專利名稱：對肺炎衣原體具有特異反應性的單克隆抗體及其制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對肺炎衣原體具有特異反應性的單克隆抗體，制造此單克隆抗體的方法，產(chǎn)生這種抗體的細胞，制造該細胞的方法，檢查和/或測定肺炎衣原體的方法，該方法所用試劑，診斷肺炎衣原體感染的方法和試劑。本發(fā)明能夠被有效地用于制藥工業(yè)，特別是用于制造用以診斷肺炎衣原體感染的試劑。
已知有四種衣原體，它們是結膜炎衣原體，肺炎衣原體，鸚鵡衣原體，和眼結膜衣原體。據(jù)信肺炎衣原體會引起呼吸道感染，非典型肺炎等等。
由于肺炎衣原體引起的呼吸器官感染的癥狀與肺炎支原體或流感病毒引起的感染的癥狀相似，醫(yī)師經(jīng)常對此作出錯誤的判斷。所以，就需要開發(fā)一種診斷肺炎衣原體引起的感染的簡單方法。
一般，通過檢測感染部位的病原細胞或者通過檢測體液，如血清等中的該病原細胞的抗體，就能可靠地診斷出感染。前一種方法被稱為抗原試驗，而后者被稱為抗體試驗。二者在臨床上都很重要。
抗原試驗包括間接熒光抗體技術和直接熒光抗體技術，在間接熒光抗體技術中，被檢測的抗原的抗體被加入到試樣中，然后加入另一種被熒光劑和類似物作為標記的抗體以測定試樣中有無該抗原，在直接熒光抗體技術中，不用另一種熒光抗體，而是將預先被熒光劑和類似物作了標記的待檢的抗原的抗體加入到試樣中，從而測定試樣中有無抗原。
作為肺炎衣原體的抗原，已知有脂多糖(LPSs)和蛋白質。LPSs對衣原體屬具有普遍的抗原性。作為蛋白質抗原，39.5KDa，60KDa，75KDa，98KDa蛋白質及其類似物是已知的。39.5KDa蛋白被稱為主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein)(下文略為″MOMP″)。
作為對衣原體屬有特異性的抗原，GLXA(一種特異性糖脂抗原屬)，脂多糖(LPSs)，MOMP及其類似物是已知的。Elizabeth S.Stuart等人報道了抗衣原體屬的GLXA的單克隆抗體(CurrentMicrobiology，28，85-90(1994))。Harland D.Caldwell等人報道了抗衣原體屬的LPs的單克隆抗體(Infection and Immunity，44(2)，306-314(1984))。他們通過直接熒光抗體技術，用單克隆抗體給肺衣原體的包含體染色。Ellena M.Peterson等人(Infectionand Immunity，59(11)，4147-4153(1991)和Byron E.Batteiger等人(Infection and Immunity，53(3)，530-533(1986))報道了抗衣原體屬的MOMP的單克隆抗體。
從Richard S.Stephens等人(J.Immunology，128(3)，1083-1089(1982))的報道開始，已發(fā)表了許多有關抗結膜炎衣原體的單克隆抗體。H.Puy等人報道了抗鸚鵡衣原體的單克隆抗體，其中包括在間接熒光抗體試驗中對鸚鵡衣原體和肺炎衣原體具有同樣反應性的單克隆抗體(Immunology Letters，23，217-222(1989/1990)。但是，尚無單克隆抗體識別出的抗原的描述。Kuroda等人報道了抗眼結膜衣原體的單克隆抗體(Am.J.Vet.Res，54(5)，709-712(1993))。
在一般的用初級體或肺炎衣原體的MOMP的免疫接種中，很難獲得能夠產(chǎn)生與MOMP中抗原性低的抗原位點有特異性反應的單克隆抗體的細胞。無論是與MOMP的低抗原位點有特異反應的單克隆抗體，還是產(chǎn)生這種抗體的細胞，目前都未得到。
Iijima等人報道了作為抗肺炎衣原體的單克隆抗體的53 KDa蛋白的單克隆抗體(Y.Iijima，J.clinical Microbiology，32(3)，583-588(1994)。
Cho-chou Kuo等人報道了在間接熒光抗體技術中，肺炎衣原體的包含體能被肺炎衣原體有特異性的單克隆抗體(RR402)染色(J.Clinical Microbiology，24(6)，1034-1037(1986)及日本未審查專利申請昭64-500083號)。但是，沒有被單克隆抗體識別的抗原的描述。
Izutsu等人報道了與肺炎衣原體反應的單克隆抗體(日本未審查專利申請平7-16098號)。他們揭示出通過間接熒光抗體技術，用單克隆抗體能使包含體染色。
Harland，D，Caldwell等人報道的抗LPS單克隆抗體具有對除肺炎衣原體之外的衣原體屬種類的反應性，故難以用這種單克隆抗體專門檢測肺炎衣原體。
Ellena M，Peterson等人和Byron E.Batteiger等人報道的抗MOMP的單克隆抗體具有對除肺炎衣原體之外的衣原體屬種類的反應性，故難以用這些單克隆抗體專門檢測肺炎衣原體。另外，它們未被標記。
尚不清楚Iijima等人報道的抗體是否能專門檢測肺炎衣原體。并且，尚無肺炎衣原體的包含體能被該單克隆抗體染色的報道。
Cho-chou等人和Izutsu所用的間接熒光抗體支術的方法需要長時間進行抗原試驗，因此，對臨床檢查中短時間處理大量試樣來說是不適宜的。
本發(fā)明的一個目的是提供對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應性的單克隆抗體。這些單克隆抗體能用來專門檢測肺炎衣原體，并能在臨床檢查中短時間處理大量試樣。
本發(fā)明的主題是以下物質(1)一種對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異反應性的單克隆抗體。
(2)如(1)所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應性。
(3)如(1)所述的單克隆抗體，其對肺炎衣原體的初級體具有反應性。
(4)如(3)所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應性。
(5)如(1)所述的單克隆抗體，其中的抗體是被標記的。
(6)如(1)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的。
(7)如(6)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(8)一種單克隆抗體，對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應性且是被標記的。
(9)如(8)所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具有反應性。
(10)如(8)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(11)一種產(chǎn)生對蛋白具有特異反應性的單克隆抗體的產(chǎn)生抗體細胞的制備方法，該方法包括給動物免疫接種天然和變性蛋白的一種，并用其他蛋白加強劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細胞，并用骨髓瘤細胞融合該產(chǎn)生抗體的細胞。
(12)如(11)所述的方法，包括給動物免疫接種一種天然蛋白并用一種變性蛋白加強劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細胞，并用骨髓瘤細胞融合該產(chǎn)生抗體的細胞。
(13)如(11)所述的方法，其中的變性蛋白是用去污劑或還原劑處理天然蛋白得到的。
(14)如(11)所述的方法，其中的蛋白是衣原體的主要外膜蛋白。
(15)如(11)所述的方法所制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
(16)一種產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，該細胞能產(chǎn)生如(1)所述的單克隆抗體。
(17)如(16)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
(18)一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如(15)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
(19)一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如(16)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
(20)用如(1)所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
(21)如(20)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(22)用如(8)所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
(23)如(22)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(24)一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如(1)所述的單克隆抗體。
(25)如(24)所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(26)一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如(8)所述的單克隆抗體。
(27)如(26)所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(28)一種用如(1)所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
(29)如(28)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(30)一種用如(8)所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
(31)如(30)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(32)一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如(1)所述的單克隆抗體作為活性成分。
(33)如(32)所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
(34)一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如(8)所述的單克隆抗體作為活性成分。
(35)如(34)所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
優(yōu)選的對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應性的單克隆抗體包括，對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應而對結膜炎衣原體的MOMP不具反應性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應并對肺炎衣原體的初級體具有反應性的單克隆抗體。較優(yōu)選的是對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應而對結膜炎衣原體的MOMP不具反應性且對肺炎衣原體的初級體有反應性的單克隆抗體。
對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應性的單克隆抗體的具體例子包括，雜交瘤細胞系CP-6產(chǎn)生的單克隆抗體，雜交瘤細胞系CP-11中產(chǎn)生的單克隆抗體及類似物。雜交瘤細胞系CP-6和CP-11已按布佩斯條約的條款在the National Institute of Bioscience andHuman-Technology，the Agency of Industrial Science andTechology(1-3，Higashi lchome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，Japan)以FERM BP5-5155和FERM BP-5156保藏。
優(yōu)選的對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應性的單克隆抗體是那些對結膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具反應性的單克隆抗體。
對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應性的單克隆抗體的具體例子包括，雜交瘤細胞系AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體及類似物。雜交瘤細胞系AY6E2E8已按布達佩斯條約的條款在the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，the Agencyof Industrial Science and Technology以FERM BP-5154保藏。
本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生對蛋白具有特異反應性的單克隆抗體的產(chǎn)生細胞的制備方法，其中包括給動物免疫接種天然蛋白和變性蛋白的一種，用其他蛋白加強劑量，得到產(chǎn)生抗體的細胞，用骨髓瘤細胞融合該產(chǎn)生抗體的細胞。
本發(fā)明的制備產(chǎn)生抗體細胞的方法特征是，給動物免疫接種，除此它還能夠按通常的步驟包括給動物免疫接種，細胞融合，融合的細胞的篩選，產(chǎn)生特異性抗體的細胞的篩選，克隆等等來完成。
本發(fā)明方法所用的蛋白包括衣原體，特別是肺炎衣原休屬，細菌，病毒的MOMP，動物，包括人以及植物所衍生的各種蛋白及類似物。
天然蛋白被定義為保持原始空間結構的蛋白質，包括衣原體，細菌，病毒有機體本身，例如，衣原體的EB，以及蛋白質的部分和完全提純物。天然蛋白被用作免疫接種的抗原。肺炎衣原體的各種菌株衍生的抗原能用作特蛋白抗原。例如，能夠使用YK-41菌標的和EBS和TWAR。
變性的蛋白被定義為以下條件下的蛋白質，其在生理溶液中的原始空間結構已被某種處理所破壞，以及以下條件下的蛋白質，其雙硫鍵(S-S鍵)也已斷開，且優(yōu)選其氨基酸序列被識別為抗原位點。變性蛋白也可用作免疫接種的抗原。由于免疫接種變性蛋白充分地加強了產(chǎn)生變性蛋白中抗低抗原性位點的抗體的細胞，故即使在只免疫接種天然蛋白難以得到產(chǎn)生抗天然蛋白的單克隆抗體的細胞的情況下，也能容易地得到產(chǎn)生抗體細胞。
在用天然蛋白或變性蛋白作免疫接種的抗原時，只誘發(fā)形成蛋白中抗高原性位點的抗體，而難以有效地誘發(fā)形成抗低抗原性位點的抗體。
用作免疫接種抗原的肺炎衣原體的MOMP和EB可以通過例如下文實施例描述的方法從YK-41菌株中制得。
使蛋白質變性的方法包括但不限于以下方法，用還原劑或洗滌劑處理，熱處理，用有機溶劑處理等。優(yōu)選用還原劑或洗滌劑處理的方法。還原劑包括但不限于2-巰基乙醇。洗滌劑包括但不限于SDS(十二烷基苯磺酸鈉)。
被免疫接種的哺乳動物包括小鼠，鼠，兔子，羊，雞等。小鼠是特別優(yōu)選的。
哺乳動物用天然蛋白和變性蛋白的一種免疫接種并用其他蛋白作最后接種，優(yōu)選用天然蛋白免疫接種并用變性蛋白最后免疫接種。在肺炎衣原體的情況下，建議用肺炎衣原體的EB或天然MOMP給哺乳動物免疫接種再用變性蛋白，例如已被洗滌劑或還原劑處理變性的MOMP進行最后免疫接種。
另外，在免疫接種中優(yōu)選使用一種輔助劑。輔助劑的優(yōu)選例子包括弗氏完全佐劑(下文略為″FCA″)，弗氏不完全佐劑(下文略為″FIA″)及類似物。
免疫接種一般可通過1-5或更多次的注射完成?？乖淖⑸淞恳话憧蔀槊恐徊溉閯游?ng-10mg，并能隨抗原的不同而改變。
最后免疫接種一般可通過1-5或更多次的注射完成?？乖淖⑸淞恳话憧蔀槊恐徊溉閯游?ng-10mg，并能隨抗原的不同而改變。通常，用于最后免疫接種的抗原量為免疫接種中所用量的1/100至1/10。
經(jīng)上述方法足量的免疫接種后，從被免疫接種的哺乳動物中分離出脾細胞，B淋巴細胞或類似物作為能產(chǎn)生抗體的母體細胞。
一般可用骨髓瘤細胞作為制備雜交瘤細胞系的其他母體細胞。例如，可以使用小鼠的P3U1，NS-1，653，SP2，X63，MPC-11及類似物，鼠的AG1，AG2，AG3，RCY3，210及類似物，人的SKO-007及類似物。優(yōu)選的是小鼠的細胞，特別優(yōu)選P3U1，653及類似物。
細胞融合可用聚乙二醇法，Sendai病毒法，電融合法等等。優(yōu)選用聚乙二醇的方法。
雜交瘤細胞的篩選可通過在只能使感興趣的雜交瘤細胞生長的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)來進行。例如，HAT(次黃嘌呤氨蝶呤胸苷)培養(yǎng)基，HAz(次黃嘌呤重氮絲氨酸)培養(yǎng)基等是優(yōu)選的培養(yǎng)基。
篩選產(chǎn)生特異性抗體的細胞，是通過回收井中的上清液，該井中的培養(yǎng)基中生長了所需的雜交瘤細胞，再用所需蛋白(如肺炎衣原體的EB或MOMP)檢查是否存在有由酶抗體技術或免疫印跡技術形成的抗體來完成。
克隆被定義為以一個克隆衍生的一細胞群的形式獲得產(chǎn)生特異性抗體的細胞的過程。克隆可通過有限稀釋培養(yǎng)法，把菌落置于軟瓊脂上的方法，單細胞處理法，F(xiàn)ACS法等方法進行。有限稀釋培養(yǎng)方法較簡單，故是優(yōu)選的。
產(chǎn)生單克隆抗體的細胞可用上述方法獲得。
通過本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞包括雜交瘤細胞系CP-6和CP-11。
用所述方法獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞可在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生單克隆抗體。或者，通過給小鼠等注射得到的雜交瘤細胞系，再收集腹水得到單克隆抗體。
培養(yǎng)基包括，補以胎兒腓腸血清的改善Eagle培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)，Dulbecco的改善Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)，RPM11640培養(yǎng)基等等。
從培養(yǎng)液的上層清液中回收單克隆抗體可通過用蛋白A柱，蛋白G柱等的親和色譜法，離子交換色譜法，聚乙二醇分餾法，乙醇分餾法，硫酸銨分餾法及類似的方法進行。優(yōu)選的是親和色譜法，更優(yōu)選的是使用蛋白A柱。
對所得的單克隆抗體可測定其對所需的蛋白的特異反應性。例如，用Western印跡法篩選與所需蛋白有特異性反應的單克隆抗體，該法中使用了經(jīng)適當溶劑處理和電泳處理的有機物。更具體地，可測定單克隆抗體對肺炎衣原體的MOMP或EB的特異反應性，和/或與53KDa抗原蛋白的反應性。對肺炎衣原體的MOMP的特異反應性可被定量測定，方法是用Western印跡法測定與分子量約39.5KDa的MOMP帶有特異反應性的抗體的存在，該法中使用用適宜溶液處理和電泳處理的肺炎衣原本的EB。可以相信被定量測定為對肺炎衣原體的MOMP有特異反應性的單克隆抗體識別了作為抗原表位的肺炎衣原體的MOMP氨基酸序列。
研究與單克隆抗體反應的抗原蛋白是這樣進行的用λgtll及類似物制備肺炎衣原體的cDNA庫，表達cDNA來得到肽，令單克隆抗體與所得到的肽反應，分析與單克隆抗體特異反應的cDNA的密碼子，該密碼子插入λ噬菌體。
本發(fā)明制備單克隆抗體的方法能夠制備任何類型(球蛋白類型)的抗體?？梢允褂脝慰寺】贵w的片段和有單克隆抗體片段的分子。
本發(fā)明方法制備的單克隆抗體能將蛋白中低抗原性位點識別為抗原表位，這在以前是難以做到的。更特別的是，它們能識別作為抗原表位的蛋白質平面結構或氨基酸序列。
對肺炎衣原體的MOMP有特異反應性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應性的單克隆抗體可以通過以下方法得到，例如，培養(yǎng)本發(fā)明方法制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞(雜交瘤細胞系)，收集培養(yǎng)物上層清液，然后用上述方法提純。在本方法中為了制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞所用的免疫接種可用已知技術完成。
優(yōu)選地，本發(fā)明所得的單克隆抗體基本不與衣原本屬的其他種類，如結膜炎衣原體，和鸚鵡衣原體反應。特別是，更優(yōu)選基本不與衣原體屬其他所有種類的MOMP而僅與肺炎衣原體的MOMP反應的單克隆抗體，和與肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有特異性反應的單克隆抗體，因為它們能用于診斷肺炎衣原體特異性疾病種類。
如果單克隆抗體在直接或間接熒光技術中與肺炎衣原本之外的種類反應，但嚴格地說只具低的反應性，它們能從呈高反應性的那些中被識別出來，故能實用于診斷中。這種單克隆抗體也是有用的。單克隆抗體不應與經(jīng)常分離的結膜炎衣原體發(fā)生交叉反應是很重要的，但它們是否與不經(jīng)常分離的鸚鵡衣原體和眼結膜衣原體發(fā)生交叉反應并不是那么重要。如果單克隆抗體在直接或間接熒光技術中與肺炎衣原體高度反應但只與其他種類(如鸚鵡衣原體)微弱反應，而與其他種類(如結膜炎衣原體和眼結膜衣原體)根據(jù)不反應，它們就能用于確定哪個種類的衣原體引起的疾病，故它們是優(yōu)選的。
本發(fā)明的單克隆抗體包括任何類型(球蛋白類型)的抗體。還包括單克隆抗體的片段(Fab，fab′，fab′2等)和有單克隆抗體的片段的分子。
對肺炎衣原體的MOMP有特異反應性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應性的單克隆抗體可以被標記。
給單克隆抗體作標記可以是在單克隆抗體上結合一種標記試劑，如各種染料，膠體，酶等。
染料包括熒光染料，如FITC(熒光素5-異硫氫酸鹽)，若丹明，熒光素等。FITC以其適用性和易得性而成為優(yōu)選。FITC可由SigmaCo.，Ltd購得。
膠體包括金膠體等等。
酶包括過氧化物酶，堿性磷酸酶，熒光素酶，β-半乳糖苷酶等等。
給單克隆抗體結合上標記可用任何已有技術，如″EXPERIMENTALIMMUNOLOGY″中所述的方法，Ivan Lefkovits等人編，NishimuraShoten，(1985)。
另外，在單克隆抗體和標記試劑之間可以插入化學物質，如生物素，抗生物蛋白，鏈抗生物素蛋白，digoxygenin等等。
由于FITC結合在抗體的賴氨酸殘基上，結果是用FITC標記使某些抗體失去其抗原結合活性。
用例如直接或間接標記之后的本發(fā)明單克隆抗體能檢測和/或測定肺炎衣原體。用上述方法可直接給本發(fā)明單克隆抗體作標記。用已被標記試劑(已標記的另一種抗體)標記的、能識別并與單克隆抗體結合的抗原能給本發(fā)明單克隆抗體間接標記。該另一種抗體包括兔子抗一小鼠免疫球蛋白抗體等等。在標記試劑是熒光感染的情況下，用紫外線照射它并檢測和/或測定所發(fā)生的熒光。當標記試劑是酶時，加入底物檢測和/或測定由酶的催化反應產(chǎn)生的發(fā)色和顏色增強。如果需要，在兩種情況下均可使用敏化劑。
檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑包括未標記的或標記的本發(fā)明單克隆抗體本身及其混合物，至少包括以下成分的一種。
(1)、抑制非特異性免疫反應的物質(如，牛的血清清蛋白)(2)、用作標記試劑的酶的底物(3)、敏化劑(4)、控制抗原(肺炎衣原本的MOMP，53KDa抗原蛋白)(5)、作了標記的另一種抗體這些成分無論單獨使用或兩種或多種混合使用，優(yōu)選制成凍干制品以便于臨床應用。
檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑能直接用作診斷肺炎衣原體感染的試劑。
本發(fā)明的單克隆抗體能用于診斷肺炎衣原體感染。肺炎衣原體感染能用檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑或診斷肺炎衣原體感染的試劑來診斷。在試用這些試劑和診斷試劑的試驗中，當試樣呈現(xiàn)陽性時就證實肺炎衣原體感染的發(fā)生。
優(yōu)選使用本發(fā)明單克隆抗體的混合物，由于抗原的量隨試樣不同，故它能識別不同的抗原。
可以混合單克隆抗體的例子包括對肺炎衣原體的MOMP有反應性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應性的單克隆抗體。
另外，本發(fā)明單克隆抗體可以與其他單克隆抗體或多種隆抗體混合。
本發(fā)明單克隆抗體和本發(fā)明方法制得的那些抗體可以用在檢測所需蛋白的方法中，特別是使用免疫反應，如放射免疫測定法，酶免疫測定法等的方法中。它們也能用作科學研究中診斷試劑的成分。如果需要，它們能直接或以嵌合劑或飲劑或抗體的形式用在藥物制劑中。
另外，本發(fā)明單克隆抗體和本發(fā)明方法制備的那些抗體能用在診斷工具箱中，它們在其中通過聚合酶鏈反應結合起來。
本發(fā)明產(chǎn)生抗體的細胞還能用作抗體基團的來源?？贵w基團能表現(xiàn)在各種細胞中。
以上描述是本發(fā)明的概括說明。參考以下具體實施例可對本發(fā)明有更完全的理解，這些例子在此只用于說明之目的，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1制備對肺炎衣原體(1)的MOMP有特異性的單克隆抗體1.1制備肺炎衣原體的EB為了制備肺炎衣原本的EB，使用YK-41菌株。根據(jù)Kishimoto等人的方法[KENSA TO GIFUTU(試驗和技術)18(7)，959-964(1990)]用YK-41菌株感染人的肺細胞(下文稱為″HL細胞″)。在24-或6-井佩特里細菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的感染細胞被刮出并和培養(yǎng)基一起回收，然后以6000rpm離心分離30分鐘。去掉上層清液后，沉淀物被懸浮在蔗糖，磷酸鹽和谷氨酸的混合溶液中[含7.5(w/v)蔗糖，3.8mMKH2PO4，7mM K2HPO4和5mM谷氨酸，(PH7.4)，下文稱為″SPG″]。用均質機破碎懸浮物然后以2500rpm離心分離10分鐘。去掉上層清液，沉淀物懸浮于SPG中。重復這些過程5次，然后回收上層清液?；厥盏纳蠈忧逡号c23％(v/v)的Urografin(Nihon Schering K.K.)和50％(w/v)的蔗糖按上層清液Urografin蔗糖＝2∶2∶1的體積比混合，然后以8000rpm離心分離1小時。去掉上層清液后，回收下層[50％(w/v)蔗糖層]并懸浮于SPG中，洗滌后以10000rpm離心分離30分鐘。吸走上層清液，沉淀物懸浮于SPG中，以1∶4的體積比與密度梯度為26.6-38％(v/v)的Urografin混合，以8,000rpm離心分離1小時，回收中間層并懸浮于SPG。以10000rpm離心分離30分鐘后，吸去上層清液，沉淀物懸浮于適宜量的SPG中，于是得到EB溶液。分配后，該溶液存儲于4℃或-70℃。
1.2制備肺炎衣原體的MOMP用盤式制備電泳分離和提純上文1.1所得的EB溶液，由此得到肺炎衣原體的MOMP。簡要地說，0.5ml所得的EB溶液[蛋白(EB)濃度727μg/ml]與0.5ml 2X試樣緩沖液
混合，在100℃煮沸3分鐘以使蛋白質溶解。然后，將全部體積加入到盤式凝膠(基層凝膠4％；分離凝膠10％)中，進行電泳[設備盤式預備電泳設備NA-1800 Nippon Eido K.K.制造；操作條件100V(直流電壓)]并于一定體積回收(0.26ml/部分)。對于每部分進行SDS平板電泳(設備DNA-PAGE電泳設備NB-5000，Nippon Eido K.K.制造；操作條件100V(直流電壓)]。結果證明分子量為39.5K的MOMP在第33至45部分被回收(蛋白濃度0.21mg/ml)。
1.3制備雜交瘤細胞系和單克隆抗體上述過程得到的EB的生理鹽水(0.5ml)與0.6mlFCA(Difco)混合。用近距離聲波定位器(Branson)處理所得混合物得到油包水乳化物，用它作為免疫接種的抗原。用五只8周的BALB/c雌性小鼠，每只腹膜內(nèi)給藥200μl此抗原(一劑中EB的量為10μg/小鼠)。給藥6天和12天后，用FIA(Difco)進行免疫接種。此免疫接種后6天后給動物放血。用點免疫束測定法(dot immuno binding assay)(下文簡稱為″DIBA″)測定每份得到的血清漿液的抗體效價。自測定抗體效價那天開始對呈現(xiàn)最高抗體效價的動物進行三天最后免疫接種，自尾部靜脈給藥200μl由上述方法得到的提純MOMP(一劑中的MOMP的量1μg/小鼠)。三天最后免疫接種完成后次日將每只小鼠頸脫位處死并取出脾。然后將單細胞分散從而制得用于細胞融合的脾細胞。細胞融合的匹配細胞是P3U1小鼠骨髓瘤細胞，它是在CO2細胞培養(yǎng)器(Napco)中，37℃，5％CO2及飽和濕度下，在補以10％(v/v)牛胎兒血清的Dulbecco MEM培養(yǎng)基(下文述為″10F培養(yǎng)基″)里預告培養(yǎng)的。
上述脾細胞(4.8×107)和P3U1小鼠骨髓瘤細胞(1.2×107)混合，以1000rpm離心分離10分鐘。然后吸走上層清液。施以輕微的振動，0.2ml細胞融合加速劑[50％(W/V)聚乙二醇；分子量4000；Merck制造)使細胞粒松散。1分鐘45秒后，用1分鐘加入10ml培養(yǎng)液。再加入20ml培養(yǎng)液以使細胞懸浮。然后，將分散液離心分離和逐級分離(300rpm3分鐘，500rpm3分鐘，700rpm3分鐘)。吸走上層清液后，向細胞粒中加入5％Briclone(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)(下文稱為″10F＋Bri培養(yǎng)基″)以制備細胞分散液。此細胞分散液分散在96-井平底多層盤中(Corning)得到細胞密度為4×104骨髓瘤細胞/井/0.1ml，然后在37℃，5％CO2和飽和濕度下恒溫培養(yǎng)。
次日，含HAT的10F培養(yǎng)基(補以1×10-4M次黃嘌呤，4×10-7M氨蝶呤，1.6×10-5胸苷和10％(v/v)牛胎兒血清的Dulbecco′s MEM培養(yǎng)基；下文稱為″HAT培養(yǎng)基″)按體積為0.1ml/井加入到井中。此外，每3至4天用HAT培養(yǎng)基替換一半的培養(yǎng)液上層清液；如此，稱為HAT篩選的過程進行約2星期。能觀察到雜交瘤細胞系生長的井中上層清液被收集和用DIBA篩選，制備抗EB的抗體。
用96-井u形底多層盤進行DIBA(Corning)。預先將作為抗原的EB以0.02μg/點的量固定于3mm方膜過濾器上(Advantec；47mm直徑格濾器；Cat.No.A045b047A)，向該過濾器加入10％(v/v)FCS(胎兒腓腸血清)，在室溫下反應15分鐘。然后，去掉上層清液，加入100μl的雜交細胞系培養(yǎng)上層清液，在室溫下反應1小時。去掉上層清液，加入100μl稀釋500倍的過氧化物酶標記的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗體(Cappel Inc.)，室溫下反應1小時。最后，加入4-氯-1-萘酚作為底物使反應溶液上色。在固定有抗原膜過濾器上能裸眼觀察到顏色出現(xiàn)的井被斷定為在抗體制備中呈陽性。
在上述篩選得到結論呈抗體制備陽性的那些井中的雜交瘤細胞系，通過有限稀釋培養(yǎng)法次克隆。簡單地說，抗體制備陽性雜交瘤細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，測定懸浮液的細胞密度。然后將懸浮液稀釋，分散在一個新小盤上，細胞密度為從2至100個細胞/100μl/井，恒溫培養(yǎng)。使用HT＋5％Briclone培養(yǎng)作稀釋劑。
當觀察到高倍稀釋的井中有雜交瘤細胞的生長時，檢測雜瘤細胞產(chǎn)生抗體的能力，并顯微觀察來證實其是單克隆，然后重復同樣的操作過程以制備產(chǎn)生抗EB的單克隆抗體的克隆，其具有很高的能力來維持抗體的產(chǎn)生。對每個如此獲得的克隆，培養(yǎng)規(guī)模逐漸加大。最后，每個克隆培養(yǎng)在50ml 10F培養(yǎng)基中，并檢查培養(yǎng)物上層清液產(chǎn)生抗體的特性。
到此所述的試驗規(guī)程進行了兩遍，最后得到表1所示的10支產(chǎn)生單克隆抗體的克隆菌株。
由上述10支雜交瘤細胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體的球蛋白類采用ISOTYPE-Ab-STAT-1成套用具(Kit)(Sang Stat Medical)進行測定。
如表1所示，單克隆抗體CP-1，CP-2，CP-4，CP-5，CP-6，CP-7和CP-8對結膜炎衣原體不呈現(xiàn)反應性，但對肺炎衣原體呈現(xiàn)反應性。
下一步，將由10F培養(yǎng)基培養(yǎng)每個產(chǎn)生如表1所示單克隆抗體的雜交瘤克隆而獲得的繁殖細胞以1×107個細胞/小鼠的量給預先經(jīng)0.5ml Pristan(Wako Purechemical Co.，Ltd.)處理過的BALB/C小鼠由腹腔接種。接種后兩至三周，從每只小鼠體內(nèi)得到腹水，從其中提純得到本發(fā)明的單克隆抗體。
用下述方法提純接種雜交瘤克隆No.6所得到腹水，其中使用了固定化蛋白A的親合柱。簡單的說，向小鼠腹水中加入等量的1.5M甘氨酸和3M NaCl(PH8.9)的混合物。所得混合物通過0.45μm的尼龍過濾器(Corning)，送入蛋白A-Poros(NGK Insulators Ltd.)親合柱，并用1.5M甘油和3M HaCl(PH8.9)的混合物洗滌。然后，用含150mMNaCl的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)將抗體洗脫。
用1M Tris-HCl緩沖液(PH9.0)中和之后，洗脫物被冷卻，用PBS滲析過夜。測定所回收的溶液在280nm的吸收率(用Model U-2000，Hitachi，Ltd)通過0.2μm乙酸纖維素過濾器(Corning)，于-80℃下貯存，從而制得提純抗體的溶液。
1.4單克隆抗體的特異性分析用免疫印跡法進行單克隆抗體的特異性分析。用上文1.1所述的方法制得的EB溶液(EB濃度727μg/ml，測定對肺炎衣原體的反應性，具體地說，將含50μg EB的EB溶液與試樣緩沖劑
以1∶1的體積比混合，煮沸10分鐘。然后，所得混合液進行電泳[設備AE-6560，Atto有限公司制造；凝膠Pagel 1020 DL；電泳緩沖劑0.025M Tris，0.192M甘油，0.1％(w/v)SDS，(PH8.3)；操作條件直流電流20mA，80分鐘]。用NA-1510(Nippon Eido K.K.)作為轉移設備，電泳脈體，兩層3mm厚的濾紙(Whatman)和硝化纖維膜(Bio Rad)浸在預浸漬在冰中的轉移緩沖劑
中15分鐘。在一個墊片上，放有濾紙，凝膠，硝化纖維膜和依此順序的濾紙，然后，將另一個墊片放在頂端，并將它們放在轉換設備中。該設備被放在冰中，于50V直流電壓下開啟2小時，將蛋白質轉移到硝化纖維膜上。用PBS(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)洗滌硝化纖維膜(每次2分鐘，共兩次，振搖)，然后用10％FCS/PBS終止(室溫下振搖30分鐘)，再用PBS(Nissui藥物有限公司)，洗滌硝化纖維膜(每次2分鐘，共三次，振搖)，并與每個表1所列的所有雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上層清液反應(室溫下振搖1小時)。用PBS(每次兩分鐘，共三次，振搖)洗滌之后，硝化纖維膜與稀釋500倍的過氧化物酶標記的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗體(Cappel Inc.)在室溫、振搖下反應1小時。用PBS(每次兩分鐘，共三次，振搖)洗滌硝化纖維膜，然后加入成色溶液(1ml的3mg/ml 4-氯-1-萘酚，5ml PBS，2μl過氧化氫水溶液)進行反應，直到蛋白帶出現(xiàn)。然后用蒸餾水洗滌膜數(shù)次終止反應。
在上述類似條件下進行免疫印跡法，用提純的結膜炎衣原體(菌株L2)的EB分析對結膜炎衣原體的反應性。
結果是，本發(fā)明的CP-6和CP-7兩個單元克隆抗體對結膜炎衣原體的MOMP不呈現(xiàn)反應性，而對肺炎衣原體的MOMP呈現(xiàn)反應性。
1.5 用熒光抗體技術分析抗體(對結膜炎衣原體，鸚鵡衣原體和眼結膜衣原體的反應性)結膜衣原體，鸚鵡衣原體和眼結膜衣原體的離析物分別點樣(1μl)于載玻片上，將每一種表1所示的所有雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上層清液置于其上(8μl)。然后，將載玻片放在濕箱子中，反應在其中于37℃進行3小時。用PBS和蒸餾水洗滌載玻片，然后空氣干燥?？諝飧稍锖髮?μl稀釋10倍的FITC標記的抗小鼠球蛋白/山羊血清(KPL Inc.)放在載玻片上蓋住所有斑點。將載玻片放在濕箱子中，反應于37℃下進行30分鐘。然后洗滌載玻片并空氣干燥。加入100μl包埋溶液(50％甘油-PBS)以形成包含體，用熒光顯微鏡檢測。結果，本發(fā)明的CP-6和CP-7兩種單克隆抗體只在它們與肺炎衣原體在一起時有亮點，說明這些抗體與EB反應。
產(chǎn)生上述單克隆抗體CP一6的雜交瘤細胞以雜交瘤細胞和CP-6保藏在the National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technology保藏號(Accession No.)FERM P-14436；BP-5155)。
表1雜交瘤克隆號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10本發(fā)明單克隆抗體CP-1CP-2CP-3CP-4CP-5CP-6CP-7CP-8CP-9CP-10球蛋白類型 IgG2b IgG2b IGM IgG2b IgMIgG1IgG3IgM IgM IgM對肺炎衣原體的反應性*1 + + + + + + + + + +對結膜炎衣原體的反應性*2 - - + - - - - - + +*1用DIBA法測定對肺炎衣原體的反應性。
*2用DIBA法測定對結膜炎衣原體L2菌株的反應性。只有單克隆抗體CP-3，CP-9和CP-10被發(fā)現(xiàn)呈陽性。
實施例2制備對肺炎衣原體的MOMP有特異性的單克隆抗體(2)用與實施例1中1.1—1.3基本相同的方法獲得產(chǎn)生單克隆抗體的克隆(CP-11)的一支菌株，制備抗體CP-11的溶液。
用ISOTYPE Ab-STAT-1 kit(Sang Stat Medical)測定，結果發(fā)現(xiàn)雜交瘤細胞克隆CP-11產(chǎn)生的單克隆抗體的球蛋白類型是IgG1。
用與實施例1中1.4基本相同的方法分析雜交瘤細胞克隆CP-11產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性。此單克隆衣原體對結膜炎衣原體的MOMP不呈現(xiàn)反應性，對肺炎衣原體的MOMP呈現(xiàn)很強的反應性，對鸚鵡衣原體的MOMP只是呈現(xiàn)極弱的反應性。
另外，用與實施例1中1.5基本相同的方法，用間接熒光抗體技術分析此單克隆抗體。結果如表2所示。
表2反應性*肺炎衣原體+++鸚鵡衣原體±結膜炎衣原體 -眼結膜衣原體 -*極強反應性 +++強反應性 ++弱反應性+極弱反應性 ±未觀察到反應性 -如數(shù)據(jù)所示，根據(jù)用此單克隆抗體的間接熒光技術，強反應可斷定表示肺炎衣原體；極弱反應可斷定表示鸚鵡衣原體；不反應可斷定表示結膜炎衣原體或眼結膜衣原體。
產(chǎn)生此單克隆抗體的雜交瘤細胞以雜交瘤細胞系CP-11保藏在the Natioal Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technolgy(Accession No.FERM P-14592；Bp-5156)。
從以上結論可推斷此單克隆抗體能識別肺炎衣原體的MOMP暴露在EB膜外面的那部分氨基酸序列。
實施例3制備雜交瘤細胞系AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體。
用雜交瘤細胞系AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體作為單克隆抗體。雜交瘤細胞AY6E2E8保藏于the National Institute ofBioscience and Human-technology，Agency of IndnstrialScience and Technology(Accession No.FERM P-13688；BP-5154)。
給小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細胞系AY6E2E8得到含單克隆抗體的腹水，向1體積的該腹水中加入3體積PBS，混合，并于3000rpm離心分離10分鐘。用孔徑大小為0.22μm的過濾器濾出上層清液，通過高壓液相色譜法(HPLC法)用預先經(jīng)PBS平衡了的色譜超級蛋白A柱Chromatop Superprotein A Column)(4.6mm dia.×100mm，NGKInsulators，Ltd.)提純。
用0.22μm過濾器過濾后的試樣(1ml)被倒入該柱中，然后以1ml/min保持3分鐘和5ml/min保持4分鐘加入PBS進行洗滌。向此柱中以2ml/min的速率加入1升純水保持5分鐘，其水中溶解有8.77gNaCl，16.7g檸檬酸(一水合物)和14.72g Na2HPO4·12H2O，洗脫單克隆抗體。收集含有單克隆抗體的部分。向這些部分加入2M三(羥甲基)氨基甲烷的水溶液，將pH值調整至7-9。所得溶液在4℃下貯存。
實施例4與雜交瘤細胞系AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體反應的抗原蛋白分析4.1制備肺炎衣原體菌株YK-41的基因組的DNA由上述1.3所得提純的肺炎衣原體菌株YK-41的EB懸浮液(300μl)(蛋白濃度1.37mg/ml)在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。將沉淀物懸浮于500μl含有1mM EDTA的Tris-HCl緩沖液(PH8.0)中(下文稱為″TE緩沖液″)。再進行一次類似的離心分離，然后將沉淀物懸浮于300μl TE緩沖液中。向懸浮液中加入30μl 1％的SDS水溶液和30μl 1mg/ml的蛋白酶K水溶液，于56℃恒溫培養(yǎng)30分鐘，溶解EB。向所得溶液中加入350μ1 0.1M的Tris-HCl緩沖液(PH8.0)飽合酚，用渦流混合機充分混合。然后，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘，回收水層(DNA提取液)。重復這一提取過程。然后向回收水層中加入2μl 10mg/ml RNase溶液，于37℃恒溫培養(yǎng)2小時，從而分解RNA。向所得溶液中加入300μl 0.1M Tris-HCl緩沖液(PH8.0)飽和酚，氯仿和異戊醇按25∶24∶1(體積比)的混合液(下文稱為″PCI″)，用渦流混合機充分混合，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。然后回收所得水層。這一操作總共重復5次。
向所得溶液中加入1/10體積的10M醋酸銨水溶液和2體積的乙醇，沉淀DNA5分鐘，然后在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。對于沉淀過程，加入600μl 70％的乙醇水溶液，混合后在4℃下以12000rp離心分離5分鐘，重復此過程兩次。將離心管放置15分鐘，并打開蓋子以干燥沉淀物。將沉淀物溶解在200μl TE中，于-20℃貯存。
4.2制備基因組DNA庫向100μl所得的基因組DNA溶液中加入10μl限制酶的M-緩沖液和10μl限制酶的混合物(通過混合AccI，Hae III各0.4μl和用20μl ITE稀釋AluI的1/50稀釋液)，在37℃恒溫培養(yǎng)20分鐘。反應時間20分鐘是基因組DNA被分解成部分水解的、大小為1kbp-7kbp的DNA片段所需的時間。預先用少量的基因組DNA來測定反應時間。向上述反應溶液中加入100μl PCI，用渦流混合機充分混合，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘，然后回收水層。向此水層中加入3M醋酸鈉水溶液(10μl)和乙醇(220μl)，于-80℃下放置15分鐘，使部分水解的DNA沉淀。在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘之后，排掉上層清液。向沉淀物中加入500μl 70％的乙醇水溶液，混合后以12000rpm再次離心分離5分鐘。排掉上層清液，將沉淀物減壓干燥。
將上述得到的部分水解的DNA溶解在20μl純水中。向19μl此溶液中加入14μl下文描述的連接劑(20pmole/μl)，4.5μl 10mMATP，4.5μl含50mM MgCl2的0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，50mM二硫蘇糖醇和500μg/ml牛血清清蛋白(下文稱為″10X絡合化緩沖液″)，2μl純水和1μl T4連接酶，在16℃下恒溫培養(yǎng)4小時，從而使連接劑連在DNA上。
5′-AATTCGAACCCCTTCG-3′3′-GCTTGGGGAAGCp-5′將連上連接劑的部分水解的DNA送入Chroma Spin 6000柱，其中的流動相是含有0.1M NaCl和1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液。收集兩滴洗脫物。用0.8％瓊脂膠電泳分析每一個部分的位置，回收含1kbp-7kbp DNA片段部分。向如此得到的144μl部分中，加入13μl純水，20μl 10mM ATP，20μl含0.1M MgCl2的0.5M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，50mM二硫蘇糖醇，1mM亞精胺氫氯化物和1mM EDTA(下文稱為″10X磷酸化緩沖液″)和3μl多核苷酸激酶，于37℃下恒溫培養(yǎng)30分鐘，將DNA片段的5′末端磷酸化。向反應溶液中加入PCI(200μl)，振搖使混合充分，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。然后回收水層。向回收層中加入1μl 20mg/ml糖原水溶液，20μl 3M醋酸鈉水溶液和400μl乙醇，以沉淀核苷酸。所得溶液在4℃下以12000rpm離心分離10分鐘。向沉淀物中加入200μl乙醇，重新離心分離。排掉上層清液，將沉淀物空氣干燥，再溶解于1μl純水中。
向0.6μl如此得到的溶液中加入1μl預先用EcoRI水解了的入gtllDNA(1μg/μl，層基因)0.5μl 10X絡合化緩沖液，0.5μl10mM ATP，0.4μl T4連接酶和2μl純水，在4℃下恒溫培養(yǎng)過夜。用Gigapack II Gold Packaging Kit(層基因)，將所得λgtll DNA重組體包裹起來。
4.3克隆抗原多肽的DNA密碼大腸埃希桿菌(E.Coli)的Y 1090r菌株全環(huán)被培植在添加3ml10mM MgSO4，0.2％麥芽糖和50μg/ml α-氨基芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，(在1升水中含5g NaCl，10g多胨和5g酵母提取物)，于37℃，振搖下恒溫培養(yǎng)過夜，然后以2000rpm離心分離10分鐘。向沉淀物(E.coli)中加入9ml 10mM的MgSO4水溶液并混合。量出所得E.coli懸浮液的一部分(0.35ml)。向此懸浮液中加入0.1-10μl的λgtll(DNA庫)懸浮液，在37℃下恒溫培養(yǎng)20分鐘，用λgtll感染E.coli。向2.5ml預先在47℃放置的液體LB瓊脂培養(yǎng)基中加入上述λgtll感染的E.coli。立即從LB瓊脂培養(yǎng)基上將此培養(yǎng)基刮出。上層瓊脂培養(yǎng)基變硬后，細胞在42℃恒溫培養(yǎng)3-4小時。當觀察到斑塊，將在10mM IPTG水溶液中浸漬的硝化纖維過濾器(φ82mm)置于上層瓊脂培養(yǎng)基的上面，細胞進一步在37℃下恒溫培養(yǎng)12小時。用裝有黑墨水的注射器針頭貫穿，在硝化纖維過濾器上標上三個不對稱的點。然后從瓊脂培養(yǎng)基上移走硝化纖維，用含有150mM NaCl和0.1％Tween 20的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5，下文稱為″TTBS″緩沖液″)洗滌3次。將瓊脂培養(yǎng)基置于冷藏箱中。
硝化纖維過濾器被浸漬在含150mM NaCl并添加0.1％牛血清清蛋白的20mM Tris-HCl緩沖液中(pH7.5，下文稱為″TBS緩沖液″，在37℃下?lián)u動1小時完成中斷反應。然后用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維兩次，浸于5-10μg/ml對肺炎衣原體有特異性的單克隆抗體(AY6E2E8)的TTB溶液，在37℃下振搖1小時。用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維3次，然后在TTBS緩沖液中的過氧化物酶標記的(50ng/ml)抗一小鼠IgG抗體溶液中于37℃下振搖1小時。用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維3次，再用TBS緩沖液洗滌3次。然后將過濾層浸上成色溶液中(其制備是向100ml TBS緩沖液中加入60μl 30％的過氧化氫水溶液和20ml 0.3％的4-氯-1-萘酚甲醇溶液)，在室溫下放置約30分鐘。當?shù)玫阶銐虻念伾珪r，從溶液中將濾層回收出來，用純水洗滌并進行空氣干燥。
找出并辯認與硝化纖維上的色點對應的瓊脂培養(yǎng)基上的斑點。用Pasteur′s吸管貫穿在這些位置的瓊脂來回收斑塊。在含有0.1M NaCl，8mM硫酸鎂和0.01％明膠的50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5，下文稱為″SM緩沖液″)中滴入一滴氯仿后，把回收的斑塊放入其中；將混合物放置過夜，提取斑塊中的λ噬菌體。重復上述過程直到所有的斑塊變成與上述單克隆抗體可反應。于是，克隆了抗原多肽的DNA密碼。
結果是得到了能表達肺炎衣原體屬特異性的抗原多肽的λ噬菌體，該抗原多肽已與肺炎衣原體特異性單克隆抗體反應。
4.4培養(yǎng)得到的λ噬菌體，提純DNA用與上述4.3基本相同的方法制備斑塊。回收其中一個斑塊，放入100μl SM緩沖劑中，在4℃下放置過夜，提取λ噬菌體。預先將250μl E.coli菌件Y1090 r-在LB培養(yǎng)液中恒溫培養(yǎng)過夜，加入λ噬菌體溶液(5-10μl)，在37℃下放置20分鐘，從而用λ噬菌體感染E.coli。預先將含有10mM硫酸鎂的LB培養(yǎng)基加熱至37℃，把感染了的細胞放在其中培養(yǎng)，細胞于搖動下于37℃恒溫培養(yǎng)5-7小時，直到入噬菌體引起E.coli溶解。然后加入250μl氯仿，以3000rpm離心分離10分鐘以去掉E.coli細胞殘渣。于是得到λ噬菌體懸浮物。用WizardλPreps Kit(Promega)提純λ噬菌體DNA。
4.5放大肺炎衣原體抗原多肽的DNA密碼在600μl微管中，放入61.5μl純水，10μl 10X反應緩沖液(Tris-HCl緩沖液，pH8.3，含有500mM KCl，15mM MgCl2和0.01％明膠)，1μl 20mM dNTP，0.1μl得到的λ噬菌體DNA溶液，1μl 20nMλgtll正向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，1μl 20nMλgtll反向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和0.5μl AmpliTaq DNA聚合酶，然后將2-3滴礦物油在其頂端鋪成層。在以下條件下恒溫培養(yǎng)，94℃，30秒，55℃，30秒，73℃ 2分鐘，重復30次，從而放大DNA。反應完成后，對反應混合物進行低溫熔化瓊脂糖膠體電泳。將放大的DNA剪斷，用Wizard PCR Prep Kit(Promega)提純。
4.6分析DNA基礎序列通過熒光標記的終止劑循環(huán)序列方法，用Taq DNA聚合酶分析DNA基礎序列，用PCR放大的DNA作樣板，將反應產(chǎn)物供給Model373A DNA Sequencer(Applied Biosystems)。將所得的DNA基礎序列剪輯，結扎，用DNA序列軟件″DNASIS″(Hitachi SoftwareEngineering)測定它們的氨基酸翻譯區(qū)位。
結果是，發(fā)現(xiàn)所得的λ噬菌體DNA，是肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白的氨基酸序列的密碼。
由此可知雜交瘤細胞系AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體將肺炎衣原體的53隨爾頓抗原蛋白識別為抗原。
實施例5制備熒光標記的抗體按照前述Ivan Lefkovits等人的方法，用FITC分別給雜交瘤細胞系CP-11和AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體標記。
將FITC-Celite(Sigma，Cat，No.F1628)溶解在DMSO中，制備10mg/ml溶液。
另一方面，使用NAP-10柱，用0.1M NaHCO3緩沖液(pH8.2-8.6)代替溶有單克隆抗體的緩沖液。
向1.5ml得到的單克隆抗體溶液(單克隆抗體含量2mg)，加入50μl FITC溶液，在4℃下靜置8小時。
所得反應溶液通過PD-10柱，用PBS平衡。用PBS去掉未反應的FITC。于是得到FITC標記的單克隆抗體。
實施例6制備冷凍干燥制劑將1.9mg FITC標記的單克隆抗體，7.6mg Evans blue(WakoPurechemical Co.，Ltd.)，1.9g牛血清清蛋白(GIBCO BRL)和1.9ml 10％NaN3(Wako Purechemical Co.，Ltd.)溶解在PBS(-)(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)中至總體積為100ml。
所得溶液被分配在1ml小瓶中，在-80℃下放置1小時，然后在冷凍干燥器中(Iwaki & Co.，Ltd.)冷凍干燥過夜。如此得到冷凍干燥制劑(即CP-11制劑和AY6E2E8制劑)。
另一方面，用與上述類似的方法，用雜交瘤細胞系CP-11和AY6E2E8的FITC標記的單克隆抗體制備混合的冷凍干燥制劑。實施例7用直接熒光抗體技術給肺炎衣原體包含體染色將每一個由實施例6制備的冷凍干燥制劑溶解在2ml純水中。在點有肺炎衣原體菌株YK-41的載玻片上放上8μl所得溶液，使所有的點上部位全部被此溶液蓋住。然后，將載玻片放在濕箱子里，反應在其中于37℃下進行30分鐘。洗滌載玻片并空氣干燥。反應產(chǎn)物用100μl包埋溶液[50％(v/v)甘油-PBS]包埋，用熒光顯微鏡檢測。結果列于表3中。
表3制劑 染色強度*CP-11制劑 +AY6E2E8制劑 +混合制劑 ++*極強的反應性 ++強的反應性+-如表3所示，無論CP-11制劑還是AY6E2E8制劑均呈現(xiàn)強的反應性，使肺炎衣原體的檢測成為可能。與單一制劑相比，混合制劑呈現(xiàn)出極強的反應性，用該試劑能夠很好地檢測肺炎衣原體。
本發(fā)明的對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異性反應的單克隆抗體在特別檢測肺炎衣原體中非常有用，因為此單克隆抗體對微生物中大量含有的MOMP具有特異性反應。另外，用少量的此抗體即能完成檢測。
本發(fā)明的單克隆抗體的特征還在于它對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不呈現(xiàn)任何反應性，適于將肺炎衣原體感染與結膜炎衣原體感染區(qū)分開來，后者在臨床上經(jīng)常是單獨分開的。故，此抗體對準確診斷出肺炎衣原體感染非常有用。
此外，本發(fā)明的標記了的抗體使得能夠利用以此標記的物質檢測和測定肺炎衣原體。因此，這些抗體對臨床測試中快速處理大量試樣非常有用。
本發(fā)明的對肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白具有反應性、并作了標記的單克隆抗體對準確診斷肺炎衣原體感染很有用，因為此抗體能夠檢測出作為肺炎衣原體屬的特異性抗原的53K道爾頓抗原蛋白。
產(chǎn)生上述單克隆抗體的細胞系能用于連續(xù)、大量地制備這些抗體。這些細胞系也可用作抗體基因的來源。
本發(fā)明的用這些細胞系制備單克隆抗體的方法能夠用以連續(xù)和大量地制備上述的單克隆抗體。
本發(fā)明的檢測和測定肺炎衣原體的方法以及檢測和測定肺炎衣原體的試劑可用在非常精確地檢測和測定肺炎衣原體的方法中。
本發(fā)明的肺炎衣原體感染的診斷方法和肺炎衣原體感染的診斷試劑可用在非常精確地診斷肺炎衣原體的方法中。
根據(jù)本發(fā)明制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞系的方法，能夠制備有效產(chǎn)生抗那些蛋白的單克隆抗體的細胞系，而用常規(guī)的方法卻難以完成抗那些蛋白的單克隆抗體的制備。本發(fā)明產(chǎn)生抗體的細胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體能用于特別檢測目標蛋白的各種診斷方法和診斷試劑中，它們也可以用作藥物。
上述產(chǎn)生抗體的細胞系能用以連續(xù)和大量地產(chǎn)生這些單克隆抗體，還能用作抗體基因的來源。
用上述細胞系制備單克隆抗體的方法能用以連續(xù)和大量地制備上述單克隆抗體。
權利要求
1.一種對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異反應性的單克隆抗體。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應性。
3.如權利要求1所述的單克隆抗體，其對肺炎衣原體的初級體具有反應性。
4.如權利要求3所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應性。
5.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中的抗體是被標記的。
6.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的。
7.如權利要求6所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
8.一種單克隆抗體，對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應性且是被標記的。
9.如權利要求8所述的單克隆抗體，其對結膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具有反應性。
10.如權利要求8所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
11.一種產(chǎn)生對蛋白質具有特異反應性的單克隆抗體的產(chǎn)生抗體細胞的制備方法，該方法包括給動物免疫接種天然和變性蛋白的一種，并用其他蛋白加強劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細胞，并用骨髓瘤細胞融合該產(chǎn)生抗體的細胞。
12.如權利要求11所述的方法，包括給動物免疫接種一種天然蛋白并用一種變性蛋白加強劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細胞，并用骨髓瘤細胞融合該產(chǎn)生抗體的細胞。
13.如權利要求11所述的方法，其中的變性蛋白是用洗滌劑或還原劑處理天然蛋白得到的。
14.如權利要求11所述的方法，其中的蛋白是衣原體的主要外膜蛋白。
15.如權利要求11所述的方法所制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
16.一種產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，該細胞能產(chǎn)生如權利要求1所述的單克隆抗體。
17.如權利要求16所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，是雜交瘤細胞包系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
18.一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如權利要求15所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
19.一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如權利要求16所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
20.用如權利要求1所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
21.如權利要求20所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
22.如權利要求8所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
23.如權利要求22所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
24.一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如權利要求1所述的單克隆抗體。
25.如權利要求24所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
26.一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如權利要求8所述的單克隆抗體。
27.如權利要求26所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
28.一種用如權利要求1所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
29.如權利要求28所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
30.一種用如權利要求8所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
31.如權利要求30所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
32.一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如權利要求1所述的單克隆抗體作為活性成分。
33.如權利要求32所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
34.一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如權利要求8所述的單克隆抗體作為活性成分。
35.如權利要求34所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細胞系AY6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標記。
全文摘要
本發(fā)明涉及對來自肺炎衣原體的主要外膜蛋白和初級體具有特異性反應，但對結膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具任何反應性的單克隆抗體；對肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白具有反應性，但對結膜炎衣原林、鸚鵡衣原體的包含體不具任何反應性的單克隆抗體；制備這些單克隆抗體的方法；產(chǎn)生它們的細胞系；用它們檢測和測定肺炎衣原體的方法；含有它們的檢測和測定肺炎衣原體的試劑；用它們診斷肺炎衣原體感染的方法；以它們作為活性成分的診斷肺炎衣原體感染的試劑。
文檔編號A61K39/395GK1133192SQ9511582
公開日1996年10月16日 申請日期1995年8月3日 優(yōu)先權日1994年8月3日
發(fā)明者黑巖保幸, 馬場憲三, 川越清隆, 井口晃史, 守川俊英, 井筒浩, 中尾義喜, 山木光男, 永山朱美, 中野博子, 齋藤茂 申請人:日立化成工業(yè)株式會社