專利名稱：含有n-取代甘氨酸的血管舒緩激肽拮抗劑肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種激肽，更具體地說(shuō)，涉及血管舒緩激肽受體拮抗劑。
血管舒緩激肽(BK)是一種內(nèi)源性肽類激素，通過一組被稱為激肽釋放酶的肽鏈內(nèi)切酶的作用，使激肽原蛋白水解斷開而釋放。在由刺激外周A-和C-纖維神經(jīng)元而引發(fā)的包括疼痛和痛覺過敏等多種病理生理學(xué)反應(yīng)中，血管舒緩激肽是介體。有證據(jù)表明，BK在炎癥反應(yīng)中起重要的作用，并且是幾種病癥的重要介體，包括與膿毒癥有關(guān)的低血壓，以及肺支氣管疾患，如氣喘。
BK拮抗劑被認(rèn)為在阻止或降低BK的作用，并隨之消除或減輕上面提到的疾病是有用的。還有令人信服的證據(jù)表明，血管舒緩激肽在治療如下病癥中可能是有用的頭部創(chuàng)傷性水腫(腫脹)，嚴(yán)重?zé)齻鸬乃[和疼痛，以及與手術(shù)或癌癥有關(guān)的疼痛。
血管舒緩激肽是一個(gè)具有精氨酸1-脯氨酸2-脯氨酸3-甘氨酸4-苯丙氨酸5-絲氨酸6-脯氨酸7-苯丙氨酸8-精氨酸9序列的九肽。在此所用的數(shù)字編碼通常用于將激動(dòng)劑或拮抗劑的相關(guān)序列與血管舒緩激肽的親本結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較的場(chǎng)合中。K.G.Claeson及其同事(美國(guó)專利4,242,329)證明，含有以D-苯丙氨酸或D-脯氨酸置換脯氨酸7的經(jīng)修剪的血管舒緩激肽，顯示出有弱的，但是可測(cè)定的血管舒緩激肽拮抗劑活性。Stewart將D-苯丙氨酸引入血管舒緩激肽序列的第7位置，結(jié)果產(chǎn)生對(duì)血管舒緩激肽受體具有拮抗活性的肽(美國(guó)專利No.4,801,613)。盡管這些化合物在理論上是令人感興趣的，但它們?nèi)狈ψ鳛橛谢钚运巹┑淖銐虻男Я腕w內(nèi)穩(wěn)定性。
G.Breipohl和其同事在Hoechst(EPA 0 455 133 A2)以及D.Kyle和其同事在Scios-Nova(PCT/US92/03031)已經(jīng)開發(fā)出一種高效血管舒緩激肽拮抗劑，它是在血管舒緩激肽序列的第7位置引入D-Tic，D-環(huán)己丙氨酸或者引入取代的D-脯氨酸類似物。在Hoechst合成的化合物含有D-Tic7，并且在第8位置必須含有一個(gè)雜環(huán)氨基酸，其中α-氨基酸氮和α-碳被引入到一個(gè)雜環(huán)中，除此之外，這種殘基的例子還包括L-Oic或L-Tic。Kyle合成的化合物在第8位置引入了類似的雜環(huán)或者取代的4-羥基脯氨酸或取代的4-硫代脯氨酸。Young和其協(xié)作者已將N-芐基甘氨酸引入到血管舒緩激肽序列的第7位置，并且得到了具有中度血管舒緩激肽受體激動(dòng)劑活性的肽(第十三屆美國(guó)肽研討會(huì)，埃德蒙頓，阿爾伯他，1993年6月20日)。
盡管已經(jīng)有了一些成果，但仍然非常需要提供新的，經(jīng)過改進(jìn)的，具有有用的拮抗劑特性的BK拮抗劑。本發(fā)明的主要目的就是提供這樣一種在其肽鏈中含有N-取代甘氨酸的拮抗劑。
用N-取代的甘氨酸作為其中設(shè)計(jì)關(guān)鍵的有效的血管舒緩激肽拮抗劑，在以前尚未被報(bào)導(dǎo)過。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種血管舒緩激肽拮抗劑，它們含有一個(gè)或者多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基，其中的N-取代基可以是一個(gè)烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)基，芳香基，或芳香雜環(huán)基。這些化合物已顯示出是血管舒緩激肽的高效拮抗劑，并且已證明在體內(nèi)有極好的穩(wěn)定性和作用持續(xù)時(shí)間。作為有效的血管舒緩激肽拮抗劑，本發(fā)明的化合物被認(rèn)為對(duì)治療由血管舒緩激肽所介導(dǎo)的一些病理狀況是有用的，包括疼痛，炎癥，水腫，與頭部損傷有關(guān)的水腫，叮咬和刺痛，周期性偏頭痛，SIRS/膿毒癥，慢性炎癥，燒傷，小細(xì)胞癌，與氣喘有關(guān)的呼吸道超敏感性和炎癥。
發(fā)明詳述概括地說(shuō)，本發(fā)明的血管舒緩激肽受體拮抗劑是一種含有一個(gè)或者多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基的肽。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了有如下面通式(1)的血管舒緩激肽受體拮抗劑Z’-Z0-A1-B2-C3-D4-E5-F6-G7-H8-I9-J10(I)其中Z’可任選為不存在，但如果存在，則是氫，乙酰基，金剛烷羥基，金剛烷乙?；?，(C1～C8)-烷基，烷?；蓟酋；?，烷氧羰基，或者是一個(gè)二氧奎寧環(huán)基-羧酸的衍生物；Z0可任選為存在，或者Z0和A1(可能相同或不同)代表一個(gè)直鏈，氫，從如下氨基酸衍生而來(lái)的氨基酸殘基D或L精氨酸，D或L賴氨酸，D或L鳥氨酸，或者H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)nCO-(其中n＝0-3)，或者是按照藥物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行的在生理pH下含帶正電荷的雜原子的精氨酸的普通取代，例如含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍或烷基鏻部分(moieties)的鳥氨酸，精氨酸，或賴氨酸的類似物或同系物，條件是當(dāng)A1是H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)nCO-(其中n＝0-3)時(shí)，Z’和Z0不存在；當(dāng)A1是氫時(shí)，Z0和Z’不存在。
B2和C3可能相同或不同，是脯氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，硫脯氨酸，N-(甲基)絲氨酸，N-(甲基)蘇氨酸，N-甲苯基丙氨酸，甘氨酸或NR’CHR”CO，其中R’和R”獨(dú)立地是氫，烷基(例如C1～C8直鏈或支鏈烷基或C3～C8環(huán)烷基)，芳基，雜芳基，或烷氨基；D4是甘氨酸，丙氨酸，或噻吩丙氨酸；B2C3D4E5可以被-NH(CH2)nCO-取代，其中n是從4到14的整數(shù)；E5是苯丙氨酸，甲基取代的苯丙氨酸，甘氨酸，環(huán)戊基甘氨酸，環(huán)己基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，2-二氫化茚甘氨酸，噻吩丙氨酸，N-(2-二氫化茚)甘氨酸，或N-取代的甘氨酸，其中取代基是烷基(C1-C8)，環(huán)烷基(C3-C8)，CH2Ar，CH2CH2Ar其中Ar是芳基，烷噻吩基，芳香族氨基酸，或者是在α-氮原子或α-碳原子上以甲基或乙基取代的芳香族氨基酸；F6是一個(gè)側(cè)鏈可能被取代的中性、堿性或酸性的脂肪族或芳香族氨基酸，例如被取代的絲氨酸，或半胱氨酸，其取代基可選自如下基團(tuán)N-(烷基)-琥珀酰亞胺，N-(烷基)吡咯烷酮，烷基(C1-C20)，鏈烯烷基(C2-C20)，芳基，或烷芳基(C7-C20)；G7是一個(gè)芳香氨基酸，包括D-Tic，D-Dic，D-苯丙氨酸，二氫化茚甘氨酸，D-環(huán)戊基甘氨酸，D-環(huán)己基甘氨酸，D-脯氨酸，或者是在第3或第4位置以烷基，芳基，硫代烷基(thioalkyl)，硫代芳基(thioaryl)，氧烷基(oxyalkyl)，或氧代芳基(oxyaryl)取代的脯氨酸；或者是一個(gè)N-取代的甘氨酸殘基，其中取代基可以是芳基，烷芳基，-CH2R或-CH2CH2R，其中R是二氫化茚，吲哚，萘基或苯基；H8是一個(gè)選自如下式所示的氨基酸殘基 其中m是一個(gè)1～6的整數(shù)；R1是烷基(C1-C12，直鏈或支鏈)，環(huán)烷基(C3-C8)，單環(huán)或多環(huán)芳基(例如苯基或萘基)，含有3-8個(gè)選自碳、氮、氧或硫原子的單環(huán)或多環(huán)的雜芳基或雜環(huán)基。R1還可以是被取代的環(huán)烷基，含有1～4個(gè)選自如下的取代基氨基，苯并基，羥基，巰基，巰基烷基，烷基，氧烷基(oxyalkyl)，烷氧基(alkyloxy)，羧基，鹵素，苯基，三氟甲基，三氟甲氧基，氨烷基，烷氨基，或氨甲?；?；或者R1也可以是被取代的芳基或雜芳基，含有1～4個(gè)選自從如下基團(tuán)的取代基氨基，苯基，羥基，巰基，巰基烷基，烷基，氧烷基，烷氧基，羧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，氨烷基，烷氨基，或氨甲酰基；R2是氫，甲基或高級(jí)烷基(例如直鏈或支鏈的1～8個(gè)碳原子的烷基)，或者是一個(gè)氨基酸的酸性，堿性或中性的側(cè)鏈(烷基或芳香基)；當(dāng)G7是一個(gè)N-取代的甘氨酸時(shí)，H8可以是順-內(nèi)-八氫吲哚-2-羰基。
I9不存在或者是一個(gè)直鏈，羥基，或一個(gè)堿性、酸性或中性氨基酸，具體地說(shuō)，是精氨酸或賴氨酸或H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)n-NH-其中n＝0～3，或者按照藥物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行的在生理pH下含帶正電荷的雜原子的精氨酸的普通取代，例如含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍，或烷基膦部分的精氨酸或賴氨酸的類似物或同系物，條件是當(dāng)J10存在時(shí)，I9不是OH，當(dāng)J10不存在時(shí)，I9不存在或不是一個(gè)直鍵；J10不存在，或者如果存在，則是羥基，或者是一個(gè)堿性，酸性或中性的氨基酸，或O-R，或NHR，在此R是一個(gè)含有1～15碳原子的烷基(直鏈或分支鏈的)。
本發(fā)明是建立在如下發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上把一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基引入與血管舒緩激肽有關(guān)的肽序列中，將產(chǎn)生基本上具有血管舒緩激肽拮抗劑活性的拮抗劑。另外還發(fā)現(xiàn)，肽鏈中含有N-取代甘氨酸的某些肽，會(huì)顯示出有用的激動(dòng)劑活性。但是，本發(fā)明主要是涉及一種在肽鏈中含有N-取代甘氨酸的新型肽，并證明具有突出的血管舒緩激肽活性以及伴隨的其他一些以后將要談到的有用特性。
重要的是，同一些已有的高效化合物相比較，該化合物的藥理學(xué)表現(xiàn)顯著不同，已有的高效化合物例如HOE-140，即具有如下通式的肽D-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸-甘氨酸-Thi-絲氨酸-D-Tic-Oic-精氨酸盡管HOE-140對(duì)2型血管舒緩激肽(BK2)受體非常有效，但在多數(shù)體外或體內(nèi)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)1型血管舒緩激肽(BK1)受體沒有活性。新近的資料表明，B1受體的激活對(duì)慢性炎癥或持久性痛覺過敏癥狀的各種模型是重要的(Dray，A.等，TIPS，14 287(1993))。在一種B1受體拮抗劑模型中(LPS處理的免血壓測(cè)定法)，本發(fā)明的優(yōu)選化合物顯示出基本的體內(nèi)試驗(yàn)活性。與之相比較，在該試驗(yàn)中HOE-104沒有活性。
在此公開的化合物比以前設(shè)計(jì)的化合物更具經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢(shì)，合成本發(fā)明中的N-取代甘氨酸將非常節(jié)約，因?yàn)闆]有多重立體中心結(jié)構(gòu)，否則需涉及復(fù)雜，昂貴的殘基，如Oic或4-取代的羥脯氨酸或硫代脯氨酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在血管舒緩激肽的肽序列第7或第8位置引入N-取代的甘氨酸殘基，可以產(chǎn)生高效的血管舒緩激肽受體拮抗劑。這些化合物與以前設(shè)計(jì)的不同，其中所含的雜環(huán)氨基酸不受限制，環(huán)中僅含有氨基酸殘基的氮原子，例如取代的脯氨酸或八氫-吲哚-2-羧酸(Oic)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中包括有這樣一種化合物在其如前面規(guī)定的血管舒緩激肽序列中的第8位置，含有N-環(huán)戊基，N-環(huán)己基，N-芳香基或N-烷芳基甘氨酸。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員都認(rèn)識(shí)到，在組織中可能存在不同的受體亞型。因此，對(duì)于一種特效的化學(xué)治療，其最優(yōu)的實(shí)施方案將取決于治療作用所針對(duì)的疾病狀態(tài)和血管舒緩激肽拮抗劑所針對(duì)的組織。對(duì)于這些參數(shù)只能通過對(duì)人的臨床測(cè)定來(lái)進(jìn)行確實(shí)的研究，但是在本發(fā)明公開內(nèi)容中所顯示的對(duì)動(dòng)物組織的作用和受體結(jié)合資料可作為選擇活性化合物的一種指導(dǎo)。
在此所使用的“血管舒緩激肽受體拮抗劑”，其定義為，一種能阻斷血管舒緩激肽與其受體結(jié)合的能力，或者能引起血管舒緩激肽對(duì)其受體的結(jié)合發(fā)生某種改變，以至使有效的信號(hào)傳遞不能發(fā)生的分子拮抗劑可以是典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。因此，受體拮抗劑不必像天然配體那樣結(jié)合在相同的位點(diǎn)或以相同的取向相結(jié)合，但是應(yīng)該證明，其分子與受體的物理性相互作用而阻斷了受體的活性。
對(duì)這里使用的其他術(shù)語(yǔ)可作如下定義“血管舒緩激肽型肽”是一種含有至少一個(gè)連接二個(gè)氨基酸的酰胺鍵的分子，并具有與哺乳動(dòng)物血管舒緩激肽受體相結(jié)合的能力。血管舒緩激肽型肽可能是激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，拮抗劑，或者在小于1mmol的濃度下，除了可測(cè)定的與哺乳動(dòng)物血管舒緩激肽受體相結(jié)合外，沒有可測(cè)定的生物活性。
術(shù)語(yǔ)“芳香雜環(huán)”和“雜芳基”指的是單環(huán)或多環(huán)的芳香族環(huán)系統(tǒng)，含有氮，氧，或硫，并且包括(但不局限于)吡咯，吡啶，吲哚，噁唑，吡唑，嘧啶，嘌呤，鳥嘌呤，腺嘌呤，吡嗪，喹啉，異喹啉，呋喃，苯并呋喃，苯并噁唑，噻吩，苯并噻吩和噻唑。
術(shù)語(yǔ)“芳香基”或“芳基”包括苯基，萘基，二苯基，二氫化茚，或芴。
“雜環(huán)”指的是含有3～8個(gè)原子的單環(huán)或多環(huán)，原子包括碳和至少1個(gè)選自氮、氧或硫的原子。這些結(jié)構(gòu)包括上述定義的芳香雜環(huán)結(jié)構(gòu)，以及環(huán)氧化物，環(huán)氧乙烷，四氫呋喃，四氫吡喃，氮丙啶，β-內(nèi)酰胺，γ-內(nèi)酰胺，哌啶，哌嗪，吡咯烷酮，二氮雜，氮雜，噁唑烷，或噁唑烷酮。
前面提到的“烷?；被颉巴檠趸睉?yīng)被理解為分別含有2-8個(gè)和1-8個(gè)碳原子。前面提到的烷基取代基，例如在烷基中，可能獨(dú)立地或共同含有1～8個(gè)碳原子。
前面提到的脯氨酸的第3或第4位置可表示如下 這里使用的“精氨酸取代物”指的是按照藥物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行的精氨酸的普通取代，在生理pH下它將具有一個(gè)帶正電荷的雜原子。它們包括，但不局限于，含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍或烷基鏻部分的精氨酸，鳥氨酸或賴氨酸的類似物和同系物。
在描述氨基酸時(shí)，如歐洲生物化學(xué)雜志，138，9(1984)所述，通用于氨基酸的三字母編碼已被通常采用。但是，對(duì)于描述新型N-取代的甘氨酸，用這些縮寫有時(shí)會(huì)引起混淆。因此，為明了起見，對(duì)在此所使用的某些殘基的幾個(gè)縮寫表述如下 Igl＝2-二氫化茚 NMch＝N-(甲基環(huán)己基) NPeg＝N-(苯乙基甘氨酸 甘氨酸 甘氨酸 NBng＝N-(芐基) NPhg＝N-(苯基) NCpg＝N-(環(huán)戊基)甘氨酸甘氨酸甘氨酸 NChg＝N-(環(huán)己基) Cpg＝環(huán)戊基甘氨酸 δ-Gpa＝δ-胍基戊酸甘氨酸本發(fā)明中使用的另一些縮寫表示如下BOC 叔-丁基氧羰基Bop-C1雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯D-Dic二氫異喹啉-3-基-羥基DMF 二甲基甲酰胺Oic 順式-內(nèi)-八氫吲哚-2-羰基PyBrop 溴代-三-吡咯烷子基六氟磷酸鏻TFA三氟乙酸Tic1，2，3，4-四氫異喹啉-3-基-羰基與本發(fā)明有關(guān)的肽可以用各種本領(lǐng)域的人員熟悉的常規(guī)途徑來(lái)制備。例如，很多肽可以通過液相或者固相技術(shù)，用本領(lǐng)域人員熟知的程序來(lái)合成(J.史泰華等，固相肽合成，皮爾斯化學(xué)公司，(1984)(M.伯丹斯基等，肽合成實(shí)踐，斯普林杰·維拉格出版社，1984，伯丹斯基，肽合成原理，斯普林杰·維拉格出版社(1984))(G.巴蘭尼等，國(guó)際肽及蛋白研究雜志30705739(1987))。但是，要把氨基酸偶聯(lián)到受阻的N-取代甘氨酸上，只能用特殊的縮合劑，從被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)的氨基酸得到，所用縮合劑包括Bop-C1(R.D.唐等，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志107，4342(1985)或PyBrop(Coste，J.，肽第二十一屆歐洲肽研討會(huì)進(jìn)展(1990))或?；?貝爾曼等，有機(jī)化學(xué)雜志55，721-728，(1990))或?；?L.A.卡皮諾等，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志112，9652(1990))。固相技術(shù)(R.N.祖科爾曼，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志114，10646(1992)是已知的借助固相合成法達(dá)到合成包含N-取代甘氨酸的肽的途徑，它是通過用α-鹵代羰基化合物，使胺和苯胺N-烷基化來(lái)合成N-取代的甘氨酸。但是，允許使用廉價(jià)而有效的偶聯(lián)劑Bop-C1的固相技術(shù)，以前未被報(bào)導(dǎo)過。
新的N-取代甘氨酸或N-取代氨基酸可用下述方法合成結(jié)構(gòu)為R1NH2的胺或苯胺可以與一個(gè)被適當(dāng)保護(hù)的，具結(jié)構(gòu)A的α-鹵代乙酸鹽反應(yīng)，生成N-取代的氨基酸B，反應(yīng)是在極性溶劑中進(jìn)行的，例如可用乙腈，二氯甲烷，氯仿，四氫呋喃，或二甲基甲酰胺，其中可加入或不加入另外的堿，如叔胺，金屬氫化物，金屬碳酸鹽或磷酸銨，金屬二磷酸鹽或二磷酸銨。通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法對(duì)α-氨基實(shí)行保護(hù)，可得到適合用于肽合成常規(guī)方法的氨基酸衍生物C，(T.格林尼和P.G.M.武茲提供了許多適合于通常用于肽合成技術(shù)的保護(hù)基實(shí)例(J.格林尼等，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，第二版，約翰·威利父子，(1991))。 其中X＝鹵素或離去基團(tuán)，P1和P2是保護(hù)基。
可選地，使適合的被保護(hù)的氨基酸與包含一個(gè)離去基團(tuán)X的部分反應(yīng)而生成B，離去基團(tuán)包括例如，氯，溴，碘，甲基磺酸鹽，甲磺酰鹽，三氟化物的酯等。通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法對(duì)該胺進(jìn)行保護(hù)，可得到一個(gè)用于肽合成的中間體(見J.格林尼等，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，第二版，約翰·威利父子，(1991))。在受限制的情況下，X可能被陰離子置換，并通過此陰離子的烷基化作用而直接生成C，在此陰離子是通過使一個(gè)N-保護(hù)的(用基于氨基甲酸乙酯或氨磺酰的保護(hù)基)氨基酸，用強(qiáng)堿如NaH使之去質(zhì)子化而形成的。 其中X＝鹵素或離去基團(tuán)，P1和P2是保護(hù)基最后，中間體B可能通過還原性胺化作用來(lái)形成，在此適合的胺和醛或酮被縮合形成席夫堿或亞胺，然后用氫和催化劑或者活性氫化物試劑(例如氰基氫硼化鈉或氫硼化鈉)還原成目的胺B。再通過用本領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的方法對(duì)該胺進(jìn)行保護(hù)，可得到一個(gè)適合用于肽合成的中間體C。 其中P1和P2是保護(hù)基，而R3-Co-R4代表-環(huán)酮或一個(gè)直鏈酮，或者是一個(gè)醛，并由于還原性胺化作用而提供一個(gè)R1。
血管舒緩激肽拮抗劑的應(yīng)用是用于治療由血管舒緩激肽或其密切相關(guān)的代謝物所中介的，包括創(chuàng)傷，炎癥或其它一些病理狀態(tài)。其應(yīng)用可能包括治療叮咬，刺傷，一般的創(chuàng)傷，頭部創(chuàng)傷，包括炎癥性腸道疾病在內(nèi)的各種炎癥，燒傷，皮疹，休克或與膿毒癥有關(guān)的低血壓，以及疼痛，特別是與外科手術(shù)或牙科手術(shù)有關(guān)的疼痛。此外，血管舒緩激肽拮抗劑還可能用于治療呼吸道超敏和炎癥，以及其他與氣喘有關(guān)的癥狀。血管舒緩激肽是一個(gè)公認(rèn)的促有絲分裂劑，并且在本發(fā)明中公開的化合物，在體外試驗(yàn)中已顯示不出表明它們可能具有作為抗癌劑用途的活性。
這些化合物可能被局部給藥，或通過注射，輸液給藥，或者在適當(dāng)?shù)馁x形劑中以口服懸液或以片劑，丸劑，膠囊，Caplets等劑型給藥。給藥劑量和方式將由血管舒緩激肽的應(yīng)用情況來(lái)確定，并且可通過臨床檢驗(yàn)的常規(guī)方法來(lái)測(cè)定，以找到最佳的劑量。這些劑量預(yù)期在0.001mg/kg～100mg/kg活性化合物的范圍內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的化合物是由氨基酸組成的，并由于其酸性或堿性而可能形成鹽，因此任何藥理學(xué)允許的，由在此所述的化合物衍生而來(lái)的鹽，都認(rèn)為是本發(fā)明的一部分，例如鹽酸鹽，乙酸鹽，磷酸鹽，馬來(lái)酸鹽，檸檬酸鹽，苯甲酸鹽，水楊酸鹽，琥珀酸鹽，抗壞血酸鹽等。藥物化學(xué)中的一個(gè)通常途徑是修飾已知的，以肽為基礎(chǔ)的藥物，以形成顯示出較較大生物有效度的酯或酰胺前體藥，因此由在此所公開的化合物衍生而來(lái)的前藥，也是本發(fā)明的組成部分。設(shè)計(jì)和制備前藥的方法在藥物化學(xué)文獻(xiàn)中已有詳細(xì)的敘述(Bundgaard，H，前藥的設(shè)計(jì)，Elsevier(1985))。
本發(fā)明的化合物可以與其它藥理學(xué)制劑一起同時(shí)給藥，例如激肽拮抗劑，包括神經(jīng)激肽拮抗劑，或類阿片激動(dòng)劑，蛋白酶抑制劑，特別是彈性蛋白酶抑制劑，或者還可以與其它鎮(zhèn)痛藥或抗癌藥共同給藥。
本發(fā)明的代表性化合物包括如下的化合物，在此NBng，NChg，NCpg，NPeg，NMch和NPhg分別代表N-芐基甘氨酸，N-環(huán)己基甘氨酸，N-環(huán)戊基甘氨酸，N-苯乙基甘氨酸，N-甲基環(huán)己基甘氨酸和苯基甘氨酸，包括如下化合物1. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic化合物2. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-Nchg化合物3. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl*-NChg-Arg*異構(gòu)體A化合物4. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl*-NChg-Arg
*異構(gòu)體B化合物5.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg化合物6.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-Oic-Arg化合物7.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-NChg-Arg化合物8.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg-Arg化合物9.D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NChg-Arg化合物10. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg-Arg化合物11. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-Oic-Arg化合物12. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch-Arg化合物13. δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg化合物14. δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg化合物15. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg-Arg化合物16. D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg-Arg化合物17. D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Nchg-Arg化合物18. δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg上面列出的代表性化合物中，相當(dāng)于通式(I)的化合物如下Z’不存在Z0是D-Arg或δ-Gpa或不存在A1是Arg或δ-GpaB2是Pro或HypC3是HypD4是GlyE5是ThiF6是SerG7是NBng，NPeg，NChg或D-Tic，Igl，D-Phe或D-CpgH8是Oic，Arg，NChg，MNch，NPhg，G7和H8至少一個(gè)是N-取代的甘氨酸I9不存在或是Arg；和J10不存在盡管在前面已說(shuō)明N-取代的甘氨酸殘基是位于所例證肽的第7和/或第8位置(用BK序列數(shù)字編碼)，但是應(yīng)該理解，N-取代甘氨酸的定位是可以改變的。同樣，根據(jù)本發(fā)明，除了已說(shuō)明的以外，其它的N-取代基和變通也是可用的。例如，略去末端精氨酸基就可以得到有用的例舉化合物的類似物。但是，根據(jù)本發(fā)明，一組優(yōu)選的肽應(yīng)包括含有8-10個(gè)氨基酸的通式(1)化合物，其中第7和/或第8位置(用BK序列數(shù)字編碼)是一個(gè)N-取代甘氨酸，優(yōu)選的取代基是苯基，芐基，苯乙基，環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基，或者低碳烷基環(huán)己基如甲基環(huán)己基。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選化合物亞組由下式定義D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly其中甘氨酸殘基的取代基R是下列基團(tuán)取代的環(huán)己基甲基、乙基，丙基，異丙基，甲氧基，乙氧基，正或異丙氧基，CH2OCH2CH3，CH2CH2OCH(CH3)2，CH2CH2OCH3，CH2CH2OCF3，硫代甲基，硫代乙基，硫代丙基(正丙基或異丙基)。
通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，其中的拮抗劑代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。列舉這些實(shí)施例的目的是例證性的和啟發(fā)性的，而不是作為一種限制。實(shí)施例1合成例舉肽的一般程序在精氨酸C-末端作肽端接對(duì)所有的氨基酸α-氮用叔丁氧羰基保護(hù)。絲氨酸用芐基醚保護(hù)。精氨酸胍基用甲苯磺酰基保護(hù)，除非另有說(shuō)明。對(duì)羥脯氨酸的側(cè)鏈不作保護(hù)。樹脂的制備將預(yù)先用Na-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸(每克約0.25～0.75當(dāng)量)衍生的聚丙烯酰胺(PAM)樹脂(通常用O.20～2g，Bachem)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)(Stewart，J.M.等，固相肽合成，皮爾斯化學(xué)公司(1984))。用25ml干燥的CH2Cl2處理該樹脂，并通過氮?dú)獍l(fā)泡提供攪拌1分鐘。將此溶液干燥脫水，并用CH2Cl2重復(fù)洗2次(每次用25mlCH2Cl2)。同樣用二甲基甲酰胺重復(fù)洗3次(每次25ml)隨后再用二氯甲烷洗3次(每次25ml)。去保護(hù)將洗過的樹脂用25ml1∶1的三氯乙酸和二氯甲烷的混和液處理。用氮?dú)獍l(fā)泡攪拌持續(xù)5分鐘后，濾去溶劑。樹脂再用25ml1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合液處理，用氮?dú)獍l(fā)泡攪拌持續(xù)25分鐘后，濾去溶劑。中和將該樹脂依次用二氯甲烷洗(3次，每次25ml)，用二甲基甲酰胺洗(2次，每次25ml)，再用二氯甲烷洗。然后該樹脂再用10％(v/v)的二異丙基乙基胺在二氯甲烷中的溶液洗(3次，每次25ml)。該樹脂再用二氯甲烷洗(3次，每次25ml)，以便除去微量的堿。與N-Boc-氨基酸HOBt酯偶聯(lián)的方法將4當(dāng)量Boc保護(hù)的氨基酸溶解于最小量的二甲基甲酰胺(DMF)中，隨后再加入4當(dāng)量HOBt(1-羥基苯并三唑單水化物)。其中再加入4當(dāng)量DCC(二環(huán)己基碳化二亞胺)。在室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。過濾除去二環(huán)己基脲，將得到的濾液加到裝有N-去保護(hù)肽基樹脂的肽合成容器內(nèi)。繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將Boc保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到含有受阻仲胺(例如D-Tic，Oic或一個(gè)N-取代甘氨酸殘基)N-未端的肽基樹脂上的步驟將2當(dāng)量Boc保護(hù)的氨基酸，以及2當(dāng)量二異丙基乙基胺溶解于最小量二氯甲烷中。將該溶液在氮中冷卻至0C，并用2當(dāng)量Bop-Cl處理。在氮中，0℃下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。再將該均勻溶液加到裝有N-去保護(hù)肽基樹脂的肽合成容器中，隨后加入另含有2當(dāng)量二異丙基乙基胺的等體積二甲基甲酰胺。繼續(xù)攪拌2小時(shí)。在實(shí)施例中確定的特殊情況下，此步驟中使用了4當(dāng)量活化的氨基酸，同時(shí)也使用了加倍量的試劑和溶劑。偶聯(lián)后的洗滌步驟該樹脂先用二甲基甲酰胺洗(3次，每次25ml)，隨后再用二氯甲烷洗(3次，每次25ml)。對(duì)偶聯(lián)是否完成的評(píng)估用改進(jìn)的Kaiser方法(Stewart，J.M.等，固相肽合成，皮爾斯化學(xué)公司，(1984))，取少量該樹脂顆粒與茚三酮反應(yīng)，以定性測(cè)定偶聯(lián)反應(yīng)是否已經(jīng)完成。如果反應(yīng)已完成，該樹脂再用二氯甲烷洗，并去保護(hù)，使偶聯(lián)步驟繼續(xù)如上述進(jìn)行。如果看來(lái)還存在未反應(yīng)的胺，應(yīng)再次對(duì)樹脂進(jìn)行中和和偶聯(lián)步驟。進(jìn)行Kaise測(cè)定時(shí)，N-烷基氨基酸殘基可能會(huì)給出不規(guī)則的結(jié)果，在這種情況下，為了測(cè)定偶聯(lián)反應(yīng)是否完成，在將少量肽基樹脂樣品水解后，用定量氨基酸分析法可能是有價(jià)值的。用氟氫酸(HF)去保護(hù)仔細(xì)使該肽樹脂干燥后，將其移入特制的HF反應(yīng)容器中(Peninsula實(shí)驗(yàn)室)，先用1ml茴香醚處理肽，然后在低溫下凝集大約9ml HF。使反應(yīng)在0℃下持續(xù)45-60分鐘，然后在真空下仔細(xì)除去HF。將樹脂和清除劑混合物在真空下干燥1小時(shí)，然后仔細(xì)用無(wú)水乙醚洗該殘留物，并將此肽萃取到10％乙酸溶液中。將該乙酸溶液用反相制備型C18高效液相色譜儀純化(Dynamax or Vydac 30×2.5cm，10μ C18)，然后冷凍干燥成固體，得到目的肽。在Oic或N-取代的甘氨酸C-未端作肽端接將C-未端Boc-氨基酸(1.0mmol)溶解于10ml 95％乙醇和3ml水的混合液中。加入碳酸氫銫(1mmol)，攪拌反應(yīng)1小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上真空除去溶劑。加入少量苯并通過真空除苯而去除殘留的水分，直到形成白色的可游離移動(dòng)的粉未。將梅里菲爾德樹脂(Bachem，1％交鏈的，100-200目，～1meq/g，1.0meq)和銫鹽懸浮于干燥的，用氮?dú)馇鍧嵾^的二甲基甲酰胺(6-8ml/g樹脂)，在氮中，50℃下攪拌反應(yīng)24到36小時(shí)。將此溶液過濾，樹脂每次用下列溶劑50ml，順序地洗3次二甲基甲酰胺，50％二甲基甲酰胺水溶液，二甲基甲酰胺，以及乙醇。然后將樹脂干燥過夜。用在衍生化作用過程中得到的一部分樹脂，可制備接近Boc-氨基酸取代濃度的樹脂。象上述PAM樹脂一樣，可制備Boc-氨基酸衍生的樹脂用于肽合成和去保護(hù)。肽指征在此所使用的氨基酸分析方法，對(duì)通常存在的氨基酸可提供精確的定量分析。對(duì)特殊氨基的定量分析往往需要作徹底的方法改進(jìn)。用氨基酸分析儀，通過保留時(shí)間測(cè)定，可對(duì)一些特殊氨基酸如D-Tic，Oic，和N-取代甘氨酸作定性鑒定。類似的說(shuō)明也適用于肽鏈測(cè)序。對(duì)于能夠作定性鑒定，但不能以定量方式測(cè)定的殘基，被用星號(hào)(*)作標(biāo)記。從對(duì)化合物得到的數(shù)據(jù)表明，所有的化合物的序列都是正確的，在詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)論述中，對(duì)這些已作了明確的驗(yàn)證。通過肽測(cè)序法可鑒定特殊的殘基，但是對(duì)特殊殘基的定量分析還未能實(shí)現(xiàn)。用于本目的的低分辨率激光解吸附質(zhì)譜儀，能以大約0.1％的精密度測(cè)定分子離子。這種在精確度上的較小的預(yù)期局限性，證明是在計(jì)算的和表觀測(cè)定分子量之間存在約1a.m.u差異的原因，對(duì)幾個(gè)化合物報(bào)告了這種情況。實(shí)施例II化合物1的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-OicN-α-Boc-N-芐基甘氨酸乙酯將碳酸二特丁基酯(1.28g，5.7mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(2.0ml)的溶液，在攪拌下加到N-芐基甘氨酸乙酯(1.0g，5.17mmol，97.0％)和三乙胺(0.79ml，5.7mmol)溶于DMF(1.0ml)的溶液中。該溶液在氮?dú)庵?，于室溫下攪?9小時(shí)。在真空下蒸發(fā)除去二甲基甲酰胺，將得到的油狀物溶解于乙酸乙脂(50ml)中。用10％NaCO3溶液洗此乙酸乙脂層(二次，每次25ml)，再用鹽水冼(二次，每次30ml)，然后用MgSO4干燥，最后蒸發(fā)去除溶劑，得到標(biāo)題所示的化合物(1.48g，98.0％)為油狀物。1HNMR(CDCl3)，化學(xué)位移(δ)1.2-1.3(t，3H)，1.49(s，9H)，3.8(s.1H)，3.9(s，1H)，4.1-4.2(q，4H)，4.5-4.55(d，2H)，7.2-7.4(m，5H)；13C核磁共振(NMR)(CDCl3)化學(xué)位移(δ)13.95，14.04，28.06，28.12，47.54，47.93，50.85，51.33，60.70，80.16，80.33，127.22，127.31，127.93，128.36，137.195，137.43，155.40，155.56，169.67，169.71。N-α-Boc-N-芐基甘氨酸將溶于最小量水的NaOH(0.3g，7.57mmol)攪拌下加到N-α-Boc-N-芐基甘氨酸乙酯(0.74g，2.52mmol)溶于甲醇(5.0ml)的溶液中。此反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。真空蒸發(fā)去除甲醇，將得到的殘留物溶解于水中。此含水層用氯仿萃取(2次，每次50ml)，冷卻至0C，然后用1N HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，再用乙酸乙脂抽提該溶液。然后該乙酸乙酯層用鹽水洗，用MgSO4干燥，真空蒸發(fā)處理，產(chǎn)生1.18g(88.0％)標(biāo)題所示化合物。1H NMR(CDCl3)；δ1.49(s，9H)，3.82(s，1H)，3.98(s，1H)，4.52(s，1H)，4.56(s，1H)7.2-7.4(m，5H)，11.5(brs，1H)；13C NMR(CDCl3)，δ28.19，28.26，47.43，47.57，50.85，51.49，80.92，81.10，127.46，127.52，128.08，128.6，136.98，137.16，155.58，155.99，175.40，175.70。
按前面所述的方法制備Nα-Boc-Oci樹酯(0.6g，0.83meq/g)，順序地偶聯(lián)形成肽，然后用前述方法將肽從樹酯上斷裂下來(lái)，得到91∶3mg粗制品。用高效液相色譜法(HPLC)純化(10-65％CH3CN，0.1％三氟乙酸(TFA)，梯度時(shí)間大于55分鐘，(20ml/min)最后得到冷凍干燥的無(wú)色化合物146.1mg。激光解吸附質(zhì)譜(LD-MS)分析計(jì)算值1136(M+H)，測(cè)定值1136(M+H)。氨基酸分析(AAA)精氨酸(Arg)2.06(2)，羥脯氨酸(Hyp)0.83(1)，脯氨酸(Pto)0.99(1)，甘氨酸(Gly)0.99(1)，Thi*，絲氨酸(Ser)1.12(1)，Nbng*，0ic*。得到正確的序列分析結(jié)果。實(shí)施例III化合物2的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NchgN-(環(huán)己基)甘氨酸芐基酯將環(huán)己胺(14.3ml，125mmol)溶于50ml四氫呋喃(THF)中，在氮中冷卻至0℃，再將α-溴乙酸芐基酯(79.3ml，50mmol)溶于50mlTHF的溶液，滴加到此溶液中。使該反應(yīng)液升溫至室溫，然后攪拌大約15小時(shí)。真空下除去溶劑，將殘留物溶解于200ml二氯甲烷中，并用100ml 10％碳酸鈉洗。再用50ml二氯甲烷對(duì)該碳酸鈉溶液萃取二次。合并所有的二氯甲烷層，用無(wú)水硫酸鎂干燥，然后進(jìn)行真空濃縮。該殘留物用溶于二氧六環(huán)的4N HCl 26ml處理，真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，殘留物用冷無(wú)水乙醚研磨。收集此固體物，在真空下干燥幾小時(shí)，得到混雜有微量環(huán)己胺鹽酸鹽的該化合物鹽酸鹽15g。將此混合物溶于300ml二氯甲烷，并用100ml 10％碳酸鈉溶液洗此溶液。然后用二氯甲烷對(duì)此水溶液作及萃取。合并全部二氯甲烷層，先用硫酸鎂干燥，再用高真空(約1托)下干燥，得到標(biāo)題所述的11.63g純油狀化合物。1H NMR(CDCl3)δ1.0-1.32(m，4H)，1.55-1.78(0m，4H)，1.83(m，2H)，2.41(tt，J＝10，4H3，1H)，3.48(s，2H)，5.17(s，2H)，7.36(s，5H)，13C NMR(DMSO)，δ24.62，25.82，33.08，48.02，56.12，66.28，128.15，128.36，135.47，142.53。Boc-N-(環(huán)己基)甘氨酸芐基酯將N-(環(huán)己基)甘氨酸芐基酯溶于44.4ml＝氧六環(huán)中，和44.4ml1N NaOH的溶液，隨后再加入碳酸二特丁基酯(10.68g)。連續(xù)攪拌大約15小時(shí)，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)。得到的殘留物在100ml水和100ml乙酸乙酯之間作分配萃取。將二層分離，水層用5％硫酸氫鉀酸化至pH3。然后用乙酸乙酯萃取此水層，再將全部乙酸乙酯溶液合并，并用飽和碳酸氫鈉和飽和的氯化鈉溶液洗，用硫酸鎂干燥。先通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，再在高真空下進(jìn)一步干燥，最后得到14.50g油狀的，標(biāo)題所示化合物。1H NMR(CDCl3)δ0.95-1.55(m，14H)，1.63(m，1H)，1.77(m，4H)，3.70-4，1(m，3H)，5.16(s，2H)，7.36(s，5H)。Boc-N-(環(huán)己基)甘氨酸將Boc-N-(環(huán)己基)甘氨酸芐基酯(14.0g，40mmol)溶于240ml無(wú)水乙醇中，用干燥的氮?dú)獯迪?，并在惰性氣體下，小心地將10％的鈀炭加入伯爾裝置，以氫氣(4.3p.s.I)置換氮?dú)猓瑢⒋嘶旌衔镌谑覝叵抡駬u24小時(shí)以上。再用氮?dú)獯迪椿旌衔?，并通過一層硅藻土墊片過濾除去催化劑和固體物。濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而濃縮，殘留物被溶解于300ml乙酸乙酯中。用150ml 1N氫氧化鈉溶液萃取此乙酸乙酯層。然后在冰浴內(nèi)，用1N鹽酸將此堿性溶液酸化至pH3。再用乙酸乙酯萃取此酸性溶液(3次，每次用乙酸乙酯100ml)。然后用飽和氯化鈉溶液洗，真空濃縮成無(wú)色油狀物，并在高真空下進(jìn)一步干燥。將得到的玻璃狀固體用乙烷研磨，再經(jīng)過濾，干燥處理后，得到無(wú)色粉未狀的標(biāo)題所示化合物(8-89g)，熔點(diǎn)(M.P)103-104℃(不對(duì))，C.H.N分析(C13H23NO4)，C計(jì)算值60.68，測(cè)定值60.77，H計(jì)算值9.01，測(cè)定值9.20，N計(jì)算值5.44，測(cè)定值5.44。1H NMR(CDCl3)，δ1.07(m，1H)，1.10-1.55(m，4H)；1.43(s，9H)，1.55-1.9(m，5H)，3.67-4.13(m，3H)，11.33(brs，1H)，13C NMR(CDCl3)δ25.43，25.68，28.20，30.91，44.03，44.26，44.36，44.42，54.03，54.18，56.13，80.36，80.47，154.81，176.83。
按前面所述方法制備Nα-Boc-NChg樹酯(0.63g，0.79meq/g)，順序地偶聯(lián)形成肽，然后用前述方法將肽從該樹酯上斷裂下來(lái)，得到71mg粗制品。用HRLC純化(10-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)最后得到23g冷凍干燥的無(wú)色化合物2。LD-MS分析計(jì)算值1136.6(M+1)，測(cè)定值1136.5(M+1)，AAA精氨酸2.01(2)，羥脯氨酸0.81(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸0.98(1)，Thi*，絲氨酸1.27(1)，NChg*，Tic*。得到正確的序列分析結(jié)果。實(shí)施例IV
化合物3和化合物4的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl*-NChg-Arg*異構(gòu)體A和B(D.L)-N-(Boc)-2-二氫化茚甘氨酸按Porter和Shive的方法(Porter，T.H.和Shive，W.J.Med，Chem.11402(1968))制備(D.L)-2-二氫化茚甘氨酸。將D、L-2-二氫化茚甘氨酸(3.36g，17.54mmols)溶解于含有氫氧化鈉(1.76g，1.1當(dāng)量)的二氧六環(huán)(30ml)和水(15ml)的混合物中。加入碳酸二特丁基酯(4.35g，19.3mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)18小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去揮發(fā)性物質(zhì)，并用氮仿萃取含水的殘留物，然后用HCl酸化至pH2-3，再用乙酸乙酯萃取。用鹽水洗此乙酸乙酯溶液，并用無(wú)水硫酸鎂干燥。除去溶劑后得到2.87g(56％)(D.L)-N-(Boc)-2-二氫化茚甘氨酸。
將預(yù)先用Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸聚丙烯酰胺(PAM)樹脂(1.52g，Bachem，1.0meq)，裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被順序地偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹脂上斷裂下來(lái)，得到330mg粗制品。用HPLC法純化。100mg這種粗制品(10-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20mL/min)，得到30.4mg異構(gòu)體A(化合物3)和31.5mg異構(gòu)體B(化合物4)。HPLC保留時(shí)間(5-55％CN3CN，0.1％TFA超過50分鐘，C185μ，分析柱)異構(gòu)體A(化合物3)27.9分鐘，異構(gòu)體B(化合物4)28.6分鐘，化合物3(異構(gòu)體A)LD-MS分析計(jì)算值1306(M+H)，測(cè)定值1307(M+H)。AAA精氨酸3.36(3)，羥脯氨酸0.93(1)，脯氨酸0.90(1)，甘氨酸0.90(1)，Thi*，絲氨酸0.91(1)，Nchg*，Igl*?；衔?(異構(gòu)體B)LD-MS分析計(jì)算值1306(M+H)，測(cè)定值1305.8(M+H)。AAA精氨酸3.43(3)，羥脯氨酸0.92(1)，脯氨酸0.89(1)，甘氨酸0.89(1)，Thi*，絲氨酸0.91(1)，NChg*，IgI*。
實(shí)施例V化合物5(CP-0597)的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg將預(yù)先用Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹酯裝入用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)，肽被順序地偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)，得到330mg粗制品。整個(gè)合成過程中用了4當(dāng)量預(yù)先活化的Boc-氨基酸。粗制品HPLC純化(10-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)后得到131.8mg化合物5。HPLC保留時(shí)間(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C185μ，分析柱，保留時(shí)間(R.t)＝30.3分鐘，LD-MS分析計(jì)算值1293，測(cè)定值1293(M+H)，氨基酸分析精氨酸3.13(3)，羥脯氨酸0.90(1)，脯氨酸0.95(1)，甘氨酸0.98(1)，THi*，絲氨酸1.04(1)，NChg*，Tic*。得到正確的序列分析結(jié)果實(shí)施例VI化合物6的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-Oic-Arg將預(yù)先用Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯?；?L-精氨酸衍生化的Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹脂(0.24g，Bachem，0.14meq)，裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被順序地偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。一部分該粗制品用HPLC純化(5-55％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)，得到8.3mg化合物6，HPLC保留時(shí)間(R.t)＝14.0分鐘(20-60％CH3CN，0.1為TFA超過30分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS分析計(jì)算值1293，測(cè)定值1293(M+H)。AAA精氨酸2.98(3)，羥脯氨酸1.08(1)，脯氨酸0.97(1)，甘氨酸1.10(1)，Thi*，絲氨酸0.87(1)，NBng*，Oic*。得到正確的序列分析結(jié)果。實(shí)施例VII化合物7的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-NChg-Arg將預(yù)先用Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM樹脂(0.240g，Bachem，0.14meq)，裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。一部分粗制品用HPLC純化(5-55％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)，得到42mg化合物7。HPLCR.t＝13.5分鐘，(20-60％CH3CN，0.1％TFA大于30分鐘，C18 5μ分析柱)。LD-MS分析計(jì)算值1280，測(cè)定值1280。AAA精氨酸3.03(3)，羥脯氨酸1.06(1)，脯氨酸0.99(1)，甘氨酸1.02(1)，THi*，絲氨酸0.90(1)，NBng*，NChg*。得到正確的序列分析結(jié)果。實(shí)施例VIII化合物8的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg-ArgN-環(huán)戊基甘氨酸芐基酯在0℃，攪拌下，將溶于20ml CH2Cl2的2-溴乙酸芐基酯(3.30ml，20.0mmol)溶液滴加到溶于20mlCH2Cl2的環(huán)戊基胺(8.60g，100mmol)溶液中。加完-2-溴乙酸芐基酯后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)17小時(shí)。真空除去有機(jī)溶劑，將殘留物溶于乙酸乙酯，并用飽和的Na2CO3溶液洗。用1N HCI萃取該溶液。用Na2CO3使此含水層成堿性，然后用氯仿萃取。有機(jī)溶劑層用MgSO4干燥并蒸發(fā)除去溶劑。殘留物用快速硅膠柱層析法純化，依次用己烷和己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)洗脫，得到2.3g(50.0％)標(biāo)題所示油狀化合物。1H NMR(CDCl3)δ1.25-1.85(m，9H)，3.0-3.12(m，1H)，3.43(s，2H)，5.15(s，2H)，7.27-7.42(m，5H)，13C NMR(CDCl3)δ23.72，32.71，49.53，59.03，66.24，128.1，128.32，135.42，172.29。N-α-Boc-N-環(huán)戊基甘氨酸芐基酯先將N-環(huán)戊基甘氨酸芐基酯(2.31g，9.9mmol)和三乙胺(1.66ml，11.9mmol)溶于3.0ml二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在攪拌下向此溶液加入溶于DMF(3.0ml)的碳酸二特丁基酯(2.16g，9.9mmol)。此溶液在N2中，在室溫下繼續(xù)攪拌19小時(shí)。真空蒸發(fā)除去DMF，得到的油狀物溶解于乙酸乙酯(50ml)。此乙酸乙酯層先用10％Na2CO3溶液洗(2次，每次25ml)，再用鹽水洗(2次，30ml)，用MgSO4干燥，蒸發(fā)除去溶劑后得到標(biāo)題所示的油狀化合物(3.28g，99.0％)。使用前對(duì)此化合物不作進(jìn)一步純化。13C NMR(CDCI3)δ23.44，28.13，29.11，29.80，44.86，56.28，66.61，79.96，128.15，128.30，128.46，135.5，155.0，170.48。N-α-Boc-N-環(huán)戊基甘氨酸將N-α-Boc-N-環(huán)戊甘氨酸芐基酯(3.28g，9.9mmol)溶解于有10％鈀炭(0.33g)脫氧酯化的乙醇(30ml)中。此反應(yīng)混合物在帕爾氧化器中，在氫氣下(30p.s.I)攪拌17小時(shí)。用一層硅藻土墊片過濾，蒸發(fā)除去乙醇。將得到的殘留物溶解于乙酸乙酯中，然后先用冷的1N Hcl(100ml)洗此乙酸乙酯層，再用鹽水洗(2次，每次100ml)，用MgSO4干燥并真空蒸發(fā)處理。將得到的化合物用乙酸乙酯/己烷重結(jié)晶，產(chǎn)生1.09g(47.0％)無(wú)色固體狀的標(biāo)題所示化合物。C，H，N分析，(C12H21NO4)C計(jì)算值59.24，測(cè)定值58.94，H計(jì)算值8.70，測(cè)定值8.69，N計(jì)算值5.76，測(cè)定值6.00。1H NMR(CDCl3)δ1.2-1.72(m，15H)，1.76-1.96(m，2H)，3.64-4.0(brs，2H)，4.1-4.6(m，1H)，10.36(brs 1H)。
將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹脂(1.52gBachem，0.5meq)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸被用于偶聯(lián)。用氟化氫(HF)去保護(hù)基后，得到428mg粗制品。將100mg粗制品用HPLC純化(10-65％ CH3CN，0.1％ TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)，得到22.3mg白色冷凍干燥的化合物8。HPLCR.t＝28.7分鐘(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C185μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1278.6，測(cè)定值1279.6(M+1)。AAA精氨酸2.93(3)，羥脯氨酸0.96(1)，脯氨酸1.01(1)，甘氨酸1.04(1)，THi*，絲氨酸0.90(1)，Tic*，Ncpg*。得到正確的序列分析結(jié)果。實(shí)施例IX化合物9的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NChg-Arg將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹脂(1.52g，Bachem，0.5meq)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸被用于偶聯(lián)。用氟化氫(HF)去保護(hù)基后，得到586.7mg粗制品。將100mg粗制品用HPLC純化(10-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)，得到72.8mg化合物9。HPLCR.t＝30.5分鐘(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1281.5，測(cè)定值1281.5(M+H)。AAA精氨酸3.11(3)，羥脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.95(1)，甘氨酸1.00(1)，THi*，絲氨酸1.06(1)，苯丙氨酸0.97(1)，Nchg*。實(shí)施例X化合物10D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg-ArgN-α-Boc-環(huán)戊基甘氨酸按Dunn的方法合成D-環(huán)戊基甘氨酸(Hill，J.T和Dunn.F.W.，J.Org.Chem，301321(1965))。向150ml二氧六環(huán)和75ml水的混合液中加入D-環(huán)戊基甘氨酸(3.93g，27.5mmol)和氫氧化鈉(27.5ml，1M溶液)。將溶液冷卻到0℃，加入碳酸二特基酯(6.60g，30.2mmol)。使反應(yīng)混合液升溫至室溫，攪拌約15小時(shí)。真空除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘留物溶于水，用5％NaOH堿化至pH9。含水層用乙酸乙酯萃取3次，合并提出物，用鹽水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到5.44g(81.5％)玻璃狀標(biāo)題所示化合物。1H NMR(CDCl3)δ1.15-1.9(m，8H)，1.45(s，9H)，2.25(m，1H)，3.99(dd，0.32H)，4.25(dd，0.68H)，5.01(d，7.0Hz，0.68H)，6.27(d，7.0Hz，0.32H)，NH和α-H產(chǎn)生由旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體引起的二個(gè)信號(hào)。
將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹脂(1.52g，Bachem，0.5meq)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸被用于偶聯(lián)。用氟化氫(HF)去保護(hù)基后，得到349mg粗制品。用HPLC純化100mg此粗制品(10-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于55分鐘，20ml/min)，得到30.2mg化合物10。HPLCR.t＝29.2分鐘(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1258.9，測(cè)定值1258.9(M+H)。AAA精氨酸3.13(3)，羥脯氨酸0.92(1)，脯氨酸0.96(1)，甘氨酸0.98(1)，THi*，絲氨酸1.02(1)，Cpg*，NChg*。實(shí)施例XI化合物11的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-Oic-ArgN-苯乙基甘氨酸芐基酯鹽酸鹽將溶解于CH2Cl2(30ml)的2-溴乙酸芐基酯(3.3ml，20.0mmol)溶液，在0C，攪拌下滴加到溶解于CH2Cl2(30ml)的苯乙基胺(12.6ml，100mmol)中。溫度升至室溫后，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后過濾，真空蒸發(fā)去溶劑。將得到的殘留物溶解于乙酸乙酯，再用鹽水洗，用硫酸鈉干燥。真空蒸發(fā)除去乙酸乙酯。粗制品用快速硅膠柱層析純化，用已烷和乙酸乙酯-己烷(9∶1v/v)順序洗脫。含有產(chǎn)物的組分中存在微量雜質(zhì)-2-溴乙酸芐基酯。將此部分再溶解于CHCl3中，用1N HCl洗。干燥氯仿層，用石油醚沉淀出鹽酸鹽。生成2.3g無(wú)色固體。1H NMR(CDCl3)δ1.95(brs 1H)，2.73-2.9(m，3H)，3.44(s，2H)，5.12(s，2H)，7.13-7.36(m，10H)。13C NMR(CDCl3)δ36.17，50.46，50.63，66.32，26.06，128.18，128.3，128.4，128.50，135.4，139.4，171.88。N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸芐基酯將溶解于DMF(3.0ml)的二特丁基酯(1.87g，8.54mmol)溶液，在攪拌下加到溶解于DMF(3.0ml)的N-苯乙基甘氨酸芐基酯(2.30g，8.54mmol)和三乙胺(1.31ml，9.4mmol)溶液中。得到的溶液在N2中，室溫下攪拌22小時(shí)。真空蒸發(fā)除去DMF，將得到的油狀物溶解于乙酸乙酯(50ml)。乙酸乙酯層用10％Na2CO3溶液洗(2次，每次25ml)，用鹽水洗(2次，每次30ml)，用MgSO4干燥，溶劑被蒸發(fā)后，得到3.13g油狀的標(biāo)題所示化合物。1H NMR(CDCl3)δ1.37，1.44(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，9H)，2.75-2.9(m，2H)，3.33-3.55(m，2H)，3.8，3.92(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，2H)，1.15(s，2H)，7.1-7.4(m，10H)，13C NMR(CDCl3)δ28.09，28.20，34.64，35.02，49.16，50.07，50.39，66.62，66.68，80.12，126.18，126.26，128.14，128.21，128.31，128.38，128.43，128.73，135.41，138.95，138.99，154.85，155.49，169.84，169.89。N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸將N-α-Boc-N-苯乙基甘氨酸芐基酯(3.13g，8.47mmol)溶解于乙醇(50ml)中，小心地充入氮?dú)夂?，?0％鈀碳(pd/c)(0.3g)懸浮于此溶液中。在Parr氫化器中，在氫氣下(約40 p.s.I)，此反應(yīng)混合物被攪拌18小時(shí)。然后使混合物通過一層硅藻土過濾，蒸發(fā)除去乙醇。將得到的殘留物溶解于乙酸乙酯中，用冷1NHCI(100ml)洗，再用鹽水洗(2次，每次100ml)，用MgSO4干燥，真空蒸發(fā)后得到2.16g(88.2％)無(wú)色固體狀標(biāo)題所示化合物。1HNMR(CDCl3)δ1.45(s，9H)，2.8-2.92(m，2H)，3.44-3.6(m，2H)，3.8，3.92(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，2H)，7.12-7.36(m，5H)，11.32(brs，1H)，13C NMR(CDCl3)δ34.65，35.01，49.15，49.69，50.37，50.55，80.64，80.77，126.32，126.42，128.5，128.56，128.80，138.79，138.93，155.97，175.32，176.02。
將預(yù)先用Nα-Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺酰基-L-精氨酸衍生化的Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸PAM樹脂(1.52g，Bachem，0.5meq)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸被用于偶聯(lián)。用氟化氫(HF)脫保護(hù)基后，得到487mg粗制品。將100mg粗制品用HPLC純化(10-70％ CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于60分鐘，20ml/min)，得到23.0mg無(wú)色冷凍干燥的化合物11。HPLCR.t＝32.8分鐘(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1305，測(cè)定值1305。AAA精氨酸3.16(3)，羥脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸1.00(1)，THi*，Ser1.00(1)，Oic*，NPeg。實(shí)施例XII化合物12的合成D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch-ArgN-環(huán)己烷甲基甘氨酸芐基酯以2.38g(10mmol)2-溴乙酸芐基酯和5.66g環(huán)己烷甲基胺開始，用與合成N-苯乙基甘氨酸芐基酯同樣的程序合成該化合物。產(chǎn)物通過鹽酸鹽沉淀作用純化。然后將該鹽酸鹽溶解于CHCI3中，用Na2Co310％洗CHCL3層，最后離析出1.3g(52.0％)油狀的標(biāo)題所示化合物。鹽酸鹽的13C NMR(CDCl3)，δ25.21，25.27，25.72，25.83，30.43，30.68，30.84，34.64，37.58，46.25，46.46 54.17，68.11，128.63，128.70，128.81，134.243，165.63。N-α-Boc-N-環(huán)己烷甲基甘氨酸芐基酯以1.39g N-環(huán)己烷甲基甘氨酸芐基酯開始，合成方法與合成Boc-N-苯乙基甘氨酸芐基酯相同。生成1.8g(94.0％)油狀物。N-α-Boc-N-環(huán)己烷甲基甘氨酸以1.80g N-α-Boc-N-環(huán)己烷甲基甘氨酸芐基酯開始，合成方法與合成Boc-N-苯乙基甘氨酸相同。生成1.28g(95.0％)無(wú)色的離析固體。1H NMR(CDCl3)δ0.84-1.8(m.20H)，3.04-3.2(m，2H)，3.9-4.04(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，2H)，11.44(brs.1H)，13C NMR (CDCl3)δ25.67，25.78，26.25，26.36，28.13，28.19，28.24，30.59，30.63，30.72，36.85，37.08，37.69，45.53，49.08，49.69，54.47，54.62，80.17，80.37，155.46，156.37，174.68，175.06。
將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺酰基-L-精氨酸PAM樹脂(1.52g，Bachem，0.5meq)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹酯上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸用于偶聯(lián)。用氟化氫(HF)去保護(hù)基后，得到480mg粗制品。HPLC純化(5-70％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于60分鐘，20ml/min)，總共得到191mg無(wú)色的冷凍干燥化合物12。HPLCR.t＝33.7分鐘(5-70％CH3CN，0.1％TFA大于65分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1307，測(cè)定值1308(M+H)。AAA精氨酸3.16(3)，羥脯氨酸0.91(1)，脯氨酸0.94(1)，甘氨酸1.00(1)，THi*，絲氨酸0.99(1)，Tic*，NMch*。實(shí)施例XIII化合物13的合成δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸梅里菲爾德樹酯(4.20g，Bachem Rboc20，0.48meq/g)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)，形成一個(gè)四肽(絲氨酸-(OBn)偶聯(lián))，然后，加甘氨酸，羥脯氨酸，脯氨酸和精氨酸的操作被轉(zhuǎn)移給CS-BIO自動(dòng)肽合成儀。從反應(yīng)容器內(nèi)取出一部分這種肽基樹酯(0.53g)。此樹酯樣品如上述用TFA去保護(hù)，并用上述用于HOBt/二亞酰胺活化的方法偶聯(lián)N-(BOC)-右旋-氨基戊酸。此殘基如前所述用三氟乙酸去保護(hù)，再通過順次用二氯甲烷，10％二異丙基乙基胺的二氯甲烷溶液，二氯甲烷，最后是二甲基甲酰胺(DMF)洗來(lái)使之中和。將樹酯同0.566g 1氫-吡唑-1-甲酰脒(Bernatowicz，M.S.等，有機(jī)化學(xué)雜志572497(1992))和溶解于20ml DNF的0.76ml二異丙基乙基胺的混合物一起，在47℃加熱2.25小時(shí)。用二氯甲烷和二甲基甲酰胺洗樹酯，并將于1氫-吡唑-1-甲酰脒的反應(yīng)另重復(fù)二次。依次用二氯甲烷，甲醇，再二氯甲烷洗樹酯，并真空干燥。用HF去保護(hù)后得到80mg無(wú)色冷凍干燥的化合物13。HPLCR.t＝22.6分鐘(5-55％CH3CN，0.1％TFA大于50分鐘，C18 5μ，分析柱)LD-MS計(jì)算值1278(M+H)，測(cè)定值1278.7(M+H)。實(shí)施例XIV化合物14δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸梅里菲爾德樹酯(4.20g，Bachem Rboc20，0.48meq/g)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)，形成一個(gè)四肽(絲氨酸-(OBn)偶聯(lián))，然后，加甘氨酸，羥脯氨酸，和脯氨酸的操作被轉(zhuǎn)移給CS-BIO自動(dòng)肽合成儀。從反應(yīng)容器內(nèi)取出一部分這種肽基樹酯(0.260g)。此樹酯被如上所述用TFA去保護(hù)，并用上述用于HOBt/二亞酰胺活化的方法偶聯(lián)N-(BOC)-右旋-氨基戊酸。此殘基如前所述用三氟乙酸去保護(hù)，再通過依次用二氯甲烷，10％二異丙基乙基胺的二氯甲烷溶液，二氯甲烷，最后是二甲基甲酰胺(DMF)洗而使之中和。將樹酯同0.405g1氫-吡唑-1-甲酰脒(Bernatowicz，M.S.等，有機(jī)化學(xué)雜志 1448-58(1959))和溶解于14.5ml DMF的0.545ml二異丙基乙基胺的混合物一起，在47℃加熱2.25小時(shí)。用二氯甲烷和二甲基甲酰胺洗樹酯，并重復(fù)于1氫-吡唑-1-甲酰脒的反應(yīng)。依次用二氯甲烷，甲醇，再二氯甲烷洗樹酯，并真空干燥。用HF去保護(hù)后得到30mg無(wú)色冷凍干燥的化合物14。HPLCR.t＝22.3分鐘(5-55％CH3CN，0.1％TFA大于50分鐘，C18 5μ，分析柱)，LD-MS計(jì)算值1123(M+H)，測(cè)定值1123(M+H)。實(shí)施例XV化合物15D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg-ArgFmoc-D-Tic酰氯將1當(dāng)量Fmoc-D-Tic溶解于CH2Cl2(0.3M)中，并置于備有攪拌棒和回流冷凝器的燒瓶?jī)?nèi)。攪拌下加入亞硫酰氯(10當(dāng)量)，此混合物在氮中回流2小時(shí)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使反應(yīng)混合物濃縮，殘留物用CH2Cl2稀釋，再濃縮除去過剩的亞硫酰氯。照此重復(fù)二次，得到的酰氯用己烷研磨(或者按另一種方法，從CH2Cl2/己烷中重結(jié)晶)直至得到細(xì)粉未。使用時(shí)不需進(jìn)一步純化。Fmoc-D-Tic-N-芐基甘氨酸在燒瓶?jī)?nèi)，將N-芐基甘氨酸(1.2當(dāng)量)懸浮于干燥的四氫呋喃(THF)中，加入3當(dāng)量二異丙基-乙基胺。將燒瓶置于冰水浴中，在氮?dú)庀聰嚢?5分鐘。將1當(dāng)量Fmoc-D-Tic酰氯溶解于干燥的THF(0.15M)中，緩慢地加到此冷卻的燒瓶中。立即開始生成沉淀，使升溫至室溫后，攪拌反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完成后，立即用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶于乙酸乙酯中，用5％KHSO4，水，和鹽水洗。用Na2SO4干燥，在高真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和放置，產(chǎn)生白色泡沫狀物。此二肽用HPLC作純度分析(C18 RP柱，4.6×250mm流速1ml/min，從含有0.1％TFA的30-100％CH3CN/H2O，梯度時(shí)間為30分鐘，在254nm檢出)，使用時(shí)不需進(jìn)一步純化。Fmoc-D-Tic-NPhg-OH附著于精氨酸-OHMP樹脂用Bop-C1，在前述用于將N-保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)于受阻的N-取代氨基酸的條件下，將Fmoc-D-Tic-Nphg-OH二肽(約0.785mmol)偶聯(lián)于肽基樹脂(0.25mmol)。肽合成通過在二甲基甲酰胺(DMF)中與20％哌啶反應(yīng)(2次，每次30分鐘)，使Fmoc-D-Tic-Nphg-Arg-OHMP樹脂脫去N-保護(hù)基。然后按順序洗樹脂，用DMF洗3次，用二氯甲烷洗2次，用甲醇洗2次，再用二氯甲烷洗2次。用如前面所述的BOP-C1程序使Fmoc-絲氨酸-(O-t-Bu)-OH被偶聯(lián)。然后將樹脂移入ABI型431自動(dòng)肽合成儀，用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/HBTV偶聯(lián)程序加入另外的殘基(ABI 431 Fmoc程序，應(yīng)用生物系統(tǒng)431A型肽合成儀用戶手冊(cè)，第二版，1992年1月)。然后樹脂用二氯甲烷洗幾次，在無(wú)水氮?dú)饬髦懈稍铩Ｈ缓笥煤?.5ml苯硫基甲烷和0.25ml乙烷二硫酚的10ml三氯乙酸處理樹脂。在室溫下通入氮?dú)夤呐莘磻?yīng)3小時(shí)。將混合物過濾，用約1ml三氯乙酸洗樹脂。合并濾液，在真空下濃縮，殘留物用無(wú)水乙醚處理，并在冰浴溫度下放置15分鐘。然后通過過濾收集沉淀，再仔細(xì)用冷無(wú)水乙醚洗，真空干燥，得到205mg無(wú)色粉末。取一小部分這種物質(zhì)用HPLC純化(0-35％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于50分鐘，10ml/min)，得到10mg無(wú)色冷凍干燥的化合物15。HPLCR.t＝20.9分鐘(5-55％CH3CN，0.1％TFA大于50分鐘，C18 5μ，分析柱)。LD-MS計(jì)算值1287.5(M+H)，測(cè)定值1287.5(M+H)。得到正確的氨基分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例XVI化合物16D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg-Arg按照用于制備化合物15中Fmoc-D-Tic-NPhg-OH的方法制備二肽Fmoc-D-Phe-NPhg-OH。用化合物15中所述的程序，將此二肽Fmoc-D-Phe-NPhg-OH(約0.5mmol)偶聯(lián)到Arg-HMP樹脂(0.25mmol)。肽被合成后，如化合物15中所述，從樹脂上斷裂下來(lái)，得到260mg粗制品肽。將此肽75mg用HPLC純化(5-50％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于60分鐘，10ml/min)，得到18.9mg無(wú)色冷凍干燥的化合物16。HPLCR.t＝21.9分鐘(5-55％CH3CN，0.1％TFA大于50分鐘，C185μ分析柱)。LD-MS計(jì)算值1275(M+H)，1298(M+Na)，測(cè)定值1274(M+N)，1298(M+Na)。實(shí)施例XVII化合物17D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg將Boc-Ng-對(duì)-甲苯磺?；?L-精氨酸梅里菲爾德樹酯(4.2g，Bachem，RBOC20，0.48meq/g)裝入為用于人工固相肽合成而設(shè)計(jì)的容器內(nèi)。肽被按順序偶聯(lián)合成后，用前述的方法從樹脂上斷裂下來(lái)。4當(dāng)量預(yù)先活化的氨基酸被用于偶聯(lián)。用HF去保護(hù)基后，得到1.05g粗制品。將一小部分該粗制品用HPLC純化(0-65％CH3CN，0.1％TFA，梯度時(shí)間大于50分鐘，10ml/min)得到無(wú)色冷凍干燥的化合物17。得到正確的氨基酸和肽序列分析數(shù)據(jù)。實(shí)施例XVIII生物學(xué)數(shù)據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選化合物是血管舒緩激肽拮抗劑，因此，對(duì)涉及血管舒緩激肽作用的疾病或病理生理學(xué)狀態(tài)，具有廣泛的治療用途。下列方案將針對(duì)本說(shuō)明的各種化合物描述在此使用的，以體外或體內(nèi)法測(cè)定其血管舒緩激肽拮抗劑活性的實(shí)驗(yàn)方法，以及用于表明其選擇性和體內(nèi)穩(wěn)定性特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法。B2拮抗劑活性的體外法測(cè)定按照如下所述，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的大鼠子宮PA2測(cè)定實(shí)驗(yàn)選用雌性Spragne-Dawley大鼠(200-250g)，預(yù)先用己烯雌酚(100μg/kg)處理，18小時(shí)后重去頭部放血活殺。分離出子宮角，置于4ml的組織浴中，施加1g靜止張力，組織浴中充有DeJalon氏液，溫度31℃，并吹入氣體。在不加和加入拮抗劑的二種情況下制作對(duì)血管舒緩激肽的濃度-作用曲線(預(yù)先溫育15分鐘)。按照Arunlakshana和Schild提供的方法(Arunlakshana，O.，Schild，H，O.，英國(guó)藥理學(xué)雜志1448-58(1959))計(jì)算拮抗劑的效力。在暴露于高濃度的拮抗劑(通常是10-5克分子濃度)后，每個(gè)組織被沖洗4次，每次10分鐘，此后可再次制作血管舒緩激肽的濃度-作用曲線。計(jì)算此時(shí)對(duì)血管舒緩激肽的PD2(對(duì)血管舒緩激肽產(chǎn)生50％最大初始反應(yīng)的克分子濃度的負(fù)對(duì)數(shù))，并與開始時(shí)制作的對(duì)照血管舒緩激肽濃度-作用曲線的PD2相比較。這種與同時(shí)制作的對(duì)照曲線相比較的PD2差值，可用于表示對(duì)激動(dòng)劑反應(yīng)的“恢復(fù)百分率”。B1拮抗劑活性的體外法測(cè)定用雌性新西蘭大白兔，通過給予超大劑量戊巴比妥(80mg/kg，靜脈注射)而活殺后，分離出胸主動(dòng)脈。將血管條安裝在5ml的組織浴內(nèi)，施加2g靜止張力，組織浴液是Krebs溶液(118.3mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM MgSO4，1.2mM KH2PO4，25mMNaHCO3，25mM葡萄糖，及2.8μmM抗炎吲哚酸)，并以95％O2/5％CO2通氣。在第1小時(shí)和第3小時(shí)制作脫-精氨酸9-血管舒緩激肽的二條濃度-作用曲線。在第5小時(shí)，向組織浴內(nèi)加入脫-精氨酸9-血管舒緩激肽，使其最后濃度為10-7M。這將引起持續(xù)，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)45分鐘的穩(wěn)定收縮。然后根據(jù)所得到的曲線，可計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)或引起50％收縮逆轉(zhuǎn)的濃度。結(jié)果如表1所示。穩(wěn)定性研究從男和女志愿者或從豚鼠收集全血，制備血漿樣品。將樣品裝入加有肝素鈉的培養(yǎng)管內(nèi)，在4℃，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。吸出上清液部分，置于小瓶?jī)?nèi)，貯存于-20℃。用如SKidgel和Booth所述的差速離心法，制備大鼠或豬的肺和腎臟及質(zhì)膜(Booth，AG.等，生化雜志142575-581 1974，對(duì)于肺，Erdos，E.G.等，生化藥理學(xué)333471-34781984，對(duì)于腎)。膜制備貯存于-20℃。用PBS(0.0132M磷酸鹽，0.1454M NaCl，pH 7.2)將血管舒緩激肽拮抗劑稀釋成1mM濃度。在一排Eppendorf管內(nèi)各加入這種工作液10μl，接著加入人或豚鼠血漿(90μl)，或加入PBS用作空白對(duì)照，然后被溫育不同的時(shí)間。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過加入100μl在乙腈或乙醇中的1N HCl，使反應(yīng)終止。樣品先放置大約15分鐘，然后以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。分離出上清液部分，用孔徑0.22μm的濾器(Milliproe)過濾，用HPLC分析(C18，12-80％乙腈水溶液，都含有0.1％三氯乙酸，在波長(zhǎng)214nm下進(jìn)行探測(cè))。
豬的腎、肺制備用PBS作1∶10稀釋，大鼠腎制備用PBS作1∶100稀釋，豬肺制備在PBS內(nèi)作1∶1稀釋。在一排Eppendorf管內(nèi)各加入血管舒緩激肽拮抗劑溶液(10μl)，接著加入各種稀釋的膜制備(90μl)。在不同的時(shí)間點(diǎn)，通過加入100μl乙醇使反應(yīng)終止，然后如上所述進(jìn)行離心和HPLC分析。用計(jì)算機(jī)程序ENZFIT(Elsevier)測(cè)定HPLC峰消失的半衰期。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表2。表1。在體外功能性組織測(cè)定中的血管舒緩激肽拮抗劑的活性B2化合物 pA2n ％恢復(fù) B1n(大鼠子宮)(兔主動(dòng)脈)1 5.67±0.173326.41±0.2532 6.76±0.7130 5.79 ±0.0653 6.41±0.493100＜5 44 激動(dòng)劑＜5 45 9.5±0.051071 ＜5 36 7.3±0.033 93 ＜5 27 激動(dòng)劑＜5 28 8.50±0.09 3 56 ＜5 49 7.73±0.09 3 87 5.52 4105.85±0.09 3 75 5.34 411激動(dòng)劑＜5 412激動(dòng)劑＜5 4139.09±0.25 1066147.65±0.25 6 81158.88±0.12 6 54167.68±0.09 6 60178.48±0.38 5 60CP-0589*6.9±0.893 57未測(cè)定CP-0601*7.0±0.203 75未測(cè)定HOE-140 10.3 7 41無(wú)活性*CP-0589 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Thi-Gly-Ser-D-Tic-Oic-Arg*CP-0601 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Gly-Ser-D-Tic-Oic-Arg二種化合物都是用合成化合物1-12所述的常規(guī)固相肽合成法合成的。拮抗劑對(duì)豚鼠回腸制備的結(jié)合用雄性化Hartley種豚鼠，頸部脫位處死，取得回腸。用冰冷的生理鹽水灌洗回腸，使之外翻并用棉紗布擦凈。然后，將該組織冷凍，貯于-70℃。使用時(shí)，取35g回腸在冰上解凍，用組織絞碎器將回腸仔細(xì)地絞碎，然后加入10倍體積(350ml)的三甲基氨基乙磺酸(TES)勻漿緩沖液(25mM，pH6.8)，其中含有一種混合的蛋白質(zhì)抑制劑，(1mM1，10-鄰二氮雜菲，5μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，100μg/ml桿菌肽，1mM苯甲脒，以及100μM苯基甲基磺酰氟)。用Brinkman PT-20Polytron勻漿器將此混合物作勻漿(設(shè)定7，4×20秒間隔)，然后作差速離心(1000xg，4℃，10分鐘)。棄去沉淀，溶液部分加新鮮勻漿緩沖液使之恢復(fù)到原體積，然后在4℃，以43000xg的轉(zhuǎn)速再離心15分鐘。將沉淀仔細(xì)地再混懸于勻漿緩沖液中，如上再次離心。再次棄去上清液部分，沉淀部分混懸于TES緩沖液中(25mM，pH 6.8)，再離心(43000g，15分鐘)。將最后得到的沉淀再混懸于5倍體積(165ml)的TES緩沖液中，得到濃度大約為2.0mg/ml的蛋白質(zhì)，貯存于-70℃?zhèn)溆?。溫育反?yīng)在總體積0.315ml下進(jìn)行，溫育液由下列成分組成20ul氚標(biāo)記的血管舒緩激肽溶液(0.3nM)，20ul非-特異對(duì)照，藥物或賦形劑，150μl試樣緩沖液(25mM TES，pH6.8，1mM1，10鄰二氮雜菲，1nM二硫蘇糖醇(DTT)，2μM卡托普利，140μg/ml桿菌肽，100μMthiorphan和0.1％牛血清白蛋白)，和125μl稀釋的膜制備(1∶4稀釋，最后濃度為0.2mg/ml)，最后加入膜制備開始結(jié)合反應(yīng)。檢測(cè)試驗(yàn)在聚丙烯試管內(nèi)進(jìn)行，樣品在24℃溫育45分鐘。然后，將此樣品混合物通過經(jīng)0.1％聚乙烯胺水溶液預(yù)處理(2小時(shí)以上)的Whatman GF/B玻璃纖維濾紙，快速過濾。濾紙和試管均用冰冷的洗滌緩沖液洗8次，每次用1.0ml，洗滌緩沖液含有10mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.5)，100mM NaCl和0.02％牛血清白蛋白。用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性。
被稱為CP-0597的化合物5和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)見表2。
在實(shí)施例1中公開的，具有專利申請(qǐng)序列號(hào)07/859，582的CP-127，是一個(gè)二聚體，其結(jié)構(gòu)通式如下
此化合物本身是一個(gè)高活性的血管舒緩激肽拮抗劑體內(nèi)試驗(yàn)生物學(xué)數(shù)據(jù)兔血壓雄性新西蘭白兔用戊巴比妥麻醉，作股動(dòng)脈插管用于記錄血壓。并在股靜脈上作一插管用于快速濃注或持續(xù)滴注化合物。股動(dòng)脈導(dǎo)管與Gould壓力轉(zhuǎn)換器相連，記錄血壓，并顯示在Grass多導(dǎo)生理記錄儀上。平衡期之后開始進(jìn)行特定的實(shí)驗(yàn)程序。BK2ED50-穩(wěn)定的基線血壓確定之后，對(duì)動(dòng)物單次快速注射血管舒緩激肽(0.2和0.4nmol，靜脈注射)，引起血壓降低約15-25％。先不給預(yù)待測(cè)化合物，測(cè)定血管舒緩激肽的作用，然后，再給予各種劑量(0.01，0.03，和0.10μg/kg/min靜脈注射)CP-0597(化合物5)的同時(shí)，給予血管舒緩激肽，測(cè)定化合物的ED50(即CP-0597引起對(duì)血管舒緩激肽最大反應(yīng)的50％的劑量)。在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，測(cè)定的ED50是0.51±0.006μg/kg/min(29.2 P mol/kg/min)。
BK1ED50-在實(shí)驗(yàn)前12-18小時(shí)，給兔靜脈注射大腸桿菌脂多糖(LPS)(10μg/每只動(dòng)物)。預(yù)先給予內(nèi)毒素導(dǎo)致血管系統(tǒng)中的BK1受體激活(upregulation)，可用于評(píng)價(jià)BK1拮抗劑活性。刺激原先存在的BK2受體和誘導(dǎo)產(chǎn)生的BK1受體，都能引起低血壓。血壓穩(wěn)定之后，對(duì)動(dòng)物單次快速注射血管舒緩激肽(0.2和0.4nmol)和去-Arg9血管舒緩激肽(4.0和8.0nmol)。然后在不給予和給予CP-0597的情況下，對(duì)這二個(gè)激動(dòng)劑進(jìn)行測(cè)定，CP-0597是以遞增劑量的方式給藥(1，3，和10μg/kg/min)。在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，測(cè)定發(fā)現(xiàn)CP-0597對(duì)BK1活性的ED50是2.9±0.92μg/kg/min (1.7nmol/kg/min)，HOE 140在劑量高達(dá)10μg/kg/min時(shí)仍無(wú)活性。靜脈內(nèi)給予CP-0597的選擇性作用先測(cè)定對(duì)乙酰膽堿(20nmol)，去甲腎上腺素(20nmol)，P物質(zhì)(20 P mol)，血管緊張肽(100 P mol)，血管緊張肽II(2 P mol)，和血管舒緩激肽(200 P mol)產(chǎn)生的血壓反應(yīng)，待血壓穩(wěn)定后，再在給予CP-0597(0.1μg/kg/min靜脈注射)之后，測(cè)定每個(gè)血管作用劑的反應(yīng)，并與預(yù)先的拮抗劑反應(yīng)相比較。在此項(xiàng)研究中，與對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比較，僅血管舒緩激肽的反應(yīng)受到了拮抗作用，其它血管作用劑的反應(yīng)未受影響。CP-0597靜脈內(nèi)輸注給藥的作用持續(xù)時(shí)間CP-0597以靜脈內(nèi)輸注給藥的方式作上述選擇性實(shí)驗(yàn)。在選擇性實(shí)驗(yàn)完成之后，停止輸注CP-0597，測(cè)定對(duì)血管舒緩激肽(0.2和0.4nmol)的反應(yīng)，最初30分鐘之內(nèi)，每隔5分鐘測(cè)定一次，以后每隔15分鐘測(cè)定一次，直到停藥后1小時(shí)。在輸注給藥停止后1小時(shí)，仍然對(duì)血管舒緩激肽的反應(yīng)有100％的抑制作用。大鼠血壓雄性Sprague-Dawley大鼠用戊巴比妥麻醉，作股動(dòng)脈插管用于記錄血壓。每只動(dòng)物的雙側(cè)股靜脈也作插管，用于待測(cè)化合物給藥。股動(dòng)脈導(dǎo)管與Gould壓力轉(zhuǎn)換器相連，記錄血壓，并顯示在Grass多導(dǎo)生理記錄儀上。平衡期之后開始進(jìn)行特定的實(shí)驗(yàn)程序。CP-0597皮下給藥的選擇性作用血壓穩(wěn)定之后，測(cè)定對(duì)乙酰膽堿(20nmol)，去甲腎上腺素(1nmol)，P物質(zhì)(2 P mol)，血管緊張肽(20 P mol)，血管緊張肽II(2 P mol)，和血管舒緩激肽(20 P mol，腹膜內(nèi)注射)的反應(yīng)。然后，用CP-0597處理動(dòng)物(1.0mg/kg皮下注射)。皮下注射CP-0597后30分鐘，再測(cè)定每個(gè)血管作用劑的反應(yīng)，并與預(yù)先的拮抗劑反應(yīng)相比較。在此研究中，與對(duì)照相比較，僅血管舒緩激肽的反應(yīng)受到了拮抗，其它血管作用劑的反應(yīng)未受影響。CP-0597靜脈內(nèi)單次快速注射的作用持續(xù)時(shí)間血壓穩(wěn)定后，測(cè)定對(duì)血管舒緩激肽(10 P mol和20 P mol，腹膜內(nèi)注射)的反應(yīng)，作為對(duì)照。然后以CP-0597作靜脈內(nèi)單次快速注射(3mg/kg，10mg/kg或30mg/kg)后，再測(cè)定對(duì)血管舒緩激肽的反應(yīng)，每間隔5分鐘測(cè)定一次，直到反應(yīng)恢復(fù)到對(duì)照水平。在3μg/kg的劑量，反應(yīng)被抑制了約50％，30分鐘后恢復(fù)到對(duì)照水平。在10μg/kg和302g/kg的，的反應(yīng)被100％抑制，60分鐘后，50％恢復(fù)到對(duì)照水平，90分鐘后，反應(yīng)完全恢復(fù)。CP-0597皮下給藥的作用持續(xù)時(shí)間主動(dòng)脈血壓穩(wěn)定之后，對(duì)動(dòng)物給予血管舒緩激肽(10 P mol和20 Pmol，腹膜內(nèi)注射)。用于建立對(duì)照血壓反應(yīng)。然后動(dòng)物被皮下注射給予CP-0597(1mg/kg和3mg/kg)。在注射CP-0597后30分鐘，以及此后每隔30分鐘，再測(cè)定動(dòng)物對(duì)血管舒緩激肽的血壓反應(yīng)，直到反應(yīng)恢復(fù)到對(duì)照水平。皮下注射CP-0597 1mg/kg時(shí)，在注射后3小時(shí)，反應(yīng)仍然被100％抑制。皮下注射CP-0597 3mg/kg時(shí)，在注射后5小時(shí)，反應(yīng)仍然被100％抑制。
體內(nèi)試驗(yàn)生物學(xué)數(shù)據(jù)摘要于表3。
表3 實(shí)施例5(CP-0597)體內(nèi)試驗(yàn)生物學(xué)數(shù)據(jù)
表1說(shuō)明，能夠開發(fā)出在血管舒緩激肽序列的第8位置，含有N-取代甘氨酸殘基的高效血管舒緩激肽拮抗劑。例如，化合物5，8，13，15，和17都是高效拮抗劑，并表明具有可作為有效藥劑的高度可能性。
在用大鼠子宮作為功能性組織進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)化合物4，7，11，和12是激動(dòng)劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員都能理解，激動(dòng)劑也是有潛在價(jià)值的心臟防護(hù)劑。并且，從事血管舒緩激肽拮抗劑開發(fā)研究的技術(shù)人員都理解，對(duì)一類組織是激動(dòng)劑的化合物，對(duì)另一類組織有可能是拮抗劑。例如，Stewart已公開了一種在血管舒緩激肽序列的第7位置含有D-苯丙氨酸的血管舒緩激肽拮抗劑。Stewart，發(fā)現(xiàn)根據(jù)豚鼠回腸的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在第6位置和第7位置含有D-苯丙氨酸的拮抗劑，如Npc-360，對(duì)大鼠子宮是激動(dòng)劑(見美國(guó)專利4,693,993，和J.Stewart血管舒緩激肽；基礎(chǔ)和臨床研究，P，60，1991)。的確，類似現(xiàn)象也同樣表現(xiàn)于在此公開內(nèi)容的所選化合物中。例如，化合物12對(duì)大鼠子宮組織顯示出是一個(gè)激動(dòng)劑，但對(duì)豚鼠回腸顯示出拮抗劑活性，并且有非常高的結(jié)合常數(shù)(Ki＝0.2Pmol豚鼠回腸)。具有高度組織選擇性的化合物，可能作為雙重作用的藥劑發(fā)揮功能，對(duì)一種組織可能希望它具有拮抗劑活性，但對(duì)另一些組織則可能它具有拮抗劑活性。這種考慮特別運(yùn)用于開發(fā)心臟保護(hù)藥劑。
本發(fā)明最優(yōu)選的化合物在第7位置含有一個(gè)芳香族D-氨基酸，在第8位置含有一個(gè)N-取代的甘氨酸，在此，取代基是中等大小的環(huán)烷基或苯基。這些類似物對(duì)許多種組織具有BK2拮抗劑活性。在芳香族環(huán)或環(huán)烷基環(huán)之間，引入一個(gè)亞甲基單位，將增加其對(duì)多種組織具有激動(dòng)劑活性的可能性。類似的情況是，倘若在第8位置存在一個(gè)構(gòu)型受約束的殘基如Oic，在第7位置存在N-芐基甘氨酸或環(huán)取代的N-芐基甘氨酸將產(chǎn)生具有中等效力的拮抗劑。如果使另一個(gè)亞甲基間隔基加入甘氨酸N-取代作用，那么可以預(yù)期，這種空間延伸將產(chǎn)生對(duì)多種重要組織的激動(dòng)劑。類似情況是，如果將在第8位置受約束的殘基用一個(gè)非約束性殘基如亮氨酸，或N-Chg置換，預(yù)期將產(chǎn)生對(duì)多種重要組織的激動(dòng)劑活性。
選擇性置換N-取代的甘氨酸殘基，特別是在第8位置上，其重要價(jià)值是，取代基的明智選擇，對(duì)化合物與血管舒緩激肽受體的結(jié)合有非常大的影響，這將導(dǎo)致產(chǎn)生有效的拮抗劑或非常緊密結(jié)合的激動(dòng)劑。
通過引入N-取代甘氨酸殘基，可開發(fā)出具有非常好的藥劑特性的高效分子。引入N-取代甘氨酸所賦與的最重要的特性之一是對(duì)酶解作用的穩(wěn)定性。表2說(shuō)明，在第8位置具有N-取代甘氨酸殘基的優(yōu)選化合物，如化合物5，表現(xiàn)出對(duì)特定組織具有非常有效的受體結(jié)合作用。這些類似物，例如在實(shí)施例1中公開的，通常擁有美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)，07/859,582的血管舒緩激肽拮抗劑CP-127，比血管舒緩激肽本身或一些藥物更加有效。
更重要的是，表2說(shuō)明化合物5對(duì)一些重要酶系統(tǒng)的降解作用，具有不尋常的穩(wěn)定性。肽類藥物將被肽酶迅速降解。特別是與血管舒緩激肽有關(guān)的分子，將被下列多種酶迅速降解氨基肽酶，羧基肽酶(CP)和肽內(nèi)切酶如中性肽內(nèi)切酶(NEP)和心血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)。人血漿具有來(lái)源于羧基肽酶N和氨基肽酶M作用的，豐富的肽酶活性。在此公開內(nèi)容中所述的組織制備，都顯示有很強(qiáng)的蛋白酶活性，如下所示豬腎豬肺大鼠腎大鼠肺NEP ACE NEP ACEACE CP-M ACE NEPMCPrinCP-M肽內(nèi)切酶-24，16表2中摘要的穩(wěn)定性測(cè)定數(shù)據(jù)是體外試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。個(gè)別化合物在活動(dòng)物的血漿，腎或肺組織中的實(shí)際穩(wěn)定性可能與此不同。但是，體外試驗(yàn)測(cè)定法提供了一種用于比較許多化合物的可重復(fù)性方法，而不必為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)犧牲大量的動(dòng)物。因此，這一套血漿和組織制備，可非常廣泛地用于篩選肽類化合物對(duì)蛋白酶活性的穩(wěn)定性，肽類藥物可能遇到這種穩(wěn)定性問題。在所有這些測(cè)定中，化合物5是具有大于6小時(shí)半衰期的非常有效的化合物。與此相比較，血管舒緩激肽表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)偷姆€(wěn)定性。并且看來(lái)化合物5比CP-127具有更高的穩(wěn)定性。其他一些參考化合物如在Scios-Nova實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的NPC17761和NPC17731，在第7位置含有被取代的脯氨酸殘基，在第8位置含有Oic的化合物，它們?cè)陉P(guān)鍵性的測(cè)定中，顯示出可測(cè)定的較低的穩(wěn)定性。
表3中提供的數(shù)據(jù)確證了體外試驗(yàn)測(cè)定和體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定之間的互相關(guān)系。在活體兔實(shí)驗(yàn)中，化合物5對(duì)阻斷血管舒緩激肽在BK2受體的作用特別有效(ED500.051μg/kg/min)。此外，在活體兔實(shí)驗(yàn)中，化合物5還顯示出對(duì)BK1有基本的阻斷活性(2.9μg/kg/min)。這二個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與在中毒性休克中，血管舒緩激肽降低血壓的作用非常一致，并且對(duì)預(yù)測(cè)在治療SiS/膿毒癥中的有效作用有重要的意義。所例舉的化合物不僅在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有效力，并且還顯示出長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間(兔靜脈注射給藥60分鐘后反應(yīng)100％被抑制)。的確，已證明皮下注射下給藥(大鼠，3mg/kg)后，可使激動(dòng)劑作用完全阻斷達(dá)5小時(shí)。一個(gè)從肽衍生的激動(dòng)劑具有如此的穩(wěn)定性，是非常不尋常的，并證明，含有N-取代甘氨酸的激動(dòng)劑，作為藥劑可能非常有用。
最后應(yīng)指出用兔和大鼠二種血壓模型進(jìn)行的研究證明，降血壓作用的阻斷，與血管舒緩激肽受體的阻斷有關(guān)。其他血管作用劑，如乙酰膽堿，去甲腎上腺素，P物質(zhì)，血管緊張肽和血管緊張肽II的活性，都不受化合物5的影響。
參考文獻(xiàn)1. J.史泰華和R.瓦里克，美國(guó)專利號(hào)4,801,613。2. J.史泰華和R.瓦里克，美國(guó)專利號(hào)4,693,993。3. G.伯里波爾，S.亨克，J.諾里，F(xiàn).霍克和B.斯庫(kù)爾金斯，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)? 455 133 A2。4. D.凱利， PTC申請(qǐng)?zhí)? PTC/US92/10469。5. D.凱利， PTC申請(qǐng)?zhí)? PTC/US92/03031。6. D.凱利， PTC申請(qǐng)?zhí)? PTC/US92/03033。7. D.楊等，含有N芐基甘氨酸的血管舒緩激肽類似物的合成，P375，第十三屆美國(guó)肽研討會(huì)，埃德蒙頓，阿爾伯他，1993年6月20日。8. D.楊等，N芐基甘氨酸在制備有生物活性的肽的肽-類胨類似物中的應(yīng)用，P323，第十三屆美國(guó)肽研討會(huì)，埃德蒙頓，阿爾伯他，1993年6月20日。9. D.楊等，N芐基甘氨酸作為芳香氨基酸殘基取代物的應(yīng)用，第十一屆美國(guó)肽研討會(huì)進(jìn)展，P155(1990)。10. S.G.法瑪爾和R.M.伯奇，血管舒緩激肽的藥理學(xué)，血管舒緩激肽拮抗劑，R.M.伯奇編輯，馬歇爾·德克公司，紐約，PP1-31，(1991)。11. T.格里斯巴徹爾，F(xiàn).蘭貝克，血管舒緩激肽拮抗劑在血管舒緩激肽誘導(dǎo)的血漿外滲、靜脈狹窄、前列腺素E2釋放、傷害感受器激活和兔Iris括約肌收縮中的作用，英國(guó)藥理學(xué)雜志，92333-340(1987)。12. Y.O.泰沃和J.D.萊文，介導(dǎo)血管舒緩激肽和去甲腎上腺素痛覺過敏的花生四烯酸代謝的表征，腦研究，458402-406(1988)。13. I.R.斯特蘭卡等，作為疼痛介體的血管舒緩激肽受體位于感覺神經(jīng)元，拮抗劑具有止痛作用，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，853245-3249(1988)。14. A.德瑞，J.貝坦尼，P.福斯特和M.N.波金斯，血管舒緩激肽誘導(dǎo)的傳入纖維的激活是能過蛋白激酶C介導(dǎo)的，神經(jīng)科學(xué)通訊，91301-307(1988)。15. L.R.斯特爾蘭肯，S.G.法瑪爾和R.M.伯奇，B2血管舒緩激肽受體抗劑，F(xiàn)ASEB雜志，32019-2025(1989)。16. J.哈利，A.H.迪肯遜和M.沙克特，血管舒緩激肽在大鼠化學(xué)傷害中的作用的電生理學(xué)證據(jù)，神經(jīng)科學(xué)通訊，97198-202(1989)。17. F.馬休，A.路斯?fàn)?，D.萊格利，J.D.蓋洛德，激肽藥理學(xué)它們與組織損傷和炎癥的相關(guān)性，普通藥理學(xué)，14209-229(1983)。18. D.普洛德，A.P.開普蘭，激肽制劑在炎癥失調(diào)中的機(jī)制和作用，免疫學(xué)研究年鑒，649-84(1988)。19. R.W.科爾曼，P.Y.王，病理狀態(tài)下的激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，血管舒緩激肽、賴氨酰緩激肽和激肽釋放酶，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第25卷，E.G.埃爾多斯編輯，斯普林杰·維拉格出版社，紐約(1979)。20. M.W.格里維斯，炎癥及介體，英國(guó)皮膚學(xué)雜志，119419-426(1988)。21a. F.馬丁尼茲-布洛登，J.R.昂辛斯，J.麥斯特斯，V.阿馬哥斯，C.瑞納爾多，非復(fù)雜膿毒癥病人中的血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)和膿毒癥休克-與心臟性休克的對(duì)比，血栓形成和血栓溶解雜志，58709-719(1978)。21b. E.T.威爾利，J.A.所羅門，D.M.摩達(dá)菲利，K.a.伯恩海姆，J.C.凱各尼斯，CP-0127，一種新的，強(qiáng)有力的血管舒緩激肽拮抗劑，提高了患內(nèi)毒素休克疾病模型的大鼠和兔的存活率，試劑和作用，38413-420(1992)。22. S.G.法瑪爾，血管舒緩激肽的氣管藥理學(xué)，亞伯拉罕，M.威廉，患過敏性氣喘疾病模型的羊中的血管舒緩激肽，血管舒緩激肽拮抗劑，R.M.伯奇編輯，馬歇爾·德克公司，紐約，PP.213-236和261-276(1991)。23. A.昂騰伯格，C.道特爾曼，A.白特曼，W.慕勒爾-埃斯特爾，作為血管性腦水腫介體的激肽釋放酶-激系統(tǒng)，神經(jīng)外科雜志，64269-276(1986)。24. I.A.赫德爾和A.N.尼利，哈格曼因子依賴性激肽在出生時(shí)的活化及其與出生后免疫抑制綜合癥和感染的理論聯(lián)系，出生看護(hù)和恢復(fù)雜志，11496503(1990)。25. F.西庫(kù)特里，血管神經(jīng)活性物質(zhì)及其與血管疼痛的關(guān)系，頭疼的臨床學(xué)研究，16(1967)。26. J.C.凱洛尼斯，E.T.威爾利，K.T.古任，S.R.尤班克，L.G.艾倫，M.J.杠甘，S.D.洛依，K.A.伯恩海姆，J.K.布洛蓋特，一類新的血管舒緩激肽拮抗劑雙琥珀酰亞胺烷烴肽二聚體的合成和體外活性，醫(yī)學(xué)化要志，1563-1572(1992)。27. A.德瑞和S.貝萬(wàn)，TIPS，14 287(1993)。28. J.M.史泰華和J.D.楊，固相肽合成，皮爾斯化學(xué)公司(1984)。29. M.伯丹斯基和A.伯丹斯基，肽合成實(shí)踐，斯普林杰·維拉格出版社，1984。米克洛斯·伯丹斯基，肽合成原理，斯普林杰·維拉格出版社，(1984)。30. G.巴蘭尼等，固相肽合成25周年報(bào)告，國(guó)際肽和蛋白研究雜志，30705739(1987)。31. R.D.唐，D.H.里奇，M.豪安，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，107 4342(1985)。32. J.科斯特，肽第二十一屆歐洲肽研討會(huì)進(jìn)展(1990)。33. M.貝爾曼；M.貝納特；H.內(nèi)里奇；L.A.卡斯皮諾；D.薩達(dá)特-阿里；通過FMOC氨基酸氯化物偶聯(lián)和4-(氨甲基)六氫吡啶去封閉作用快速而連續(xù)地合成肽，有機(jī)化學(xué)雜志，55，721-728(1990)。34. L.A.卡皮諾，D.薩達(dá)特-阿里，H.G.曹，R.H.德薩爾姆，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，112 9652(1990)。35. R.N.祖科爾曼，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，114 10646(1992)。36. T.格林尼和P.G.M.武茲提供了大量的保護(hù)基因的例子，它們與現(xiàn)有的肽合成技術(shù)相容，T.格林尼，P.G.M.有機(jī)合成中的保護(hù)基因，第二版，約翰·威利父子出版社(1991)。37. H.邦德加德，前藥設(shè)計(jì)，艾斯維爾出版社(1985)。38.參考文獻(xiàn)28，P.105-107。39. T.H.波特爾和W.希福，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志，11 402(1968)。40. J.T.希爾和F.W.道恩，有機(jī)化學(xué)雜志，30 1321(1965)。41. ABI 431Fmoc步驟，應(yīng)用生物系統(tǒng)431A型肽合成儀用戶手冊(cè)，第2.0版，1992年1月。42. M.S.伯納托維茲，G.馬蘇達(dá)和Y.吳，有機(jī)化學(xué)雜志，57 2497(1992)。43. O.阿倫拉克沙納，H.O.希爾德，英國(guó)藥理學(xué)雜志，1448-58(1959)。44. A.G.布斯和A.J.肯尼，生物化學(xué)雜志，142 575-581(1974)。45. E.G.埃多斯，A.R.約翰遜，R.A.斯基格爾，生化藥理學(xué)，33 3471-3478(1984)。
序列表(1) 一般信息(i)申請(qǐng)人GOODFELLOW，VAL S.
MARATHE，MANOJ V.
WHALLEY，ERIC T.
FITZPATRICK，TIMOTHY D.
KUHLMAN，KAREN G.
(ii)發(fā)明的題目含有N-取代甘氨酸的血管舒緩激肽拮抗劑肽(iii)序列數(shù)目 8(iv)通訊地址(A)收信人 CUSHMAN，DARBY&CUSHMAN(B)街道1100 NEW YORK AVENUE，N.W.
(C)城市WASHINGTON(D)州 D.C.(哥倫比亞特區(qū))(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵政編碼20005-3918(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī) IBM PC可兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件 PatentIn Release#1.0，Veision#1.25(vi)通用的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)? US 08/208，115(B)申請(qǐng)日期1994年3月9日(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名 KOKULIS，PAUL N.
(B)注冊(cè)號(hào) 16,773(C)說(shuō)明書/摘要號(hào)203567/DKT.14(iX)電訊資料(A)電話(202)861-3000(B)傳真(202)822-0944
(C)電報(bào)6714627 CUSH(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述 SEQ ID NO1Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg15(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述 SEQ ID NO2Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg15 10(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述 SEQ ID NO3Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa15(2)SEQ ID NO4的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg1 5(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Arg Xaa Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg1 510(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述SEQ ID NO6Xaa Arg Pro Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Arg1 510(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述SEQ ID NO7Xaa Arg Pro Xaa Gly Gly Ser Xaa Xaa Arg1510(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫再|(zhì)線性(ii)分子類型肽(Xi)序列描述SEQ ID NO8Xaa Arg Pro Xaa Gly Phe Cys Xaa Leu Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.一種作為血管舒緩激肽拮抗劑的肽，在其肽鏈中含有一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的作為血管舒緩激肽拮抗劑的肽，其中拮抗劑是由下式定義的Z’-Z0-A1-B2-C3-D4-E5-F6-G7-H8-I9-J10其中Z’可任選地不存在，如果存在，則是氫，乙?；?，金剛烷羧基，金剛烷乙?；?C1-C8)-烷基，烷酰基，芳磺?；蛲檠豸驶蛘呤且粋€(gè)二氫奎寧環(huán)基羧酸的衍生物；Z0和A1，可能相同或不同，選自下列基團(tuán)直鍵，氫，氨基酸殘基衍生物包括D或L精氨酸，D或L賴氨酸，D或L鳥氨酸，H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)nCO-(其中n＝0-3)，或精氨酸取代物，條件是當(dāng)Z’不存在時(shí)，Z0不是直鍵。B2和C3，可能相同或不同，是脯氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，N-甲基絲氨酸，N-甲基蘇氨酸，N-甲基苯丙氨酸，甘氨酸，和NR’CHR”CO，其中R’和R”獨(dú)立地選自氫，C1-C8直鏈或支鏈烷基，C3-C8環(huán)烷基，芳基，雜芳基，和烷氨基；D4是甘氨酸，丙氨酸，或噻吩丙氨酸；B2C3D4E5可能被-NH(CH2)nCO-置換，其中n是從4到14的整數(shù)；E5是苯丙氨酸，甲基取代的苯丙氨酸，甘氨酸，環(huán)戊基甘氨酸，環(huán)己基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，2-二氫化茚甘氨酸，噻吩丙氨酸，N-(2-二氫化茚)甘氨酸，或N-取代的甘氨酸，其中取代基可以是C1-C8烷基，環(huán)烷基，CH2Ar或CH2CH2Ar，其中Ar是芳基，烷基噻吩基，或者是一個(gè)芳香族氨基酸，或在α-氮原子或α-碳原子上以甲基或乙基取代的芳香族氨基酸；F6是一個(gè)脂肪族或芳香族氨基酸；G7是一個(gè)芳香族氨基酸，選自D-Tic，D-Dic，D-苯丙氨酸，2-二氫化茚甘氨酸，D-環(huán)戊基甘氨酸，D-環(huán)己基甘氨酸，D-脯氨酸或在第3或第4位置以烷基，芳基，硫代烷基，硫代芳基，氧烷基，或氧代芳基取代的脯氨酸，以及一個(gè)N-取代的甘氨酸殘基，其中取代的基團(tuán)是芳基，烷芳基，-CH2R，或-CH2CH2R，其中R是二氫化茚，吲哚，萘基或苯基；H8是如下結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基 其中m＝1-6，R1是被取代的或未被取代的C1-C12烷基，被取代或未被取代的C3-C8環(huán)烷基，被取代或未被取代的單環(huán)芳基或多環(huán)芳基，或者是含有3-8個(gè)選自碳，氮，氧或硫原子的單環(huán)或多環(huán)的雜芳基或雜環(huán)基；R2是氫，甲基或高級(jí)烷基，或者是一個(gè)酸性，堿性或中性的烷基或芳香族氨基酸側(cè)鏈；I9不存在或者是一個(gè)直鍵，OH，氨基酸，或H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)n-NH-(其中n＝0-3)，或精氨酸取代物，條件是當(dāng)J10存在時(shí)，I9不是OH，J10不存在時(shí)，I9不存在或是一個(gè)直鍵；J10不存在，或者如果存在則是OH或一個(gè)氨基酸，-OR或-NHR，其中R是烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中Z’是氫。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中，Z0和A1相同或不同，選自L-精氨酸，D-精氨酸，H2N(NH＝C)NHCH2CH2CH2(CH2)nCO-(其中n＝0-3)，由含有烷基胺、苯甲脒、哌啶、烷基胍或烷基鏻部分的精氨酸，鳥氨酸或賴氨酸的類似物或同系物組成的精氨酸取代物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中B2和C3相同或不同，選自脯氨酸和羥脯氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中D4是甘氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中E5是苯丙氨酸、環(huán)戊基甘氨酸，環(huán)己基甘氨酸或噻吩丙氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中F6是絲氨酸，半胱氨酸，取代的絲氨酸或半胱氨酸，其中取代的側(cè)鏈選自N-(烷基)-琥珀酰亞胺，N-(烷基)吡咯烷酮，C1-C20烷基，C2-C20鏈烯烷基，芳基和烷芳基。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中G7是D-Tic，D-苯丙氨酸，D-環(huán)戊基甘氨酸，或者是在第4位置以烷基，芳基，氧烷基取代的D-脯氨酸，或者是一個(gè)N-取代的甘氨酸殘基，其中取代的基團(tuán)可以是芳基，烷芳基，或-CH2R，其中R是二氫化茚，吲哚，萘基或苯基。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中B2C3D4E5是NH(CH2)nCO，其中n＝4至14。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中R1是一個(gè)被取代的芳基，雜芳基或環(huán)烷基，含有1-4個(gè)選自如下基團(tuán)的取代基氨基，羥基，巰基，巰烷基，烷基，氧烷基，烷氧基，羧基，鹵素，三氟甲基，三氟甲氧基，氨烷基，烷氨基或氨甲?；?；
12.根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中I9是精氨酸或賴氨酸，或者是一個(gè)由含有烷基胺，苯甲脒，哌啶，烷基胍，或烷基鏻部分的精氨酸，鳥氨酸或賴氨酸類似物或同系物組成的精氨酸取代物。
13.一種含有N-取代氨基酸的血管舒緩激肽類肽，所述N-取代氨基酸選自N-環(huán)戊基甘氨酸，N-環(huán)己基甘氨酸，N-苯基甘氨酸，N-苯乙基甘氨酸，或N-甲基環(huán)己基甘氨酸。
14.一種在第8位置含有N-取代氨基酸的血管舒緩激肽類肽，其中取代基不形成含有N-取代氨基酸α-碳原子的環(huán)。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求2的血管舒緩激肽拮抗劑，其中R1是環(huán)戊基或環(huán)己基，苯基或一個(gè)烷基-二氫化茚衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求2的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly其中甘氨酸殘基的取代基R是以如下基團(tuán)取代的環(huán)己基甲基，乙基，丙基，異丙基，甲氧基，乙氧基，正或異丙氧基，CH2OCH2CH3，CH2CH2OCH(CH3)2，CH2CH2OCH3，CH2CH2OCF3，硫代甲基，硫代乙基，硫代丙基(正或異丙基)。
17.根據(jù)權(quán)利要求2的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg；D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl-NChg-Arg；D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NChg-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg-Arg，
18.根據(jù)權(quán)利要求2的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg-Arg。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic；D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-Oic-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-NBng-NChg-Arg。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-Oic-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch-Arg。
21.根據(jù)權(quán)利要求2的如下式所示的化合物δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg；δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg；δ-Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg或δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg。
22.根據(jù)權(quán)利要求2的如下式所示的化合物D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg-Arg或D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg-Arg。
23.一種治療某些病理狀態(tài)的方法，其中，血管舒緩激肽或與之緊密相關(guān)的代謝物是已知的病原，介體或激素信號(hào)，該方法包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中的病理狀態(tài)是疼痛或炎癥。
25.一種治療心血管功能障礙的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中的心血管功能障礙包括局部缺血，血管損傷或心血管組織損傷。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其含有8至10個(gè)氨基酸殘基，其中在位置8和/或9的氨基酸殘基是一個(gè)N-取代的甘氨酸殘基，其中所述的位置是按從N-末端開始的順序編號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有N-取代甘氨酸的血管舒緩激肽類肽，特別是血管舒緩激肽拮抗劑肽，可用于治療某些由血管舒緩激肽介導(dǎo)的，包括疼痛和炎癥的病理狀態(tài)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1148393SQ95193017
公開日1997年4月23日 申請(qǐng)日期1995年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月9日
發(fā)明者V·S·古費(fèi)羅, M·V·馬拉特, E·T·瓦利, T·D·菲茨帕特里克, K·G·庫(kù)爾曼 申請(qǐng)人:科特克公司