專利名稱：一種用于治療惡性腫瘤的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種用于腫瘤免疫治療的藥物及其制備方法，涉及生物化學領(lǐng)域。
惡性腫瘤作為一種較難攻克的疾病，目前臨床上主要的治療方法是依靠外科手術(shù)切除瘤體，化學藥物和放射治療，這些方法共有的不足是治療后腫瘤細胞仍有復發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能，患者死亡率較高。腫瘤生物治療是近年來新興起的治療惡性腫瘤的一種輔助療法，它的治療手段之一是制備腫瘤疫苗，其腫瘤疫苗的來源主要有兩種途徑一種是利用患者自身的腫瘤細胞，切除后在體外經(jīng)照射、病毒感染等方法降低其致瘤性，加入佐劑BCG(卡介苗)制成腫瘤疫苗后回輸給患者。該疫苗應用于臨床后取得了良好的治療效果，但也發(fā)現(xiàn)了其不足之處疫苗中既包括了腫瘤細胞中有利的因子，也包括了有害的因子，治療效果不穩(wěn)定；治療對象僅限于手術(shù)切除腫瘤后的患者，不能成為批量生產(chǎn)的藥品；其佐劑BCG(卡介苗)易引起局部經(jīng)久不愈的潰瘍，不利于該疫苗的長期使用。第二種途徑是利用一些被證明能夠誘發(fā)機體細胞免疫或體液免疫的已知分子結(jié)構(gòu)的腫瘤抗原，如利用化學合成方法獲得的S-Tn抗原，以基因工程方法、轉(zhuǎn)染病毒方法以及將合成提取的抗原加佐劑等方法制成疫苗，用于腫瘤治療。目前該疫苗處于臨床I、II期試用階段，尚未形成產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的在于提供一種取材方便、制備方法簡便、治療效果好、保存活性時間長、無毒付作用、便于患者長期使用的腫瘤疫苗以及制備該腫瘤疫苗的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的A.組成1.從新鮮牛頜下腺中提取的S-Tn抗原?；瘜W結(jié)構(gòu)式為NeuAc-GalNAc-O-Ser/Thre，為一分子量400KD以上的糖蛋白，其中碳水化合物占60％，蛋白質(zhì)含量為37.4％；碳水化合物中主要組分為羥乙酰神經(jīng)胺酸(NEUGC)，含量55.3％；胺乙酰神經(jīng)胺酸(NEUAC)。含量28.4％。
2.佐劑脂質(zhì)體。由卵磷脂和膽固醇組成，比例為2∶1克分子比。
3.S-Tn抗原在藥物中的含量(重量)為0.01～0.05％。
4.佐劑脂質(zhì)體在藥物中的含量(重量)為0.42～0.44％。
B.制備方法(一)S-Tn抗原的制備1.取新鮮放血致死的牛頜下腺，立即置于液氮；2.除去腺體表面的結(jié)締組織和脂紡組織，將腺體剪成塊狀，用生理鹽水漂洗；3.將腺體與7倍體積的0.01M氯化鈉混合，放入組織勻漿器內(nèi)制成糊狀勻漿；4.將勻漿放入離心機內(nèi)，離心12000g，20分鐘，去除沉淀后加入相當于1/2體積的濃度為0.01M氯化鈉溶液，混勻后離心12000g，20分鐘，重復兩次，合并上清液；
5.在上清液中滴加2M醋酸，調(diào)至PH值為4.7，再次離心12000g，20分鐘，去除沉淀；6.在上清液中滴加10％(W/v)十六烷基溴化胺溶液，加入比例為1克腺體原料兌加十六烷基溴化胺溶液0.1ml，放入攪拌器內(nèi)攪拌1小時，去除上清液，用冷蒸餾水漂洗三次凝塊；7.在凝塊中加入濃度為50％的氯化鈣溶液，加入比例為1克腺體原料兌加氯化鈣溶液2ml，攪拌，待凝塊溶解后放置24小時，放置過程中如有沉淀現(xiàn)象可離心去除沉淀；8.向溶液中兌加冷乙醇，攪拌，直至濃度達到60％～75％，沉淀放置過夜；9.將溶液離心3000g，30分鐘，棄去上清液，用冷蒸餾水溶解凝塊沉淀；10.全溶后的粘液兌加100倍體積水后透析3天，所得液體為S-Tn抗原溶液，將S-Tn抗原溶液冷凍干燥制成粉狀，4℃以下封存。
(二)佐劑脂質(zhì)體的制備1.卵磷脂和膽固醇按2∶1克分子比，溶解于氯仿中，加入比例為1ml氯仿中兌加類脂質(zhì)(卵磷脂+膽固醇)5.19mg；2.將混合液旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，制成半透明薄膜，室溫干燥過夜；3.薄膜置于氮氣下吹20～30分鐘后，加入0.9％的氯化鈉溶液，調(diào)至脂質(zhì)最終濃度為6.2mg/ml，在4～10℃冰浴中超聲10～20分鐘，即得淡黃色乳劑狀脂質(zhì)體溶液。
(三)疫苗的制備1.將冷凍干燥的S-Tn抗原粉溶于0.9％氯化鈉溶液中，加入比例為1mgS-Tn凍干粉中兌加氯化鈉溶液1ml；2.在脂質(zhì)體成品中加入S-Tn抗原溶液，其比例為0.7ml脂質(zhì)體乳劑中加入S-Tn抗原溶液0.1～0.5ml；3.在上述混合液中加入20％甘露醇注射液0.2ml；4.將所得液體按照每瓶1ml規(guī)格分裝，冷凍干燥后制成粉劑疫苗，放入冰箱，4℃保存。
使用前，向疫苗中加入1.0～1.5ml的蒸餾水，反復吹打15次以上或放入Vertax儀器中旋轉(zhuǎn)振蕩成乳劑，皮下注射。
采用上述組成和方法制成的腫瘤疫苗，具有以下優(yōu)點1.制備S-Tn抗原有材料來源不同于以往。國外采用化學方法合成的S-Tn抗原，只含有胺乙酰神經(jīng)胺酸(NeuAc)；本疫苗中所含的S-Tn抗原由牛頜下腺中提取，不僅含胺乙酰神經(jīng)胺酸(NeuAc)，而且富含具有腫瘤特異性的羥乙酰神經(jīng)胺酸(NeuGc)；2.化學方法合成的S-Tn抗原，分子量小，不足以誘發(fā)機體免疫反應，合成疫苗過程中必須連接鑰孔原蟲血紅蛋白(KLH)；本疫苗中所含的S-Tn抗原為大分子糖蛋白，本身所含的肽鏈不僅可以誘發(fā)體液免疫，更具有誘發(fā)細胞免疫的功能；3.疫苗中用作佐劑的脂質(zhì)體，可輔助誘發(fā)IgG抗體及輔體介導的殺傷腫瘤細胞作用，激活巨噬細胞和提呈抗原給T細胞，產(chǎn)生多種細胞因子，殺傷腫瘤細胞，全面調(diào)動機體的免疫功能；4.本疫苗對人體腫瘤細胞具有特異性，即只對表達S-Tn抗原的腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷力，對其它細胞無殺傷作用；5.取材方便，制備方法簡單，制成的疫苗性能穩(wěn)定，保存活性時間長(1～2年)，對人體無毒付作用，注射局部無紅斑、潰瘍等現(xiàn)象，便于患者長期使用。
權(quán)利要求
1.一種用于治療惡性腫瘤的藥物，其特征在于由以下成份組成(1)從新鮮牛頜下腺中提取的S-Tn抗原，化學結(jié)構(gòu)式為NeuAc-GalNAc-0-Ser/Thre，為一分子量400KD以上的糖蛋白，其中碳水化合物占60％，蛋白質(zhì)含量為37.4％；碳水化合物中主要組分為羥乙酰神經(jīng)胺酸(NEUGC)，含量55.3％；胺乙酰神經(jīng)胺酸(NEUAC)，含量28.4％；(2)佐劑脂質(zhì)體，由卵磷脂和膽固醇組成，其比例為2∶1克分子比。(3)S-Tn抗腺在藥物中的含量(重量)為0.01～0.05％；(4)佐劑脂質(zhì)體在藥物中的含量(重量)為0.42～0.44％；
2.一種制備如權(quán)利要求1所述藥物的方法，其特征在于包括以下步驟(一)S-Tn抗原的制備(1).取新鮮放血致死的牛頜下腺，立即置于液氮；(2).除去腺體表面的結(jié)締組織和脂紡組織，將腺體剪成塊狀，用生理鹽水漂洗；(3).將腺體與7倍體積的0.01M氯化鈉混合，放入組織勻漿器內(nèi)制成糊狀勻漿；(4).將勻漿放入離心機內(nèi)，離心12000g，20分鐘，去除沉淀后加入相當于1/2體積的濃度為0.01M氯化鈉溶液，混勻后離心12000g，20分鐘，重復兩次，合并上清液；(5).在上清液中滴加2M醋酸，調(diào)至PH值為4.7，再次離心12000g，20分鐘，去除沉淀；(6).在上清液中滴加10％(W/v)十六烷基溴化胺溶液，加入比例為1克腺體原料兌加十六烷基溴化胺溶液0.1ml，放入攪拌器內(nèi)攪拌1小時，去除上清液，用冷蒸餾水漂洗三次凝塊；(7).在凝塊中加入濃度為50％的氯化鈣溶液，加入比例為1克腺體原料兌加氯化鈣溶液2ml，攪拌，待凝塊溶解后放置24小時，放置過程中如有沉淀現(xiàn)象可離心去除沉淀；(8).向溶液中兌加冷乙醇，攪拌，直至濃度達到60％～75％，沉淀放置過夜；(9).將溶液離心3000g，30分鐘，棄去上清液，用冷蒸餾水溶解凝塊沉淀；(10).全溶后的粘液兌加100倍體積水后透析3天，所得液體為S-Tn抗原溶液，將S-Tn溶液冷凍干燥制成粉狀，4℃以下封存；(二)佐劑脂質(zhì)體的制備(1).卵磷脂和膽固醇按2∶1克分子比，溶解于氯仿中，加入比例為1ml氯仿中兌加類脂質(zhì)(卵磷脂+膽固醇)5.19mg；(2).將混合液旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，制成半透明薄膜，室溫干燥過夜；(3).薄膜置于氮氣下吹20～30分鐘后，加入0.9％的氯化鈉溶液，調(diào)至脂質(zhì)最終濃度為6.2mg/ml，在4～10℃冰浴中超聲10～20分鐘，即得淡黃色乳劑狀脂質(zhì)體溶液；(三)疫苗的制備(1)將冷凍干燥的S-Tn抗原粉溶于0.9％氯化鈉溶液中，加入比例為1mgS-Tn凍干粉兌加氯化鈉溶液1ml；(2)在脂質(zhì)體成品中加入S-Tn抗原溶液，其比例為0.7ml脂質(zhì)體乳劑中加入S-Tn抗原溶液0.1～0.5ml；(3)在上述混合液中加入20％甘露醇注射液0.2ml；(4)將所得液體按照每瓶1ml規(guī)格分裝，冷凍干燥后制成粉劑疫苗，放入冰箱，4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療惡性腫瘤的藥物及其制備方法，涉及生物化學領(lǐng)域。其特征是采用新鮮放血致死的牛頜下腺，經(jīng)漂洗、勻漿化、離心等化學方法從中提取出S-Tn抗原，輔以由卵磷脂和膽固醇為原料制得的佐劑脂質(zhì)體制成凍干粉劑疫苗。采用該組成和方法制得的疫苗，富含具有腫瘤特異性的羥乙酰神經(jīng)胺酸；并可激活巨噬細胞和T細胞，產(chǎn)生多種細胞因子，殺傷腫瘤細胞。該藥物制備方法簡單，制成的產(chǎn)品性能穩(wěn)定，保存活性時間長、使用對人體無毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK1145785SQ9511640
公開日1997年3月26日 申請日期1995年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月21日
發(fā)明者袁玫, 費麗華 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院