專利名稱：：用吖啶或吖啶衍生物協(xié)助滅活病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用吖啶或吖啶衍生物，優(yōu)選聯(lián)合使用氯芐烷銨來滅活包膜或無包膜的病毒。優(yōu)選地，在較大地保留蛋白質(zhì)生物活性之下進行本發(fā)明的方法。多年來人們已經(jīng)知道，未處理的人類血漿或血清中可能含有使人致病的病毒，如HIV，HBV或HCV，這些病毒一旦傳染給易感受體，就可能引起嚴重的疾病如AIDS或肝炎。為了預(yù)防這種潛在的病毒傳染，在制備從人體血漿或血清中獲得的治療劑時，一方面，僅僅從預(yù)選的，任何人都能判斷是無病毒的起始物質(zhì)開始制備，另一方面，在制備過程中采用病毒—滅活/消除措施。通過精密測定和連續(xù)校對，確定所用的病毒滅活/消除法的功效。在制備上述治療劑中，除物理滅活病毒措施外，化學(xué)滅活病毒措施也是已知的。尤其經(jīng)常討論的化學(xué)方法是SD(溶劑/清潔劑)法。它適用于滅活包膜病毒，即由含脂質(zhì)的膜包裹著的病毒，但存在嚴重的不利之處，即對所有已知無包膜(無膜的)病毒完全無效。而且，也已知無其它化學(xué)方法適于滅活無包膜病毒同時又保留治療劑或人體血漿或血清中蛋白質(zhì)組分的生物活性。盡管化學(xué)滅活病毒法僅用于補充物理法的能力，并且盡管大多數(shù)通過血液或血制品潛在傳染的病毒具有脂質(zhì)膜，為了安全，特別需要建立也能確實滅活無包膜病毒的有效的化學(xué)滅活法。當最近象討論通過血液或血制品潛在傳染的病毒一樣，討論HAV和細小病毒如細小病毒B19時，這一點更加吸引人(VoxSanguinis67，Supplementl，1994ProceedingsofaSymposiumbeldattheNewYorkBloodCenter)。本發(fā)明的目的也在于開發(fā)一種工業(yè)上可用的化學(xué)滅活病毒的方法，該方法可滅活包膜的和無包膜的病毒，如細小病毒，并保留所含蛋白質(zhì)(如治療劑中使用的蛋白質(zhì))的生物活性。通過向待處理的含蛋白液體中加入吖啶或吖啶衍生物，可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。意外地發(fā)現(xiàn)，吖啶或吖啶衍生物可以滅活包膜的或無包膜的病毒。例如，吖啶衍生物為利凡諾，9-氨基吖啶(即己基間苯二酚氨基吖啶)，3，6-二氨基吖啶(普魯黃素)，吖啶鎖辛，AcrizaneChloride(氯化酚吖啶)，吖啶橙，喹吖啶，acricide，吖啶酮，吖啶-9-羧酸，氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧-9-吖啶基)氨基]-3-二乙氨-2-丙醇二鹽酸鹽)，3，7-二氨基-5-苯基吩嗪鹽酸鹽(酚藏紅花，藏紅BExtra)，吩惡嗪，吩噻嗪且特別為吖啶黃(3，6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3，6-二氨基吖啶)及其鹽，例如氯化物，硫酸鹽，溴化物。意外地還發(fā)現(xiàn)，吖啶或吖啶衍生物和氯芐烷銨合用，在病毒滅活期間顯示協(xié)同作用，即合用下滅活病毒的數(shù)量比單用每種物質(zhì)都要高。本發(fā)明滅活病毒法可在蛋白溶液如血液，血清，血漿，血制品，尿囊液或奶中進行。滅活病毒的條件為PH3-10或5-9(例如在血清或血漿溶液中)并且溫度為1℃-80℃，優(yōu)選20℃-60℃，特別優(yōu)選20℃-40℃，或25℃-37℃，持續(xù)30分鐘-10小時，優(yōu)選2-5小時。為了滅活病毒，所用吖啶或吖啶衍生物的濃度為1.0g/l-0.00001g/l或1.0g/l-0.004g/l，優(yōu)選0.1g/l-0.001g/l并且氯芐烷銨的濃度為0.1g/l-0.004g/l，優(yōu)選0.05g/l-0.01g/l。如果必要，可通過簡單的，公知的方法如活性炭吸附或透析，除去蛋白溶液中的吖啶和氯芐烷銨。本發(fā)明滅活病毒法進一步的好處是對待處理物質(zhì)中蛋白組分極大的保護作用不同的生物活性，例如抗體活性和凝集活性，都不減小或僅減小可接受的范圍。因此，本發(fā)明滅活病毒法可用于，例如消除下列物質(zhì)的污染—含蛋白溶液(稀的或濃的)—血液或血制品；液體和細胞組分—血清，血漿—尿囊液—器官提取物—奶—緩沖溶液—診斷抗原—疫苗，疫苗抗原本發(fā)明的方法更進一步適用于消毒病毒污染的，例如區(qū)域，設(shè)備，坑水，廢棄物和各種表面。也可用于消毒病毒污染的器官移值物如角膜、腦膜、肝、心臟、肺或腎臟。通過下面的實施例進一步來說明本發(fā)明。本發(fā)明工藝中通常使用的方法病毒用已知的方法在組織培養(yǎng)物中復(fù)制；將病毒收集物離心并用作進一步研究的起始物。在微量滴定板上(每稀釋段有8個0.1ml的樣品)，通過雙滴定(doubletitration)來測定傳染效價(infectiousnesstiter)。貯備液乳酸利凡諾(EL)3％的蒸餾水溶液Entozon(E)3％的吖啶蒸餾水液吖啶黃(A)1％的蒸餾水溶液氯芐烷銨(BACI)10％的蒸餾水溶液通常的實驗步驟將9份緩沖液或溶媒或蛋白質(zhì)溶液與1傷病毒混合。加入一定量各滅活病毒實施例中標明的并重新與后面的病毒滴定液混合的貯備液。在各實施例提到的時間和溫度后，移開樣品并用雙測定法滴定，以便能測定與方法相關(guān)的病毒滅活。用于研究的病毒種類縮寫名稱PI3V牛副流感3號病毒BPV牛細小病毒PPV豬細小病毒IBRV傳染性牛鼻氣管炎病毒BVDV牛病毒性腹瀉病毒CPV犬細小病毒BAV-11型牛腺病毒Reo33型呼腸孤病毒流感A流感A病毒—山東流感B流感B病毒—B巴拿馬本文進一步使用的縮寫/名稱EME培養(yǎng)基伊格爾最小必需培養(yǎng)基BeriateP凝集因子VIII施行巴氏消毒的補體濃縮物(BehringwerlcsAG，Marburg，Germany)HaemateP施行巴氏消毒的凝集因子VIII和Von-Wille-brand因子的濃縮物(BehringwerkeAG，Mar-burg，Germany)BeriplexP施行巴氏消毒的凝血酶原復(fù)合物的濃縮物(BehringwerkeAG，MarburgGermany)Venimmun靜脈用人體多價免疫球蛋白制劑(7S)(Behring-werkeAG，Marburg，Germany)Entozon下列組合物的制劑每1g顆粒中含0.059g二甲氧基-6-硝基-9-[(3-二乙基氨基-2-羥基)丙基氨基]吖啶二鹽酸化物和0.295g乳酸利凡諾(ASIDVeterinarVertriebsGmbH)QAE纖維素二乙基-2-羥基丙基氨基乙基纖維素(蛋白提純用離子交換劑)FCS胎兒腓腸血清實施例1用BACI滅活PI3V將EME培養(yǎng)基與PI3病毒和BACl混合并在37℃水浴上恒溫培養(yǎng)。經(jīng)指定的時間后，樣品進行病毒滅活試驗。結(jié)果見表1。表1在37℃下，用BACI滅活PI3病毒1相當于加入BACI并完全與反應(yīng)原料混合的時間從表1結(jié)果可見，用高劑量的BACI(0.1mg/ml，0.05mg/ml)迅速滅活PI3病毒，即在為測定PI3病毒傳染性而將含病毒樣品與BACI完全混合，取樣并滴定所需要的時間里，傳染性的病毒不見了。在其它兩個BACI試驗濃度(0.025mg/ml和0.0125mg/ml)，看得出病毒滅活明顯具有濃度—時間依賴關(guān)系。實施例2用BACI或Entozon滅活病毒用BACI或Entozon來處理表2所示的病毒樣品并在45℃下恒溫培養(yǎng)。試驗開始1或2小時取樣進行病毒滴定。表2在45℃下，通過BACI或Entozon法滅活病毒表2結(jié)果顯示，在選擇的試驗條件下，用BACI不滅活BPV。用Entozon滅活是可能的，實際上，滅活BPV比滅活PPV更快。實施例3用BACI和吖啶黃滅活病毒用BACI或吖啶黃來處理表3所示的病毒樣品的懸浮液并在37℃恒溫培養(yǎng)2小時。為測定病毒滅活情況，取樣滴定。表3</tables>表3結(jié)果顯示，BACI和吖啶黃都能滅活包膜病毒—IBRV，PI3V，BVDV，BACI的滅活作用稍大些。吖啶黃可滅活無膜病毒BPV，但BACI單獨用不能。發(fā)現(xiàn)在EME培養(yǎng)基中用吖啶黃和BACI可滅活病毒之后，檢查這些物質(zhì)是否也能滅活存在于含蛋白溶液中的病毒。用標明的病毒樣品來處理下列蛋白溶液BeriplexRPPV馬血清BVDV，BPVBeriateBVDV，BPV，BAV-1，Reo3，IBRVHoematePPV，Reo3VenimmunnBVDV，PPV，CPVFCSCPV卵尿囊液流感A，流感B這些實驗中獲得的結(jié)果以下面表格形式表示。實施例4用存在于蛋白溶液中的吖啶和氯芐烷銨來滅活病毒表4結(jié)果顯示，按方法學(xué)上簡單的方法，在蛋白溶液中用吖啶和/或氯芐烷銨來完全地滅活不同的病毒是可能的。然而這里清晰可見，單獨用氯芐烷銨只能滅活含包膜的病毒，而用吖啶卻能滅活含包膜的病毒而且也能滅活無包膜的病毒樣品。兩種物質(zhì)在殺病毒作用上具有協(xié)同作用，即合用吖啶黃和氯芐烷銨滅活病毒的數(shù)量高于單用兩種物質(zhì)。表4結(jié)果也顯示，在蛋白溶液中滅活病毒依賴于1.被滅活的病毒的種類2.蛋白溶液的組分和性質(zhì)3.滅活劑的濃度4.滅活時間5.滅活溫度滅活病毒也依賴于PH—來顯示該結(jié)果。在PH低于5.5時，病毒滅活比高PH時更慢。表5-7包含用吖啶黃和/或氯芐烷銨滅活病毒后，蛋白溶液生物活性的結(jié)果。用VenimmunR通過測定病毒滅活前后抗體的含量和用HaematcR，BeriateR和BeriplexR通過測定促凝集活性來測定生物活性—用國際單位測定。表4在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒<p>表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶或氯芐烷銨滅活病毒>表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒表4(續(xù))在蛋白溶液中用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒<p>表5測定用吖啶黃和氯芐烷銨滅活病毒，前后蛋白溶液的生物活性(抗體效價)1根據(jù)Spenarmn-Karber法，每個稀釋段用8個樣品，以log2稀釋度來計算效價20.001mg吖啶黃10.62mgmlBACI表6測定用吖啶黃和氯芐烷銨(BACL)滅活病毒前后蛋白溶液的生物活性(抗體效價)<1用log2稀釋度測定效價2I.＝滅活劑0.001mg/me吖啶黃+0.02mg/mlBACI表7測定用吖啶黃(A)和氯芐烷銨(BACL)滅活病毒—前后蛋白溶液的生物活性(凝集活性)<p>表5和6的結(jié)果顯示，在用吖啶和氯芐烷銨滅活病毒期間，在Venimmun中滅活(1型脊髓灰質(zhì)炎，和抑制血細胞凝集(HAH)抗體(Pl3和Reo3病毒)的含量的影響不超過試驗變化范圍(常量±1個log，稀釋段)。用吖啶/氯芐烷銨滅活后，凝集制劑(Boriate，Hae-mate，Beriplex)的活性減小是可授受的(表7)。權(quán)利要求1.一種滅活病毒的方法，其包括使用吖啶或吖啶衍生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中另外使用氯芐烷胺。3.在蛋白質(zhì)存在下進行權(quán)利要求1或2的方法并且其中保留這些蛋白質(zhì)的生物活性。4.權(quán)利要求1，2或3的方法，其中在20-60℃下進行恒溫培養(yǎng)。5.上述權(quán)利要求1-4中任一方法，其中溫度為25-37℃。6.上述權(quán)利要求1-5中任一方法，其中在PH5-9下進行恒溫培養(yǎng)。7.上述權(quán)利要求1-6中任一方法，其中以0.0001到1.0g/l的濃度使用吖啶或吖啶衍生物。8.權(quán)利要求7的方法，其中以0.0005到0.1g/l的濃度使用吖啶或吖啶衍生物。9.上述權(quán)利要求2-8中任一方法，其中以0.004到0.1g/l的濃度使用氯芐烷銨。10.權(quán)利要求9的方法，其中以0.001到0.05g/l的濃度使用氯芐烷銨。11.上述權(quán)利要求1-10中任一方法，其中恒溫培養(yǎng)的時間為0.5h-10.0h。12.權(quán)利要求11的方法，其中恒溫培養(yǎng)的時間為2-5h。13.上述權(quán)利要求1-12中任一方法，其中病毒為細小病毒或其它無包膜病毒。14.上述權(quán)利要求1-13中任一方法，其中病毒為包膜的病毒。全文摘要本發(fā)明涉及使用吖啶或吖啶衍生物，優(yōu)選合用氯芐烷銨來滅活包膜或無包膜的病毒。優(yōu)選地，在較大地保留所含蛋白生物活性下進行本發(fā)明方法。文檔編號A61L2/00GK1132249SQ95120599公開日1996年10月2日申請日期1995年12月8日優(yōu)先權(quán)日1994年12月10日發(fā)明者D·伯恩哈特申請人:柏林魏克股份公司