終濃度，測定激發(fā)比產(chǎn)生的變化。
IC50值作為拮抗劑效力的量度。這些值被定義為減少50％的100pMC5a攻擊劑量的鈣上升反應(yīng)所需的C5a類似物的濃度。EC50值用作激動劑效力的量度。EC50被定義為引起減少50％由類似物產(chǎn)生的最大鈣上升反應(yīng)的C5a類似物的濃度。結(jié)果引于下面表5。表5對C5a類似物C5a誘導(dǎo)的鈣上升的研究類似物 鈣上升(nm)IC50EC50(拮抗劑)(激動劑)9谷胱甘肽 1000NM(測得)8谷胱甘肽 2000NM7谷胱甘肽 2000NM8半胱氨酸 105 NM9 43 NM8 14 NM7 54 NM15 NM 9016 NM 31017 NM 12018 NM 15019 NM 4020 NM 7521 6 NM22 10 NMC5aNM 0.07
C5a類似物No.7被試驗至濃度為1.0×106M。C5a類似物No.8被試驗至濃度為3.0×10-6M，類似物No.9被試驗至濃度為1.5×106M，類似物No.21被試驗到濃度為8.0×10-7M。在所有情況下都沒有測得激動劑活性。上面表2中統(tǒng)一分析的結(jié)果證明本發(fā)明類似物作為C5a競爭性抑制劑起作用。證明本發(fā)明類似物C-末端應(yīng)該是未復(fù)合的半胱氨酸殘基或通過二硫鍵與另一本發(fā)明C5a類似物復(fù)合的半胱氨酸殘基，才能實現(xiàn)最高效力。實施例8兔皮膚炎癥模型在雄性重2.5-3.0kg的新西蘭白兔身上進(jìn)行所有實驗。將兔背部的毛刮凈，用不同顏色標(biāo)記指明40-50個皮膚點。不同刺激物(即，C5a，C5a類似物，C5a+C5a類似物，載體對照物，等)使用無菌一次性26號0.5英寸針頭和1.0cc結(jié)核菌素注射器真皮內(nèi)注射，0.1ml/位點。在安死術(shù)前大約45分鐘，一式六份I.D.注射給藥。單獨的C5a以50ng/位點的劑量注射，C5a受體拮抗劑以不同濃度用與C5a相同劑量共注射。在安死術(shù)之前20分鐘，1.0ml生理鹽水中18-36uCi[125I]-標(biāo)記的牛血清白蛋白通過邊緣耳靜脈導(dǎo)入系統(tǒng)循環(huán)。45分鐘時，用I.V.過量的戊巴比妥鈉使兔安樂死。通過心臟穿刺術(shù)得到5.0ml外周血，以2000rpm離心10分鐘，收集1.0ml血漿，用作測定血漿中125I量的參考。兔死后，取其背部皮膚用大頭針別在木制解剖板上。皮膚主要脈管中的血液用手?jǐn)D壓至周圍部分。這一過程減少皮膚位點間的變化并且減少背景放射活性。借助15mm木制鏜孔刀具和小錘在皮膚上打孔取出炎癥損傷組織，并保存在12×75mm聚苯乙烯試管中。然后用Gamma計數(shù)儀(Genesys)分析注射位點的放射活性含量。由血管滲出并位于炎癥位點的[125I]牛血清白蛋白(BSA)的量被發(fā)現(xiàn)與血管滲透性的增強程度成正比。C5a類似物的ID50值是減少50％由50ngC5a在相同位點共注射產(chǎn)生的放射活性的C5a類似物的劑量。
發(fā)現(xiàn)C5a類似物No.8(表1中)具有70ng/位點的ID50，而在175ng/位點劑量時不引起前炎癥反應(yīng)。這一結(jié)果證明這種類似物是體內(nèi)拮抗劑，并且不具有體內(nèi)激動劑性質(zhì)。實施例9兔體內(nèi)C5a誘導(dǎo)的中性白細(xì)胞減少所有的實驗在重2.5-3.0kg雄性新西蘭白兔身上進(jìn)行。用10mg/kg甲苯噻嗪和50mg/kg氯胺酮結(jié)合肌內(nèi)給藥使兔麻醉。25號蝶形導(dǎo)管插入耳側(cè)靜脈用來輸液。從中心耳動脈將每一血樣(0.2ml)采集到裝有25號5/8英寸針頭，并裝有7.5％ EDTA為抗凝劑的塑料注射器中。立即將血樣壓至含10微升7.5％ EDTA的微離心管中。得到初動脈血樣(#1)，此后立即靜脈內(nèi)輸注(濃縮藥丸注射)載體或?qū)嵤├? C5a類似物。20秒鐘后，得到第二血樣(#2)，此后20秒后靜脈內(nèi)輸注0.2ml 100ng C5a。20秒后，取第三血樣(#3)。30分鐘后，進(jìn)行第二輪血樣(#4)-20秒-C5a-輸注-20秒-血樣(#5)操作。血樣用自動血液分析(Technicon H*1)應(yīng)用兔血軟件評價。比較載體處理的和C5a類似物處理的動物體內(nèi)由C5a引起的嗜中性白細(xì)胞數(shù)的減少(每毫升的數(shù)目)(由比較血樣#3與#2和#5與#4而確定的C5a誘導(dǎo)中性白細(xì)胞減少)。C5a類似物沒有改變基線嗜中性細(xì)胞數(shù)正常值；即C5a類似物不具有激動劑(類C5a)性質(zhì)。與載體處理的兔相比，C5a類似物處理兔體內(nèi)C5a誘導(dǎo)白細(xì)胞減少明顯被抑制(P＞0.05)，在40秒和30分鐘C5a激發(fā)時間間隔時分別達(dá)67％和41％。這些結(jié)果證明系統(tǒng)給藥C5a類似物的藥效。實施例10C5a類似物與+肽H-Ile-Ser-Phe-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-Gly-Arg-OH(SEQ ID NO.52)的比較受體結(jié)合與C5a誘導(dǎo)鈣升高。
制備五種C5a類似物(表2中No.5、7、8、9和10)，并進(jìn)行C5a受體結(jié)合與C5a受體鈣升高測定，并且與Or等，J.Med.Chem. 35402-406(1992)中表I(No.14)公開的合成+肽相比較。這些實驗的結(jié)果見下面表6。表6化合物 受體結(jié)合 Ca++升高Ki(nM) IC50(nM)EC50(nM)類似物5 0.06 84″7 0.35 859″8 0.04 51″9 0.15 621″10 0.03 0.6C5a(1-74)0.0035 0.07十肽 5,0002058這些結(jié)果證明被試驗的本發(fā)明C5a類似物與該+肽相比具有大于14000-10000倍的受體親和力。上面數(shù)據(jù)還證明本發(fā)明C5a類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑，而該+肽具有明顯的激動劑活性。實施例11制備C5a(1-71，C27S，O71C)的特異性多克隆抗體制備抗原采用購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL USA)的ImiectImmunogen EDC結(jié)合藥盒，按照生產(chǎn)商的說明將1mgC5a(1-71，C27S，Q71C)結(jié)合到2mg Keyhole Limpet血藍(lán)素上。加入3500cpm125I-C5a(NewEngland Naclear，Boston，M.A.)跟蹤結(jié)合作用效力。結(jié)合物終體積為2.25ml，含0.34mgC5a(1-71，C27S，Q71C)(0.15mg/ml)和大約0.9mg/mlKLH?？笴5a(1-71，C27S，O71C)抗血清的產(chǎn)生用0.5ml弗氏完全佐劑(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)將C5a(1-71，C27S，Q71C)結(jié)合物勻漿化。由Millbrook Farms(Amberst，MA)購得的雌性新西蘭白兔在肩胛部在兩個位點(每一位點用0.2ml勻漿物)進(jìn)行皮下注射。21天后重復(fù)該程序。用弗氏不完全佐劑(Sigma〕再進(jìn)行注射；總共55天后進(jìn)行第三次注射，第126天時第四次注射。每次注射后3和5星期之間從兔身上取血樣(大約30ml)，使其凝固，移取血清。用于抗體吸附的肽固定化應(yīng)用購自Pierce Chemical Co.的Imject Immunogen EDC結(jié)合藥盒，將C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a(1mg)結(jié)合到2mg牛血清白蛋白(BSA)中，并且125I-C5a跟蹤結(jié)合效力。如上文所述。C5a(1-71，C27S，Q71C)/BSA終體積為2.25ml，含0.25mg/mlC5a(1-71，C27S，Q71C)；對于C5a/BSA，終體積為2.25ml，含0.32mg/mlC5a。兩種結(jié)合物含有大約0.9mg/mlBSA。
兩種肽結(jié)合物用碳酸鈉緩沖至pH8.6的0.2M碳酸氫鈉透析。對于每種結(jié)合物，通過加入戊二醛至1％ v/v終濃度并在20℃保溫15分鐘而活化。2ml用相同緩沖液預(yù)沖洗的AH(氨基己基)-瓊脂糖凝膠(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)凝膠在緩沖液中充分洗滌去除戊二醛，然后加入結(jié)合物溶液，并在20℃保溫1小時，從凝膠上洗去未偶聯(lián)蛋白質(zhì)，保留的結(jié)合位點通過用20ml 0.2MN-甘氨酰甘氨酸在4℃保溫過夜而封閉。將凝膠裝入0.5cm×10cm玻璃柱，并用含0.1％疊氮化鈉的pH7.2的Dulbecco’s磷酸緩沖鹽水(PBS-A)充分洗滌。親和層析來自用C5a(1-71，C27S，Q71C)免疫的兔的血清以2ml/hr的流速通過C5a/BSA柱。收集由柱中出現(xiàn)的被吸附的抗血清。柱子用0.05M磷酸鈉緩沖至pH7.2且含0.1％疊氮鈉的0.5M NaCl充分沖洗。用3M硫氰酸銨去除結(jié)合抗體。使用線內(nèi)分析紫外監(jiān)測儀在280nm讀數(shù)測定洗脫抗體，并且最大偏差0.2OD。在頭兩次血清走柱過程中收集洗脫的抗體并立即用PBS-A透析，然后超濾濃縮至大約1mg/ml。對每批血清重復(fù)幾次這一步驟。當(dāng)測定不到蛋白質(zhì)從C5a柱上洗脫下來時，血清被認(rèn)為是被吸附了。
然后被吸附的抗血清通過C5a(1-71，C27S，Q71C)免疫吸附柱。結(jié)合的抗體用3M硫氰酸銨洗脫并立即進(jìn)行PBS-A透析，然后濃縮至大約1mg/ml。實施例12a測定結(jié)合C5a(1-71，C27S，Q71C)的標(biāo)記抗體的制備從C5a柱上洗脫下來的抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗體(即與C5a交叉反應(yīng)的抗體)與堿性磷酸酶結(jié)合向5mg(5000單位)堿性磷酸酶(Type VI)-T，Sigma Chemical Co.)中加入1.4mg在1ml PBS中的抗體。加入Gluteraldehyde至終濃度0.2％ v/v?；旌衔镌?0℃保溫90分鐘，然后在4℃用PBS-A透析過夜。將緩沖液換成含1mM氯化鎂，pH8.0的0.05M Tris緩沖液，在4℃透析過夜。實施例12b通過ELISA技術(shù)測定結(jié)合的C5a(1-71，C27S，Q71C)特別純化的0.57mg/ml的兔抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)在pH8.6，0.1M硼酸鈉/硼酸中稀釋至1∶500。ELISA平板(Maxisorp，Nunc，Naperville，IL)用100μl/孔這種溶液包被，在20℃進(jìn)行4小時。平板沖洗三次去除未結(jié)合物質(zhì)。向孔中加入100μl，用PBS-A+1％BSA(PBS/BSA)合適地稀釋的C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a(1-71，C27S，Q71C)的標(biāo)準(zhǔn)制劑的樣品，在20℃進(jìn)行4小時。加入以1∶3000的比例溶在100μl PBS/BSA中標(biāo)記的抗體，并在4℃保溫過夜。沖洗平板，然后加入酶底物(對于堿性磷酸酶，是pH9.8 1mg/ml 10％v/v二乙胺中的磷酸對硝基苯酯(Sigma.ChemicalCo.))。黑暗中顯色在20℃進(jìn)行，大約5小時，平板用Biomek 1000(BeckmanInstruments，CA，USA)在405nm讀數(shù)。
用上述相同條件，繪制C5a(1-71，C27S，Q71C)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(未給出數(shù)據(jù))。實施例12c親和純化特異抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)的特異性用100μl包被緩沖液中，1μg/孔C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a在包被微滴定平板，在20℃進(jìn)行4小時。沖洗平板，100μl PBS./BSA中吸附在C5a上后從C5a(1-71，C27S，Q71C)洗脫下來的抗體的系列稀釋液加入到平板的孔中。在20℃保溫4小時后，再沖洗平板。兔抗體的結(jié)合用山羊抗兔/辣根過氧化物酶(Pierce Chemical Co.)以1∶1000在PBS/BSA中的稀釋度，以100μl/孔測定。與第二抗體一起在20℃保溫4小時后，沖洗平板，并用2，2’-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6磺酸二銨鹽ABTS底物(Pierce ChemicalCo.)證明Horseradish過氧化物活性。進(jìn)行30分鐘后顯色，在405nm處讀數(shù)。實施例13測定兔血漿樣品中C5a(1-71，C27S，Q71C)從兩個被麻醉兔(#1和#2)身上取血樣，裝入肝素涂層的試管中，然后對兩只兔靜脈注射C5a(1-71，C27S，Q71C)。30分鐘間隔后采集血樣。然后再注射C5a(1-71，C27S，Q71C)，并且在30分鐘后又取血樣。這一過程又重復(fù)4次。樣品被離心去除血細(xì)胞，移取血漿并在-20℃儲存直至用于ELISA。
樣品在PBS/BSA中稀釋，并對實施例11作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品在ELISA分析中定量測定。然后測定循環(huán)C5a(1-71，C27S，Q71C)隨時間的增長。在注射C5a(1-71，C27S，Q71C)之前，在由兩只兔身上取的樣中不能測得活性，證明抗體的特異性。這一結(jié)果還證明，該抗體不具有與兔C5a的交叉反應(yīng)活性，C5a(1-71，C27S，Q71C)不是兔體內(nèi)自然存在的物質(zhì)。實施例14兔循環(huán)中C5a(1-71，C27S，Q71C)與標(biāo)準(zhǔn)C5a(1-71，C27S，Q71C)的比較使用特異抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗體作為C5a(1-71，C27S，O71C)的解毒劑使用#2兔最后一次時間點上得到的血漿樣品(由實施例13得到)進(jìn)行一系列二倍稀釋，并將得到的曲線的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相比較。兩個曲線斜率是平行的，表明在兔體內(nèi)循環(huán)的C5a(1-71，C27S，Q71C)仍然保持其抗原性質(zhì)，并且在ELISA中以相同的方式被識別為標(biāo)準(zhǔn)C5a(1-71，C27S，Q71C)。這一結(jié)果也表明如果需要從循環(huán)作用中去除C5a(1-71，C27S，Q71C)，則該類似物將被這一抗體中和。實施例15制備單克隆抗C5a(1-71，C27S，Q71C)抗體在BALB/C小鼠體內(nèi)，用被Kohler和Milstein(Nature 256495-497(1975))建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行單克隆抗體的制備。使用相同的C5a(1-71，C27S，Q71C)抗原(與KLH偶聯(lián))的制劑免疫小鼠。用C5a(1-71，C27S，Q71C)/BSA和C5a/BSA進(jìn)行通過融和免疫鼠脾細(xì)胞和雜交瘤系P3/NSI/1-Ag4-1(ATCC TIB18)而產(chǎn)生的單克隆細(xì)胞系的篩選。在用多克隆兔抗血清進(jìn)行的與之直接平行方法中，那些只與C5a(1-71，C27S，Q71C)反應(yīng)而不與C5a反應(yīng)的抗體被用作特異性單克隆抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗體。識別兩者的抗體被用作測定抗體，并用堿性磷酸酶標(biāo)記。
本說明書中提及的所有公開物和專利申請是為指導(dǎo)與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員。所有這些公開物和專利申請在此引入作為參考，正如每一公開物和專利申請被特別和各個指明引入作為參考。
這里所說明的本發(fā)明的各種改變對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。這種改變也落在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般情報(i)申請人(A)姓名CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr. 141(C)城市Basel(E)州Switzerland(F)郵編(ZIP)4002(G)電話+41 61 69 11 11(H)電傳+41 61 696 79 76(I)電報962 991(ii)發(fā)明名稱基本上沒有激動劑活性的C5a受體拮抗劑(iii)序列數(shù)目52(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計算機IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/162，591(B)申請日06-DEC-1993(2)SEQ ID NO1的情報(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列說明SEQ ID NO1Tyr Asp Gly Ala1(2)SEQ ID NO2的情報(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列說明SEQ ID NO2Asp Gly Ala Tyr1(2)SEQ ID NO3的情報(i)序列特征(A)長度74個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列說明SEQ ID NO3Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser1 5 10 15Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu20 25 30Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile35 40 45Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn50 55 60Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg65 70(2)SEQ ID NO4的情報(i)序列特征(A)長度239堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO4AATTCTATGA CTCTGCAAAA GAAGATCGAA GAAATCGCTG CTAAGTACAA GCACTCCGTC60GTTAAGAAGT GTTGTTACGA TGGTGCATGC GTCAACAACG ACGAAACCTG TGAACAACGA120GCTGCTCGTA TTTCTCTGGG CCCTCGCTGT ATCAAGGCTT TCACTGAATG TTGTGTTGTC180GCTTCCCAAC TGCGCGCTAA CATTTCTCAC AAGGACATGC AACTCGGCCG CTAAAAGCT 239(2)SEQ ID NO5的情報(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列說明SEQ ID NO5Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO6的情報(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO6ACGGTGCTTC TGTTAACA 18(2)SEQ ID NO7的情報(i)序列特征(A)長度；35堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO7CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCTA 35(2)SEQ ID NO8的情報(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO8AGCTTAGCAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO9的情報(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO9CTGCGTGCTT GCTA14(2)SEQ ID NO10的情報(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO10AGCTTAGCAA GCACGCAG18(2)SEQ ID NO11的情報(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO11CTGCGTGCTA ACTGCTA17(2)SEQ ID NO12的情報(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO12AGCTTAGCAG TTAGCACGCA G 21(2)SEQ ID NO13的情報(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO13CTGCGTGCTA ACATCTGCTA20(2)SEQ ID NO14的情報(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO14AGCTTAGCAG ATGTTAGCAC GCAG 24(2)SEQ ID NO15的情報(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO15CTGCGTGCTA ACATCTCTTG CTA23(2)SEQ ID NO16的情報(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO16AGCTTAGCAA GAGATGTTAG CACGCAG 27(2)SEQ ID NO17的情報(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO17CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CTGCTA26(2)SEQ ID NO18的情報(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO18AGCTTAGCAG TGAGAGATGT TAGCACGCAG30(2)SEQ ID NO19的情報(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；線性(xi)序列說明SEQ ID NO19CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAATGCTA29(2)SEQ ID NO20的情報(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO20AGCTTACGAT TTGTGAGAGA TGTTAGCACG CAG 33(2)SEQ ID NO21的情報(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO21CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACTGC TA 32(2)SEQ ID NO22的情報(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO22AGCTTAGCAG TCTTTGTGAG AGATGTTAGC ACGCAG 36(2)SEQ ID NO23的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO23CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCTA 35(2)SEQ ID NO24的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO24AGCTTAGCAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO25的情報(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO25CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAATGCTA 38(2)SEQ ID NO26的情報(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO26AGCTTAGCAT TGCATGTCTT TGTGAGAGAT GTTAGCACGC AG42(2)SEQ ID NO27的情報(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO27CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAACTGTGCT A41(2)SEQ ID NO28的情報(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO28AGCTTAGCAC AGTTGCATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG45(2)SEQ ID NO29的情報(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO29CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTC GTTA44(2)SEQ ID NO30的情報(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO30AGCTTAACGA CCCAGGCACA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG48(2)SEQ ID NO31的情報(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO31CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTT A 41(2)SEQ ID NO32的情報(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO32AGCTTAACCC AGGCACATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG 45(2)SEQ ID NO33的情報(i)序列特征；(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO33CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGTA 38(2)SEQ ID NO34的情報；(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO34AGCTTACAGG CACATGTCTT TGTGAGAGAT GTTAGCACGC AG 42(2)SEQ ID NO35的情報(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO35CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAACTGGGTT GCTA 44(2)SEQ ID NO；36的情報(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO36AGCTTAGCAA CCCAGTTGCA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG 48(2)SEQ ID NO37的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO37CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAATA 35(2)SEQ ID NO38的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO38AGCTTATTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO39的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO39CTGCGTCCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG GACTA35(2)SEQ ID NO40的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO40AGCTTAGTCC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG39(2)SEQ ID NO41的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO41CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TCTTA 35(2)SEQ ID NO42的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO42AGCTTAAGAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO43的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO43CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CACTA35(2)SEQ ID NO44的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO44AGCTTAGTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO45的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO45CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CGTTA 35(2)SEQ ID NO46的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO46AGCTTAACGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG39(2)SEQ ID NO47的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO47CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CTGTA 35(2)SEQ ID NO48的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO48AGCTTACAGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG39(2)SEQ ID NO49的情報(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO49CTGCGTGCTA ACATCTCTTT CAAAGACATG TGCTA35(2)SEQ ID NO50的情報(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO50AGCTTAGCAC ATGTCTTTGA AAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO51的情報(i)序列特征(A)長度252個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列說明SEQ ID NO51GAATTCCCAC TCAAAATAAG GAGGAAAAAA AAATGCTGCA GAAGAAAATC GAAGAAATCG60CTGCTAAGTA CAAACACTCT GTTGTTAAAA AATGCTGCTA CGACGGTGCT TCTGTTAACA 120ACGACGAAAC TTGCGAACAG CGTGCTGCTC GTATCTCTCT GGGCCCGCGT TGCATCAAAG 180CATTCACTGA ATGCTGCGTT GTTGCTTCTC AGCTGCGTGC TAACATCTCT TTCAAAGACA 240TGTGCTAAGC TT 252(2)SEQ ID NO52的情報(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列說明SEQ ID NO52Ile Ser Phe Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.人C5a肽類似物，其中所述類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的人C5a類似物，其中所述類似物包含不同于相應(yīng)人C5aC-末端區(qū)的C-末端區(qū)，因為它包含半胱氨酸殘基，并且在其C-末端截短至少兩個氨基酸殘基。
3.權(quán)利要求1的人C5a類似物，以半胱氨酸殘基為其C-末端。
4.權(quán)利要求2的人C5a類似物，其中所述半胱氨酸殘基以加合物形式存在。
5.權(quán)利要求2的人C5a類似物，其長度為64至72個氨基酸。
6.權(quán)利要求2的人C5a類似物，其長度為68至72個氨基酸。
7.權(quán)利要求2的人C5a類似物，其長度為70至72個氨基酸。
8.權(quán)利要求2的人C5a類似物，其長度為71個氨基酸。
9.權(quán)利要求7的人C5a類似物，它是C5a(1-71， Gln71Cys)。
10.權(quán)利要求1中人C5a類似物的衍生物，其中所述衍生物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑。
11.權(quán)利要求2中人C5a類似物的衍生物，其中所述衍生物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑。
12.權(quán)利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，His67Phe，Gln71Cys)。
13.權(quán)利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)。
14.權(quán)利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)
15.包含人C5a第一和第二多肽類似物或其衍生物的二聚物，其中每一種所述類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑，且具有C-末端半胱氨酸殘基，其中所述第一和第二類似物的半胱氨酸殘基是通過二硫鍵連接在一起的，而且其中所述第一和第二C5a類似物可以是相同的或不同的。
16.權(quán)利要求15的二聚物，其中每一所述第一和第二類似物的C-末端區(qū)不同于相應(yīng)的人C5a的C-末端區(qū)，因為它被至少截短了兩個氨基酸殘基。
17.權(quán)利要求15的二聚物，其中每一所述第一和第二類似物是C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)
18.編碼權(quán)利要求1的人C5a類似物的DNA分子。
19.編碼權(quán)利要求6的人C5a類似物的DNA分子。
20.編碼權(quán)利要求8的人C5a類似物的DNA分子。
21.編碼權(quán)利要求9的人C5a類似物的DNA分子。
22.編碼權(quán)利要求10的人C5a類似物的衍生物的DNA分子。
23.編碼權(quán)利要求13的人C5a類似物的衍生物的DNA分子。
24.編碼權(quán)利要求14的人C5a類似物的衍生物的DNA分子。
25.重組DNA分子，包含與權(quán)利要求18的DNA分子可操作地連接的啟動子，所述啟動子能在給定宿主中起作用。
26.與給定宿主相容的重組體質(zhì)粒，包含權(quán)利要求25的重組DNA分子。
27.與給定宿主相容的重組體載體，包含權(quán)利要求18的重組DNA分子。
28.用權(quán)利要求18的重組體DNA分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的重組體宿主。
29.權(quán)利要求28的重組體宿主，它選自細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、哺乳動物和植物細(xì)胞。
30.權(quán)利要求28的重組體宿主，它是大腸桿菌。
31.權(quán)利要求1的人C5a類似物的特異性抗體，其中所述類似物與人C5a基本上不具有交叉反應(yīng)活性。
32.權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
33.權(quán)利要求31的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
34.權(quán)利要求10的人C5a類似物衍生物的特異性抗體，其中所述抗體與人C5a基本上不具有交叉反應(yīng)活性。
35.權(quán)利要求34的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
36.權(quán)利要求34的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
37.權(quán)利要求14的衍生物的特異性抗體，其中所述抗體與人C5a基本上不具有交叉反應(yīng)活性。
38.權(quán)利要求37的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
39.權(quán)利要求37的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
40.權(quán)利要求15的C5a類似物或其衍生物的二聚物的特異性抗體，其中所述抗體與人C5a基本上不具有交叉反應(yīng)活性。
41.權(quán)利要求17二聚物的特異性抗體，其中所述抗體與人C5a基本上不具有交叉反應(yīng)活性。
42.用于治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1的C5a類似物和藥用載體。
43.用于治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求10的C5a類似物衍生物，和藥用載體。
44.用于治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求14的C5a類似物衍生物，和藥用載體。
45.用于調(diào)整人C5a類似物體內(nèi)活性的藥物組合物，所述人C5a類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑，包含調(diào)整類似物活性有效量的權(quán)利要求26的抗體和藥用載體。
46.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述抗體的量能有效地基本上中和類似物體內(nèi)活性。
47.治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用權(quán)利要求42的組合物步驟。
48.治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用權(quán)利要求43的組合物步驟。
49.治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥的方法，包括給需要治療的哺乳動物施用權(quán)利要求44的組合物步驟。
50.減輕哺乳動物C5a介導(dǎo)炎癥的方法，包括在補體激活引起或加重癥狀相關(guān)時，對哺乳動物施用足以減輕炎癥的權(quán)利要求42的組合物的步驟。
51.減輕哺乳動物C5a介導(dǎo)炎癥的方法，包括在補體激活引起或加重癥狀相關(guān)時，對哺乳動物施用足以減輕炎癥的權(quán)利要求43的組合物的步驟。
52.減輕哺乳動物C5a介導(dǎo)炎癥的方法，包括在補體激活引起或加重癥狀相關(guān)時，對哺乳動物施用足以減輕炎癥的權(quán)利要求44的組合物的步驟。
53.調(diào)整需要的受治療者人C5a類似物的活性的方法，所述人C5a類似物是基本上不具有激動劑活性的受體拮抗劑，包括步驟給受治療者施用權(quán)利要求45的藥物組合物。
54.中和需要的受治療者人C5a類似物的活性的方法，所述人C5a類似物是基本上不具有激動劑活性的受體拮抗劑，包括步驟給受治療者施用權(quán)利要求46的藥物組合物。
55.在受治療者體內(nèi)測定人C5a類似物的定性或定量試驗，所述人C5a類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑，包括步驟由受治療者體內(nèi)采集組織或體液樣品，和在足以使抗體和類似物之間生成可檢測免疫復(fù)合物的條件下，使樣品與權(quán)利要求31的抗體接觸，其中該免疫復(fù)合物的生成指征受治療者體內(nèi)該類似物的存在。
56.權(quán)利要求55的測定方法，進(jìn)一步包括受治療者體內(nèi)類似物的定量步驟。
57.一種制備生物活性C5a類似物或其衍生物的方法，其中所述類似物是基本上不具有激動劑活性的C5a受體拮抗劑，包括步驟在適于引起DNA分子表達(dá)的條件下，培養(yǎng)用編碼C5a類似物的DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞；使這樣培養(yǎng)的細(xì)胞與變性和增溶劑接觸制備變性形式的C5a類似物；和在合適的條件下，將這樣變性的C5a類似物與含有還原劑和氧化劑的溶液混合，以制備生物活性形式的C5a類似物，還原劑對氧化劑重量摩爾比至少是大約100∶1。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述混合是在pH約6.5至約7.5時進(jìn)行的。
59.權(quán)利要求57的方法，其中混合進(jìn)行的時間是大約1/2小時至大約4小時。
60.權(quán)利要求57的方法，其中氧化還原對是還原的谷胱苷肽/氧化的谷胱苷肽。
61.權(quán)利要求57的方法，其中大腸桿菌細(xì)胞被編碼C5a類似物衍生物C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)的DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
62.權(quán)利要求57的方法，其中大腸桿菌細(xì)胞被編碼C5a類似物衍生物C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)的DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
63.權(quán)利要求57的方法，其中還原劑/氧化劑摩爾比為至少大約100∶1至大約500∶1。
全文摘要
公開了人C5a的多肽類似物，它是基本上不具有過敏毒素或激動劑活性的C5a受體拮抗劑，以及該類似物的衍生物，該類似物或衍生物的二聚物形式。也提供了編碼多肽的DNA分子和制備類似物的方法。含有C5a類似物的藥物制劑在治療學(xué)上用于治療哺乳動物C5a介導(dǎo)疾病或炎癥，并且預(yù)防學(xué)上用來防止或減輕由分別引起炎癥或惡化已存在炎癥的癥狀引起的炎癥。并進(jìn)一步公開了C5a類似物，其衍生物，其類似物和衍生物的二聚物的特異性抗體，該抗體基本上不具有與人C5a交叉反應(yīng)的活性。該抗體被用來檢測或定量循環(huán)C5a類似物或衍生物，以及調(diào)整，例如中和體內(nèi)C5a受體拮抗劑活性。
文檔編號A61P9/10GK1142854SQ94194914
公開日1997年2月12日 申請日期1994年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月6日
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