專利名稱：分枝狀聚合體化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的治療或診斷用的分枝狀聚合體化合物(dendrimericcompound)，及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(包括診斷成象領(lǐng)域)中應(yīng)用。
螯合劑及其金屬螯合物已長(zhǎng)期用于治療和診斷醫(yī)學(xué)中，最為突出的是用于金屬解毒、放射性同位素的治療性傳遞，特別是用于診斷成像。
醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，例如，MRI、X線、γ閃爍顯像、和CT掃描，已成為診斷和治療疾病的極其重要的工具。某些內(nèi)部器官的成像是借該器官(如骨骼)的固有特性，使之在具體的成像類型中(如X線)與周圍組織區(qū)別開。而其它器官和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)只有通過特定的成像技術(shù)使其局部光線加強(qiáng)而成可見的影像。
研究人員許多年來一直認(rèn)為將多種金屬進(jìn)行螯合可以增加這些金屬的生理耐受劑量，從而能夠允許它們用于體內(nèi)作為對(duì)比劑以增強(qiáng)身體組織結(jié)構(gòu)的成像(如，參見，C.D.Russell and A.G.Speiser，J.Nucl.Med.211086(1988)和美國(guó)專利No.4,647,447(Gries等分))。盡管如此，這些簡(jiǎn)單的金屬螯合成像加強(qiáng)劑，在不進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)的情況下，一般不能提供任何十分顯著的部位特異性。
近些年來已經(jīng)在以螯合物為基礎(chǔ)的對(duì)比劑領(lǐng)域取得了許多進(jìn)展，并且已開發(fā)出了新的與眾不同的螯合劑，它具有特殊的具體用途，例如，可以使靶器官、血流、軸索傳遞等成像。例如，使用親脂性對(duì)比劑通過MRI使肝膽系統(tǒng)選擇性成像，或通過靶特異性生物分子，如抗體，與螯合劑基團(tuán)偶合，將該對(duì)比劑靶作用到身體的特定器官或部位。
最近的研究已致力于生產(chǎn)具有金屬螯合位點(diǎn)多樣性的螯合劑，包括靶特異性位點(diǎn)定向性螯合劑。這可以通過創(chuàng)制一種低聚螯合劑來實(shí)現(xiàn)，如NycomedSalutar，Inc.在WO-91/05762中所述，它具有一種線性或分枝狀的低聚體結(jié)構(gòu)，含有可變性螯合劑和連續(xù)基團(tuán)或者，如同Nycomed Salutar，Inc.在Wo-90/12050和Torchlin等人在Hybridoma，6229-240(1987)中所述，將多個(gè)螯合劑基團(tuán)連接到骨架或載體結(jié)構(gòu)上形成多聚螯合劑“放大體”。這種骨架可以含有一種簡(jiǎn)單的鏈狀聚合物，如，聚胺或多肽，或一種分枝狀聚合體(如，Tomalia等人在polymer Journal17117(1985)和US-A-4587239中所述的一種星芒分枝狀聚合體)。為了制備一種位點(diǎn)特異性多聚螯合劑，可以將一種或多種這類帶有骨架分子的螯合劑基團(tuán)結(jié)合到一種位點(diǎn)定向的大分子上，如，一種蛋白質(zhì)上。
多聚螯合劑的優(yōu)點(diǎn)是每個(gè)分子上可以結(jié)合幾個(gè)金屬離子，從而增加了金屬離子向靶位點(diǎn)或區(qū)域的傳遞，又能夠更有效地將治療或診斷金屬靶作用于位點(diǎn)，而達(dá)到增強(qiáng)對(duì)比劑效果的目的。再者，鑒于它們體積的增加，可溶性含金屬的多聚螯合劑在體內(nèi)具有獨(dú)特的定位性和生物分布作用，使得它們可以特別適用于作為所謂的“血池”性對(duì)比劑；由于它們的不成粒性和相對(duì)高的分子量，這種多聚螯合劑不會(huì)立即分散到血管外的空間中(如同最近在MRI對(duì)比加強(qiáng)中所用的單體螯合物如Gd DTPA-BMA和Gd DTPA的情況一樣)，而是在血池中保持循環(huán)。這種在血管內(nèi)停留時(shí)間的延長(zhǎng)意味著多聚螯合劑可以作為靶特異性血池試劑而不需結(jié)合到位點(diǎn)特異性生物分子上。
盡管如此，雖然這代表了相當(dāng)先進(jìn)的技術(shù)，但是這種多聚螯合劑并不十分令人滿意。特別是人們已經(jīng)注意到多聚螯合劑不能在體內(nèi)進(jìn)行快速的充分代謝，并且在某些情況下會(huì)被認(rèn)為是小顆?；虻鞍讟游镔|(zhì)，從而將其從血液中清除進(jìn)入肝臟。這種現(xiàn)象的一種潛在嚴(yán)重后果是多聚螯合劑在體內(nèi)的含量會(huì)增加累積到不可接受的有毒程度。而實(shí)際上，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了合成聚合物在細(xì)胞內(nèi)的滯留，特別是在肝細(xì)胞中的滯留(參見，如，Biochim BiophysActa 587282(1979))。
因此，仍然需要研究新的和改進(jìn)的多聚螯合劑分子。本發(fā)明試圖滿足這一需求，特別是提供改進(jìn)的放大型多聚螯合劑分子，以生物清除率而言具有理想的藥效學(xué)特性。
我們已發(fā)現(xiàn)通過形成以分枝狀聚合體為基礎(chǔ)的分子，并在其中建立生物降解切割位點(diǎn)，可以改善生物分散性和生物清除率。所得到的這種結(jié)構(gòu)，根據(jù)所選擇的載在分枝狀聚合體框架上的活性部位而可以用作各種診斷或治療試劑，并可以將其設(shè)計(jì)得能夠達(dá)到所需要的分散和清除目標(biāo)。
因此，本發(fā)明的一方面是提供一種分枝狀聚合體化合物，它含有一個(gè)分枝狀聚合體骨架結(jié)構(gòu)，其上連接有多個(gè)診斷或治療活性基團(tuán)(例如，能夠與金屬離子配位的螯合劑基團(tuán))，其特征在于該化合物的分子骨架結(jié)構(gòu)含有至少一個(gè)生物降解切割位點(diǎn)，以致于在將其切割時(shí)所說的活性基團(tuán)以腎臟可排泄形式釋放，并且優(yōu)選的是該分枝狀骨架結(jié)構(gòu)或其片段也以腎臟可排泄形式釋放。
在本發(fā)明的化合物中，生物降解位點(diǎn)可以是遠(yuǎn)離分枝狀聚合體的骨架結(jié)構(gòu)，但是優(yōu)選的實(shí)施方案是在骨架結(jié)構(gòu)上有該位點(diǎn)，特別是在分枝部位上。
用一個(gè)核心單體，即具有至少兩個(gè)，優(yōu)選2-20個(gè)，特別優(yōu)選3-12個(gè)聚合位點(diǎn)的0級(jí)分枝狀聚合體，形成一種分枝狀聚合體(或級(jí)聯(lián)式)高分子，如形成本發(fā)明化合物中的骨架部分，向其上連接具有至少3個(gè)聚合位點(diǎn)的單體，結(jié)果形成分枝位點(diǎn)。隨著每個(gè)分枝繼續(xù)生成分枝，即形成新一“級(jí)”的分枝狀聚合體。因此，分枝狀聚合體典型的是一種具有多價(jià)核心的聚合物，該多價(jià)核心與至少兩個(gè)分枝狀聚合體的“分枝”以其價(jià)結(jié)合。
對(duì)于本發(fā)明的化合物來說，優(yōu)選0-8級(jí)，特別優(yōu)選3-6級(jí)分枝狀聚合體結(jié)構(gòu)。如果該結(jié)構(gòu)帶有如下所述的生物分布修飾劑如PEG，則優(yōu)選4級(jí)聚合體，而沒有這種修飾劑的情況下，特別優(yōu)選4和5級(jí)聚合體。
通過向分枝狀結(jié)構(gòu)，如在分枝部位或在分枝狀聚合體的臂上，結(jié)合上一些生物可降解鍵，可以使分枝狀聚合體骨架具有生物可降解性。這些鍵可以是有機(jī)或無機(jī)官能團(tuán)，但在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分枝狀聚合體骨架的至少一個(gè)分枝位點(diǎn)是生物可降解的，并且含有一個(gè)多原子結(jié)構(gòu)，在其骨架結(jié)構(gòu)中含有至少一個(gè)雜原子。這種生物可降解分枝位點(diǎn)在本發(fā)明中稱之為無機(jī)生物可降解位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選這種生物降解位點(diǎn)是朝向分枝狀聚合體的核心，例如，在低級(jí)分枝位點(diǎn)或分枝上，如第1、2、3級(jí)分枝位點(diǎn)或分枝上。
通過這種方式，分枝狀聚合體的生物降解可以引起分枝狀聚合物骨架的分段，如，產(chǎn)生可被腎臟排泄的片段。優(yōu)選的生物降解(一個(gè)或多個(gè))位點(diǎn)是位于分枝狀聚合體結(jié)構(gòu)中在降解時(shí)能夠產(chǎn)生比較均勻片段的位點(diǎn)。
在一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，該化合物在分枝狀聚合體的核心可以有一個(gè)初級(jí)的生物降解位點(diǎn)，并且在下面的討論中，生物可降解的分枝位點(diǎn)一般指分枝狀聚合體的核心。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分枝狀化合物可以具有一個(gè)以上的生物可降解位點(diǎn)。特別優(yōu)選的是該位點(diǎn)的排列使第一個(gè)生物可降解位點(diǎn)(或第一組位點(diǎn))朝向該化合物的外周，而第二個(gè)(或組)位點(diǎn)位于或進(jìn)一步朝向核心，等等。通過這種方式，生物降解可以按逐級(jí)方式進(jìn)行，在外部降解位點(diǎn)發(fā)生降解時(shí)，內(nèi)部生物降解位點(diǎn)可變得更加暴露(以易于降解)。特別優(yōu)選的是，在這種化合物中，外部的降解位點(diǎn)位于或接近于活性基團(tuán)連接點(diǎn)，以致于在體內(nèi)低分子量的可快速清除的基團(tuán)從分枝狀聚合體結(jié)構(gòu)上斷裂下來，而該分枝狀聚合體結(jié)構(gòu)本身則進(jìn)一步分解。對(duì)于這類化合物來說，生物降解位點(diǎn)可以全部在生物可降解無機(jī)結(jié)構(gòu)的分枝點(diǎn)上。盡管如此，也可以由生物可降解的有機(jī)結(jié)構(gòu)，如酯、氨基甲酸酯、雙酯或二硫連接基團(tuán)，直接或間接連接到分枝點(diǎn)或分枝狀聚合體框架上來提供生物降解位點(diǎn)。
特別適合于作生物可降解鍵的是雙酯鍵，即，分子式-O-CO-O-CH2-O-CO-O-的鍵，其中的一個(gè)或兩個(gè)末端氧可以去掉，而其中的亞甲基可以被取代。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物具有一個(gè)分枝狀聚合體骨架基團(tuán)，通過生物可降解結(jié)構(gòu)，尤其是有機(jī)結(jié)構(gòu)，在其上連接多個(gè)活性基團(tuán)和連接或不連接一個(gè)或多個(gè)生物分布的改性基團(tuán)，例如，多羥基烷基或羥基聚烷氧基烷基基團(tuán)。
這種可斷裂結(jié)構(gòu)使得治療或診斷活性基團(tuán)，如，生物可耐受金屬單-，雙-或低聚螯合物，能夠更快速的排泄，而且仍然保留了該單分散聚合物系統(tǒng)的在生產(chǎn)和給藥上的優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的化合物綜合了兩方面的優(yōu)點(diǎn)，即清楚定義的單分散分枝狀聚合體化合物的一些優(yōu)點(diǎn)，與從內(nèi)部建立能生物降解成可更快速清除的低分子量片段(如，樹枝狀片和單-，雙-或低聚分子)的結(jié)構(gòu)而帶來的一些優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的分枝狀化合物及其衍生物(如，鹽和螯合物)在這里稱之為“放大體”。由分枝狀聚合體框架攜帶的“活性”基團(tuán)可以是任何具有所需診斷或治療作用的基團(tuán)，并且也可用該框架攜帶能夠改變化合物生物分布的基團(tuán)(改性基團(tuán))，例如，能夠引起該化合物分布到所需組織或身體部位的位點(diǎn)定向分子、親水或親脂性基團(tuán)、或蛋白結(jié)合抑制劑。
合適的診斷用活性基團(tuán)包括螯合劑基團(tuán)，以便當(dāng)分枝狀聚合體化合物與合適的順磁性金屬、放射活性金屬或重金屬離子，或與多原子離子進(jìn)行金屬取代時(shí)，它可以作為如MR、X-線、EIT或閃爍顯像的對(duì)比試劑。
這類放大體中的螯合劑基團(tuán)能夠螯合金屬離子而且具有高度的穩(wěn)定性，并且與合適的金屬離子進(jìn)行金屬取代，以加強(qiáng)成像和/或傳遞細(xì)胞毒性劑量的放射活性等。
可以結(jié)合到分枝狀聚合體框架上的其他診斷上的活性基團(tuán)包括鹵代的、特別是氟化的或碘化的基團(tuán)，例如鹵代烷基或鹵代芳基。所形成的分枝狀聚合體化合物適合于作為MR或X-線的對(duì)比劑。特別適用的這類基團(tuán)包括多鹵代C1-6烷基和三碘代苯基。有關(guān)MR和X-線對(duì)比劑的文獻(xiàn)記載了很多關(guān)于鹵代有機(jī)基團(tuán)或含鎢螯合劑，它們可以提供有效的MR或X-線對(duì)比加強(qiáng)作用，并且它們可以容易地載到分枝狀聚合體框架上(參見，例如，Haavaldsen等，Acta Pharm Suec 20219(1983)和Speck“X-ray contrastmedia”Spring Verlag，1991)。
治療活性基團(tuán)在結(jié)合到分枝狀聚合物框架上時(shí)就能夠發(fā)揮其治療作用，例如，正象螯合的金屬放射性同位素以及生物降解繼而產(chǎn)生生物清除的情況一樣。該分枝聚合體化合物也可以充當(dāng)一種前藥，在治療活性基團(tuán)與框架結(jié)合的鍵降解時(shí)，能夠控制該藥物以其活性形式持續(xù)釋放?？梢酝ㄟ^常規(guī)的化學(xué)方式將治療基團(tuán)結(jié)合到分枝狀聚合體框架上。因此，例如，可以利用類似于Li等人的方法(參見“Polymeric drugs and drugs delivery Systems”，ACS1991的第11章)通過生物可降解氨基甲酸酯或碳酸酯鍵將抗高血壓藥和其他生物活性試劑如哌唑嗪、環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮、氯壓定和三甲氧唑啉結(jié)合到該框架。
如上所述，如果需要，本發(fā)明的化合物可以攜帶有生物分布改性基團(tuán)，如，能增加溶解性的多羥基烷基，和延長(zhǎng)血液滯留時(shí)間的聚乙二醇(PEG)殘基。其他可以利用的生物分布改性劑是位點(diǎn)定向性分子，例如，蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。這些可以利用常規(guī)技術(shù)通過所需的生物可降解或非生物可降解連結(jié)鍵進(jìn)行連結(jié)。
向位點(diǎn)定向性分子上的連接可以產(chǎn)生雙功能試劑，它能夠加強(qiáng)成像和/或向靶細(xì)胞、組織、和/或身體各通道傳送放射活性的細(xì)胞毒性劑量?；蛘?，也可以將診斷活性放大體用作肝臟或血池試劑而不需結(jié)合到位點(diǎn)定向性分子上。
但是，如果用作血池試劑，放大體優(yōu)選結(jié)合到抑制蛋白結(jié)合的基團(tuán)上，也即，結(jié)合到生物分布改性劑上，如PEGs、肽或糖類(如氨基葡糖聚糖)，這些改性劑可以通過抑制那些能促進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)從血流吸收分枝狀聚合體的蛋白質(zhì)的結(jié)合來延長(zhǎng)其血流停留時(shí)間。
除了PEGs之外，其他的烯化氧聚合物(例如，氧化丙烯聚合物)當(dāng)然可以用作蛋白結(jié)合抑制劑。同樣，多聚葡聚糖和多糖如直鏈淀粉、支鏈淀粉、淀粉、糖原，特別是肝素和其他氨基葡糖聚糖如軟骨素-4-硫酸鹽，軟骨素-6-硫酸鹽，角質(zhì)素，皮膚素和類肝素也可以使用。
這些改性劑優(yōu)選的分子量最高可達(dá)40KD，特別優(yōu)選在100D-30KD范圍，更加優(yōu)選500D-20KD，尤其優(yōu)選低于10KD。
因此，作為本發(fā)明優(yōu)選的化合物是式I的那些化合物D(L1A)n(L2M)m (I)(其中D是一個(gè)分枝狀聚合體骨架部分，優(yōu)選結(jié)合有一個(gè)生物可降解無機(jī)結(jié)構(gòu)，特別優(yōu)選的是結(jié)合一個(gè)第3至第6級(jí)結(jié)構(gòu)；每個(gè)A是一個(gè)診斷或治療活性基團(tuán)，例如，螯合劑基團(tuán)，特別優(yōu)選是一個(gè)大環(huán)螯合劑，或它的一個(gè)螯合物；每個(gè)M是一個(gè)生物分布改性劑，特別優(yōu)選是一種蛋白結(jié)合抑制劑或一種水溶性增強(qiáng)劑；L1和L2是化學(xué)鍵或連接基團(tuán)，特別優(yōu)選是生物可降解連接基團(tuán)；n是一個(gè)正整數(shù)，優(yōu)選3-200，m是0或一個(gè)正整數(shù)，不大于n)。
根據(jù)本發(fā)明的放大體多聚螯合物，由于它們的加強(qiáng)成像特性和位點(diǎn)特異性，當(dāng)使用磁共振(MRI)、X-線、γ閃爍顯像法，發(fā)光成像和CT掃描時(shí)，它們特別適用于加強(qiáng)所選擇的哺乳動(dòng)物體內(nèi)器官、組織、細(xì)胞等的成像。這些放大體多聚螯合劑也很適用于金屬解毒，用于治療性傳輸放射性同位素或治療性金屬離子或多原子離子，以及適用于診斷核醫(yī)學(xué)。
這些放大體在某些意義上是由于其在體內(nèi)的獨(dú)特定位性，在醫(yī)學(xué)診斷和治療中它們本身是有用的物質(zhì)。放大體的不同形狀、帶電性及大小(一般為1-100KD，優(yōu)選5-90KD，更優(yōu)選20-90KD，特別是30-85KD，如40-50KD)主要是改變其生物分布性。這些放大體一般具有長(zhǎng)的血管內(nèi)停留時(shí)間，一般大約幾小時(shí)(并且通常最終會(huì)清除到細(xì)胞外液(ECF)空間并從腎臟排泄)。因此，鑒于這些放大體主要在血管系統(tǒng)內(nèi)停留一段診斷用的時(shí)間，它們廣泛適用于血池和心臟灌注成像、大腦成像、血管成像、評(píng)價(jià)肺病的肺部成像、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤檢測(cè)、淋巴系造影和容量測(cè)定、血栓檢測(cè)和血管造影。作為血池試劑，它們特別適用于研究血流和血容量，尤其是涉及損傷檢測(cè)和心肌灌注研究。而傳統(tǒng)的單體MRI對(duì)比劑由于能快速地分散到細(xì)胞外/血管外空間，不適用于這些目的。而且，考慮到它們松弛性強(qiáng)，本發(fā)明的MRI對(duì)比劑相對(duì)于目前的單體MRI對(duì)比劑如GdDTPA和GdDOTA而言可以以相當(dāng)?shù)偷膭┝拷o藥，從而在使用過程中明顯改進(jìn)了其安全范圍。
本發(fā)明還能夠生產(chǎn)水溶性MRI對(duì)比劑，它可以安全地口服用于有效地肝臟成像。對(duì)于這種試劑來說，分枝狀聚合體多聚螯合劑優(yōu)選用作Mn(II)，F(xiàn)e(III)，Gd(III)或Dy(III)順磁離子的載體以獲得最佳的MR效果。
而且，通過適當(dāng)?shù)剡x擇螯合的種類，本發(fā)明的螯合物可以制備成能夠作為X-線對(duì)比劑(例如，如同在WO-A-91/14460和WO-A-92/17215中所述，通過選擇鎢或鉬或可螯合的金屬簇如鎢的多氧合陰離子及其全部或部分硫類似物)，并且通過選擇一種合適的鑭系元素金屬離子，它還可以同時(shí)作為MR和X-線對(duì)比劑。如果螯合的是金屬簇，該螯合劑部分尤其常用的是EDTA，DTPA或TTHA衍生物，例如，那些在碳骨架結(jié)構(gòu)上攜帶有一個(gè)適合于連接到分枝狀聚合體骨架結(jié)構(gòu)(如下述的基團(tuán) )上的官能團(tuán)的分子?？梢杂蓪?duì)硝基芐基甘氨酸和多氨基鏈烷烴如二亞乙基三胺，通過已知的合成途徑制備這類化合物。
將放大體連結(jié)到位點(diǎn)定向性分子上甚至可以得到體內(nèi)更大的靶特異性。這種分子優(yōu)選是一種抗體、抗體片段、其他能夠在體內(nèi)移動(dòng)到該位點(diǎn)以傳輸診斷或治療活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)或大分子。在本發(fā)明中，這種位點(diǎn)定向性大分子向其靶器官遷移和/或結(jié)合的能力不會(huì)因?yàn)榧由匣钚曰鶊F(tuán)，如螯合的金屬，而被減弱。對(duì)于多聚螯合物來說，每個(gè)分子上螯合的數(shù)目應(yīng)足以能夠加強(qiáng)該特定靶器官的成像。這些雙功能多聚螯合物是互相分開的實(shí)體，并且理想的是基本上不交叉。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的放大體可以由式II表示D(L1Ch)n (II)其中D是一種分枝狀聚合物骨架分子的殘基，優(yōu)選是其核心基團(tuán)可被生物降解，并且該核心包含有一個(gè)多原子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在其骨架中含有至少一個(gè)碳之外的原子；每個(gè)Ch各自為螯合劑(或其一種螯合物或鹽)的殘基；n是一個(gè)3-200范圍的整數(shù)，優(yōu)選最大為100，例如50-100；以及L1是一種化學(xué)鍵或一種連結(jié)基團(tuán)，優(yōu)選含有一種生物可降解功能團(tuán)，例如，一種酯，酰胺，二硫化物，氨基甲酸酯，或雙酯基團(tuán)。
使用這個(gè)通式表示該放大體時(shí)，本發(fā)明相應(yīng)的雙功能多聚螯合劑和多聚螯合物可以由通式III表示
T(L2D(L1Ch)n)p(III)其中T是一種位點(diǎn)定向性分子的殘基，每個(gè)D(L1Ch)n各自為式II的一個(gè)放大體的殘基，L2是一種化學(xué)鍵或連接基團(tuán)(如式II中對(duì)L1所述)，它能連接放大體到位點(diǎn)定向性分子上，而p是一個(gè)正整數(shù)，例如1-10，優(yōu)選1，2，3，4或5。
同樣，本發(fā)明相應(yīng)的血池放大體可以由式IV表示(QL2)mD(L1Ch)n (IV)其中L1，m，D，L1，Ch和n的定義同上，m是一個(gè)正整數(shù)(例如1-100，優(yōu)選2-50)，m不大于n，且每個(gè)Q是一種蛋白結(jié)合抑制劑。
在這種化合物中，生物可降解酰胺鍵一般在由內(nèi)源性蛋白酶引起的蛋白水解時(shí)是多酰胺功能鍵。單酰胺功能鍵一般不能作為生物可降解鍵。
連結(jié)有活性基團(tuán)的分枝狀聚合體骨架分子優(yōu)選具有多個(gè)可連接的位點(diǎn)，該位點(diǎn)的排列是從核心基團(tuán)主要向外散射狀延伸，也即，是一種星芒分枝狀聚合體類型的骨架分子。這種星芒分枝狀聚合體類型的骨架分子包含有一個(gè)中心核基團(tuán)，其上可以連接多個(gè)連接基團(tuán)。這些連接基團(tuán)的末端是分枝的，其上再加上連接基團(tuán)，這些基團(tuán)每一個(gè)與第一個(gè)連接基團(tuán)可以相同或不同。在核心基團(tuán)上攜帶具有末端分枝位點(diǎn)的連接基團(tuán)的骨架分子是0級(jí)(G0.0)分枝狀聚合體骨架分子。如果一種分子其本身末端已分枝過一次，并且又帶末端有分枝位點(diǎn)的連接基團(tuán)，則這樣的分子稱之為第一級(jí)(G1.0)骨架分子。一般可以通過將兩個(gè)分離的連接分子縮合而制備這種連接基團(tuán)，其中的第二個(gè)末端有分枝位點(diǎn)，因此，0級(jí)分枝狀聚合體在其末端由第一個(gè)這種連接分子分枝一次即稱之為0.5級(jí)(G0.5)分枝狀聚合體，再加上第二個(gè)連結(jié)分子即形成第1級(jí)(G1.0)分枝狀聚合體，它在分枝狀聚合體臂的末端有分枝位點(diǎn)。用這種第1和第2連接分子在末端進(jìn)一步分枝可形成G1.5，G2.0，G2.5等分枝狀聚合體。每次連續(xù)分枝一回，用于結(jié)合活性基團(tuán)和改性劑基團(tuán)的連接點(diǎn)的數(shù)目就相應(yīng)增加。通過這種方式，就形成了星芒分枝狀聚合體，它類似于Tomalia的PAMAM星芒分枝狀聚合體(參見，Angew.Chem.29138(1990)andMacromol.192466(1986))。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，這種分枝狀聚合體骨架的核心基團(tuán)可以是任何生物可降解的多原子無機(jī)或部分無機(jī)結(jié)構(gòu)(也即，在其骨架上具有雜原子的一種結(jié)構(gòu))，其上可以連接多個(gè)基團(tuán)(也即，至少2個(gè)，但優(yōu)選至少3個(gè)，特別優(yōu)選可高達(dá)20個(gè)基團(tuán))。這些基團(tuán)可以是連接基團(tuán)，或者也可以是活性或改性劑基團(tuán)。因此，盡管本發(fā)明大體的分枝狀聚合體骨架優(yōu)選至少是第二級(jí)，但它也可以是第1級(jí)或者甚至是0級(jí)結(jié)構(gòu)。如果分枝狀聚合體骨架是0級(jí)或第1級(jí)結(jié)構(gòu)，理想的是它使用一種生物可降解的核心，它含有一個(gè)下面將進(jìn)一步討論的環(huán)狀基團(tuán)或非環(huán)狀含磷基團(tuán)，或者也可以是或另外需要在分枝狀聚合體上加載多功能活性基團(tuán)或改性劑基團(tuán)，例如，低聚螯合劑，如聚賴氨酸聚DOTA。
“生物可降解”是指該核心(或其他生物可降解基團(tuán)所在的部位)在生理?xiàng)l件下易于水解或能進(jìn)行其他分解方式，從而引起本發(fā)明的化合物分裂成較低分子量的部分，這些部分可以在不需進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的情況下被清除，或者在體內(nèi)發(fā)生代謝，這種代謝比那些不具有生物可降解分枝位點(diǎn)的相應(yīng)的分枝聚合體化合物更加容易。一般來說，生物降解包括分枝狀聚合體化合物中特定化學(xué)鍵的酶水解，如，酯、氨基甲酸乙酯或聚酰胺基團(tuán)，而這些基團(tuán)在沒有酶存在下是穩(wěn)定的。換句話說，整個(gè)結(jié)構(gòu)是有目的設(shè)計(jì)得能在體內(nèi)生理?xiàng)l件下分解成碎片，優(yōu)選按照已明確定義的機(jī)理分解。
優(yōu)選將該化合物設(shè)計(jì)成其生物可降解鍵斷裂時(shí)釋放出相同低分子量產(chǎn)物的活性基團(tuán)。從安全性和鑒別方面考慮這具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)。
通過上述討論可以得知，這種活性基團(tuán)的釋放可以是簡(jiǎn)單地包括一種連接該基團(tuán)到分枝聚合體框架上的化學(xué)鍵裂解，該分枝聚合體框架帶有一個(gè)單官能活性基團(tuán)(如一種單螯合物)，或者帶有一個(gè)多功能基團(tuán)(如，一種低聚螯合物)，此時(shí)活性基團(tuán)是以多官能形式連接的?；蛘撸摶钚曰鶊F(tuán)的釋放也可以是分枝聚合體框架內(nèi)部的化學(xué)鏈斷裂，使得該活性基團(tuán)與分枝聚合體的碎片連接在一起釋放。不論何種情況，如果有不帶活性基團(tuán)的分枝聚合體片段存在，也可將其設(shè)計(jì)得能進(jìn)一步生物降解，例如，通過在分枝聚合體臂中包括無機(jī)生物可降解分枝位點(diǎn)或生物可降解化學(xué)鍵來進(jìn)行生物降解，否則它太大不能被腎臟排泄。不過再次說明，特別理想的是任何一種生物降解產(chǎn)物(例如，分枝聚合體框架的片段)應(yīng)當(dāng)是大小相同的。
優(yōu)選的Go核心部分可以由通式V表示B°(L°R°)n°(V)其中B°是一個(gè)分枝位點(diǎn)，它含有一個(gè)取代或不取代的多原子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在其骨架中含有至少兩個(gè)非碳原子，優(yōu)選的原子選自無機(jī)原子，如氮、磷、硅、硼和氧，可以是均環(huán)或雜環(huán)形式，優(yōu)選具有5-8個(gè)環(huán)原子，并且優(yōu)選在其骨架中含有至少2個(gè)連接到非碳原子上的生物可降解鍵；L°是一個(gè)化學(xué)鏈或一個(gè)0級(jí)連接基團(tuán)，例如，一個(gè)C1-10亞烷基鏈，中間可以有或沒有氮，氧或硫原子間隔，并且可被橋氧基或C1-4烷基取代或不取代；R°是一種能夠進(jìn)行加成、置換或優(yōu)選的是縮合反應(yīng)的官能團(tuán)，通過這些反應(yīng)可以將至少一個(gè)1級(jí)連接基團(tuán)L1連接到B°L°上，例如，氨、羥基或羧基或其衍生物，例如，一種酯、酰胺、氨基甲酸酯或雙酯；和n°是一個(gè)至少是2的整數(shù)，優(yōu)選3-8，特別優(yōu)選3-6；或者，如果B°本身能夠進(jìn)行加成、置換或優(yōu)選是縮合反應(yīng)從而將至少一個(gè)連接基團(tuán)L1接結(jié)合到其上時(shí)，n0也可以是0或1。
正如上面關(guān)于分枝狀聚合體分級(jí)命名的討論所述，連接基團(tuán)L°和L1以及任何更高級(jí)的連接基團(tuán)各自來源于兩個(gè)不同的連接分子。因此，L°可以包括兩個(gè)基團(tuán)L1°和L2°，第一個(gè)連接到B°而第二個(gè)連接到R°上。這些基團(tuán)之間的鍵合適的是一種酯、酰胺、雙酯、二硫鍵或氨基甲酸酯鍵，在這種情況下全部的L°基團(tuán)包括一個(gè)亞烷基鏈，其中間插入的氧、磷、硅、硼、硫或氮原子，并且可被橋氧基取代或不取代。
使用類似的命名方法，一種X級(jí)(Gx)的分枝狀聚合體骨架分子具有通式VIB°(L°(L1(L2··(LxRx)nx··)n2)n1)n° (VI)其中Rx是一種能夠被連接到一個(gè)螯合劑部分上的官能團(tuán)，例如，一種胺或酯基。作為進(jìn)一步解釋，對(duì)于PAMAM星芒散射分枝狀聚合體來說，n°是3，n1、n2、n3等的每一個(gè)是2，而Rx是一個(gè)胺基)。
連接基團(tuán)L1，L2等及其次級(jí)成分L11，L21等可以是常規(guī)分枝狀聚合體中，例如，PAMAM星芒散射分枝狀聚合體中所用的任何連接基團(tuán)。
在這種分枝狀聚合體化合物中，外部結(jié)構(gòu)(例如，分枝狀聚合體分枝)可以保護(hù)生物可降解部分足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使分枝狀聚合體化合物在分解成低分子量片段之前完成其所需的功能，例如，作為診斷成像試劑用于血池成像。有一部分物質(zhì)在不改變大小的情況下可以通過腎臟。而有些可以在血液中或腎臟中降解生成低分子量物質(zhì)，也可以通過腎臟過濾系統(tǒng)。盡管如此，一般認(rèn)為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會(huì)沉淀部分分枝狀聚合體化合物到肝臟、脾臟和其他網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官中。這個(gè)過程被認(rèn)為能導(dǎo)致本發(fā)明的分枝聚合體物質(zhì)在細(xì)胞之間停滯，很快形成低分子量的片段，并通過主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制而到達(dá)細(xì)胞之外。一旦到達(dá)細(xì)胞之外，這些低分子量的片段會(huì)通過幾種途徑而排出體外。例如，該片段可以分泌到膽汁中以便經(jīng)過處理進(jìn)入糞便。該片段還可以從肝臟中再吸收入血流中。由于此時(shí)是一種低分子量片段，該化合物可以通過腎臟過濾進(jìn)入尿液。
這種分枝聚合體的構(gòu)成所帶來的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)聚合物骨架的大小和分子量進(jìn)行控制，并且可以避免現(xiàn)有技術(shù)中的線性骨架結(jié)構(gòu)(如前所述的Torchlin和Manabe的那些結(jié)構(gòu))經(jīng)常帶來不需要的非特異性交聯(lián)反應(yīng)。
除了能夠設(shè)計(jì)成生物可降解的這一事實(shí)之外，以無機(jī)成分為核心的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以通過獨(dú)特的光譜技術(shù)，包括nmr(尤其是31P，29Si，11B)，對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化標(biāo)征。由于nmr光譜受對(duì)稱性改變的影響，因此可以容易地對(duì)分枝狀聚合體結(jié)構(gòu)及其從對(duì)稱核心的擴(kuò)張上進(jìn)行改變。磷酸鹽核心還具有的優(yōu)點(diǎn)是該核心本身的分解產(chǎn)物是高度生物可耐受的。
而且，通過使用比PAMAM分枝聚合體的氨核心具有更多分枝位點(diǎn)的核心結(jié)構(gòu)，能夠在較少的合成步驟中制備一種具有所需數(shù)量活性基團(tuán)連接點(diǎn)的分枝聚合體骨架。
而且，與Tomalia所述(如前所述)的常規(guī)星芒散射分枝聚合體的氨核心相比，本發(fā)明聚合體的核心幾何結(jié)構(gòu)對(duì)于沒定等級(jí)的結(jié)構(gòu)來說可以設(shè)計(jì)成更大而密度更小的分枝狀聚合體。例如，可以按下面所述通過引入環(huán)狀和OPE3(E是氧或氮)為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)這一目的。
因此，以本發(fā)明的新穎核心基團(tuán)為主結(jié)構(gòu)的分枝狀聚合體化合物在較低分子量下可表現(xiàn)出血流滯留(這基本由大小決定)，從而節(jié)約原料。
較小密度的結(jié)構(gòu)還具有易于與水接觸的優(yōu)點(diǎn)(可產(chǎn)生較低的粘度，更高的溶解度、生物降解性，以及對(duì)于順磁螯合物來說，在金屬螯合位點(diǎn)具有更好的松弛性)，并且具有易于與內(nèi)源性分解代謝酶接觸的優(yōu)點(diǎn)(以促進(jìn)生物降解)。而且，由于其聚螯合劑特性，在低滲摩爾濃度下或獲得本發(fā)明化合物的合適成像劑量。如果需要，可以通過改變或取代連接位點(diǎn)或分枝位點(diǎn)的基團(tuán)而形成更加開放的結(jié)構(gòu)，例如從而可控制由于水或酶滲入而降解的速度。實(shí)現(xiàn)這種目的的方式，可以是在連接基團(tuán)中插入一個(gè)肽或其他間隔基團(tuán)以增加這種連接基團(tuán)的長(zhǎng)度；或通過封阻R°、R1等基團(tuán)的一個(gè)或幾個(gè)分枝點(diǎn)以限制分枝聚合體在一級(jí)或多級(jí)分枝點(diǎn)的分枝程度。
本發(fā)明放大體中的生物可降解核心合適的是式VII部分Y[XY]q(VII)其中每個(gè)Y是硼、磷、硅或氮原子，在其化合價(jià)限定或允許的位置攜帶有基團(tuán)R或[X′Y′]q，和每個(gè)X是碳、氧、氮、硫或硅基團(tuán)，它在化合價(jià)允許或限定的位置上，攜帶有R基團(tuán)或[Y′X′]q，條件是，如果X是碳，則它所連接的Y基團(tuán)是氮、硼或硅；如果X是硅，它所連接的Y基團(tuán)是硅，以及如果Y[XY]q不是一個(gè)(CN)3環(huán)的情況下，至少要有兩個(gè)X-Y鍵存在且其中的X不是碳，或Y[XY]q是PLE]3，OP[EE]3或SP[E]3，其中E是氧或氮，或兩個(gè)非相鄰的Y基團(tuán)可以共用一個(gè)Y基團(tuán)表示，從而，和介入的X和Y基團(tuán)一起，形成一個(gè)4-10，優(yōu)選6元環(huán)；q是不超過3的整數(shù)，如化合價(jià)允許或限定；X′和Y′的定義如同X和Y分別所定義，但不帶有側(cè)鏈[Y′X′]q或[X′Y′]q’，每個(gè)R可以相同或不同，它代表一個(gè)鍵，氫原子或橋氧基。
在連接基團(tuán)和分枝基團(tuán)存在的情況下，它些生物可降解核心因而與式VIII的分子相對(duì)應(yīng)Y＂[X＂y＂]q (VIII)其中q定義同上；Y＂和X＂是如上定義的Y和X基團(tuán)，但其中每個(gè)R基團(tuán)是一種能將X＂或Y＂基團(tuán)連接到R°基團(tuán)、-Z-alk(R°)基團(tuán)、或RT基團(tuán)上的化學(xué)鍵；每個(gè)R°各自代表一個(gè)可反應(yīng)基團(tuán)而能連接一個(gè)連接部分正在增長(zhǎng)的分枝狀聚合體；每個(gè)Z各自是一個(gè)化學(xué)鍵、一個(gè)氧或硫原子或一個(gè)基團(tuán)NRT；每alk各自是一個(gè)亞芳基或C1-10的亞烷基，該亞烷基可以視情況插入一個(gè)亞芳基或用亞芳基封端，并且可視情況用橋氧基或C1-4烷基取代，或在氮原子上用RT基團(tuán)取代，以及可視情況用氧、氮或硫原子間隔；S是一個(gè)正整數(shù)，例如，1至6，優(yōu)選1，2或3；和每個(gè)RT各自是一個(gè)封端基團(tuán)，例如，一個(gè)吲哚基或一個(gè)C1-6烷基。
合適的alk基團(tuán)的例子包括中間插有肽鍵的亞烷基和多肽鏈本身或插入到一個(gè)亞烷基鏈中的多肽鏈。
特別優(yōu)選的式V的化合物含有2至20，尤其是3至12個(gè)用于連接分枝聚合體增長(zhǎng)連接基團(tuán)的位點(diǎn)。還優(yōu)選它們含有總共1至10個(gè)，特別是6個(gè)X和Y基團(tuán)。
特別優(yōu)選的XY骨架結(jié)構(gòu)的例子包括(SiC)3，(Si)4，(SiO)3，(Si)5，(Si)6，(Si)7，(PO)3，(NC)3，(PN)3和(BN)3環(huán)以及無環(huán)的O＝PN3，O＝PO3，S＝PN和SPO3結(jié)構(gòu)。
代表性的本發(fā)明的核心結(jié)構(gòu)包括以磷為基礎(chǔ)的核心，特別是，以亞磷酸鹽、磷酸酯和酰胺及膦嗪(phosphazene)基團(tuán)為主的核心，并被R°基團(tuán)取代，以使分枝狀聚合體增長(zhǎng)或連接一個(gè)螯合劑基團(tuán)。
因此，合適的核心結(jié)構(gòu)包括式(a)和(b)的磷酸酯和亞磷酸鹽，式(c)的膦嗪(phosphazenes)和式(d)的磷酸酰胺。
其中J是O或S，并且R1和R2基團(tuán)的至少一個(gè)是能夠與如伯胺或丙烯酸甲酯反應(yīng)而使分枝聚合體繼續(xù)增長(zhǎng)的基團(tuán)。因此，例如，R1可以是氫、RT或-alk-(R°)s((a)、(b)和(d)中至少兩個(gè)R1基團(tuán)不是RT)，和每個(gè)R2可以是基團(tuán)R、R1、OR1、Hal、-N＝Phal3或-NR1RT(其中Hal是一個(gè)鹵原子，如，氯)至少兩個(gè)R2基團(tuán)不是RT；S和alk定義同上；而R是一個(gè)定義同上的反應(yīng)基團(tuán)，例如，為第1級(jí)連接分子提供一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，該連接分子如，胺、醛、鹵素、鏈烷磺酰氧基或芳基磺酰氧基或一種可視情況酯化的羧基，如COOR3(其中R3是一個(gè)C1-6烷基)。
在R2基團(tuán)中，任何芳基優(yōu)選C6芳基，特別優(yōu)選1，4-亞苯基，并且任何亞烷基優(yōu)選是線型C1-6亞烷基。
但是，優(yōu)選的是在上述的式(a)、(b)、(c)和(d)中所有的R1和R2基團(tuán)按上述定義進(jìn)行選擇以使分枝狀聚合體能夠擴(kuò)增而引起對(duì)核心的對(duì)稱取代。
或者，為了獲得不同類型的分枝核心，在分枝狀聚合體中選擇的R1和R2基團(tuán)可以是封端基團(tuán)，例如，選擇咪唑基團(tuán)，使分枝增長(zhǎng)終止。
由于這種基團(tuán)易于水解(參見，例如，Allcock等人，Inorg Chem21515(1982))，因此使用咪唑基封端基團(tuán)特別有意義。這種基團(tuán)為更大程度上控制分枝狀聚合體多聚螯合劑的水解降解提供了機(jī)會(huì)。
因此，一種代表性的以磷為基礎(chǔ)的核心可以包括式(c′)的結(jié)構(gòu) 其中R4是 或-NH-CH2CONHCH2CH2NR27并且R5是 或R4和R5獨(dú)立地選自于Hal和-N＝pHal3，R6是COOCH3，COOC2H5或CH2NH2和R7是H或-alk(R°)5，例如，一種式(c＂)的結(jié)構(gòu) (參見，例如，Ngo等人，JACS 1135057(1991))。
這種分子的優(yōu)點(diǎn)是水解的速度，并因此使生物降解可以控制。
膦嗪尤其具有多價(jià)性的優(yōu)點(diǎn)；膦嗪由于能夠從核心磷產(chǎn)生至少6個(gè)分枝(從胺膦嗪可產(chǎn)生出12個(gè)分枝)，因此它可以用較少的合成步驟連接上更多的數(shù)量的末端基團(tuán)。分枝的多樣性也可以更好地控制水對(duì)這種聚合物的穿透性。
另外，膦嗪易于水解成良性的產(chǎn)物如氨和磷酸鹽，這從安全的角度考慮是重要的(參見本發(fā)明提及的Allcock的對(duì)比文獻(xiàn))。
亞磷酸鹽、磷酸酯、磷酸酰胺及膦嗪這些原料是公知的，許多可從市場(chǎng)上買到，而且現(xiàn)已開發(fā)的合成方法使分枝容易，也即，單體單位容易連接上。例如，參見Allcock等人，Inorg.Chem.21515(1982)和“Inorganic Polymers”Practice Hall，1972.“Biodegradable Polymers”(1992)，J.H.L Crammer，E.H.Schacht，E.H.G.Mense，Biomaterials，13，601.“Phosphorous-NitrogenCompounds”，by H.R.Allcook，1972，Academic Press.Allcock，等人，IC.1982，21，515。
對(duì)于亞磷酸鹽、磷酸酯等及其合成的描述參見，例如，“PhosphorusAnoutline of its Chemistry”4th Edition，D.EC.Cororidge，Elsevier，1990；Sokolowskii，J.Gen.Chem.USSR(Eng.Transi)303529(1960)；Dudek，Pr Nauk，Inst.Technol.Nieorg.Nawozow Miner.Politech.Wroclaw 303-9(1986)；Steinbach等人，Z.Anorg.Allg.Chem.523180-186(1985)；Foss等人，Zh.Obshch.Khim.481713(1978)；US-A-3685974；和US-A-3788986。
關(guān)于膦嗪合成的描述參見“Phosphazenes as Camer Molecules forBioactive Side GrouPs”ACS Monograph#232(1983)H.R.Allcock；CychcPhosphazene With Six Substitutions，JACS，913102，(1969)；and(1970)，58。還參見“Phosphorous-Nitrogen Compounds”，by H.R.Allcock，1972，Academic Press。
對(duì)核心結(jié)構(gòu)合成途徑特征的分析鑒定能夠?qū)Ξa(chǎn)生的多聚螯合物的大小及其在血管內(nèi)停留時(shí)間進(jìn)行控制。
對(duì)于亞磷酸鹽及磷酸酯核心結(jié)構(gòu)的合適合成方案包括 (B)(1)+excess NH1----->O＝P(NH2)(6) (D)(1)+NH2-CHR21-COOR20---->O＝P(NH-CHR21-COOR20)3(10)(11) (E)O＝P(OH)3+(10)----->O＝P(OCO-CHR21-NH2)3(13)(F)Na3PO4+(10)----->(13) (H)(1)+3HO-(CH2)n-Br----->O＝P(O(CH2)nBr)3(17) (18)(18)+(2)----->O＝P(O(CH2)nNH(CH2)2NH2)3(19)(I)O＝P(R22)3+HO(CH2)3Hal----->O＝P(OCH2CH2CH2Hal)3(20) (21) (22) 化合物(25)可以從Aldrich獲得，它和PHal3可以按照如上所示的方法中的(1)相類似的方法使用。焦磷酸((HO)2PO.O.PO(OH)2)也可以類似地使用，并且可以從市場(chǎng)上獲得。
在上述反應(yīng)步驟中，Hal代表鹵素，特別是氯，R20是一個(gè)烷基或另外一個(gè)合適的羧基封阻基團(tuán)，R21是氫或一種氨基酸α-側(cè)鏈，例如，一種可視情況胺化了的C1-4烷基，R22是一種C1-6烷基并且可以用原料的亞磷酸鹽類似物來制備式(b)的化合物。
在上述的制備方案中，如果與一種氨基酸或其衍生物進(jìn)行有效地縮合反應(yīng)，可以重復(fù)此反應(yīng)以形成一種二肽或肽連接物，從而對(duì)水解或酶裂解具有一種特定的敏感性(例如，參見Crommen等人，Biomaterials 13601(1992)和Kopacek等人，Ann NY Acad Sci 44693(1985))。而且，通過使用具有一個(gè)以上氨基功能團(tuán)的氨基酸，如賴氨酸，使得在連接基團(tuán)中進(jìn)行分枝成為可能。
用于OP(E)3核心結(jié)構(gòu)(其中E是氮)的其他起始物質(zhì)包括，例如，原磷?；０稯P(NH2)3，它可以通過Goehring等人的方法制備(Chem Ber.891771-1774(1956)。
可以按照Allcock等人所述方法制備膦嗪(Phosphazene)核心結(jié)構(gòu)，見“Phosphazenes as Carrier molecules for bioactive side goups”ACSmonograph No.233(1983)，JACS 913102(1969)和(1970)58及Inorg.Chem.21515(1982)；因此可以由六氯代環(huán)三膦嗪和甘氨酸乙酯制備下面的化合物 如上所述，以磷為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是易于進(jìn)行特征鑒定。
自旋活性磷(31P)的敏感性及天然豐度(100％)使得它是一種可進(jìn)行鑒定的理想原子核。由于每個(gè)P原子分出分枝步驟的幾何對(duì)稱性因而能夠即時(shí)判斷該分枝步驟的合成是否成功。也有利于在體內(nèi)使用獨(dú)特的31P信號(hào)。生物分布和代謝程度是可以測(cè)定的。
另外，公知的拉伸頻率P＝N(1150-1400cm-1)P-O-O烷基(Ca1040cm-1)和P-O-芳基(Ca1220cm-1)適用于通過IR光譜對(duì)該分子進(jìn)行分析和鑒定。這與Tomalia(如前所述)的多聚氨分枝聚合體相比是一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，Tomalia的分枝聚合體幾乎沒有光譜學(xué)上的分枝。
以硅為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)形成本發(fā)明的另一組改進(jìn)的核心基團(tuán)。這種核心結(jié)構(gòu)優(yōu)選地是以硅烷或硅氧烷為基礎(chǔ)。
Morikawa等人在Macromolecules，243469(1991)和253247(1992)中描述了多聚硅氧烷星芒散射狀聚合物。雖然所描述的聚合物不適用于本發(fā)明，但該硅氧烷單體可以形成本發(fā)明核心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，向該結(jié)構(gòu)上可以連接如多胺等連接基團(tuán)(L1，L2等)以形成如多聚胺等的分枝狀聚合體。
因此，代表性的以硅為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)包括環(huán)狀和無環(huán)硅烷及硅氧烷R73Si[(O)tSiR72]uR7(e)其中t是0或l，而u是0或一個(gè)正整數(shù)，優(yōu)選是1至8；R7可以代表一個(gè)RT基團(tuán)或一個(gè)R°或Z-alk(-R°)s基團(tuán)，至少兩個(gè)R7是R°或Z-alk-(R°)s，Z是一個(gè)化學(xué)鍵或一個(gè)氧或硫原子或一個(gè)亞胺基，alk(R°)s定義同上，或兩個(gè)R7基團(tuán)可以連接到不同硅原子上一起代表在一個(gè)5至8，優(yōu)選6或7元環(huán)上的一個(gè)化學(xué)鍵，或R7基團(tuán)代表一個(gè)式A的基團(tuán)[(O)tSiR72]uR7(A)其中t和u的定義同上，而R7的定義也如同上述關(guān)于R7的定義但不代表式A的基團(tuán)。在上述的式(e)中至少有兩個(gè)Si-O或Si-N鍵必須存在。
因此，以硅為基礎(chǔ)的式(e)的核心結(jié)構(gòu)的例子包括下列通式的結(jié)構(gòu)SiR74＂(f)SiR73＂-SiR73＂(g)[SiR72＂] (h)[SiR72＂O]3(i)R73′Si-O-SiR73＂ (j)其中R7＂是一個(gè)如上所定義的Z-alk(R°)s基團(tuán)，而V是5，6或7。
這一類的核心結(jié)構(gòu)可以利用硅氯化物為原料而容易制備，并且有些這種環(huán)狀核心結(jié)構(gòu)和前體及類似物的確是已知的(參見West等人，Pure Appl.Chem.54104，(1982)，和Zhon等人J.Polymer Sci.Chem.Edit 291097(1991)，以及Polymer Preprints，205th ACS Meeting，Denver Colorado 28.3.93至1.4.93，第822-823頁)。按照如上所定義的由這種核心結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分枝狀聚合體擴(kuò)增可以制得其他種類的核心結(jié)構(gòu)。
例如，可以按照下述步驟用氯化硅為起始原料制備核心結(jié)構(gòu) (其中R°′是一種保護(hù)的R°基團(tuán)，例如，一種BOC保護(hù)的胺)如果需要，可以將氯化硅與氨基酸酯如NH2CH2COOEt.HCl反應(yīng)制備以酯為末端的-alk(R°)s基團(tuán)。
這種核心結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是可以容易地控制分枝的程度。而且，硅能夠通過高價(jià)進(jìn)行取代以制備不穩(wěn)定的5或6個(gè)配價(jià)中間體，這有益于能夠制備可以控制水解以產(chǎn)生可預(yù)見性片段的分枝狀聚合體。
以硅為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，容易使用29Si-nmr(例如，使用極化傳送脈沖序列，如DEPT和INEPT)和IR及UV-VIS光譜對(duì)它們進(jìn)行鑒定。
以硼為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)形成另一類適用于本發(fā)明的核心結(jié)構(gòu)。例如，這類結(jié)構(gòu)基于式(k)的環(huán)狀化合物 (其中R7的定義同上，而X2是-O-、＝N-或-NR7′-)，特別是式(l)和(m)的化合物 (其中R7＂的定義同上)。
這些也可以通過類似于上述的標(biāo)準(zhǔn)硼化學(xué)技術(shù)來制備，例如，使R7＂B(OH)2(其中R7＂是一種可視情況進(jìn)行保護(hù)的R7′基團(tuán))或BCl3與氨縮合，然后進(jìn)行環(huán)取代。
因此，這種以硼為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)的合成途徑的例子包括下述過程 (其中R＂是一種可取代的基團(tuán)(根據(jù)適當(dāng)情況可以是親電子性的或親質(zhì)子性的取代)和R7＂是一種可視情況保護(hù)的R7′基團(tuán))。而且，可以對(duì)末端R°基團(tuán)進(jìn)行改性，以便用優(yōu)選的末端酯取代末端胺，而且可以按與本發(fā)明所涉及的其他核心結(jié)構(gòu)和常規(guī)分枝體核心結(jié)構(gòu)相類似的制備方法來生產(chǎn)這種核心結(jié)構(gòu)的分枝狀聚合體。
以硼為基礎(chǔ)的核心結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是，它們可以容易地降解成良性的代謝產(chǎn)物，如，NH4+和R-B(OH)2，并且可以用明確定義和鑒定的合成方案控制其合成過程及控制其對(duì)水解的敏感性，而且也可以使用核磁共振法進(jìn)行鑒定。
另一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)是硼的存在可使該分枝狀聚合體適用于中子捕獲性療法。
可以使用的其他核心結(jié)構(gòu)包括式n的三嗪 其中R、alk和S的定義同上，a和b各是0或1，a和b的和為1。
例如，可以由文獻(xiàn)中已知的或某些情況下從Alarich獲得的三烷基三嗪和三烯丙氧基三嗪制備這些三嗪，例如， 通過將(F)或(G)與BOC單保護(hù)的1，2-乙二胺反應(yīng)，然后脫保護(hù)，或使(H)與SO2Cl2或另一種鹵化劑反應(yīng)，然后將鹵化物與1，2-乙二胺反應(yīng)，等等。
可以按照上述討論再進(jìn)行進(jìn)一步的R基團(tuán)改性和分枝狀聚合體增長(zhǎng)。
盡管如此，在所有情況下，制備和改性生物可降解的核心，例如，水解敏感的核心，所用的反應(yīng)條件當(dāng)然是非水性溶劑，如，甲醇、甲苯、乙腈、1，2-乙二胺、甲基丙烯酸甲酯等。用于進(jìn)行分枝狀聚合體增長(zhǎng)的偶合反應(yīng)，例如，與1，2-乙二胺或甲基丙烯酸甲酯的反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)在較低的溫度下進(jìn)行以避免聚合反應(yīng)；一般來說，與1，2-乙二胺的反應(yīng)步驟可以在-5至+10℃下進(jìn)行，而與甲基丙烯酸甲酯的反應(yīng)可以在20至40℃下進(jìn)行。
還應(yīng)當(dāng)指出的是，盡管在前面的討論中一直是關(guān)于生物可降解核心結(jié)構(gòu)，但是，這種基團(tuán)，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，也可以在分枝狀聚合體中形成一個(gè)或幾個(gè)非核心分枝位點(diǎn)。同樣該環(huán)狀核心可以直接連接上螯合劑或其他活性的或改性的部分形成本發(fā)明的零級(jí)分枝狀化合物。而且，雖然上面的討論集中在可以連接活性基團(tuán)的生物可降解分枝狀聚合體框架上，但是，如上所述，可以用非生物可降解分枝狀聚合體框架，如Tomalia(如前所述)的PAMAM分子，來攜帶通過生物可降解連接體結(jié)合其上的單或多功能活性基團(tuán)。
因此，主鏈結(jié)構(gòu)D和活性(例如，螯合劑)部分A或修飾劑M之間的連接是可視情況通過如前所述的生物可降解鍵結(jié)合。但是，對(duì)于螯合劑部分來說，這些基團(tuán)優(yōu)選通過酰胺鍵連接，酰胺的氮來自于骨架分子或更通常是來自于一種連接其上的連接基團(tuán)，而酰胺的羰基來自于螯合劑上的羧基或羧基衍生官能團(tuán)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中骨架(D)與螯合劑(Ch)的連接可表示為D-L3-Ch(其中L3是一種視情況可生物裂解的連接基團(tuán))，而在另一個(gè)實(shí)施方案中表示為D-L4(Ch)s(其中L4是一種視情況可生物裂解的連接基團(tuán)，而S是一個(gè)大于1的整數(shù))。在后者情況下，可對(duì)L4進(jìn)行選擇以致于它斷裂之后釋放出單或多聚螯合劑。
L3和L4優(yōu)選包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，在分枝狀聚合體和螯合劑之間提供一個(gè)可水解的間隔基，例如，一種能夠被蛋白酶間介切割的基團(tuán)。因此，一種以胺為末端的分枝狀聚合體可以連接到一種螯合劑基團(tuán)AA-NH-CH2CH2NHCOCH2DO3A(Gd)，其中DO3A(Gd)是一個(gè)連結(jié)的環(huán)氮原子、釓螯合的、DO3A殘基，而AA是一個(gè)低聚氨基酸間隔基。
通過將多個(gè)活性基團(tuán)連接到一個(gè)分枝狀聚合體骨架分子上，一般是一個(gè)水溶性的具有反應(yīng)基團(tuán)的聚合物上，可以制備本發(fā)明的放大體。該骨架分枝狀聚合體聚合物合適的是具有至少3個(gè)，優(yōu)選不超過400，特別是不超過384，尤其是不超過192，例如，不超過48個(gè)反應(yīng)基團(tuán)。該反應(yīng)基團(tuán)可以是胺，優(yōu)選伯胺，羧酸鹽，酯，乙醇或硫醇鹽等。
優(yōu)選的分枝狀聚合體骨架聚合物分子是單分散性，如果需要，它們可以是徑向?qū)ΨQ的，每個(gè)視情況可分枝的連接基團(tuán)是等同的。
一類優(yōu)選的螯合試劑包括具有一個(gè)9-18元環(huán)的大環(huán)試劑，該環(huán)上結(jié)合有選自O(shè)，N和S的環(huán)雜原子，并且具有至少與環(huán)連接的側(cè)鏈，該側(cè)鏈可視情況進(jìn)一步攜帶有金屬配位基團(tuán)，或能夠改變螯合復(fù)合物生物分布的基團(tuán)，其中一個(gè)側(cè)鏈起連接大環(huán)與分枝狀聚合體的作用。
因此，一類優(yōu)選的大環(huán)螯合劑可以表示為通式IX 其中X3是O，S或NR12X是一個(gè)3-8的整數(shù)，優(yōu)選3或4，W是一個(gè)2-4的整數(shù)，優(yōu)選2或3，和R12是氫或一個(gè)如上所述的側(cè)鏈，優(yōu)選是一個(gè)C1-18烷基，它可視情況被一個(gè)金屬配位基團(tuán)、一個(gè)螯合基團(tuán)、一個(gè)親水基團(tuán)或一個(gè)親脂基團(tuán)取代，與這些基團(tuán)的連接視情況可通過酯、酰胺、胺、乙醇或醚官能團(tuán)連接。
優(yōu)選的大環(huán)骨架部分包括下面的多氮雜環(huán)鏈烷烴 盡管連接一個(gè)親水或親脂基團(tuán)或連接到分枝狀聚合體上的側(cè)鏈容易連接到一個(gè)大環(huán)的環(huán)碳原子上，但非氫R12側(cè)鏈優(yōu)選連接到環(huán)氮原子上。
通過R12側(cè)鏈，尤其是環(huán)氮原子連接的側(cè)鏈，可以攜帶的配位基團(tuán)的例子包括COOH，COMR222(其中R22是氫或者取代或不取代的烷基、酯、胺或乙醇，例如，一種被胺、羥基或C1-4烷氧基取代或不取代的C1-6烷基，例如，2-氨基-乙基)、CONHOH、SO3H、PO3H、羥基苯基、羥基吡啶基、酮基、和羥基。
在這種情況下，配位基團(tuán)優(yōu)選結(jié)合在R12的1-或2-位上，尤其是1位點(diǎn)。盡管如此，R12優(yōu)選的是在1位上不被羥基取代。優(yōu)選該大環(huán)骨架攜帶有2-4個(gè)，特別是至少3個(gè)這種配位基團(tuán)。因此，舉例說明，螯合基團(tuán)可以是一個(gè)1，4，7，10-四氮雜-1，4，7-三羧甲基-10-(1，4-二氮雜-5-氧代-己基)環(huán)十二烷。
優(yōu)選的親水性R12基團(tuán)包括羥基化的和/或烷氧基化的烷基，如，2-羥基乙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、2-羥基-丁基、3-羥基丁基、4-羥基丁基、2，3-羥基-1-甲基-丙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基、2(2-羥基-乙氧基)乙基、和2(2(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙基，特別是2-羥基乙基、2-羥基丙基、2，3，4-羥基丁基和三羥基仲丁基。
親脂性R12的例子包括中等長(zhǎng)鏈至長(zhǎng)鏈的線型或分枝的烴(例如，C10-C20)的芳香基團(tuán)，例如，芳烷基，烷芳基或芳基。
因此，合適的大環(huán)螯合劑的例子包括DOTA、DO3A、DOXA、HP-DO3A、TCDA和環(huán)烯及它們類似物，以及能連結(jié)到靶分子或連接到一種聚合物骨架上產(chǎn)生一種多聚螯合劑的這類螯合劑。
也可以使用含有線型或分枝的多氮雜烷烴骨架單位的螯合劑。這些包括通式X的化合物R212((CR212)qX3)YR12(X)其中X3、R12和S的定義同上，且至少[(CR212)qX]Y基團(tuán)的末端X3是氮，而Y是一個(gè)0至4的整數(shù)，優(yōu)選1，2或3，特別是1或2，但是R12基團(tuán)也可以一起在連接體骨架上形成稠合飽和或不飽和環(huán)，該環(huán)本身可以被金屬配位基團(tuán)取代，NR212可以表示為N＝R14，其中R14是一個(gè)取代或不取代的C1-8亞烷基，如對(duì)R12來說，一個(gè)N(CR212)2N鍵中間可視情況插入一個(gè)C6飽和或不飽和碳環(huán)的環(huán)，而且一個(gè)氮在非末端X3上連接了R12基團(tuán)可以代表一個(gè)支鏈[(CR215)qX3]mR152，且其中X3、S和Y定義同前，R15的定義同R12，但不能代表這樣一個(gè)支鏈。
因此，也可以使用通式XI的亞氨基酸螯合劑(R12)3N (XI)(其中R12的定義同上，但條件是至少兩個(gè)R12基團(tuán)帶有金屬配位基團(tuán)，例如，CH2COOH，并且其中一個(gè)連結(jié)到分枝狀聚合體上)。
下面是用于這類螯合劑的優(yōu)選的多氮烷烴骨架結(jié)構(gòu)單位的例子 因此，合適的線型和分枝螯合劑的例子包括EDTA、DTPA、TTHA、EGTA、EHPG、DPDP、pycac、pycbac、DTPA-BMA、salen、二肽(例如，H-gly-tyr-OH、H-Pro-gly-OH、H-gly-scr-OH、H-gly-asp-OH和H-gly-glu-OH)、HENSAL、H2SHED、HSALIMH、DFO、PnAO、NTA、HIDPA、LICAM、DEPA、及其類似物的殘基。
適用于連接到分枝狀聚合體骨架的螯合劑的另外些例子參見于由該領(lǐng)域中技術(shù)領(lǐng)先的公司如，NycomedImaging As，Nycomed Salutar Inc.，ScheringAG，Bracco，Guerbet，Mallinckrodt和Squibb申請(qǐng)的關(guān)于MRI對(duì)比劑的專利文獻(xiàn)中，例如，US-A-4647447，EP-A-235261，WO-A-89/00557，WO-A-90/08138，WO-A-90/08134，WO-A-91/10669，WO-A-91/15466，WO-A-91/15467，WO-A-92/11232，EP-A-290047，WO-A-90/12050，WO-A-91/05762，WO-A-91/10645，WO-A-92/08707，EP-A-232751，EP-A-292689，WO-A-88/07521，WO-A-88/08422，EP-A-305320，EP-A-331616，等，及本文所列的出版物。
然而，合適的螯合劑是一種多聚氨基多羧酸(PAPCA)，優(yōu)選一種大環(huán)的PAPCA，特別優(yōu)選的是該分枝狀聚合體骨架連接到大環(huán)螯合劑環(huán)結(jié)構(gòu)的供體環(huán)雜原子上，特別上連在氮原子上?；蛘撸鳛榱硪粋€(gè)例子，該分枝狀聚合體骨架可以通過連接到大環(huán)螯合劑的一個(gè)環(huán)雜原子上的連接基團(tuán)而連接上一個(gè)大環(huán)螯合劑基團(tuán)(例如，一種 基團(tuán)，其中alk′是一個(gè)C1-4亞烷基鏈，而X_是NCS、NH2、N2+、NCO、-alk′-COOH、NHCOCH2Cl或NHCOCH2Br)或在一個(gè)環(huán)碳原上連接，如Meares等人所建議的(參見Acc Chem Res 17202(1984)和US-A-4678667)。因此，舉例說明，可以利用連接基團(tuán) 連接一個(gè)大環(huán)如DO3A(在未取代的環(huán)氮原子上連接)。在另一個(gè)優(yōu)選的方案中，可以使用寡聚氨基酸連接體或能夠使該螯合劑形成可水解鍵(如Wo92/04392的二酯鍵)的連接體。
同樣，可以使用常規(guī)的化學(xué)方法使其他的改性劑和活性基團(tuán)，如PEG分子或碘芳基，偶合到分枝狀聚合體骨架上。
本發(fā)明的放大體和雙官能多聚螯合劑可以以其未進(jìn)行金屬取代或金屬取代不足的狀態(tài)用于吸收體內(nèi)的金屬離子，例如，用于金屬解毒療法。或者，也可以使用其金屬取代形式的放大體和雙官能多聚螯合劑在診斷或治療應(yīng)用中傳輸螯合的金屬離子。
用放大體選擇進(jìn)行螯合的金屬離子，使它們能夠在診斷或治療中發(fā)揮作用。這些作用包括，但不局限于，增強(qiáng)MRI、γ閃爍顯像或CT掃描中的成像，或傳輸細(xì)胞毒性試劑以殺死有害細(xì)胞，如，腫瘤細(xì)胞，或用于傳送釩以治療糖尿病等。
通過螯合反應(yīng)能夠結(jié)合的金屬包括鑭系元素和其他金屬離子，包括它們的同位素和放射性同位素，例如，Mg，Ca，Sc，Ti，B，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，Sr，Y，Zr，Rc，Ru，In，Hf，W，Re，Os，Pb和Bi。上述某些特別優(yōu)選的放射性同位素包括153Sm，64Cu，67Cu，67Ga，68Ga，89Sr，88Y，90Y，99mTc，97Ru，103Ru，111In，186Re，188Re，203Pb，211Bi，212Bi，213Bi和214Bi。本發(fā)明多聚螯合的金屬離子是根據(jù)治療或診斷應(yīng)用上的要求來選擇的。
如果與放射性核素一起使用，例如，用于核醫(yī)學(xué)，本發(fā)明帶來的優(yōu)點(diǎn)是可使放射性核素與大環(huán)螯合劑緊密結(jié)合。由于背景的金屬含量較低，這可以獲得更具體的圖像。
本發(fā)明的雙官能分枝狀聚合體化合物包括將放大體偶聯(lián)到位點(diǎn)定向性分子上。該位點(diǎn)定向分子可以是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)選擇的任何靶器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞群，或其他部位中自然聚集的分子。這些分子可以包括氨基酸、寡肽(例如，己肽)、分子識(shí)別單位(MRu′S)、單鏈抗體(SCA′S)、蛋白質(zhì)、Fab片段、和抗體。位點(diǎn)定向性分子包括多糖(例如，透明質(zhì)酸、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、纖維素、淀粉、右旋糖酐、藻酸鹽、葡聚糖、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素(dermatan)、硫酸軟骨素(chondroitin)硫酸乙酰肝素、肝素、菊糖、和膠原)，膽汁酸、類脂及其衍生物(例如，F(xiàn)A，磷脂、糖脂、和膽固醇)、蛋白質(zhì)(如小麥胚凝集素、補(bǔ)體成分、補(bǔ)體成分片段、細(xì)胞因子、類二十烷酸(eicosanoids)、纖連蛋白(fibbronectin)、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、紅血蛋白、EGF(表皮生長(zhǎng)因子)、甘露糖-6-磷酸、配體、凝集素、脫唾液酸、膽球蛋白(asialofetuin)、多克隆IgG，血液凝集蛋白(例如，水蛭素)，脂蛋白和糖蛋白)，激素，生長(zhǎng)因子，核酸、脫氧核糖核酸、抗原、半抗原和凝血因子(如PF4)。代表性的位點(diǎn)定向性蛋白質(zhì)包括聚合的纖維蛋白片段(例如，E1)，血清淀粉樣蛋白前體(SAP)蛋白，低密度脂蛋白(LDC)前體、血清白蛋白、無損紅血細(xì)胞的表面蛋白、受體結(jié)合分子如雌激素，肝特異性蛋白/聚合物如半乳糖-新糖白蛋白(NGA)(參見Vera等人，Radiology 151191(1984))N-(2-羥基-丙基)甲基丙烯酸酰胺(HMPA)共聚體，并帶有不等數(shù)量結(jié)合的半乳糖胺(參見Duncan等人，Biochim.Biophys.Acta 88062(1986))，以及烯丙基和6-氨基己基糖苷(參見Wong等人，Carbo.Res.17027(1987))，和血纖維蛋白原。
該位點(diǎn)定向性蛋白也可以是一種抗體或其片段或一個(gè)小的位點(diǎn)特異性肽。對(duì)抗體的選擇，特別是抗體的抗原特異性，將取決于該結(jié)合物的有效用途。單克隆抗體比多克隆抗體較優(yōu)選。
人血清白蛋白(HSA)是用于血管系統(tǒng)研究的優(yōu)選蛋白質(zhì)。HSA在商業(yè)上可由多種途徑獲得，包括Sigma化學(xué)公司。與某種有用抗原反應(yīng)的抗體制劑是公知的。抗體制劑在商業(yè)上可從幾種來源獲得。血纖蛋白片段E1可以按照Dlexa等人在J.Biol.Chem.2544925(1979)中所述的方法制備。de Beer等人在J.Immunol.Methods 5017(1982)中描述了LDL前體和SAP蛋白的制劑。上述的文章本文全部引用作為參考文獻(xiàn)。
將骨架聚合物連接到抗體和其他蛋白上的方法屬于本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員的水平。這些方法描述在pierce 1989 Handbook and General Catolog及本文引用的文獻(xiàn)，Blatter等人，Biochem.，241517(1985)和Jue等人，Biochem.，175399(1978)中。上述引用的參考文獻(xiàn)本文全部引用作為參考。
在雙官能分枝狀聚合體化合物中，優(yōu)選將1或2個(gè)骨架分子連接到位點(diǎn)定向性分子上。通過限制連接到位點(diǎn)定向性分子上的放大體的數(shù)目，該雙官能分枝狀化合物的藥理學(xué)性能將會(huì)表現(xiàn)出高度的靶特異性和低的非特異性結(jié)合。
該雙官能分枝狀聚合體化合物能夠含有大量的活性基團(tuán)(例如，螯合劑基團(tuán))。這可以使得位點(diǎn)特異性成像比以前得到的成像有所加強(qiáng)。
這些放大體和雙官能多聚螯合劑不僅特別適用于磁共振和X-線成像，它們也適用于其他形式的成像，同樣適用于核醫(yī)學(xué)。目前可獲得的成像加強(qiáng)劑的滲摩爾濃度會(huì)使這些試劑產(chǎn)生某些有害的副作用，包括引起病人的疼痛。通過使溶液中每個(gè)分子中加強(qiáng)成像的螯合金屬中心的數(shù)目能顯著增加，本發(fā)明可以明顯降低滲摩爾濃度，而成像加強(qiáng)的程度仍保持相同或增加。
一般來說，放大體的合成是在將骨架分子結(jié)合到任何大的改性部分如PEG或一個(gè)位點(diǎn)定向性大分子上之前，先將活性部分結(jié)合到骨架分子上。在大多數(shù)情況下，將螯合劑結(jié)合到骨架分子上所用的反應(yīng)條件會(huì)使蛋白質(zhì)變性。因此，為了保護(hù)其三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物功能，一種抗體或其他位點(diǎn)定向性蛋白在將螯合劑基團(tuán)結(jié)合到骨架分子上之前一般不與該骨架分子結(jié)合，當(dāng)然除非是這種結(jié)合可以在不使蛋白變性的情況下進(jìn)行。在放大體與改性劑例如，位點(diǎn)定向性大分子)結(jié)合之前或之后，可以加上金屬離子以形成多聚螯合劑的金屬配合物。優(yōu)選的是，在放大體多聚螯合劑與大多數(shù)蛋白質(zhì)(特別是抗體)結(jié)合之前加上金屬，這尤其要避免金屬與蛋白的不正常結(jié)合。然而，對(duì)于某些金屬離子如半衰期較短的放射性核素來說，優(yōu)選在剛剛使用之前，結(jié)合之后進(jìn)行金屬取代。
一般來說，可以使用已知的方法將螯合劑結(jié)合到骨架分子上。這些方法包括，例如，Krejcarek等人的混合酐方法(Biochemical and BiophysicalResearch Communications 77581(1977))，Hnatowich等人的環(huán)狀酐方法(參見Science 220613(1983)及其他)，Meares等人的骨架衍生方法(參見Anal.Biochem.14268(1984))和Manabe等人在Biochemica et Biophysica Acta883460-467(1986)中所述的用改良的環(huán)狀酐方法將DTPA殘基連接到一個(gè)多聚-L-賴氨酸骨架上的方法。雖然對(duì)于優(yōu)選的大環(huán)螯合劑，如，DOTA來說，由Krejcarek和Hnatowich所述的常用的混合酐和環(huán)狀酐結(jié)合方法不能生效，但是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過改良該混合酐方法，即將一種多羧基大環(huán)螯合劑在無水介質(zhì)中與一種強(qiáng)度足以提取全部羧基質(zhì)子(也即，足夠高的pKa)的胺堿反應(yīng)，產(chǎn)生一種胺鹽，該鹽可以與一種烷基鹵代甲酸反應(yīng)產(chǎn)生一種活化的酐，而這種酐能結(jié)合到骨架分子上而又不引起與現(xiàn)有技術(shù)的雙官能多聚螯合劑發(fā)生無用的交聯(lián)。對(duì)大多數(shù)大環(huán)螯合劑來說，四甲基胍或一種類似強(qiáng)度的胺堿是優(yōu)選的堿。
當(dāng)然，也可以使用更復(fù)雜的結(jié)合技術(shù)，例如，以類似于Meares等人的方法(同前)利用骨架衍生的大環(huán)螯合劑，但是由于成本增加且整個(gè)生產(chǎn)過程的復(fù)雜性使得這種途徑不太理想。同樣，根據(jù)螯合劑上存在的活性基團(tuán)可以通過一種鹵代乙酰基鹵化物、一種碳酰氯或一種硫代碳酰氯將螯合劑連接到骨架聚合物上。
對(duì)于帶有側(cè)基羧化物的大環(huán)螯合劑來說，包括但不限于DOTA、TETA、TRITA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十三烷四乙酸)和NOTA，其中一個(gè)羧化物能夠形成一個(gè)能與骨架聚合物的伯胺基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)。由羧化物基團(tuán)形成反應(yīng)基團(tuán)的方法包括改良的混合酐反應(yīng)，例如，使用異丁基氯甲酸酯(IBCF)，或用一種碳化二亞胺形成一種“活化的酯”(DCC或EDAC，參見Pierce Catalog(1988)，第252和253頁)。兩種反應(yīng)過程都產(chǎn)生一種可通過穩(wěn)定的酰胺鏈被螯合劑基團(tuán)進(jìn)行多個(gè)取代的骨架聚合物。然而改良的混合酐方法是用于將含羧化物的大環(huán)螯合劑連接到骨架聚合物上的優(yōu)選方法。
該改良的混合酐反應(yīng)是在無水溶劑中進(jìn)行，該溶劑優(yōu)選熔點(diǎn)在5℃以下，并將其冷卻到不低于5℃或大于大約在其凝固點(diǎn)之上55℃的溫度。螯合劑在合適溶劑中的溶解可有效地通過用胺堿就地制備一種螯合劑的胺鹽而實(shí)現(xiàn)。
對(duì)堿的選擇要由相關(guān)羧化物的pKa而決定。對(duì)于大多數(shù)螯合劑來說，四甲基胍(TMG)是特別優(yōu)選的。一般來說，堿選自于那些pKa值超過螯合劑的最高pKa至少0.5，優(yōu)選0.8，特別優(yōu)選至少1.0的堿較為合適。具有pKa值至少為11，優(yōu)選是至少11.3，特別優(yōu)選至少12的胺堿是特別優(yōu)選的，并且除TMG之外還可特別提出哌啶、喹寧環(huán)和N-乙基哌啶，特別是DBU(1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯)和DBN(1，5-二氮雜二環(huán)[4，3，0]九-5-烯)。另外，Martell和Smith在“Critical Stability Constants”Vol.5，第一次修訂版，Plenum Press，NY1982中還列舉了一些堿。
在攪拌狀態(tài)下加入適量的純凈(冷藏的)烷基鹵代甲酸酯，并通過冷卻，例如需要的話加入冷卻劑，以保持溶劑的原始溫度。異丁基氯甲酸酯是特別優(yōu)選的。所產(chǎn)生的螯合劑的活化酐能夠與含胺的分枝狀聚合體反應(yīng)形成一種放大體多聚螯合劑。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用來說，在此時(shí)對(duì)放大體多聚螯合劑進(jìn)行金屬化，并通色譜法或結(jié)晶法純化以除去多余的金屬離子和較低分子量的金屬配合物。如果與靶特異性分子一起使用，要將該放大體多聚螯合劑，或至少部分金屬取代形式的且還含有至少一個(gè)游離胺的放大體多聚螯合劑，與靶分子結(jié)合，例如通過與許多種公知的雜雙官能偶合劑中的一種進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合。對(duì)于先進(jìn)行金屬取代不太合適的情況，例如，用半衰期短的放射性核素金屬離子，可以使用一種無金屬的放大體按上面所述進(jìn)行偶合，然后通過金屬取代(見下面)，最后進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的色譜或過濾純化來制備該雙官能多聚螯合劑。
也可以通過一種非配位伯胺基團(tuán)或不涉及金屬配位的遠(yuǎn)端羧基，將螯合劑連接到骨架聚合物上。具有一個(gè)非配位伯胺基團(tuán)的大環(huán)螯合劑包括伯胺側(cè)鏈衍生的DOTA大環(huán)、伯胺衍生的DO3A、和伯胺衍生的六氮雜和八氮雜大環(huán)和大二環(huán)(HAMS、冢狀化合物和棺狀化合物)以及一大類衍生的冠醚穴狀化合物。如果用螯合劑(或?qū)嶋H上可以是任何其他活性部分)上的羧基進(jìn)行連接，可以用常規(guī)的羧基活化反應(yīng)的化學(xué)方法例如連接到該骨架上的胺官能團(tuán)上或與該骨架結(jié)合的一個(gè)連接體上。
這些螯合劑上的非配位伯胺基團(tuán)可以與一種鹵代乙酰基鹵化物在公知的條件下反應(yīng)形成一種鹵代乙酰胺。該鹵代乙酰胺可以與骨架聚合物上的伯胺反應(yīng)形成一種穩(wěn)定的在螯合劑和聚合物之間的酰胺連接鍵。可以用DeRiemer等人，在J.Labelled Compd.Radiopharm.181517(1981)中所述的鹵代乙酰鹵化物方法將含胺的螯合劑連接到骨架聚合物上。
螯合劑上的胺基團(tuán)也可以與光氣反應(yīng)產(chǎn)生一種反應(yīng)性異氰酸酯基團(tuán)，或與硫光氣反應(yīng)產(chǎn)生一種反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。這些基團(tuán)能夠與骨架聚合物的伯胺反應(yīng)在配體和骨架聚合物之間分別形成一種穩(wěn)定的尿素或更穩(wěn)定的硫脲連接基團(tuán)。Gansow，Inorg.Chimica Acta 91213(1984)和Moi等人在J.Amer.Chem.Soc.1106266(1988)中描述了將螯合劑連接到具有胺基團(tuán)的的蛋白上的方法，是通過用光氣或硫光氣方法分別形成異氰酸酯或異硫氰酸酯基團(tuán)?？蓞⒁奃esreux，Inorg.Chem.191319(1980)；Bryden等人，Anal.Chem.531418(1981)；Delgardo等人，Talanta 29815(1982)；Cacheris等人，Inorg.Chem.26958(1987)；Moi等人，Inorg.Chem 263458(1987)和Meares等人，Acc.Chem.Res.17202(1984)。
下面的反應(yīng)式進(jìn)一步解釋了將螯合劑部分偶合到骨架聚合物上的其他方式。 對(duì)于以胺為末端的分枝狀聚合體聚合物，該物質(zhì)NH2-聚合物和CH3OCO-聚合物分別代表全級(jí)和半級(jí)(例如，G2.0和G2.5)分枝狀聚合體。
在聚合物中插入的寡聚氨基酸(例如，寡聚賴氨酸)鏈與活性(或改性)部分連接體的相對(duì)位置特別理想的應(yīng)當(dāng)是能夠控制該活性基團(tuán)在體內(nèi)的水解釋放。
如前所述，對(duì)于由多聚螯合劑螯合的金屬離子的選擇取決于應(yīng)用該多聚螯合物的診斷或治療的技術(shù)。例如，對(duì)于磁共振成像來說，該金屬離子應(yīng)當(dāng)是順磁的，并且優(yōu)選是非放射活性的。對(duì)于X-線和超聲成像來說，應(yīng)當(dāng)使用重金屬離子，例如，用原子序數(shù)至少為37，優(yōu)選至少為50的金屬離子，并且優(yōu)選非放射活性的此金屬種類。對(duì)于閃爍顯像或放射療法來說，該金屬離子當(dāng)然應(yīng)當(dāng)是放射活性的同位素。對(duì)于溫?zé)岑煼▉碚f，可以使用螯合基團(tuán)連接到分枝狀聚合體鐵的氧化物或其他超順磁多原子金屬種類，其在外用時(shí)能夠改變磁場(chǎng)，或者在MW輻射時(shí)能產(chǎn)生局部的熱效應(yīng)。這些物質(zhì)可以同樣用于磁共振、X-線、EIT或磁性成像當(dāng)中。
將金屬離子與螯合劑和多聚螯合劑配合的方法屬于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)。所用的每種金屬都可以通過三種普通方法中的一種結(jié)合到螯合劑基團(tuán)中，此三種方法是直接結(jié)合，模板合成和/或金屬轉(zhuǎn)移。優(yōu)選直接結(jié)合。
優(yōu)選的是，要在將放大體連接到位點(diǎn)定向性分子上之前完成金屬與雙官能多聚螯合劑的結(jié)合。將金屬從亞化學(xué)計(jì)量水平進(jìn)行滴定，使其上升到全部結(jié)合水平，從而沒有必要做透析和大范圍的色譜純化。這種方法避免了大量的損失及稀釋。而且也防止了金屬離子與位點(diǎn)定向性分子的非特異性結(jié)合。不過，如果將本發(fā)明應(yīng)用于半衰期短的放射性核素時(shí)需要把雙官能多聚螯合劑的金屬取代作為最終步驟，然后進(jìn)行簡(jiǎn)單快速的純化(例如，凝膠過濾)以除去多余的未結(jié)合的放射性核素。
可以通過下述的一般方法將金屬離子Fe(III)、Cr(III)、Mn(II)、Hg(II)、Pb(II)、Bi(III)和鑭系元素直接結(jié)合到聚氨基多羧化物上。將一種水溶形式的金屬，一般是一種無機(jī)鹽，溶于適量的蒸餾去離子水中。該溶液的pH值低于7。在室溫下向該金屬溶液攪拌加入含有等摩爾量多聚螯合劑的水溶液。通過加入堿，典型的是加入0.1M NaOH，使混合物的pH值緩慢上升直到該多螯合劑的供體基團(tuán)達(dá)到脫質(zhì)子化的程度，一般達(dá)到5-9的pH范圍，這要取決于螯合劑基團(tuán)的情況。特別需要注意的是對(duì)于鑭系離子要保持pH在8以下，以避免金屬氫氧化物的沉淀。正如下述參考文獻(xiàn)中所述的，金屬向DOTA衍生的和相關(guān)的大環(huán)螯合劑基團(tuán)中的結(jié)合一般是一個(gè)緩慢的過程。這種方法的具體例子包含在下述參考文獻(xiàn)中。
Choppin等人在J.Inorg.Nucl.Chem.，33127(1971)，Margerum在Rec.Chem.Prog.，24237(1973)和D′olieslager等人在J.Inorg.Nucl.Chem.，354255(1973)中描述了鑭系金屬向聚氨基多羧化物中的直接結(jié)合。Margerstadt在Mag.Res.Med，3808(1986)和WO-A-87/06229中描述了Gd(III)向DOTA中的結(jié)合。Kumar等人在J.Chem.Soc.Chem.Commun.，3145(1989)中描述了制備DOTA的Bi和Pb復(fù)合物的方法。上述文獻(xiàn)本文全部引用作為參考文獻(xiàn)。
根據(jù)公知的方法可以進(jìn)行Hf、Zr、W、Hg和Ta的直接結(jié)合。例如，參見，美國(guó)專利No.4,176,173(Winchell)。
當(dāng)金屬離子需要還原到更加合適的氧化狀態(tài)以便于螯合劑部分的供電子原子進(jìn)行結(jié)合時(shí)，要用金屬轉(zhuǎn)移的方法。例如，為了結(jié)合99mTc或186/188Re，必須利用還原劑如SnCl2或半胱氨酸通過公知方法將金屬離子還原成Tc(V)或Re(V)。這種方法需要形成一種中間體復(fù)合物。典型的例子是在與螯合劑如DOTA配合之前，在弱的配位配體存在下用Sn還原99mTc。這些方法在放射性藥學(xué)領(lǐng)域是公知的。67Cu利用四胺螯合劑如tet A或tet B(參見Bhardaredj等人，JACS，1081351(1986)穩(wěn)定Cu(II)用于和結(jié)合性更強(qiáng)的螯合劑反應(yīng)。
本發(fā)明多聚螯合劑的金屬螯合物對(duì)病人給藥用于成像的給藥量要足以在特定成像技術(shù)下產(chǎn)生理想的對(duì)比。一般來說，對(duì)病人每公斤體重0.001到5.0毫摩爾螯合成像金屬離子的劑量可以有效地達(dá)到足夠的對(duì)比加強(qiáng)效果。對(duì)于大多數(shù)磁共振成像應(yīng)用來說，優(yōu)選的成像金屬離子的劑量在0.001至1.2，例如，0.02至0.5，mmole/kg體重的范圍內(nèi)。而對(duì)于X-線應(yīng)用來說，一般0.5至1.5mmoles/kg的劑量可以有效地達(dá)到X-線衰減效果。對(duì)于大多數(shù)X-線應(yīng)用來說優(yōu)選的劑量為0.8至1.2mmoles的鑭系元素或重金屬/kg體重。
如果需要在血液中采集本發(fā)明的分枝狀聚合體化合物，那么優(yōu)選的是使用較高級(jí)的分枝狀聚合體骨架，例如，使用第四至六級(jí)分枝狀聚合體骨架?；蛘咭部梢允褂幂^低級(jí)的骨架，該骨架要帶有能夠使整個(gè)分子量升高并且能防止或延緩腎臟清除的改性劑(例如，PEG分子)。這種多聚螯合劑與已知的血池和ECF對(duì)比劑相比具有較強(qiáng)的對(duì)比性，因此，可以以較低的有效劑量給藥。
對(duì)于X-線應(yīng)用來說，為了使本發(fā)明聚螯合物獲得最佳效果的光子能量范圍擴(kuò)大，可以使用兩種或兩種以上不同金屬的聚螯合物，這可以是均聚螯合物的混合物或雜聚螯合物。
制備碘化部分并將其結(jié)合到分枝狀聚合體骨架(D)上的方法可由下述的反應(yīng)式進(jìn)行說明 (其中Y是所形成的分枝狀聚合體中載分枝的數(shù)量，例如，2至200，優(yōu)選5至150，特別是5至110)。所得到的化合物具有高水溶性和低滲透性，可以結(jié)合上規(guī)定的低毒性CT試劑的類似物，且每個(gè)分子上帶有大量的碘原子，例如一個(gè)G5分枝狀聚合體帶有288個(gè)碘。
或者也可以通過常規(guī)化學(xué)方法將碘直接結(jié)合到分枝狀聚合體末端上，例如，可以用甲苯磺?；然锾幚硪环N以羥基為末端的分枝狀聚合體(例如，D-(CONHCH2CH2OH)n，例如其中D是第5或更高一級(jí))產(chǎn)生聚甲苯磺酸鹽，該鹽用碘化鈉處理時(shí)產(chǎn)生聚碘代分枝狀聚合體(例如，D-(CONHCH2CH2I)n)如果抑制蛋白結(jié)合改性劑基團(tuán)結(jié)合到分枝狀聚合體框架上，視情況可以通過生物可降解鍵或連接基團(tuán)來進(jìn)行結(jié)合，在此情況下該聚合體的分步構(gòu)成方法可能包括1)制備一種分枝狀聚合體骨架，其上載有活性部分(例如，金屬螯合物)，該部分的MW基本上小于球形截面的分子量(＜50KD)，優(yōu)選小于30KD，特別是小于20KD；2)連接上一個(gè)寡聚體或多聚體改性劑以形成一種蛋白結(jié)合的立體化學(xué)屏障。
該改性劑可以是，例如PEG、PPG、多葡聚糖，或一種多糖(例如，淀粉酶，支鏈淀粉，淀粉，肝素或糖原)。每種改性劑優(yōu)選小于20KD，更優(yōu)選小于10KD。一種刷子型結(jié)構(gòu)，也即一種帶有一排抑制蛋白結(jié)合改性劑的放大體，而在每個(gè)放大體上需要幾個(gè)改性劑。該改性劑優(yōu)選應(yīng)當(dāng)結(jié)合2-50％的分枝狀聚合體結(jié)合位點(diǎn)。一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是可以避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(肝臟、脾臟及骨骼巨噬細(xì)胞的攝取)。某種改性劑如PEG可以顯著地增加血漿t1/2以及某種血池試劑的效用。
以任何金屬螯合物為基礎(chǔ)的商品試劑應(yīng)當(dāng)盡可能減少游離金屬的釋放和組織滯留。任何試劑在血液中停留的時(shí)間越長(zhǎng)，它釋放金屬的可能性越大。這對(duì)于任何無環(huán)配體來說尤其正確；DOTA或DO3A衍生的螯合劑部分在生理pH下在動(dòng)力學(xué)上對(duì)于金屬釋放是惰性的，并優(yōu)選用作為血池試劑。
制備改性放大體的另一種方式是利用在改性劑(例如，PEG)和放大體之間的水解敏感鍵。PEG還可以作為一種空間屏障，長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間可導(dǎo)致生物降解成一些小的PEG和一個(gè)放大體。另外，一種試劑的生物可降解性，如果某些器官攝取該試劑就增加了改性的安全范圍。所有片段會(huì)從血液或細(xì)胞外液中通過腎臟排出，并且會(huì)從肝臟中更快的進(jìn)入膽汁和糞便當(dāng)中。
對(duì)于帶有抑制蛋白結(jié)合改性劑的放大體來說，分枝狀聚合體骨架優(yōu)選是一種分子量＜40KD的聚合物。該聚合物必須提供多個(gè)官能團(tuán)用于連接診斷或治療試劑，并且可以包括用于連接到靶基團(tuán)(抗體、蛋白質(zhì)、肽等)上的官能團(tuán)。該聚合物也可以是一種低級(jí)別(例如，2，3，4級(jí))的分枝狀聚合體，部分帶有活性基團(tuán)，并用PEG或其他蛋白結(jié)合抑制劑改性過，使整個(gè)分子大小/分子量不超過40-100KD(分子大小以球蛋白計(jì))。通過這種方式，能夠在合理的時(shí)間內(nèi)通過腎臟排泄，而避免了肝臟的攝取。
生物降解的任何一種目的，如生物可降解核心主要是用于增加該試劑在體內(nèi)全部清除。將PEG穩(wěn)定結(jié)合到生物可降解放大體上或?qū)EG不穩(wěn)定地(通過一個(gè)水解敏感鍵)結(jié)合到一個(gè)穩(wěn)定的放大體上均是適合的。不過，生物可降解放大體如果在肝臟中少量分布可以有利于增加安全系數(shù)。該生物可降解核心可以更快地被代謝。這可以減少金屬螯合物暴露于低pH和肝臟酶的時(shí)間。
胺核心分枝狀聚合體或在表面有多個(gè)胺的可以被生物降解的分枝狀聚合體是優(yōu)選的。通過調(diào)整骨架的分子量以及活性基團(tuán)和改性基團(tuán)的結(jié)合數(shù)量可以獲得最佳的血液半衰期。1至5級(jí)(MW＝1000-25,000)結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的骨架結(jié)構(gòu)。在此范圍內(nèi)具有最多胺位點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)級(jí)別是優(yōu)選的(例如，末端胺總數(shù)為24、48或96)。
蛋白結(jié)合改性劑包括水溶性線型寡聚體/多聚體如聚醚、多元醇和多糖。這類優(yōu)選的改性劑包括分子量在200至10,000之間的聚環(huán)氧乙烷、聚乙二醇、或單甲基聚乙二醇。將這種寡聚體/多聚體結(jié)合到分枝狀骨架上優(yōu)選是結(jié)合2-50％的可結(jié)合位點(diǎn)。例如，可以將分子量在500-10,000之間的多個(gè)PEG分子結(jié)合上，以獲得＞40,000的總分子量。分子量的上限值要取決于結(jié)合上的可切割PEG基團(tuán)數(shù)和/或生物可降解分枝狀聚合體數(shù)。如果這種改性劑的結(jié)合量大于50％，會(huì)減少活性基團(tuán)含量，阻滯放大體的表面，由于立體化學(xué)方面的限制，這一結(jié)合量很難實(shí)現(xiàn)。
有很多現(xiàn)有的方法可用于將聚乙二醇或單甲基聚乙二醇結(jié)合到聚胺或其他功能性分枝狀聚合體骨架上。例如這種結(jié)合可通過一種惰性共價(jià)鍵或通過一種生物可降解連接物(如，氨基甲酸酯)來實(shí)現(xiàn)。這種連接的方法可從下列文獻(xiàn)中找到Harris，Rev.Macromol.Chem.Phys.C25(3)325(1985)，和Delgado，Critical Rev.Drug Carrier Sys.9(3，4)249(1992)。因此一種代表性的方案如下所述構(gòu)成一種載有改性劑的化合物的一般方法H2N-R是分枝狀聚合體骨架上的氨基，該骨架可以是已經(jīng)連接上或沒有連接上活性部分(如金屬螯合物)的。MePEG是分子量為500-10,000以甲氧基為末端的PEG。利用PEG的化學(xué)連接方法的可能途徑1.氰尿酰氯途徑連接條件＝pH9，與硫醇類反應(yīng)，可與單體衍生物發(fā)生二聚合反應(yīng)，UV發(fā)色團(tuán)。
反應(yīng) (參見，例如，Anal.Biochem.165114(1987)和J.Biol.Chem.2523582(1977))。
2.在PEG和放大體之間形成酰胺鍵的途徑條件＝與硫醇類不反應(yīng)，可與琥珀酸衍生物進(jìn)行酯水解。
反應(yīng) (參見，例如，Appl.Bio chem.Biotechnol.11141(1985)和Cancer Biochem.Biophys.7175(1984))。
3.在PEG和放大體之間的氨基甲酸酯鍵途徑長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，連接條件＝pH8.5-9.2，明顯的水解反應(yīng)，活化的PEG可以存放。
反應(yīng) (參見，例如，Rlin.Paediatr.200184(1988))和Anal.Biochem.13125(1983))。
4.用磺酰氯進(jìn)行連接溫和條件(pH7.5，環(huán)境溫度)，快速反應(yīng)。
反應(yīng)(參見，例如，Biotechnol.Appl.Biochem.12119(1990))。5.胺連接非常穩(wěn)定的連接反應(yīng) (參見，例如，J.Macromol.Sci.，Rev.Poly.Chem.Phys.，C25325(1985)和J.Polymer Sci.22341(1984))。 對(duì)本發(fā)明的螯合劑上面已進(jìn)行了許多討論。如果活性基團(tuán)不是螯合物形式，那么它們可以與通常給藥劑量相同或更低劑量存在，例如，常用劑量的1/5至1/1，而且對(duì)于診斷試劑來說，甚至可以高于常用劑量。因此，例如，對(duì)碘化的化合物來說，若用作X-線對(duì)比劑，整個(gè)碘濃度可考慮用50至1000，例如，150至500mgI/ml。
本發(fā)明的化合物可以與常規(guī)的藥物助劑或獸醫(yī)助劑，例如，乳化劑、脂肪酸酯、凝膠劑、穩(wěn)定劑?？寡趸瘎?、滲摩爾濃度調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等一起配制，并且可以制成適用于非腸道或腸內(nèi)給藥的劑型，例如，注射劑或輸液劑或直接向具有對(duì)外排泄口的體腔中給藥，例如，向胃腸道、膀胱或子宮內(nèi)直接給藥。因此，本發(fā)明的化合物可以是常規(guī)的藥物給藥形式，例如，片劑、膠囊劑、粉劑、溶液、混懸液、分散液、糖漿、栓劑等；不過，用生理上可接受的載體溶媒(例如，注射用水)配制的溶液、混懸液和分散液一般是優(yōu)選的。
因此，可以用生理上可接受的載體或賦形劑以完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍的方法將本發(fā)明的化合物配制成各種給藥劑型。例如，本發(fā)明的化合物可以加入藥物上可接受的賦形劑，懸浮于或溶于水介質(zhì)中，然后將所得的溶液或混懸液滅菌。合適的添加劑包括，例如，生理上可接受的生物相容性緩沖劑(例如，鹽酸氨基丁三醇)、加入(如0.01至10摩爾％)螯合劑(如，DTPA，DTPA-雙酰胺或非復(fù)合的放大體多聚螯合劑)或鈣螯合物復(fù)合物(例如，鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺、鈣-放大體多聚螯合劑或放大體多聚螯合劑的CaNa鹽)，或可視情況加入(如，1至50摩爾％)鈣或鈉鹽(例如，與放大體配位體的金屬螯合物復(fù)合的氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣等等)。
如果該化合物要制成混懸液形式，例如，混懸于水或生理鹽水中用于口服給藥，可以將小量的可溶性螯合物與一種或幾種傳統(tǒng)上存在于口服液中的非活性成分和/或表面活性劑和/用于調(diào)味的香料一起混合。
對(duì)于身體某些部分的MRI和X-線成像來說，將金屬螯合物作為對(duì)比劑的最優(yōu)選給藥方式是非腸道給藥，例如，靜脈內(nèi)給藥?？煞悄c道給藥的劑型，例如，靜脈注射液，應(yīng)當(dāng)是無菌的，且不含有生理上不可接受的試劑，并且應(yīng)當(dāng)具有低滲摩爾濃度以便在給藥時(shí)盡可能減少刺激性或其他副作用，因此該對(duì)比介質(zhì)優(yōu)選的應(yīng)當(dāng)是等滲的或稍弱高滲的。合適的載體包括習(xí)慣上用于非腸道給藥溶液的含水載體如氯化鈉注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸鹽的林格注射液和其他溶液，如下面文獻(xiàn)中所述的溶液Remington′s Pharmaceutical Sciences，15 th ed.，EastonMackPublishing Co.，第1405-1412和1461-1487頁(1975)和The NationalFormulary XIV.14th ed.WashingtonAmeeican Pharmaceutical Association(1975)。該溶液可以含有防腐劑、抗微生物劑、習(xí)慣上用于非腸道給藥溶液的緩沖劑和抗氧化劑、賦形劑和與螯合物相容并且不影響產(chǎn)品的生產(chǎn)、儲(chǔ)藏或使用的其他添加劑。
從進(jìn)一步說，本發(fā)明提供了一種診斷或治療組合物，它含有一種本發(fā)明的分枝狀聚合體化合物或其鹽以及至少含一種藥物載體賦形劑。
從再另一方面考慮，本發(fā)明提供了用本發(fā)明的分枝狀聚合體化合物或其鹽制備一種診斷或治療組合物的用途。
從又一方面考慮，本發(fā)明提供了一種使人體或非人動(dòng)物體(尤其是哺乳動(dòng)物)成像的方法，該方法包括給所說肌體一種成像加強(qiáng)量的本發(fā)明分枝狀聚合體化合物或其鹽，然后產(chǎn)生所說肌體至少一部分的圖像，例如，一種MR、X-線、超聲、EIT或閃爍成像。
從再另一方面考慮，本發(fā)明提供了一種治療人或動(dòng)物體的方法，所說方法包括給所說肌體一種治療有效量的本發(fā)明分枝狀聚合體化合物。
再另一方面考慮，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明分枝狀聚合體化合物的方法，所說方法包括將多個(gè)治療或診斷活性部分(例如，大環(huán)螫合劑)結(jié)合到一種分枝狀聚合物上，例如，一種聚胺上，并且可視情況對(duì)所產(chǎn)生的化合物進(jìn)行金屬取代，也可視情況結(jié)合到生物分布改性劑上(例如，PEG或一種位點(diǎn)定向性分子)。
用于此方法的分枝狀聚合物優(yōu)選不超過第8級(jí)聚合物，例如，第7級(jí)，特別是第4級(jí)、第5級(jí)或第6級(jí)的分枝狀聚合物。當(dāng)然所需的分枝級(jí)要取決于所需活性和改性部分連接位點(diǎn)的數(shù)目，取決于所用的連接部分和整體大小、分子量和構(gòu)像，這些因素又在某種程度上取決于該分枝狀聚合體化合物的所要求的最終用途。
從再另一方面考慮，本發(fā)明提供了一種解毒組合物，它包含一種本發(fā)明的多聚螯合劑或其與生理上可耐受的一些抗衡離子的弱螯合物或其鹽，以及一種藥物載體或賦形劑。
從再進(jìn)一步考慮，本發(fā)明提供了一種金屬解毒方法，包括給人或非人動(dòng)物體一種去毒性劑量的本發(fā)明多聚螯合劑或其與生理上可耐受的一些抗衡離子的弱螯合物或其鹽。
蛋白結(jié)合抑制劑在分枝狀聚合體化合物上的結(jié)合本身是有新穎性的，并且本發(fā)明的另一方面還提供了一種分枝狀聚合體化合物，它含有一個(gè)分枝狀聚合體骨架部分，其上連接有多個(gè)診斷或治療活性部分(例如，能夠與金屬離子配合的螯合劑部分)，其特征在于所說的骨架部分其上連接有多個(gè)抑制蛋白結(jié)合的部分，例如，PEG殘基。
本發(fā)明將通過下列具體的非限制性實(shí)施例作進(jìn)一步的解釋。除非另有說明，溫度的單位是攝氏溫度，濃度是重量百分比。
實(shí)施例1制備DTPA分枝狀聚合物放大體用TMG(50毫升)處理一種DTPA(16.8g，42mmol)的乙腈(150ml)漿液。將該混合物在氮?dú)?、環(huán)境溫度下進(jìn)行攪拌直至完全溶解，然后冷卻至-30℃。滴加入氯甲酸異丁基酯(1.5mL，12mmol)。在0℃下攪拌之后，在1.5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)滴加入一種膦嗪G0(實(shí)施例3a)(0.22g，0.04mmol)的DMF(20mL)和TMF(40mL)溶液。在環(huán)境溫度下攪拌該化合物16小時(shí)，蒸發(fā)至干燥，溶于水中(100mL)，并且0.2M草酸(3×3L)滲析6小時(shí)，用0.2M NaHCO3(2L)滲析過夜。通過中壓色譜分析法(2.5×20cm Sephadex G-25，折射率檢測(cè))將粗制物進(jìn)行純化。由1HNMR中的積分強(qiáng)度計(jì)算出結(jié)合率25％。
實(shí)施例2a)制備對(duì)硝基芐基氯乙酰胺 將對(duì)硝基芐基氯化銨(1.18g，6.2mmol)和Na2CO3(1.31g，12.5mmol)置于燒瓶中，并加入二氯甲烷(200mL)。該溶液是不均勻的，因此加入5mL水得到一種兩相的系統(tǒng)。在環(huán)境溫度下通過注射器加入氯乙酰氯(0.50mL，6.2mmol)，該溶液立即變成乳白色。攪拌15分鐘之后，該有機(jī)層成為淡黃色。45分鐘之后再加入水(5mL)，產(chǎn)生一個(gè)澄清的水相層。分離這些液層，并用CH2Cl2(50mL)洗滌水相層。在MgSO4上使結(jié)合的有機(jī)相干燥，并除去揮發(fā)物。將粗產(chǎn)物溶于CHCl3/甲醇(6∶1)中，并通過二氧化硅，除去揮發(fā)物得到標(biāo)題產(chǎn)物，是一種黃色固體，收率98％。
b)制備三叔丁基DO3A-(對(duì)-硝基芐基)酰胺。 在氮?dú)猸h(huán)境下，將三叔丁基DO3A-HBr(0.68g，1.1mmol)溶于二甲基甲酰胺中(100mL)。然后加入過量的碳酸鈉，得到一種白色漿液。在另一個(gè)燒瓶中，將二甲基甲酰胺(75mL)加入到對(duì)硝基芐基氯乙酰胺(實(shí)施例2(a)，0.25g，1.1mmol)中，并將此溶液通過套管加入到三叔丁基DO3A中。加入小量的NaI(20mg)以加速反應(yīng)。反應(yīng)液表現(xiàn)為不均勻，因此加入K2CO3(它比鈉類似物更易溶解)，并在環(huán)境溫度下將反應(yīng)液攪拌20小時(shí)。加入水(100mL)，使溶液加溫，再加入甲苯(200mL)。該液體分層，并將有機(jī)相在MgSO4上干燥。分離粗產(chǎn)物，1H和13C NMR表示只有一種產(chǎn)物。在硅柱上(5∶1CHCl3∶CH3OH)進(jìn)行閃色譜得到純的標(biāo)題產(chǎn)物(測(cè)得MH+＝707.5和MH-Na+＝729.5)。
c)制備DO3A-(對(duì)硝基芐基)酰胺將0.7克(0.01mmol)的實(shí)施例2(b)的三叔丁基酯溶于二氯甲烷(20mL)中得到一種淡黃色溶液。在環(huán)境溫度下以小等分試樣加入TEA(大約10mL)。1小時(shí)之后，該溶液顏色更黃。1.5小時(shí)之后，真空除去揮發(fā)物。重復(fù)此步驟6次，但二氯甲烷的用量更小(10-15mL)。在用CH2Cl2/TFA處理最后一次之后，除去揮發(fā)物，并將此得到的黃色殘?jiān)苡谒?10mL)。通過加入1NNaOH使pH增加到13。通過離子交換色譜法(AG-1，用乙酸洗脫0.2-0.5N)純化得到較好收率的標(biāo)題產(chǎn)物(大約70-80％，這取決于水分含量，質(zhì)譜FABMH+539.3，MH-Na+561.3)。1H和13C NMR表示為高純度，也即，叔丁基官能團(tuán)量可忽略。
d)制備Gd-DO3A-(對(duì)硝基芐基)酰胺將0.5克的實(shí)施例2(c)的三羧甲基化合物溶于水中(30mL)。然后加入溶于水(15mL)中的三乙酸釓·4H2O(大約85摩爾％，297mg)。通過逐漸加入1N NaOH將起始的pH值3調(diào)節(jié)到pH5-6。將反應(yīng)混合物加熱至77℃共24小時(shí)。使反應(yīng)物干燥，并將殘?jiān)偃苡谒?10mL)。二甲酚橙試驗(yàn)為陰性。用NaOH處理該溶液直至達(dá)到pH為9。除去水分，并將淺黃色殘?jiān)苡诩状贾?25mL)。通過過濾將任何多余的釓以不溶Gd(OH)3的形式除去。除去揮發(fā)物之后分離出一種淺黃色固體標(biāo)題產(chǎn)物(840mg)，并通過IR和UV-Vis光譜鑒別其特征。當(dāng)再溶于水時(shí)，二甲酚橙試驗(yàn)表現(xiàn)為陰性。
e)制備Gd-DO3A-(對(duì)氨基芐基)酰胺在一種玻璃壓力反應(yīng)容器中將Gd-DO3A-(對(duì)氨基芐基)酰胺(實(shí)施例2(d)，730mg)溶于水中(50mL)。加入一個(gè)攪拌棒和10％Pd/C(270mg)，并用氫氣使黑色漿液加壓(50psi)。攪拌3天之后，將溶液過濾，并使所得溶液干燥。分離得到一種褐色固體狀的標(biāo)題產(chǎn)物(680mg，98％)。通過質(zhì)譜、IR和UV-Vis光譜對(duì)產(chǎn)物的特征進(jìn)行鑒別。
f)制備Gd-DO3A-(對(duì)異硫氰酸鹽芐基)酰胺在氮?dú)猸h(huán)境下，將Gd-DO3A-(對(duì)氨基芐基)酰胺(實(shí)施例2(e)，680mg)溶于脫氧的水中(10mL)，并在另一個(gè)燒瓶中向CHCl3(8mL)中加入二氯硫化碳(Cl2C＝S)(1摩爾當(dāng)量，72μL)。向二氯硫化碳溶液快速地完全加入到該水溶液中，并在N2下攪拌該混合物18小時(shí)。用水(1×30mL)溶出粗產(chǎn)物，分離得到一種淺灰色固體狀的標(biāo)題產(chǎn)物(620mg，大約90％的收率)。用質(zhì)譜、IR、UV、Karl Fisher試劑(14％H2O)和氯化物(9％Cl-)分析。完成對(duì)該產(chǎn)品的特征鑒別。未檢測(cè)出實(shí)施例2(e)化合物的存在。
實(shí)施例3a)制備膦嗪(phosphazene)Go，{NP(NH2CH2C[O]NHCH2CH2NH2)2}3將{NP(NH2CH2CO2C2H5)2}3(1.6g，2.1mmol)在一個(gè)100mL的Schlenk燒瓶中溶于乙醇(50mL)。將新鮮餾過的乙二胺(EPA)(150mL)和乙醇(40mL)置于另一個(gè)Schlenk燒瓶中，并將所得溶液冷卻到0℃。在攪拌下將兩種溶液用N2完全清洗30分鐘，并氮?dú)猸h(huán)境下完成反應(yīng)。然后通過套管將膦嗪溶液滴加到冷卻的EDA溶液中。0℃下攪拌3天之后，將溶液加溫至25℃。取出一小等份，除去揮發(fā)物，所得到的小量油狀殘余物是標(biāo)題產(chǎn)物(1H和31PNMR光譜)。以同樣的方式制備反應(yīng)混合物，并用乙醇/甲苯(1∶10，100mL)抽提粗產(chǎn)物。真空干燥標(biāo)題產(chǎn)物得到一種高收率的淺黃色固體。31P NMR譜中有一個(gè)21.04ppm的單共振譜(參見起始物，19.58ppm)。
b)制備膦嗪Go聚Gd-DO3A將實(shí)施3(a)的Go分枝狀聚合體和實(shí)施例2(f)的Gd-DO3A-NCS分別放入不同的燒瓶中。向每個(gè)燒瓶中加入去離子水(分別為10和40mL)。記錄其pH值(10.2和9.2)，將兩種溶液混合。然后調(diào)節(jié)pH值至8.95。6天之后除去揮發(fā)物，在篩析柱上純化粗制固體得到一種淺黃色固體狀標(biāo)題產(chǎn)物。
實(shí)施例4a)制備[O＝P(OCH2CH2NH3)3]3+3Cl-向一種帶有回流冷凝器、N2接管和溫度計(jì)的三頸燒瓶中加入新餾過的乙醇胺。冷卻溶液并加入新鮮餾過的磷酰氯，加入的速度要使反應(yīng)溫度保持在90℃以下。將混合物攪拌2小時(shí)，同時(shí)用甲苯洗滌該產(chǎn)物。在純乙醇中沸騰結(jié)晶標(biāo)題產(chǎn)物。在用新鮮制得的乙醇鈉處理該鹽酸鹽獲得游離堿[O＝P(OCH2CH2NH2)3]。
b)制備[O＝P(CH2CH2N{CH2CH2CO2Et}2)3]在一種帶有氮?dú)饨庸艿膬深i燒瓶中，將純乙醇加入到[O＝P(OCH2CH2NH2)3]中(實(shí)施例4(a))。在另一個(gè)燒瓶中，將新餾過的丙烯酸乙酯溶于乙醇中，并將所得溶液加入到磷酸酯溶液中。攪拌3天之后，真空除去揮發(fā)物，得到一種粘性無色油狀的標(biāo)題產(chǎn)物。
c)制備磷酸酯為核心的分枝狀聚合體-聚Gd-DO3A通過與Gd-DO3A-NCS反應(yīng)將類似于實(shí)施例3(b)的Gd-DO3A螯合物部分結(jié)合到實(shí)施例4(b)的以磷酸酯為核心的分枝狀聚合體上。
實(shí)施例5分枝狀聚合體核心水解a)膦嗪Go，{NP(NH2CH2C[O]NHCH2CH2NH2)2}3本發(fā)明所用的分枝狀聚合體骨架聚合物與常用的PAMAM分枝狀聚合體相比其優(yōu)點(diǎn)之一是增加了對(duì)水解的敏感性。將膦嗪Go(實(shí)施例3(a)的化合物)在D2O中水解，然后進(jìn)行31P NMR光譜分析。結(jié)果概括在下表中試驗(yàn) pH 反應(yīng)溫度時(shí)間 降解 混合物
17.137℃3天無在SeronormTM存在下。
211.0 37℃5天無31.237℃4天85％47.025℃3天30％ 在半純化的小鼠肝臟存在下在5mm NMR試管中進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。用一種窄孔pH電極在試管中測(cè)試pH值。用10％HCl或40％NaOD調(diào)節(jié)pH。D2O購自Aldrich ChemicalCo.。用Hg溫度計(jì)記錄溫度，沒有對(duì)溫度校正。
試驗(yàn)1的結(jié)果表明在血液中不可能發(fā)生水解。不過，試驗(yàn)4的結(jié)果表明以這種核心為基礎(chǔ)的血池試劑，其分子量超過50kD，最終會(huì)被肝臟攝取，而易于在肝臟中降解。
用破碎的老鼠(rat)肝臟作為血池試劑可能對(duì)抗的酶的粗制物。31P NMR光譜清楚地表明3天之后有30％的降解。在暴露于老鼠肝臟成分的前三個(gè)小時(shí)之內(nèi)有20％原始膦嗪已降解。通常，由于酶的同類相殘作用在細(xì)胞水解前幾個(gè)小時(shí)之后酶活性在體外會(huì)很快的降低。
通過用新鮮混勻成漿的老鼠肝臟在離心沉淀分離出固形物之后，進(jìn)行肝臟試驗(yàn)。將均勻漿液加入到一種預(yù)先調(diào)節(jié)(pH＝7)的膦嗪Go溶液中。為便于對(duì)比，也測(cè)定了老鼠純肝臟(無信號(hào))和起始膦嗪Go的31P NMR譜。只有處理過的膦嗪Go的光譜中含有一個(gè)新的信號(hào)(2.5ppm)。
實(shí)施例6a)PGo與DO3A-NCS反應(yīng)使反應(yīng)在一個(gè)5mm NMR試管中進(jìn)行，并通過31P NMR光譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展情況。開始，使用6.9當(dāng)量的DO3A-NCS，足以完成該反應(yīng)。不過，NMR光譜含有至少三個(gè)可辨別的共振譜。加入更多的DO3A-NCS，導(dǎo)致這些產(chǎn)物的比率發(fā)生快速變化，直到最后，表現(xiàn)出一個(gè)單共振譜，這表明反應(yīng)已進(jìn)展到一種單一產(chǎn)物。 b)PGo(NICS]N-bz-DO3A)6的水解使用實(shí)施例6(a)制備的PG0(N[CS]N-bz-DO3A)6。用下述條件進(jìn)行三個(gè)試驗(yàn)a)小鼠(mouse)全血，D2O(pH6.5)，37℃。
b)小鼠肝臟，通過離心純化(某些固形物)，D2O，37℃。
c)小鼠肝臟，吐溫洗滌劑(以釋放膜結(jié)合的酶)，通過離心(某些固形物)而純化，D2O，37℃。每個(gè)試驗(yàn)都形成一種新的產(chǎn)物，其特征是單水解的物質(zhì)，N3P3(NHR)5(OH)。該產(chǎn)物是通過對(duì)膦嗪核心的一個(gè)臂進(jìn)行選擇性斷裂而制得。
通過使一種未改性的核心與一種大生物分子反應(yīng)而形成產(chǎn)物的可能已不存在，因?yàn)橥ㄟ^一種CentriprepC-10單位進(jìn)行超速過濾得到的是具有相同光譜學(xué)特性的物質(zhì)，這從起始實(shí)驗(yàn)可以看出。生物分子(蛋白質(zhì)、酶等)不能夠通過10,000MW的截濾器。
水解的相對(duì)速度以及逐次結(jié)合的31P NMR光譜如下加吐溫的肝臟≥肝臟>>全血。
起始水解產(chǎn)物N3P3(NHR)5(OH)的形成在中性pH下是穩(wěn)定的，但在低pH下是十分不穩(wěn)定的。 實(shí)際測(cè)得的確實(shí)是這種情況。將來源于兩個(gè)肝臟試驗(yàn)的成分混合和過濾之后，新的pH值是5.1，而N3P3(NHR)5(OH)與磷酸鹽的比率發(fā)生了變化而偏向于磷酸鹽。進(jìn)一步降低pH至2.7導(dǎo)致向磷酸鹽發(fā)生接近定量的轉(zhuǎn)化(增加H3PO4可導(dǎo)致在31P NMR光譜中存在一個(gè)單一峰值)。
實(shí)施例7(a)制備寡聚賴氨酸以類似于制備小的分枝狀高賴氨酸肽的方法(SPPS)(參見，Tam.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85 5409，(1988)；Denkewalter等人，US4,289,872；Tam，Wo90/11778)用固相肽合成方法(SPPS)制備寡聚體賴氨酸單位。
為了制備寡聚體無分枝賴氨酸肽，必須保護(hù)賴氨酸的∈-氨基，通常是用BOC-N3誘導(dǎo)的叔丁基氧化羰基(BOC)保護(hù)為銅-配合的賴氨酸(參見Schwyzer等人，Helv.Chim.Acta 44159(1961))。在SPPS方法中保護(hù)和脫保護(hù)氨基酸的方法是成熟的技術(shù)(參見Fields等人，Int.J.Peptide Protein Res.35，161(1990))。
重復(fù)加入保護(hù)的賴氨酸單位直至獲得一個(gè)寡聚體(5-20個(gè)單體)，同時(shí)用強(qiáng)酸(HF或TFMSA)或TFA從固體載體上切下游離肽。
(b)制備螯合劑寡聚賴氨酸 在堿存在下向ClCH2COCl中加入α-BOC-賴氨酸得到∈-酰胺衍生物。
在TMG或合適堿存在下使此產(chǎn)物與DO3A.HBr在乙腈中發(fā)生反應(yīng)生成叔丁基酯DOTA-賴氨酸衍生的酸。賴氨酸的一種類似EDTA衍生物已有報(bào)道(Rama等人，Tet.Lett.334521(1992))。
(c)形成螯合物-寡聚賴氨酸單位(i)從實(shí)施例7(b)的產(chǎn)物，通過常規(guī)方法去除DOTA的t-Bu基團(tuán)，然后結(jié)合上Gd(來源于Gd2O3)。用常規(guī)(SPPS)方法使所得到的金屬螯合物-氨基酸寡聚化。
(ii)用SPPS完成實(shí)施例7(b)的螯合物-賴氨酸單體單位的寡聚合反應(yīng)。之后加入到Gd2O3中。通過常規(guī)方法從固體載體上切割下所形成的金屬螯合物寡聚賴氨酸單位。
(iii)從實(shí)施例7(a)的產(chǎn)物使限定的寡聚賴氨酸單位在∈-位脫保護(hù)，然后在堿存在下與一種合適的DO3A衍生物，例如， (其中X＝Cl，Br，OMe等)進(jìn)行反應(yīng)生成所需的螯合物-寡聚賴氨酸單位，從固體載體上用酸切割下之后分離該單位。這之后可以結(jié)合上Gd生成金屬螯合物寡聚賴氨酸化合物。
(d)將寡聚賴氨酸單位連接到分枝狀聚合體上形成放大體現(xiàn)有許多方法可以將賴氨酸單位連接到分枝狀聚合體上。
a)使末端基團(tuán)(-C(O)OR(n+1/2級(jí))或-NH2(1，2，3，……n級(jí)))與寡聚賴氨酸的N-末端或C-末端分別進(jìn)行反應(yīng)形成一種新的酰胺鍵。
i)從實(shí)施例7(a)的產(chǎn)物，使寡聚賴氨酸單位在一種合適的溶劑中(如，MeOH，H2O)與分枝狀聚合體反應(yīng)生成一種寡聚賴氨酸分枝狀聚合體結(jié)合物。使∈-胺基團(tuán)脫保護(hù)，然后與功能化的DO3A的反應(yīng)將螯合物連結(jié)到肽鏈上。之后用Gd2O3處理，從而將Gd結(jié)合到螯合物中而形成該放大體。
ii)從實(shí)施例7(c)(iii)，進(jìn)行一種類似的反應(yīng)，但是以金屬螯合物寡聚賴氨酸單位開始該實(shí)驗(yàn)。
b)使用連接劑分子將肽鏈連接到分枝狀聚合體上從而賦予其可控制的生物降解性能。這種任務(wù)的完成可以是通過已知方法(參見，例如，Clegg等人，Bioconjugate Chem.，1425，(1990))將氨基酸作為連接劑(丙氨酸、甘氨酸等)連接到分枝狀聚合體末端上或者預(yù)先連接到寡聚賴氨酸單位上就能夠控制其在血流中的停留時(shí)間并能對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
許多其他連接劑分子也可以使用(參見Means等人，Bioconjugate Chem.12(1990)；and Brinkley，Bioconjugate Chem.32(1992))。
實(shí)施例8制備PEG改性的結(jié)合有Gd大環(huán)的第4級(jí)分枝狀聚合體{G4(N[CS]N-bz-DO3A)30}(i)制備第4級(jí)分枝狀聚合體按Watson(WO93/06868)中相同的步驟生成一種4.0級(jí)的分枝狀聚合體。將G4(0.56g)溶于去離子水中(20mL)，在另一個(gè)燒瓶中，將DO3A-bz-NCS(也即 )(2.31g，20％過量)溶于水中(80mL)，并用5NNaOH調(diào)節(jié)pH至8.5。在強(qiáng)力攪拌下將后一種溶液緩慢加入(以小等分量)到分枝狀聚合體溶液中。在10分鐘內(nèi)完成加液。攪拌4天之后，使溶液通過一中等孔隙度的玻璃料，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(加熱設(shè)定在60)除去揮發(fā)物。收集到0.48克淺橙色固體，并用Centriprep C-10濾器過濾。通過GPC分析表明可有效地將低分子量的雜質(zhì)與所需產(chǎn)物分開。以這種方式過濾剩余的粗混合物，分離出一種總量為2.1g的產(chǎn)物。將1H NMR譜積分得到每個(gè)分枝狀聚合體上大約平均載有30個(gè)螯合物(Y＝30)相當(dāng)于63％的裝載率。該產(chǎn)物也通過13C NMR和CZE分析進(jìn)行了特征鑒定。
(ii)釓結(jié)合將實(shí)施例8(i)的產(chǎn)物(551mg)溶于去離子水中(11ml)，并將Gd(OAc)3·4H2O(0.90g)溶于8mL水中。由于不是全部的乙酸釓已溶解，將分枝狀聚合體溶液加入到后者當(dāng)中。再加入水(10mL)并測(cè)pH值(5.0)。在環(huán)境溫度下24小時(shí)之后，將溶液加熱至45℃3.5小時(shí)。用Centreprep C-10濾器過濾所得到的溶液除去大多數(shù)未反應(yīng)的釓鹽。使所得溶液的pH上升到9以Ga(OH)3形式沉淀任何未反應(yīng)的釓，并通過0.45μ濾器過濾。二甲酚橙試驗(yàn)測(cè)定游離的釓表現(xiàn)為陰性。通過超過濾除去氯化物鹽，并通過GPC監(jiān)測(cè)。結(jié)果形成了一種純的產(chǎn)物(≈300mg)。
(iii)PEG-SPA與{G1(N[CS]N-bz-DO3A-Gd)30}反應(yīng)將實(shí)施例8(ii)的產(chǎn)物，G4(N[CS]N-bz-DO3A-Gd)30(160mg，5.3×10-6mol)，和PEG-SPA5000(480mg，9.6×10-5mol，Shearwater Chemical)置于不同的燒瓶中，向其中加入去離子水(分別為10mL)。向G4(N[CS]N-bz-DO3A-Gd)30中快速加入輕度混濁的PEG溶液，在環(huán)境溫度下攪拌所得到的溶液(pH7.8)24小時(shí)。用超過濾(Centriprep C-10和C-30)純化該溶液。TLC(MeOH/CHCl3，1∶1)表明已有效地除去PEG類物質(zhì)。通過常規(guī)光譜分析方法(NMR，IR，UV)和光散射方法(LALLS，PCS)對(duì)該產(chǎn)物的特征進(jìn)行鑒別。
權(quán)利要求
1.一種分枝狀聚合體化合物或其鹽，它含有一種分枝狀聚合體骨架部分，其上連接多個(gè)有診斷或治療活性的部分，其特征在于所說化合物的分子骨架含有至少一個(gè)生物降解切割位點(diǎn)，以致于在切割該位點(diǎn)時(shí)所說的活性部分以腎臟可排泄的形式釋放。
2.如權(quán)利要求1的化合物，其中所說的活性部分含有螯合劑基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2的化合物，其中所說的活性部分含有用診斷或治療有效金屬離子取代的螯合劑基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3的化合物，其中所說的金屬離子選自順磁金屬離子、重金屬離子和放射性核素離子。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的分枝狀聚合體骨架是一種不超過第8級(jí)的分枝狀聚合體。
6.如權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述的切割位點(diǎn)是在所說分枝狀聚合體骨架之內(nèi)。
7.如權(quán)利要求6的化合物，其中所說的切割位點(diǎn)位于分枝狀聚合體的分枝位點(diǎn)上。
8.如權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)所述的化合物，其中所說的切割位點(diǎn)包括一個(gè)多原子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在其骨架中含有至少一個(gè)除碳之外原子。
9.如權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)所述的化合物，其中所說分枝狀聚合體骨架之外部具有至少一個(gè)所說切割位點(diǎn)。
10.如權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物的生物降解產(chǎn)物是腎臟可排泄的。
11.如權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)所述的化合物，在生物降解時(shí)釋放出均勻的腎臟可排泄的生物降解產(chǎn)物、
12.如權(quán)利要求1至11的任一項(xiàng)所述的化合物，它還含有至少一個(gè)連接到所說分子骨架上的生物分布改性部分。
13.如權(quán)利要求12的化合物。其中所說的生物分布改性部分選自組織或肌體的位點(diǎn)定向性基團(tuán)、親水基團(tuán)、親脂基團(tuán)和蛋白結(jié)合抑制基團(tuán)。
14.如權(quán)利要求13的化合物，其中所說的生物分布改性部分是一種聚烯化氧、改性的PEG、肽或糖類殘基。
15.如權(quán)利要求1至14的任一項(xiàng)所述的化合物，它含有一個(gè)式VII的分枝狀聚合體核心部分Y[XY]q (VII)(其中每個(gè)Y是一個(gè)硼、磷、硅或氮原子，它在化合價(jià)限定或允許的位置帶有R基團(tuán)或[X′Y′]q′，并且每個(gè)X是一個(gè)碳、氧、氮、硫或硅基團(tuán)，它在化合價(jià)允許或限定的位置帶有R基團(tuán)或[Y′X′]q′，條件是如果X是碳，則它所連接的Y基團(tuán)是氮、硼或硅；如果X是硅，它所連接的Y基是硅，并且如果Y[XY]q不是(CN)3環(huán)的情況下，至少存在兩個(gè)X不是碳的X-Y鍵，或者，Y[XY]q是P[E]3，OP[E]3或SP[E]3，其中E是氧或氮，或兩個(gè)非相鄰的Y基團(tuán)能夠共用一個(gè)Y基團(tuán)表示，從而與介入的X和Y基團(tuán)一起形成一個(gè)4至10元環(huán)；q是不超過3的整數(shù)，如同化合價(jià)所允許或限定的；X′和Y′的定義分別同X和Y，但不能帶有側(cè)鏈[Y′X′]q或[X′Y′)q；并且每個(gè)R可以相同或不同，它代表一個(gè)化學(xué)鍵、一個(gè)氫原子或一個(gè)橋氧基)。
16.如權(quán)利要求15的化合物，其中所述的核心部分結(jié)合有一個(gè)(Sic)3、(Si)4、(SiO)3、(Si)5、(Si)6、(Si)7、(PO)3、(NC)3、(PN)3、或(BN)3、環(huán)或一個(gè)無環(huán)的O＝PN3、O＝PO3、S＝PN3或SPO3部分。
17.如權(quán)利要求1至16的任一項(xiàng)所述的化合物，它具有103至105D的分子量范圍。
18.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，所說方法包括(i)向一個(gè)分枝狀聚合體上結(jié)合多個(gè)診斷或治療活性基團(tuán)；或(ii)用治療或診斷有效的金屬離子對(duì)連接到分枝狀聚合體骨架上的螯合劑部分進(jìn)行金屬取代。
19.一種診斷或治療用的組合物，它含有一種如權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分枝狀聚合體化合物，或其鹽，并且含有至少一種藥物載體或賦形劑。
20.權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)所述的分枝狀聚合體化合物及其鹽在制備診斷或治療用的組合物中的應(yīng)用。
21.一種使人或非人動(dòng)物體成像的方法，該方法包括給所述肌體一種成像增強(qiáng)量的如權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)所述分枝狀聚合體化合物或其鹽，然后使所說肌體至少一部分成像。
22.一種人或動(dòng)物肌體的治療方法，所說方法包括給所說肌體一種治療有效量的如權(quán)利要求1至17的任一項(xiàng)所述的分枝狀聚合體化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分枝狀聚合體化合物，它含有一個(gè)分枝狀聚合體骨架部分，其上連接多個(gè)診斷或治療活性部分，其特征在于所說化合物的分子骨架含有至少一個(gè)生物可降解的切割位點(diǎn)，以致于在切割時(shí)所說的活性部分以腎臟可排泄形式釋放。
文檔編號(hào)A61K51/00GK1150391SQ9519309
公開日1997年5月21日 申請(qǐng)日期1995年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月20日
發(fā)明者拉里·馬杰拉姆, 布賴恩·坎皮恩, 杰里·D·費(fèi)爾曼, 馬莎·加里蒂 申請(qǐng)人:耐克麥德瑟魯塔公司