專利名稱：用作生長因子抑制物的FLT-4(類fms酪氨酸激酶)，F(xiàn)LT-15及其變異體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抑制生長因子特別是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的物質(zhì)，抑制生長因子及治療腫瘤和調(diào)節(jié)生育力的方法。
背景技術：
人們已經(jīng)知道相當多的人類生長因子，其中許多已至少部分地被表征。其中之一是已在多種組織中鑒定到的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，(Gospodarowicz等，1989，PNAS 86，7311-7315；Conn等，1990，PNAS87，2628-2632；Tischer等，1991，生物化學雜志，266，11947-11954)。顧名思義，該生長因子是內(nèi)皮細胞的高度特異性的促細胞分裂素，積極參與血管形成。VEGF是同二聚體糖蛋白，有兩個23kDa亞基，與血小板來源的生長因子A和B鏈及胎盤生長因子有序列同源性。
同源的酪氨酸激酶受體，類fms酪氨酸激酶受體(FLT)和含有激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)，是高親和性VEGF受體(de Vries等，1992，科學255，989-991；Terman等，1992，生物化學和生物物理研究公報187，1579-1586)。FLT和KDR都是跨膜受體，在細胞外配體結(jié)合區(qū)都有7個類免疫球蛋白(immunoglobulin-like)結(jié)構(gòu)域，都有細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及跨膜結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w錨定到表達該受體的細胞的細胞膜上。
已發(fā)現(xiàn)一些膜連受體分子以截短的可溶形式存在，這種形式由蛋白水解加工或mRNA的交替拼接產(chǎn)生。最近，Kendall和Thomas(1993PNAS 90，10，705-10，709和WO94/21679)描述了一種交替拼接產(chǎn)生的FLT受體可溶形式(sFLT)的發(fā)現(xiàn)。
實質(zhì)上，Kendall和Thomas用一種對flt編碼區(qū)3′端(編碼細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)特異性的探針和另一種對5′flt編碼部分(編碼細胞外N末端結(jié)構(gòu)域之一)特異性的探針篩選一個人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)cDNA文庫。與5′特異性探針雜交而不與3′特異性探針雜交的克隆被選出作進一步研究。用這種方法，分離出一個克隆，它編碼缺失跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的可溶性FLT多肽。一個內(nèi)含子終止密碼子的“通讀”造成這種截短。Kendall和Thomas建議可以將可溶性受體用作體內(nèi)VEGF的有效的特異性拮抗物。
本發(fā)明基于更多的FLT可溶性變異體的發(fā)現(xiàn)，其存在不能由Kendall和Thomas的方法預測到。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供FLT多肽的改變的可溶形式，它能結(jié)合VEGF，因而產(chǎn)生抑制效應。該多肽含有5個或更少的完整的類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，改變的FLT多肽含有4個或更少的完整的類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。改變的可溶性FLT多肽通過阻止VEGF結(jié)合其天然受體-靶細胞表面的flt和KDR-而抑制VEGF。意外的是，這種截短形式盡管缺少了分子的一個主要的細胞外部分，仍被認為保持了對VEGF的親合性。
此處用的術語“可溶性”意指FLT多肽的改變的形式，它不含有跨膜結(jié)構(gòu)域因而一般不與表達該分子的細胞的細胞膜相聯(lián)系。具體地說，本發(fā)明提供FLT多肽的可溶性的改變的形式，它基本上由4個或5個完整的類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
在一具體實施方案中，本發(fā)明提供FLT的一種改變的可溶形式，其C末端有一區(qū)域，該區(qū)域基本上含有圖5中顯示的稱作FLT4或FLT15序列的氨基酸序列，或其功能等價物。上面用的術語“功能等價物”包括這樣一些多肽，它們與FLT4或FLT15編碼的多肽基本上有相同的缺失(相對未改變的全長FLT分子而言)，但也可能有其它缺失、添加或替換(特別是保守性替換)，并且保持對VEGF的抑制效應。
優(yōu)選地，該多肽在其N-末端還含有基本上對應于未改變的野生型FLT多肽的等價部分的氨基酸序列。適宜地，本發(fā)明的多肽含有400到500個左右氨基酸殘基，優(yōu)選480個左右氨基酸殘基，最優(yōu)選的是野生型FLT序列480到440之間的氨基酸殘基。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽由mRNA的交替拼接或成熟多肽的蛋白水解加工得到，盡管很明顯，對于本領域的技術人員，該多肽可以(至少部分)被來源于重組DNA技術的核酸編碼。
本發(fā)明進一方面提供一段編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列。在具體實施方案中，本發(fā)明提供一段核酸，它含有圖3給出的FLT4序列中插入位置1655的核苷酸序列或是圖3給出的FLT15序列中插入位置1555的核苷酸序列，或其功能等價物。功能等價核酸的例子包括那些編碼與FLT4或FLT15編碼的多肽基本上相同的多肽的序列，但由于遺傳密碼的簡并性，這些多肽的核苷酸序列有所不同。對本領域的技術人員很明顯，F(xiàn)LT4和FLT15中出現(xiàn)在早熟終止密碼子后的那部分插入核苷酸序列可以去除而不影響所編碼多肽的特性。相應地，沒有這類序列的核酸分子，就本發(fā)明的目的來說，也可視為功能上等價。
適宜地，該核酸基本上含有圖3給出的FLT4或FLT15的核苷酸序列，以及編碼未改變的野生型FLT的N-末端的核苷酸序列。有利地，核酸從人類細胞樣本中用PCR擴增得到。最合需要地，核酸用與FLT分子非保守區(qū)雜交的引物由PCR方法來得到。適宜地，核酸序列用被設計成與圖3給出的下面劃線的FLT序列區(qū)域或緊鄰的區(qū)域雜交的PCR引物來得到。特別地，PCR引物應當基本上具有序列5′-GCAAGGTGTGACTTTGTTC-3′和5′-AGGATTTCTTCCCCTGTGTA-3′。
另一方面，本發(fā)明提供一種體外抑制VEGF的方法，包括加入有效量的上述多肽。在受試人體內(nèi)抑制VEGF也是人們需要的。因此本發(fā)明給出一種在受試人體內(nèi)抑制VEGF的方法，包括用有效量的上述多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)給藥。特別地，VEGF提供細胞分裂刺激信號(特別是參與血管形成的信號)，因而抑制VEGF預期會在與不適當?shù)男卵苌捎嘘P的腫瘤或疾病的治療中起到療效。
特別地，本發(fā)明給出一種治療與不適當?shù)男卵苌捎嘘P的腫瘤或疾病的方法，包括用有效量的上述多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)給藥?？赡艿玫街委煹募膊“殉舶┖吐殉策^度刺激(ovarianhyperstimulation)(Boocock等1995，國家癌癥協(xié)會雜志87，506-516)。
另外，已確證FLT由滋養(yǎng)層和卵巢及內(nèi)皮組織的細胞表達(Charnock-Jones等1994生殖生物學51，524-530)。這清楚地表明植入過程中VEGF對滋養(yǎng)層的生長和分化所起的作用。
因此，特別地，本發(fā)明提供一種通過抑制VEGF的作用來影響滋養(yǎng)層，卵巢細胞或子宮內(nèi)膜細胞的生長和/或遷移的方法，包括用有效量的上述多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)給藥。
本領域的專業(yè)人員應當理解，確定滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜細胞表面的FLT可能提供許多調(diào)節(jié)生育力的方法。例如，滋養(yǎng)層的生長對胚胎的成功植入是必需的。因此抑制滋養(yǎng)層生長提供了一種避孕或contragestion的方法。
因此本發(fā)明進一方面提供一種調(diào)節(jié)婦女生育力的方法，包括用有效量的上述多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)給藥。多肽的“有效量”是足以基本上阻遏VEGF對滋養(yǎng)層和/或子宮內(nèi)膜細胞的刺激的量。典型地，本方法將導致婦女的生育力降低。
此外，有可能鑒定出可以增強VEGF對滋養(yǎng)層的作用的藥劑，從而增大輔助或自發(fā)月經(jīng)周期(assisted or spontaneous cycles)中成功植入的概率。這種VEGF增強劑的候選物包括編碼本發(fā)明的截短FLT多肽的核酸序列的反義等價物。對本領域的專業(yè)人員很明顯，它們將被用于提高婦女的生育力。
另一方面，本發(fā)明提供一種含有上述多肽和一種生理可接受的載體物質(zhì)的藥物組合物。該組合物可在體內(nèi)按上述任一方法使用。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽在制備用于治療與不適當?shù)男卵苌捎嘘P的腫瘤和疾病的治療組合物中的應用。這樣的情況和疾病的例子在WO94/10202和WO94/21679中有詳細描述。本發(fā)明在其范圍內(nèi)也包括一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，包括將上述多肽與一種生理可接受的載體物質(zhì)混和。
本發(fā)明將由下面的說明性實施例并參考附圖來描述，其中

圖1給出密切相關的酪氨酸激酶受體(flt，fms和kit，“kit”是KDR的另一名稱)的氨基酸多重排列。
圖2給出瓊脂糖凝膠電泳的典型結(jié)果，表明在許多組織樣本中均存在交替拼接的flt編碼序列。
圖3給出編碼全長VEGF受體(FLT和相關受體KDR)的序列3′區(qū)的核苷酸序列，以及編碼本發(fā)明的多肽的兩段序列FLT4和FLT15。
圖4是野生型與突變體FLT分子的圖例表示。
圖5給出本發(fā)明的兩段多肽的C末端氨基酸序列。
實施例在來源于人類類滋養(yǎng)層(trophoblast-like)、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的細胞系中研究VEGF受體FLT的表達。所用類滋養(yǎng)層(絨膜癌)細胞系為BeWo(從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville MD，USA得到)。子宮內(nèi)膜癌細胞系為Ishikawa(從M.Nishide教授，日本Tsukuba大學得到)和HECl-A和HECl-B(從ATCC USA得到)。卵巢癌細胞系是7、17R、25、25R和35。它們都是上皮來源的，并在培養(yǎng)物中建立了10-30代。細胞系17R和25R在化療及復發(fā)后得到(細胞系25R與細胞系25來源于同一患者)。
根據(jù)ATCC的建議，BeWo細胞系在Ham′s F12中生長。子宮內(nèi)膜癌細胞系在McCoy′s培養(yǎng)基中生長(ICN流動實驗室，Irvine UK)。并加10％胎牛血清(ICN Flow)、2mM L-谷氨酰胺(ICN Flow)和50U/ml及50mg/ml的青霉素/鏈霉素(ICN Flow)。
發(fā)明人決定用PCT和原位雜交研究FLT在這些細胞系和正常組織中的表達。因此有必要構(gòu)建適合的寡聚核苷酸引物和探針。
為幫助設計合適的引物，用計算機程序“pileup”構(gòu)建了密切相關的酪氨酸激酶受體(FLT，F(xiàn)MS和KIT)的蛋白質(zhì)多重排列(圖1)。這顯示出該受體家族中的彼此不同的序列區(qū)域。圖1中被選來設計引物的區(qū)域下劃雙線。然后根據(jù)這些蛋白質(zhì)序列合成下列成套的PCR引物A)5′GCAAGGTGTGACTTTTGTTC3′B)5′GCGCTCGAGAGCATCACTCAG3′C)5′GCGCGGCCGCAGTAAAATCCA3′D)5′AGGATTTCTTCCCCTGTGTA3′這些寡聚核苷酸的下劃線部分是與flt cDNA序列雜交的區(qū)域。還加入其它核苷酸以幫助定向克隆。所用循環(huán)為第一輪用引物A和D[95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒]×25；第二輪用引物B和C[95℃30秒，44℃30秒，72℃30秒]×2[95℃30秒，65℃30秒，72℃30秒]×25。內(nèi)部引物B和C在其5′端分別有限制性內(nèi)切酶XhoI和EagI的酶切位點以允許產(chǎn)物的定向克隆。
已發(fā)現(xiàn)某些組織的PCR擴增產(chǎn)物比全長FLT cDNA產(chǎn)物明顯要大(用瓊脂糖凝膠電泳判定)。典型結(jié)果由圖2給出。
用成套引物A-D得到的PCR產(chǎn)物走膠。泳道1-3是從標為17，17R和25R的卵巢癌的初級組織樣本得到的產(chǎn)物。泳道4到7是從由卵巢癌7，17R，25和25R建立的細胞系得到的產(chǎn)物，泳道8到10分別是細胞系HECl-A，HECl-B和Ishikawa，泳道11含有HUVECs的產(chǎn)物。
標準大小帶與預期相同(285bp左右)，與發(fā)表的flt序列(Shibuya等，1990，癌基因，5，519-524)的3′端相同。然而可清楚看出除了全長fltcDNA PCR擴增產(chǎn)物，在泳道2(17R，初級組織)和泳道4(7，細胞系)有約360bp的大帶，在泳道5(17R，細胞系)也能看到同樣大小的淺帶，不過凝膠照片復制后看不清。用已知技術從凝膠中提取這些大帶，亞克隆到質(zhì)粒載體pBluescript II KS中，然后用雙脫氧核苷酸測序法(Sanger等1977PNAS 71，5463-5467)進行序列分析。
5個獨立克隆的測序(Boocock等，1995，國家癌癥協(xié)會雜志87.506-516)表明每個克隆在發(fā)表的flt序列中的兩個引物之間區(qū)域含有1或2個新的插入序列。這些克隆中的3個(命名為FLT5，F(xiàn)LT15和FLT16)在大約位置1555處含有一段85bp的插入序列，而另2個克隆(FLT13和FLT14)在約位置1665含有一段65bp的插入序列(見圖3，編號基于Shibuya等，1990，引文同上)。這些插入序列造成PCR產(chǎn)物帶變大。然而，兩種插入序列都含有閱讀框架內(nèi)終止密碼子，所以相應的全長RNA能編碼可溶性的截短的受體變異體，該變異體含有細胞外區(qū)域的頭5個類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，到氨基酸517或553，以及C末端不相關的24個或14個氨基酸(其中13個是附加的)。
盡管這些變異體flt克隆來源于只編碼氨基酸503以上的部分cDNA，利用每個新插入序列的特異性引物和正好與起始ATG5′結(jié)合的引物，仍能夠從來自HUVEC細胞、人類絨膜和卵巢癌細胞系7的cDNA擴增出大小與按相應的全長cDNA的預計相同的PCR產(chǎn)物。
圖4是不同F(xiàn)LT受體分子的圖例表示。在頂部，(a)顯示野生型全長FLT受體分子，(b)表示Kendall和Thomas描述的截短形式，(c)表示FLT4編碼的多肽，(d)表示FLT15編碼的多肽。右邊的數(shù)字表示分子中的氨基酸數(shù)目，框中數(shù)字代表存在于sFLT變異體中但不在野生型分子中的氨基酸的數(shù)目。
圖5給出可能被“全長”FLT4和FLT15克隆(即含有用來生成真實克隆的所有引物位點5′端核苷酸序列的克隆)編碼的多肽的預測的C末端氨基酸序列。FLT4克隆的最后14個氨基酸，以及FLT15克隆的最后24個氨基酸與野生型FLT序列不同。
權(quán)利要求
1.一種改變的，可溶形式的FLT多肽，它能夠結(jié)合VEGF，因而對其產(chǎn)生抑制作用，該多肽含有5個或更少的完整的類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的多肽，其含有4個或更少的完整的類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的多肽，或其功能等價物，該多肽在其C末端基本上含有圖5給出的FLT4的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1或2的多肽，或其功能等價物，該多肽在其C末端基本上含有圖5給出的FLT15的氨基酸序列。
5.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的多肽，其含有野生型FLT多肽的大約400到500個氨基酸殘基。
6.編碼上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的多肽的核酸序列。
7.權(quán)利要求6的核酸序列，或其功能等價物，該核酸序列含有插入到圖3給出的FLT4序列的1655位置的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求6的核酸序列，或其功能等價物，該核酸序列含有插入到圖3給出的FLT15序列的1555位置的核苷酸序列。
9.一種在體外抑制VEGF的方法，其包括加入有效量的權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽。
10.一種在人類受試者中抑制VEGF的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其包括權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽在治療與不適當?shù)男卵苌捎嘘P的腫瘤或疾病中的應用。
12.一種用來治療卵巢癌、卵巢過度刺激或子宮內(nèi)膜異位的權(quán)利要求11的方法。
13.一種通過施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)，抑制VEGF的作用，從而影響滋養(yǎng)層、卵巢或子宮內(nèi)膜細胞的生長和/或遷移的方法。
14.一種通過施用有效量的權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽以及一種生理可接受的載體物質(zhì)來調(diào)節(jié)婦女生育力的方法。
15.一種按權(quán)利要求11到14中任一權(quán)項的方法應用的藥物組合物，其含有權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽和一種生理可接受的載體物質(zhì)。
16.一種制備權(quán)利要求1 5的組合物的方法，其包括將一種生理可接受的載體物質(zhì)與權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的多肽混合。
全文摘要
本發(fā)明公開的是FLT多肽的改變的可溶形式，以及含有該多肽的藥物組合物，及其不同的應用。所述多肽能夠結(jié)合VEGF，因而對其產(chǎn)生抑制作用，該多肽含有5個或更少的完整類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。
文檔編號A61P35/00GK1159827SQ9519425
公開日1997年9月17日 申請日期1995年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月26日
發(fā)明者D·S·沙羅克-瓊斯, C·A·布科克, A·M·夏基, S·K·史密斯 申請人:麥特里斯醫(yī)療有限公司