專利名稱：免疫偶聯(lián)物的制作方法
所提請的發(fā)明涉及新型融合蛋白，它含有與腫瘤相關(guān)的靶向成分和一個生物活性配基。前者首選單克隆抗體或其片段。它可以識別一個優(yōu)先在人腫瘤細胞如人表皮生長因子受體(EGFR)上表達的分子；后者從趨化因子蛋白組，最好從C-X-C族中選擇。產(chǎn)生的融合蛋白可以轉(zhuǎn)送生物活性配基到特定的靶細胞或組織中，這個新的免疫偶聯(lián)物可被用于腫瘤治療。
多種治療概念已被用于對癌癥患者的治療中。過去，臨床實驗的進行使用可特異性或選擇性識別表達于惡性細胞表面上的分子的單克隆抗體。這種方法的目的是誘導抗體依賴的細胞毒性(ADCC)或補體介導的細胞毒性以消除腫瘤細胞。另一種方法是細胞素介導的免疫應答的激活作用。細胞素誘導的抗腫瘤活性可被如下介導(1)細胞素對腫瘤生長的直接的細胞毒性/細胞抑制作用(2)腫瘤抗原的非特異性機理，例如LAK活性或單核細胞/粒細胞介導的細胞毒性(3)由CD-4和CD-8陽性T-細胞介導的腫瘤抗原特異性免疫應答。
在這種情況下，一種抗腫瘤的系統(tǒng)免疫已在動物模型中觀測到。
然而，高劑量細胞素的細胞毒性及原位存在量的不足引出了靶向腫瘤治療的概念。靶向腫瘤治療的原理是以靶分子，如對腫瘤相關(guān)抗原特異的單克隆抗體與生物活性效應分子的物理結(jié)合為基礎(chǔ)的。由靶分子傳遞的效應分子應增加腫瘤中細胞素濃度并減少所需最大劑量。在動物模型中，已表明，由瘤內(nèi)注射或被轉(zhuǎn)染瘤細胞分泌作用而得到的細胞素在原位的存在可導致腫瘤細胞的消退(見綜述Colombo and Forni，Inmmunology Today 1548-51，1994)。在這些系統(tǒng)中，細胞素不減弱腫瘤的增生，但具有激活一個快速，強力的抗腫瘤反應的能力。因此，效應分子和靶向成分的物理結(jié)合代表了一種降低生物活性配基的外周存在和增強其瘤內(nèi)的可利用性的方式。而且，單個腫瘤細胞或微轉(zhuǎn)移瘤也可被這些分子所定向。
抗體直接導向的生物活性配基應可直接或產(chǎn)生一個靶細胞致死環(huán)境素而誘導對靶細胞的破壞作用。這可由細胞素如IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IFNS，TNFα和CSFS來完成。這些細胞因子已被表明可直接或通過激活宿主防御機制間接地引起抗腫瘤作用(Mire-Sluis，TIBTECH 1174K—77，1993；Colombo etal.，Cancer Res.524853-4857,1992；Thomas & Balkwill，Phar-mac，Ther.52307-330，1991)。
然而，這些細胞素的絕大多數(shù)雖然可激活效應細胞，但對其沒有或只有很弱的趨化活性，因此，當腫瘤組織中缺乏適量的效應細胞時，抗腫瘤活性會很弱。
然而，趨化因子對許多效應細胞是具趨化活性的，因而會提高其在腫瘤位點的存在量，其次，它們誘導了大量的效應細胞的功能(見例Miller and Krangel，1992)，“Biology and Biochemistry ofthe ChemokinesA Novel Family of Chemotactic and Inflammato-ry Cytokines”，Critical Reviews in Immunology 12，17)。
IL-8，MIP2α(也稱作GRO-β)和MIP2β(GRO-γ)是C-X-C趨化因子總科的成員。它們作為趨化因子并激活效應細胞的各項功能。因此可代表最優(yōu)的效應物。這個C-X-C趨化因子家族是一個最近被認為是小分子量(8-10KD)的蛋白質(zhì)組，其氨基酸序列顯示出20—50％的同源性并具有趨化和助類活性。IL-8具有一個極其確定的三維結(jié)構(gòu)(Clore et al.，Biochemistry 291689-1696，1990)并與一些CXC趨化因子共有一個N-末端ELR基本結(jié)構(gòu)?？梢灶A期，由于CXC趨化因子中的序列因源性，其三維結(jié)構(gòu)將會是非常相似的，這已經(jīng)在MCAF/MCP-1的結(jié)構(gòu)中得到證明(Gronenborn & CloreProt.Eng.4，263-269，1991)。
在溶液中，IL-8形成穩(wěn)定的二聚物(Clore et al.，Biochemistry291689-1696，1990)，并且F(ab’)IL-8融合蛋白通過兩個IL-8單體的相互作用而二聚成一個二價的免疫偶聯(lián)物是可能的。這將增強融合蛋白與抗原的相互作用。
到目前已描述過的C-X-C組的成員主要作用于嗜中性粒細胞?；蚨ㄎ挥诘谒奶柸旧w。這一組的成員是PF4，血小板基礎(chǔ)蛋白，hIP10，IL-8，MIP2α和MIP2β。這些蛋白在中性粒細胞上的作用是趨化活性，脫顆粒作用和呼吸性突放(Sherry and Cerami，Currentoption in Immunology 356-60，1991；Oppenheim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991；Miller and Krangel，CriticalReviews in Immunology 1217-46 1992；Clark-Lewis et al.，J.Bi-ol.Chem.26623128—23134，1991)。
與C-C家族密切相關(guān)的趨化因子的成員主要作用于單核細胞?；蚨级ㄎ挥?7號染色體。這些蛋白是LD78，Act-2，MCAF，1309和RANTES。這些分子在單核細胞上顯示出強大的趨化活性，(Matsushima et al.，Chem.Immunol.51236-265，1992；Oppen-heim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991)。
表皮生長因子(EGF)是一種致表皮及上皮細胞有絲分裂的多肽激素。當EGF與敏感細胞相互作用時，它結(jié)合于膜受體(EGFR)。EGFR是一個大約170KD的跨膜糖蛋白，是Cerb-B原癌基因的基因產(chǎn)物。
鼠的單克隆抗體MAb425用來抗人A431腫瘤細胞系(ATCCCRL 1555)，并發(fā)現(xiàn)其結(jié)合于EGFR外部功能區(qū)的多肽表位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，它抑制EGF的結(jié)合，體外介導腫瘤細胞毒性，并且體外抑制上皮及直腸、結(jié)腸腫瘤源細胞系的腫瘤細胞的生長。MAb425的人化或嵌合體的轉(zhuǎn)型從WO 92/15683得知。
因此，本發(fā)明的目的之一是制成這樣一些抗體及其片段它包含有導向腫瘤細胞表面EGFR抗原的表位和對其效應細胞具有高度趨化活性，并因此導致低毒性靶向腫瘤治療的生物活性配基。因此，這種免疫偶聯(lián)物體現(xiàn)了類似的原有細胞素-抗體免疫偶聯(lián)物的改進，在引起腫瘤溶解的能力方面二者具有相似的效果，但由于其趨化性質(zhì)，在有效吸引效應細胞到特異性位點的能力方面與原偶聯(lián)物不同。
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，此蛋白把單克隆抗體的一部分，至少是抗原識別位點或識別EGFR表位的完整單克隆抗體和生物活性配基連接起來，該配基選自趨化因子族，優(yōu)選C-X-C族，尤其是IL-8。編碼這些蛋白的結(jié)構(gòu)是通過DNA重組技術(shù)獲得的。融合蛋白包括抗體重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)的CH1段(CH1-偶聯(lián)物，F(xiàn)ab-片段)及合適的輕鏈，或者抗體重鏈的可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)的CH1及CH2段，或者，抗體重鏈可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)的CH1，CH2，CH3段，每一種情況下，各部位都融合在生物活性配基上。通過與合適輕鏈的共同表達，可以產(chǎn)生以抗原承載細胞為靶，并在體內(nèi)轉(zhuǎn)運活性配基到特異位點的融合蛋白。
與此類似，另一個免疫偶聯(lián)物可由將趨化因子融合到抗體FV片段的C-末端而得到。這樣的情況下，重、輕鏈可在一個多肽上表達，在此多肽上，兩種成分通過合適的連接序列結(jié)合起來以確?？乖Y(jié)合位點的適當折疊。不同的結(jié)構(gòu)在

圖1中表明。
免疫偶聯(lián)物的表在產(chǎn)生新的分子，它們結(jié)合有兩種功能首先它們以抗原承載細胞(EGFR)為靶，其次，它們在體內(nèi)轉(zhuǎn)運活性配基到特異位點。這些配基是強化學誘引劑和活性物質(zhì)，并導致在腫瘤位點的效應細胞浸潤，并可引起隨后的腫瘤破壞作用。
通過使用本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物、腫瘤、如黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌可被檢測出來并可在無大量一般毒性作用的情況下得到成功的治療。
因此，本發(fā)明的目的之一是為了提供一個免疫偶聯(lián)物，它含有一個單克隆抗體或其片斷，它們可被導向帶有表皮生長因子受體(EGFR)抗原決定基的腫瘤細胞；還含有融合于上述抗體或抗體片斷的趨化因子蛋白配基。
有幾組不同的趨化因子，如C-X-C和C-C趨化因子。
這樣，依照本發(fā)明的優(yōu)選方案是從C-X-C族中選擇趨化因子。
在C-X-C族中，IL-8是本發(fā)明所傾向的選擇。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一個免疫偶聯(lián)物，其趨化因子選自C-X-C族并優(yōu)選白細胞介素8(IL-8)。
依照本發(fā)明，可使用的抗體是完整的抗體或其片斷。合適的片斷是FVS，F(xiàn)abs或F(ab’)2S(依照本申請用語為CH1抗體片斷)，CH3和CH2抗體片段(圖1)。優(yōu)選方案為FVS，CH1-，CH2和CH3抗體片斷。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一個免疫偶聯(lián)物，其抗體是Fab片段或F(ab’2)片段，這些片段實質(zhì)包括抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1段及合適的輕鏈(抗體-CH1偶聯(lián)物)。另一個免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個實質(zhì)上包括抗體重鏈可變區(qū)，恒定區(qū)CH1和CH2段及合適輕鏈(抗體-CH2偶聯(lián)物)的抗體片段，還有一個免疫偶聯(lián)物，其抗體為一完整抗體，主要包括抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1，CH2和CH3段及合適的輕鏈(抗體-CH3偶聯(lián)物)，最后，還有一個免疫偶聯(lián)物，其抗體主要包括抗體重鏈的可變區(qū)，合適的輕鏈和一個連接輕鏈和重鏈(抗體-FV偶聯(lián)物)的多肽序列組成。
本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可包括在抗體(片段)和可產(chǎn)生誘導作用的趨化因子之間的任意一個限制性位點它使得例如一特異連接肽的引入成為可能，從而保證了偶聯(lián)物與目標表位的最佳結(jié)合。合適的連接肽和引入它們的方法在技術(shù)上已眾所周知，并在下文中敘述。依據(jù)本發(fā)明，所選擇的限制性位點是特定DNA結(jié)構(gòu)中唯一的位點。較好的限制位點是NcoI和BclI。
因此，本發(fā)明進一步的目的是提供一個免疫偶聯(lián)物，它含有一個氨基酸(序列)，該氨基酸(序列)可由抗體/抗體片斷和生物活性配基之間的DNA限制位點推導出，所述限制性位點在整個融合結(jié)構(gòu)中是唯一的。
本發(fā)明進一步的目的是提供一個免疫偶聯(lián)物，它包含一個在抗體/抗體片斷與生物活性配基之間的連接肽。
原理上，導向腫瘤細胞表面EGF受體的所有抗體都是適用的，但單克隆抗體425是優(yōu)選方案。
而且，本發(fā)明的另一個目的是提供一個免疫偶聯(lián)物，其抗體和抗體片段來源于鼠的、人化的或嵌合體的MAb425，并且以從MAb425-CH1-IL8 MAb 425-CH2-(NcoI)-IL8，MAb 425-CH2-(BclI)-IL8，MAb 425-FV-IL8，MAb425-CH3-IL8族中選擇為好。
此外，本發(fā)明的另一目的是提供一種上、下文及權(quán)利要求中所定義的免疫偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法，它包括將編碼抗體或抗體片段和生物活性配基的DNA序列，通過一個與所需融合DNA序列互補的寡核苷酸彼此融合在一單鏈DNA上。把產(chǎn)生的目的結(jié)構(gòu)置于表達載體上，轉(zhuǎn)化此載體到宿主體中，于營養(yǎng)液中培養(yǎng)宿主細胞，并表達此融合蛋白。
本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物適用于臨床治療。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種藥物配方，它至少包含有一種上、下文及權(quán)利要求中所定義的免疫偶聯(lián)物以及生理學上許可的載體。
本發(fā)明的目標之一是產(chǎn)生一種融合蛋白，它包括作為靶向成分的單克隆抗體和作為效應物，具有趨化和激活性質(zhì)的趨化因子IL-8。
第一次，可以證明當IL-8和其它趨化因子(例如MIPs)的N-末端被附加的氨基酸，例如抗體的一部分所封閉的時候，它們可以保持其生物活性。因此，在靶向腫瘤治療中，這個分子將會是很有用的，這是由于效應細胞可被導向EGF受體陽性的腫瘤細胞并在原位被激活。
可以證明，編碼MAb425重鏈及IL-8蛋白的CDNA可用分子生物學的方法被融合，蛋白可在合適的表達系統(tǒng)中表達，而且EGF受體結(jié)合能力在融合蛋白中被保留(圖2)。
IL-8的主要靶細胞是嗜中性粒細胞，它們有三種生物學功能·沿一個趨化梯度趨化移動·釋放帶有預制備的蛋白水解酶的儲存顆?！ぜ磿r產(chǎn)生過氧化物陰離子(呼吸性釋放)相應地，也研究了MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白的趨化活性，MPo釋放和過氧化物釋放的介導。
進一步，可以看出，本發(fā)明的融合蛋白(例如MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8)可引起趨化活性，誘導MPO的釋放和過氧化物的釋放。圖3a中所顯示的結(jié)果表明了以上兩種融合蛋白在重組IL-8(圖3b)的范圍內(nèi)對人中性粒細胞是有趨化性的，除了應成型為二價形式的MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白之外，還產(chǎn)生在大腸桿菌(E.coli)中表達并被純化的一價F(ab’)-IL-8融合蛋白。圖4顯示出與MAb425F(ab’)相對比，相應的在E.Coli中表達并被純化的F(ab’)-IL-8融合蛋白對人中性粒細胞是具趨化性的。
與游離IL-8相對比，MAb425/BclI/IL-8融合蛋白具有相當強的過氧化物釋放的能力(圖5)，MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白活性較小，但明顯高于對照值(圖5)。單獨的MAb425無活性。所有的試驗均以細胞松馳素B作為增強劑來進行。該試劑在單獨存在時無活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
兩種融合蛋白均誘導髓過氧化物酶(MPO)的釋放，但MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白比MAb425/BclI/IL-8融合蛋白更具活性(圖6)。所有數(shù)據(jù)均參照三硝基甲苯溶解細胞的數(shù)據(jù)計算，該數(shù)被稱作100％酶含量。所有數(shù)據(jù)的獲得均使用細胞松馳素B作為增強劑。
以前已證明，IL-8分子的N-末端帶有高度保守的E-L-R基元對于受體結(jié)合和信號傳導是必須的。IL-8的三維結(jié)構(gòu)是一個兩個N-末端均在一個開放構(gòu)型中的勻二聚物。當IL-8的兩個N-末端被附加的氨基酸所封閉時，其生物活性是可能喪失的。因此，在兩個CDNA之間引入限制性位點(NcoI/BclI)以產(chǎn)生連接肽從而恢復N-末端的可接近性。
產(chǎn)生融合蛋白的其它方法，例如兩成分的化學偶聯(lián)會導致可能在兩批產(chǎn)品間變動的非常不確定的結(jié)構(gòu)。另外，化學偶聯(lián)會破壞配體的二級結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生由于不可接近性造成的大多數(shù)蛋白質(zhì)在受體接合方面的鈍化。相比較來說，本發(fā)明的方法可產(chǎn)生確定結(jié)構(gòu)的融合蛋白，這種蛋白可以幾乎無限制地被很重現(xiàn)地表達。
總之，本發(fā)明的融合蛋白具有下述性質(zhì)—接合于EGFR陽性細胞—產(chǎn)生趨化活性—介導MPO和過氧化物的釋放—誘導腫瘤細胞的原位溶解。
因此，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物適用于腫瘤治療。
表1表1表明用于產(chǎn)生NcoI或BclI點位，以產(chǎn)生真核表達的融合蛋白的PCR引物序列。
圖1抗體一細胞因子免疫偶聯(lián)物的模型。
C＝細胞因子；VH＝重鏈可變區(qū)；VL＝輕鏈可變區(qū)；CH＝重鏈恒定區(qū)；CL＝輕鏈恒定區(qū)。
圖2以抗EGF-R的ELISA證明MAb425在COS-7的轉(zhuǎn)染上清中正方形MAb425-CH3上清液三角形MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液倒三角形MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液點PHCMV上清液橫軸上清液稀釋度縱軸光密度在490nm圖3a以COS-7轉(zhuǎn)染上清誘導趨化性柱1對照DMEM/PS柱2未稀釋的PHCMV上清柱3MAb425-CH3上清1∶14稀釋(據(jù)EGF-γ-ELISA的結(jié)果)柱4MAb425-CH3上清1∶28稀釋(據(jù)EGF-γ-ELISA的結(jié)果)柱5未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱6MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清1∶2稀釋柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清，未稀釋(2.0×10-10Mol/L*)柱8MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清1∶2，稀釋*IL-8濃度以ELISA(Amersham)測定縱軸每個計數(shù)區(qū)的細胞數(shù)目圖3b純化IL-8介導的趨化作用縱軸每個計數(shù)區(qū)的細胞數(shù)目橫軸IL-8濃度(Mol/L)圖4MAb425-CH1-IL-8(E.Coli)介導的趨化作用點大腸桿菌中表達的MAb425-CH1-IL-8正方形大腸桿菌中表達的MAb425-F(ab’)三角形Dulbecco’s/BSA對照縱軸每個計數(shù)區(qū)的細胞數(shù)目橫軸濃度(Mol/l)圖5COS-7轉(zhuǎn)染上清對過氧化物釋放的誘導柱1未被刺激的細胞柱2IL-8 10-7M
柱3未稀釋的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清(2.0×10-10Mol/L*)柱4未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱5未稀釋的MAb425-CH3上清(OMol/L*)*IL-8的濃度由ELISA(Amersham)測定縱軸光密度在550nm圖6以COS-7轉(zhuǎn)染上清液誘導MPO釋放柱1未被刺激的細胞柱2用細胞松馳素B刺激的細胞柱3IL-8 10-7M柱4未稀釋的MAb425-CH3上清液柱5MAb425-CH3上清液1∶2稀釋柱6未稀釋的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液1∶2稀釋柱8未稀釋的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液柱9MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液1∶2稀釋縱軸與總的MPO量(100％)相比的％MPO活性所有微生物、細胞素、質(zhì)粒、啟動子、抗性標記，復制起始點，限制性位點或申請中提到的其它片段都是商品化的或可普遍得到的。如果沒有給出其它提示，它們僅用作例證，而不是本發(fā)明所必需的，并可相應地被其它合適的工具和生物材料代替。
本發(fā)明所必需的相關(guān)技術(shù)在下文中詳盡敘述，其它未詳細描述的技術(shù)與已知標準方法相符，這些方法或為技術(shù)熟練人員熟知或在引用的參考文獻，專利申請和標準文獻(如“Atibodies，A Labora-tory Manul”，Harlow，Lane，Cold Spring Harbor，1988)中有更詳細的描述。
單克隆抗體MAb425是抗人A431癌細胞系(ATCC CRL 1555)的IgG1鼠單克隆抗體。MAb425結(jié)合于人EGF受體外部功能區(qū)的多肽表位并與EGF競爭結(jié)合。MAb被發(fā)現(xiàn)在體外介導腫瘤細胞毒性，并抑制表皮及直腸結(jié)腸腫瘤源細胞系腫瘤細胞的生長(Rodeck et al.，Cancer Res.473692，1987)。MAb425的人化或嵌合體轉(zhuǎn)型在WO92/15683中已公開。
趨化因子編碼趨化因子的CDNA既可以從英國Biotechnology(生化技術(shù))公司購買(人IL-8 BBG44Hermann Biermann GmbH，BadNauheim FRG)或由產(chǎn)生人細胞系U937(ATCC CRL 1593)的細胞因子中分離出的mRNA產(chǎn)生從產(chǎn)生趨化因子的細胞中得到的總mRNA是用生產(chǎn)廠家介紹的RNA201(WAK-Chemie，Germany)分離的。此RNA隨后被轉(zhuǎn)錄成CDNA，編碼趨化因子的序列使用從已發(fā)表的DNA序列推測出的合適引物進行PCR擴增。
載體PUC19是一系列有關(guān)高拷貝數(shù)大腸桿菌質(zhì)?？寺』d體的一部分，并含有PBR322和MBmp19的幾部分。PUC19包含可誘導的細菌乳糖啟動子-操縱子，其后是多克隆位點(Yanisch-Oerron etal.，Gene 33103-109，1985)。PUC載體可作為商品買到(例如New England Biolabs)。
pBluescipt KS/SK+和KS/SK噬菌體質(zhì)粒載體來自pUC19。這些載體都可作為商品買到(Stratagene，Heidelberg)。原核表達載體是以PUC19載體衍生物，PSW1載體作為基礎(chǔ)(Ward et al.，Nature 341544-546，1989)，PSW1包含一段序列，該序列編碼從Erwinia Carotovora得到的細菌pel基因的前導肽。外來DNA被導入框架，在pelB前導序列之后，使得蛋白表達入外周細胞質(zhì)中。
真核表達載體PHCMV(Gillies et al.，Cell 33717。1983)包含有猴病毒40(SV40)的復制起始點和人誕腺病毒的啟動子和增強子區(qū)。這個啟動子和增強子區(qū)的后面是多克隆位點，用以導入表達基因。在這個載體中，將MAb425重鏈可變區(qū)的嵌合體形式和與在CH2段末端的趨化因子融合的Cγ1 CH2區(qū)相結(jié)合以產(chǎn)生MAb425重鏈融合蛋白。通過與合適輕鏈相結(jié)合的方式把融合Ig鏈裝入免疫偶聯(lián)物中以形成一價抗原結(jié)合區(qū)，此區(qū)域隨后可被用于產(chǎn)生一個對靶抗原特異的二價免疫偶聯(lián)物。此重鏈及輕鏈結(jié)構(gòu)可被裝入一個或分開的載體中。
融合蛋白在真核細胞中的表達用于表達Fab425趨化因子融合蛋白的真核表達載體的構(gòu)建用PCR技術(shù)融合Mab425與趨化因子人Cγ1恒定區(qū)作為BamHI/BamHI片段被插入PUC19。這個Cγ1恒定區(qū)包含兩個SacII位點一個位于5’基因內(nèi)區(qū)5’BamHI位點下游40bp處，第二個位于5’BamHI位點下游580bp及CH3段開頭上游140bp處。第二個SacII位點適于更進一步的亞克隆，因此，用一個連接子導入一個SnaBI位點會破壞第一個SacII位點。在這個結(jié)構(gòu)中(ΔSacII Cγ1)從SacII位點向下游的片段能夠很容易地被交換。
1.IL-8從PUC18載體(BglII/EcoRI)上切下并被插入pBlueScript SK+(Stratagene GmbH，Heidelberg)(Smal/EcoRI)，從而去掉BgIII和SamI位點。ΔSacII Cγ1克隆的SacII/×baI片段被插入pBlueskript SK+。兩個基因均使用PCR技術(shù)以合適的引物擴增—對于ΔSacII cγ13’引物CH2段的末端序列和NcoI位點。
5’引物反向測序引物—對于IL-8 3’引物通用測序引物5’引物一個NcoI位點及IL-8起始序列產(chǎn)物被切下并以SK+SacII/EcoRI連接。所得肽序列CH2段C-末端的絲氨酸被變?yōu)榧琢虬彼?，IL-8部分N-末端的絲氨酸被變?yōu)楦拾彼帷?br> 在兩個多肽之間接點上新產(chǎn)生的序列是5′AAA GCC ATG GGT GCT3′Lys Ala Met Gly Alacγ1CH2 IL-8(2-72)使用引物(表1)進行同樣步驟以便在兩個基因中導入BclI位點。所得的融合基因在Cγ1恒定區(qū)與IL-8基因之間有一個BclI位點，此融合基因編碼CH-2段的全部序列，兩上附加氨基酸(纈氨酸，異亮氨酸)，設有前兩個氨基酸(絲氨酸丙氨酸)的IL-8序列。
在兩個多肽之間的接點上新產(chǎn)生的序列是5′GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3′Ala Lys Val Ile Lys Glucγ1CH2
IL-8(3-72)使用SacII和EcoRI限制性位點將PCR產(chǎn)物亞克隆入SK+。為了真核表達的需要，把這些配合基因克隆進pHcmv載體。
表1
免疫偶聯(lián)物在真核細胞中的表達免疫偶聯(lián)物在真核細胞中的表達需要將含有重鏈和輕鏈的載體DNA引入宿主細胞中。已經(jīng)介紹有多種不同的方法，如電穿孔，DEAE葡聚糖，磷酸鈣，脂質(zhì)體或原生質(zhì)體的融合。只要編碼免疫偶聯(lián)物的重組DNA序列在那種細胞型中被恰當?shù)剞D(zhuǎn)錄成mRNA，任何一種宿主細胞型都可以使用。宿主細胞可以是不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，如Sp2/0-AG14(ATCC CRL 1581)，P3×63Ag8.653(ATCC CRL 1580)或倉鼠細胞例如。CHO-KL(ATCCCCL61)或CHO/DHFR-(ATCC CRL 9096)，或BHK-21(ATCCCCL 10)。為瞬時表達的需要，可以使用COS-1(ATCC CRL 1650)或COS-7(ATCC CRL 1651)。
免疫偶聯(lián)物的瞬時表達表達載體PHCMV包含有猴病毒40(SV40)的復制起始點。細胞系COS-7是猴細胞系CV-1的一個分支，原細胞系已被轉(zhuǎn)入起始點缺乏的SV-40病毒。因此，含有SV40復制起始點的質(zhì)粒將會被擴增，免疫偶聯(lián)物的產(chǎn)物也將會增加。72小時后收集上清液，用ELISA檢測EGF受體的結(jié)合情況及趨化因子濃度。
免疫偶聯(lián)物的永久表達把含有表達免疫偶聯(lián)物的重組結(jié)構(gòu)的載體導入合適的宿主細胞中。重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)可以被裝入同一個或分開的不同載體中；在后一種情況中，兩個載體可以帶有同一選擇標記，如新霉毒抗性或二氫葉酸還原酶(DHFR)。或者帶有二個不同的選擇標記用于兩個載體都存在時的篩選。DHFR標記的選擇只能在DHFR負性細胞系如CHO/DHFR-中進行。為了表達免疫偶聯(lián)物，可以使用EGF受體特異性的ELISA分析混合種群。對陽性克隆進一步的篩選可使用限度稀釋克隆法進行。
M425趨化因子免疫偶聯(lián)物的純化由宿主細胞制造的M425免疫偶聯(lián)物可以使用任何一種合適的方法進行收集和純化，例如使用靶抗原、抗細胞因子抗體或抗個性基因抗體的親合色譜法(例如Harlow，lane，I.c.)。
本發(fā)明中使用經(jīng)標準方法(如Kostelny et al.(1992)，J.Im-munol，148，1547)，由MAb425制取的抗個性基因抗體進行純化。
為了獲得純的FV-免疫偶聯(lián)物，將表達質(zhì)粒(見下)轉(zhuǎn)入適于蛋白表達的大腸桿菌菌株。細胞生長到OD578＝0.5，并用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(ImM)誘導。細胞生長過夜，收集上清液及細胞。上清液用一個依據(jù)標準步驟制備的抗MAb425，抗個性基因的色譜柱進行分離。以含有0.5M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗柱，結(jié)合在柱上的蛋白用PH＝2.5的含0.5M Nacl的100mm甘氨酸洗脫。洗脫液立即用PH8.0的2.5M Tris中和，將含有MAb425-CH1-IL-8的各部分合并，濃縮并對PBS透析。
用于Fab425-趨化因子的原核表達載體的構(gòu)建及Fv-趨化因子融合蛋白的表達Fv片段依據(jù)Glock shuber等人的方法制成(Bit-chemistry 291362-1367，1990)。編碼輕鏈和重鏈Fd片段或Fv片段的DNA序列被導入PSW1載體的多克隆位點中。輕鏈成熟編碼序列，重鏈成熟編碼序列及Fv編碼序列位于細菌pelB基因的前導肽之后。重鏈的編碼序列包含一個NcoI(3’末端)位點。以PCR修飾編碼CDNA的趨化因子以導入NcoI(5’末端)和NotI(3’末端)或EcoRI(用于Fv融合)限制性位點。在框架中，趨化因子基因被直接融合于重鏈的CH1區(qū)或Fv段。相應地，一個連接肽，例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Sex)x，這里x可為1到4，可被導入CH1區(qū)和趨化因子基因之間。這種連接子及其制作方法可從文獻(如Curtis等，1991，Proc、Natl、Acad、Sci、U.S.A，88，5809)中得知。
這些載體使功能性F(ab’)(＝CHI)及Fv-趨化因子，融合蛋白在大腸桿菌中的有效表達成為可能。輕鏈和重鏈-趨化因子融合蛋白定位于在可誘導的乳糖啟動子(Skerra和Pluckthun，Science 2421038-1040，1988)調(diào)控下的單二順反子信使RNA上，因此，F(xiàn)ab/Fv-融合蛋白的表達可根據(jù)對培養(yǎng)條件的要求來誘導。從二順反子信使RNA上翻譯，兩個蛋白傾向于合成等量的Fd-趨化因子融合蛋白和輕鏈，以增加正確裝配入功能性Fab/Fv融合蛋白的可能性。這兩個多肽被分泌入大腸桿菌外周胞質(zhì)中，在那里發(fā)生二硫鍵的折疊，形成并裝配入功能性Fab 425 CH1/Fv融合蛋白中。延長細菌的培養(yǎng)可導致大腸桿菌外膜的部分滲透性使得融合蛋白可擴散入培養(yǎng)基中。
Mab425免疫偶聯(lián)物的結(jié)合作用Mab425免疫偶聯(lián)物的結(jié)合性質(zhì)用EGF-受體特異性的ELISA測定。簡言之，就是微滴定度板在4℃用純化的EGF-受體包被過夜。用含有融合蛋白的上清液或含有未被偶聯(lián)的Mab片段的上清液孵育該板。洗板以移去未被結(jié)合的材料，然后平板先用偶聯(lián)于過氧化物酶的羊抗人IgG及IgM(重鏈和輕鏈)，再用底物孵育，以檢測結(jié)合于EGF-受體的抗體。在490nm測定結(jié)合的EGF-受體特異性蛋白的量。
Mab425-IL-8免疫偶聯(lián)物的生物活性效應細胞的分離為了檢測生物活性，按Hoslett等(Am.J.Pathol 119101-110，1985)以前所述，從健康供血者的全血中新鮮分離出人外周血嗜中性粒細胞。離心分離血漿，用葡聚糖沉降法分離紅細胞，最后用percoll-梯度離心法分離淋巴細胞和白細胞。分離出的中性粒細胞立即使用。
趨化活性的檢測趨化性的檢測依據(jù)Fald等(J.Immunol Methocls 33239-247，1980)所述方法進行。簡言之，就是使用48boyden chamber及5um的膜，純化的中性粒細胞以1×106細胞/ml的濃度被重新懸浮于DEME介質(zhì)中(DEME，1％青霉素，1％鏈霉素，10％FCS，2mML谷氨酰胺，1mM谷銅酸鈉，10mM HEPES)。含有融合蛋白的上清液或?qū)φ丈锨逡悍湃胂旅娴目字校阅じ采w上面的孔中盛裝細胞懸液。在37℃孵育30分鐘后，把膜移去并在2％戊二醛。中將膜固定10分鐘。然后，在魏格特氏鐵蘇木精染劑中將粘附于膜上的細胞染色3分鐘。在顯微鏡下，測定結(jié)合于膜的細胞數(shù)目。
在中性粒細胞中誘導酶釋放能力的測定為評估這些免疫偶聯(lián)物在中性粒細胞中誘導顆粒釋放的能力，要控制上清液中髓過氧化物酶的活性(Henson等，J.Immunol 121851；1978)試驗在每孔5×105個細胞的96孔微量滴定度板中進行。與刺激物孵育(37℃)后，離心滴定度板，并把不含細胞的上清液轉(zhuǎn)移到另一個96孔微量滴定度板中。這個不含細胞離的上清液與二茴香胺(作為底物)孵育并在492nm測定吸收度使用濃度為10-7M的FMLF作為陽性對照。為測定全部酶含量，以三硝基甲苯溶解未經(jīng)刺激的細胞。以對全部酶含量(溶解)的百分比計算活力。
過氧化物釋放能力的測定細胞色素C可被O2-所還原并因此改變它的吸收度。這個吸收度的變化對估計過氧化物的活性是一個有價值的標志。此試驗依據(jù)Guthrie等(J.Exp.Med 1601656-1671，1984)所述方法在每孔5×105個細胞的96孔微量滴定度板中進行。將刺激物與細胞色素C孵育后，離心平板，在550nm測定上清液的吸收度。
進一步的免疫偶聯(lián)物據(jù)以上描述，已經(jīng)制備并研究了抗EGFR-CH1，-CH2-，CH3及Fv的免疫偶聯(lián)物(帶有/不帶有限制性位點和連接子)，它們包含有作為趨化因子組分的MIP-2α及MIP-2β。這些結(jié)構(gòu)顯示出與IL-8分枝相似的性質(zhì)。
免疫偶聯(lián)物的治療用途本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可為治療目的給藥于病人。因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種藥物配方，它包含有至少一個在上文及權(quán)利要求中定義的融合蛋白作為活性成分，并輔以一種或多種藥學許可的載體，賦形劑或稀釋劑。
本發(fā)明中的免疫偶聯(lián)物典型的給藥方式是靜脈內(nèi)或胃腸外注射。一般來說，這些免疫偶聯(lián)物給藥的劑量范圍很廣足以產(chǎn)生目標腫瘤的抑制及腫瘤溶解效應。這個劑量依賴于病人的年齡，個體條件，性別及疾病程度，并可以在0.1mg/kg到200mg/kg之間變動，傾向于選擇每日劑量在0.1mg/kg到100mg/kg之間，一次或多劑量給藥，持續(xù)一天或幾天。
胃腸外給藥的制劑包括無菌水溶液或非水溶液，懸液及乳劑。非水溶劑可以是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油和可注射的有機酯如油酸乙酯，以及在技術(shù)上已知的適于這些意圖的其他溶劑。本項發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可被用在一種含有生理學許可的載體的成分中。這些合適的載體可以是鹽水，PBS，林格氏溶液及乳酸化的林格氏溶液。防腐劑和其他添加劑如抗菌素，抗氧劑及螯合劑也可以出現(xiàn)在藥物配方中。
所提請發(fā)明的藥物配方適用于對所有類型腫瘤的治療，包括黑色素瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤及癌癥，也包括血液腫瘤和固體腫瘤。
權(quán)利要求
1.免疫偶聯(lián)物，包含有導向承載表皮生長因子受體抗原表位的腫瘤細胞的單克隆抗體或其片段，以及融合于上述抗體或抗體片段的趨化因子蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1中的免疫偶聯(lián)物，其趨化因子選自C-X-C族。
3.權(quán)利要求2中的免疫偶聯(lián)物，其趨化因子是IL-8。
4.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個主要包含抗體重鏈的可變區(qū)、恒定區(qū)的CH1段及合適輕鏈(抗體-CH1偶聯(lián)物)的Fab片段或F(ab)2片段。
5.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個主要包含有抗體重鏈的可變區(qū)、恒定區(qū)的CH1和CH2段及合適輕鏈(抗體-CH2偶聯(lián)物)的抗體片段。
6.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體是一個主要包含有抗體重鏈的可變區(qū)，恒定區(qū)的CH1、CH2和CH3段及合適輕鏈(抗體CH3偶聯(lián)物)的抗體片段。
7.權(quán)利要求1至3之一中的免疫偶聯(lián)物，它主要由抗體重鏈的可變區(qū)、合適輕鏈以及一段連接重鏈輕鏈(抗體一Fv偶聯(lián)物)的多肽序列所組成。
8.權(quán)利要求1至6之一中的免疫偶聯(lián)物，它包含可由抗體/抗體片斷和生物活性配基之間的一個限制性位點推導出的一個氨基酸(序列)，上述限制性位點在整個融合結(jié)構(gòu)中是唯一的。
9.權(quán)利要求1至7之一中的免疫偶聯(lián)物，它包含一位于抗體/抗體片段與生物活性配基之間的連接肽。
10.權(quán)利要求1至8之一中的免疫偶聯(lián)物，其抗體或抗體片段來源于鼠的，人化的或嵌合體的MAb425。
11.選自MAb425-CH1-IL8，MAB425-CH2-(NcoI)-IL-8，MAb425-CH2-(BclI)-IL8，MAb425-Fv-IL8，MAb425-CH3-IL8組的一個免疫偶聯(lián)物。
12.權(quán)利要求1至10之一的免疫偶聯(lián)物的生產(chǎn)方法，它包括將編碼抗體或抗體片段及生物活性的配基的DNA序列通過與所需融合DNA序列互補的單鏈DNA彼此融合在一單鏈DNA上，將產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)放入表達載體中，轉(zhuǎn)化此載體到宿主生物體中，在營養(yǎng)液中培養(yǎng)此宿主細胞并表達此融合蛋白。
13.藥物組合物，它包含至少一個權(quán)利要求1至10中的免疫偶聯(lián)物以及生理學上許可的載體。
14.權(quán)利要求1至10之一中的免疫偶聯(lián)物應用于制備抗腫瘤的藥物。
全文摘要
本項發(fā)明涉及新型免疫偶聯(lián)物，其包含對人EGF一受體分子特異性的一個單克隆抗體或其片段，以及趨化因子族中的一員，傾向于從C-X-C族中選拔，例如白細胞介素8。這些免疫偶聯(lián)物誘導細胞毒性和趨化活性并且適用于靶向腫瘤治療。
文檔編號A61K39/385GK1123185SQ95116279
公開日1996年5月29日 申請日期1995年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月16日
發(fā)明者W·霍爾茲, I·馮·霍格恩, W·斯特里瑪特爾, S·瑪滋庫 申請人:默克專利股份有限公司