專利名稱：抗vegf藥劑在子宮內(nèi)膜異位治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和它在某些組織中的相關(guān)受體(Flt和KDR)表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，并由此說明VEGF拮抗劑在子宮內(nèi)膜異位和相關(guān)病癥的治療/預(yù)防中的潛力。
背景技術(shù)：
子宮內(nèi)膜異位被定義為子宮腔外面存在子宮內(nèi)膜細(xì)胞。該疾病影響育齡婦女并帶來有害的社會、性和生育后果。子宮內(nèi)膜異位的發(fā)展與維持涉及逆行性行經(jīng)后子宮內(nèi)膜細(xì)胞在異位(ectopic site，最常見的是骨盆腹膜)的建立和后續(xù)的持續(xù)生長。(Sampson，1927，美國產(chǎn)科與婦科雜志，14,422；Ridley和Edward，1958，美國產(chǎn)科與婦科雜志，76，783-790；Lieu和Hitchcock，1968，英國產(chǎn)科與婦科雜志，93，859-862；及Thomas和Prentice，1992，生殖醫(yī)學(xué)綜述，1，21-36)。除了卵巢類固醇激素的影響外(Dizerega等，1980，生育與不育，33，649-653；Bergqvist等，1985，美國病理學(xué)雜志，121，337-341)，對控制該疾病的因素知之甚少。然而，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞植入物的生長可能受血管生成生長因子的影響(血管生成是指新血管的形成)。
子宮內(nèi)膜異位病灶的特征在于子宮內(nèi)膜組織和周圍腹膜的高度血管化(Shaw，P46-47，“子宮內(nèi)膜異位圖譜”，1993，Pathenon出版集團(tuán)；Folkman和Shing，1992，生物化學(xué)雜志207，10931-10934)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最近才被確定性質(zhì)的血管形成蛋白，它是內(nèi)皮細(xì)胞的強(qiáng)力分裂素及血管透性的介體(Ferrara等，1992，內(nèi)分泌學(xué)綜述13.18-32)。VEGF及其在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的受體flt和KDR(De Vries等1992，科學(xué)，255，989-991)與發(fā)育的胚胎中的(Breier等，1992，發(fā)育，114，521-532；Jakeman等，1993，內(nèi)分泌學(xué)，133，848-859；及Millauer等，1993，細(xì)胞，72，835-846)以及進(jìn)行深度血管形成的成人組織如常位(eutopic)子宮內(nèi)膜((Charnock-Jones等1993，生殖生物學(xué)48，1120-1128)以及黃體化的黃體(Ravindranath等，1992，內(nèi)分泌學(xué)13，254-260)中的血管形成有關(guān)。此外，它在腫瘤血管形成中的作用正在確定中(Shweiki等，1992，自然，359，843-848；Kim等，1993，自然，362，841-844)。
本發(fā)明人嘗試確定VEGF及其相關(guān)受體flt是否存在于子宮內(nèi)膜組織。另外，他們嘗試確定其它細(xì)胞，比如已知在該疾病中其數(shù)目及活化狀態(tài)升高的腹膜巨噬細(xì)胞(Halme等，1983，美國產(chǎn)科與婦科雜志，145，333-337；Olive等，1985，生育與不育，44，772-777；及Halme等，1987，美國產(chǎn)科與婦科雜志156，783-789)，是否通過分泌VEGF而與子宮內(nèi)膜異位的致病過程有關(guān)。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供一種用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，它包含一種能干擾VEGF的產(chǎn)生和/或活性的藥劑以及一種生理可接受的載體物質(zhì)。
顯然，根據(jù)本發(fā)明，有許多藥劑可以用于組合物中，根據(jù)所選藥劑的作用方式，其性質(zhì)可能相差很大。
例如，藥劑可用來全身地或優(yōu)選局部地(即在子宮內(nèi)膜組織中或其周圍)阻遏VEGF的產(chǎn)生。最好能用一種藥劑阻遏局部巨噬細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，局部巨噬細(xì)胞看起來在致病過程中起著特別重要的作用。已表明VEGF表達(dá)可能被類固醇調(diào)節(jié)(例如Charnock-Jones等，1993，生殖生物學(xué)，48，1120-1128)，估計巨噬細(xì)胞具有類固醇受體。因此調(diào)節(jié)類固醇途徑的物質(zhì)可以用于下向調(diào)控(down-regulating)的VEGF產(chǎn)生，尤其是在巨噬細(xì)胞中。一些類固醇和類固醇抑制物(例如雌激素和抗雌激素的他莫昔芬；孕酮和抗孕酮的RU 486)已為人所知。
其他藥劑包括VEGF反義RNA或核酶(例如Zaug等，1986，自然，324，429-433)，它們中的任一個均可特異性地用來抑制VEGFmRNA的翻譯，與靶定向性較低的藥劑相比，它需要特殊的應(yīng)用手段。
其它藥劑可用來阻遏或抑制VEGF的活性。這些藥劑包括例如，抗VEGF抗體(或其有效部分，如Fv，F(xiàn)ab或scFv部分)，它可以抑制VEGF結(jié)合到KDR和/或flt受體上(例如WO 94/10202所描述的)；VEGF拮抗物，它可以與VEGF競爭以結(jié)合到KDR和/或flt受體上(例如flt受體的可溶截短形式，它可以結(jié)合VEGF，如WO 94/21679所描述的)；以及酪氨酸激酶抑制物，它可以導(dǎo)入VEGF發(fā)揮其作用的細(xì)胞中去，優(yōu)選地，這些抑制物為相對小的肽類(適宜的是合成肽類)，或是可被包裝進(jìn)顆粒(例如脂質(zhì)體)中的藥劑，所述顆粒便于被巨噬細(xì)胞吞噬。
其它種類的藥劑也可用于抑制子宮內(nèi)膜組織或周圍的細(xì)胞中的flt和/或KDR表達(dá)。這些藥劑可能包括特異性地抑制flt和/或KDR mRNA的翻譯的反義RNA或核酶，或是用于基因療法的藥劑。作為后一類型的例子，可在適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞中，典型地通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，引入一個“顯性陰性受體”基因(見Millauer等，自然，367，576-579)，以阻止細(xì)胞表達(dá)有功能的VEGF受體。
優(yōu)選地，該組合物包含一種定向到子宮內(nèi)膜組織或周圍的巨噬細(xì)胞中的藥劑。最有利地，該藥劑與一種巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物(例如CD14)的配體相連，該細(xì)胞表面標(biāo)記物有助于將藥劑定向到巨噬細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解，這些種類的藥劑并不一定相互排斥，實(shí)際上，如果組合物包含兩種或更多藥劑，優(yōu)選地具有不同的作用方式，可能會產(chǎn)生協(xié)同作用。
本發(fā)明的組合物可以全身(例如靜脈內(nèi))進(jìn)藥，或局部進(jìn)藥。腹腔內(nèi)或子宮內(nèi)進(jìn)藥可能是有利的。合適的施用劑量與途徑可用試湊法搞清楚，無需創(chuàng)造性的方法。
另一方面，本發(fā)明提供一種治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，它包含一種抑制腹膜巨噬細(xì)胞激活/或募集的藥劑和一種生理可接受的載體物質(zhì)。
具有這些性質(zhì)的藥劑有免疫調(diào)節(jié)劑，例如細(xì)胞激動素，它可以特異性地抑制巨噬細(xì)胞的激活和/或募集；阻遏合適的巨噬細(xì)胞受體的抗體(或其有效部分)；抑制巨噬細(xì)胞激活/募集信號的物質(zhì)(例如抗體、特異性拮抗物)；或是反義RNA或核酶。它們阻止巨噬細(xì)胞中編碼導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化的多肽的mRNA的翻譯。
本發(fā)明因此也提供一種治療子宮內(nèi)膜異位的方法，包括給患者施用有效量的上述一種或兩種組合物。
另一方面，本發(fā)明提供一種制造用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物的方法，包括將一種生理可接受的載體物質(zhì)與一種能抑制VEGF產(chǎn)生和/或活性的藥劑混合。
另一方面，本發(fā)明提供一種制造用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物的方法，包括將一種生理可接受的載體物質(zhì)與一種能抑制腹膜巨噬細(xì)胞的激活和/或募集的藥劑混合。
本發(fā)明將進(jìn)一步由示例描述，并參照附圖，其中

圖1給出4張顯微照片，指示出VEGF mRNA在子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞與腺上皮中的原位定位；圖2給出4張子宮內(nèi)膜組織的顯微照片(A-D)，對組織中VEGF蛋白做了免疫組織化學(xué)染色。
圖3給出4張子宮內(nèi)膜組織的顯微照片(A-D)，對組織中VEGF蛋白(顯微照片C)或CD14(顯微照片D)做了免疫組織化學(xué)染色。
圖4給出4張患子宮內(nèi)膜異位(顯微照片C)或未患子宮內(nèi)膜異位(顯微照片D)的受試者的分離的腹膜巨噬細(xì)胞的顯微照片，對VEGF蛋白做了免疫組織化學(xué)染色。
圖5是從正常受試者或患子宮內(nèi)膜異位的受試者抽取的腹膜液中酸性磷酸酶活性(單位/毫升)的直方圖。
圖6是PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠分析的照片，該P(yáng)CR產(chǎn)物是在從患子宮內(nèi)膜異位和正常的受試者的腹腔巨噬細(xì)胞制取的cDNA上用對KDR(上板)或flt(下板)特異性的引物得到的。
圖7和8給出從受試者分離的腹膜巨噬細(xì)胞的FACS分析結(jié)果的圖，用的是flt或KDR的抗體。
圖9給出從患子宮內(nèi)膜異位和正常的受試者分離的KDR+腹膜巨噬細(xì)胞百分比的直方圖。
圖10給出從患子宮內(nèi)膜異位和正常的受試者分離的腹膜巨噬細(xì)胞對VEGF的趨化反應(yīng)(遷移)的直方圖。
圖11給出患子宮內(nèi)膜異位的和正常受試者的腹膜液中VEGF濃度(ng/ml)的圖表。
圖12是將人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)暴露于受從患子宮內(nèi)膜異位的和正常受試者分離的腹膜巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基后，3H胸腺嘧啶摻入的直方圖。
實(shí)施例方法患者詳細(xì)資料對因不育而自愿接受腹鏡檢查的年齡在24-44歲的婦女進(jìn)行本研究。腹鏡檢查后，患者被確診為正?；蚧甲訉m內(nèi)膜異位，并根據(jù)美國生育能力協(xié)會(AFS)制定的條件評估。對可疑的子宮內(nèi)膜異位組織做活組織檢查，用組織學(xué)方法確證診斷結(jié)果。從6個患子宮內(nèi)膜異位的患者中取異位和常位子宮內(nèi)膜活組織、腹膜液及外周血樣。另外從6名月經(jīng)周期相配的未患子宮內(nèi)膜異位的對照者取腹膜液、子宮內(nèi)膜及血。表1給出了6名患子宮內(nèi)膜異位的患者的詳細(xì)資料和在相應(yīng)的異位和常位子宮內(nèi)膜組織中用對VEGF mRNA特異的探針(操作見下述)進(jìn)行原位雜交的結(jié)果。表1病人 年齡 月經(jīng)日期AFS分值異位組織 常位組織1307 II(最小) S/G S22410IV(最小) -ve S33014II(最小) S/G S43117XII(溫和)S/GS/G54422VII(溫和)-veS/G63128I(最小) S/GS/GS＝在基質(zhì)中雜交G＝在腺體中雜交-ve＝未測到雜交腹膜巨噬細(xì)胞(PM)分離插入套針后立即從后陷凹(posterior cul-de-sac)吸出腹膜液(PF)。樣本經(jīng)過400g離心10分鐘而澄清；上清貯于-70℃?zhèn)溆谩＿M(jìn)一步在室溫下用Ficoll-Hypaque 1077(Sigma，Poole，UK)400g離心10分鐘從沉淀物中分離出巨噬細(xì)胞。用磷酸緩沖液(PBS)洗細(xì)胞，對細(xì)胞計數(shù)，然后再以1×106細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮于DMEM-H(Gibco，Paisley，UK)中，DMEM-H含有5mM Hepes，青霉素(100 mU/ml)，鏈霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。37℃下在5％ CO2中將細(xì)胞懸液粘附到處理過的玻片上2小時，進(jìn)一步純化細(xì)胞懸液，使“粘性”的巨噬細(xì)胞留在玻片上而其它白細(xì)胞被洗掉。
用試劑盒(Sigma，Poole，UK)進(jìn)行非特異性酯酶染色以及CD14的巨噬細(xì)胞單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色來確定制備物的純度。原位雜交根據(jù)前述Kanzaki的方法(Sharkey等，1993，分子內(nèi)分泌學(xué)，6，1235-1241)進(jìn)行原位雜交。恒冷切片收集到3-氨丙基-三乙氧基甲硅烷包被的玻片上，風(fēng)干，4℃下在PBS中用4％多聚甲醛固定20分鐘。玻片用乙醇脫水，貯于-70℃。含有579 bp的VEGF編碼區(qū)的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Not I或Bam I線性化，分別用作有義RNA探針和反義RNA探針的模板。每微克探針摻入約2×106cpm的35S-UTP。乙?；螅L(fēng)干的玻片在50％甲酰胺，單強(qiáng)度Denhardt’s(20mM Tris-HCl(pH8.0)，0.3M NaCl，5mM EDTA，10mM磷酸鈉)和0.5mg/ml酵母tRNA中50℃預(yù)雜交1小時。除去預(yù)雜交緩沖液，加入雜交溶液，雜交溶液中含有(除上述外)10％硫酸葡聚糖，50mM二硫蘇糖醇，和1×105cpm/μl35S標(biāo)記的有義探針或反義探針。50℃下雜交16-18小時。50℃下用(2×強(qiáng)度)檸檬酸鈉溶液(SSC)/14mMβ-巰基乙醇洗玻片兩次，用(2×強(qiáng)度)SSC漂洗，35℃下在0.5M NaCl，10mM TrispH7.0，1mM EDTA中用RNAse A(10μg/ml)處理30分鐘。室溫下用雙強(qiáng)度SSC洗玻片兩次，共15分鐘，然后65℃用(0.1×強(qiáng)度)SSC洗60分鐘，再用乙醇系列脫水。用Ilford K5乳劑涂覆玻片后，4℃下放射自顯影2-3星期。玻片用Kodak K19顯影，定影后用蘇木精明礬復(fù)染。免疫組織化學(xué)染色用異位和常位子宮內(nèi)膜組織做恒冷切片(7-30μm厚)，用冷丙酮固定10分鐘，貯于-70℃?zhèn)溆?。待染色的切片化凍、風(fēng)干后用丙酮進(jìn)一步固定2分鐘。然后用PBS沖洗，在10％山羊血清中溫育20分鐘以封閉非特異性染色。在含1％ H2O2的PBS中溫育10分鐘，使內(nèi)源過氧化物酶失活。然后切片與VEGF多克隆兔抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司，Hatfield，UK)(1∶300)或者是與10倍過量的VEGF肽預(yù)吸收24小時的VEGF抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司，Hatfield，UK)共溫育1小時。后一種處理用作陰性對照。與山羊抗兔生物素化的抗體溫育1小時，然后與ABC(Vector，Peterborough，UK)絡(luò)合后耦聯(lián)顯色。絡(luò)合物用含二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫的0.1M Tris-HCl(pH7.5)檢測。兩種組織切片中的巨噬細(xì)胞及分離的單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞用單克隆抗體LeuM3(CD14)通過相似的免疫組織化學(xué)染色步驟來鑒定(Houck等，1991，分子內(nèi)分泌學(xué)，5，1806-1814)。酸性磷酸酶酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞的水解酶標(biāo)記物，其活性增加與巨噬細(xì)胞激活有關(guān)(Halme等，1993，美國產(chǎn)科與婦科雜志，145，333-337)。從6對相應(yīng)的患子宮內(nèi)膜異位和正常的病人，(她們的組織被用來進(jìn)行原位雜交和免疫組織化學(xué)染色)的去細(xì)胞的腹膜液中鑒定酸性磷酸酶的活性。利用測量對硝基苯酚形成的定量比色鑒定試劑盒(Sigma，Poole，Dorset)確定酶活性。來自患子宮內(nèi)膜異位的患者和未患子宮內(nèi)膜異位的患者的腹膜液中酸性磷酸酶的活性的差別用未配對的學(xué)生氏t檢驗(yàn)(unpaired Student’s t-test)分析，P值小于等于0.05被認(rèn)為是顯著性差異。結(jié)果子宮內(nèi)膜異位組織的原位雜交顯示編碼VEGF的mRNA在一些個體細(xì)胞中定位于基質(zhì)和一些腺上皮中。結(jié)果在圖1中給出，圖1顯示了在在子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞和腺上皮中VEGF mRNA的原位定位。雜交信號在亮視野顯微照片中為黑色顆粒。切片用蘇木精明礬復(fù)染。用反義VEGFRNA作探針的實(shí)驗(yàn)切片在顯微照片C和D中給出。與有義對照探針雜交的等價對照切片為陰性(顯微照片A和B)。只檢測到血管內(nèi)皮細(xì)胞中編碼VEGF受體flt的信使RNA(mRNA)，數(shù)據(jù)未給出。顯微照片A、C和D的標(biāo)尺代表15μm，在顯微照片B中標(biāo)尺代表38μm。VEGF的這種分布見于在月經(jīng)周期的兩階段(“增殖”與“分泌”)中取樣的組織中，在所分析的6個子宮內(nèi)膜異位樣本中的4個出現(xiàn)(表1)。剩下的兩名患者，每人對應(yīng)月經(jīng)周期的一個階段，未顯示出任何明顯的與反義探針的原位雜交。相應(yīng)的常位子宮內(nèi)膜有一些基質(zhì)和腺上皮雜交，與上述結(jié)果一致(Charnock-Jones等，1993，分子內(nèi)分泌學(xué)，48，1120-1128)。
用免疫組織化學(xué)分析確定的VEGF免疫反應(yīng)性的定位，顯示了與異位組織中原位雜交觀察到的相似的分布模式。結(jié)果由圖2給出，圖2給出4張顯微照片(A-D)顯微照片C和D顯示在子宮內(nèi)膜組織，特異地在基質(zhì)(C)和腺上皮(D)中VEGF陽性免疫組織化學(xué)染色。顯微照片A和B是陰性對照。所有切片均用蘇木精明礬復(fù)染。上面的標(biāo)尺代表15μm(A和C)或38μm(B和D)?？梢姰愇唤M織的基質(zhì)中的個體細(xì)胞強(qiáng)烈地陽性染色，在腺體中也有陽性染色。然而，即使有也只有很少的常位子宮內(nèi)膜基質(zhì)中的個體細(xì)胞對VEGF呈現(xiàn)免疫組織化學(xué)陽性。
系列子宮內(nèi)膜切片與巨噬細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)eu M3的免疫組織化學(xué)染色顯示表達(dá)的VEGF細(xì)胞的位置與對巨噬細(xì)胞抗原染色陽性的細(xì)胞有很強(qiáng)的聯(lián)系。結(jié)果由圖3給出，圖3顯示了在子宮內(nèi)膜組織中VEGF蛋白(顯微照片C)或Leu M3(顯微照片D)的免疫組織化學(xué)定位。顯微照片A和B是陰性對照。C和D中標(biāo)有箭頭的細(xì)胞表示對VEGF和Leu M3染色呈現(xiàn)陽性的細(xì)胞(即表達(dá)的VEGF巨噬細(xì)胞)所有切片均用蘇木精明礬復(fù)染。標(biāo)尺代表5μm。如果有也只有很少的巨噬細(xì)胞見于相應(yīng)的常位子宮內(nèi)膜。
外周血單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的前體，在取自正?；颊吲c患子宮內(nèi)膜異位的患者的這些細(xì)胞的樣本中對VEGF蛋白免疫染色。兩組均沒有外周血單核細(xì)胞用免疫組織化學(xué)方法對VEGF蛋白染色呈現(xiàn)陽性。取自兩組患者的腹膜液的巨噬細(xì)胞也對VEGF蛋白免疫染色，發(fā)現(xiàn)只有患子宮內(nèi)膜異位的患者對VEGF染色呈現(xiàn)陽性。結(jié)果由圖4給出，圖4顯示了從患子宮內(nèi)膜異位的(顯微照片C)受試者和未患子宮內(nèi)膜異位的(顯微照片D)受試者的腹膜巨噬細(xì)胞中VEGF蛋白的免疫組織化學(xué)定位。顯微照片A和B表示陰性對照。所有的玻片周蘇木精明礬復(fù)染。顯微照片A和C的標(biāo)尺表示9μm，對B和D是5μm。
用酸性磷酸酶活性評價巨噬細(xì)胞的激活，總體來說，來自患子宮內(nèi)膜異位的患者的腹膜液比正常受試者的腹膜液(8.55±2.29U/ml)表現(xiàn)更高的酸性磷酸酶活性(15.77±2.25U/ml)。結(jié)果由圖5的直方圖給出。數(shù)據(jù)表示為每毫升腹膜液中酸性水解酶活力的單位數(shù)，±1標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計分析表明，患子宮內(nèi)膜異位的受試者和未患子宮內(nèi)膜異位的受試者的腹膜液在酸性磷酸酶活性上有顯著差異(P＜0.001)。腹膜巨噬細(xì)胞cDNA的flt-特異性和KDR-特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所用操作規(guī)程描述見前(Boocock等，1995，國家癌癥協(xié)會雜志，87，506-516)
總而言之，在來自所有受試的腹膜巨噬細(xì)胞(PM)樣本的cDNA用PCR均檢測到flt受體。這包括患和未患子宮內(nèi)膜異位的患者。在兩組中均未檢測到性質(zhì)上的周期依賴性差異。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳由圖6的下板給出。
在兩組患者的cDNA中用PCR均檢測到KDR受體。兩組中均明顯有KDR受體的周期依賴性表達(dá)。對周期的分泌階段取出的PF中分離到的巨噬細(xì)胞，兩組均顯示陽性結(jié)果，而對從增殖階段腹膜液中分離到的細(xì)胞卻不是這樣。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳由圖6的上板給出。
在圖6的上、下板中，泳道1含有分子量標(biāo)記物，泳道2是陰性對照(沒加DNA)，泳道3是陽性對照(胎盤cDNA)，泳道4是從患子宮內(nèi)膜異位的受試者分泌階段分離到的PM中的cDNA，泳道6是從正常受試者增殖階段分離到的PM中的cDNA，泳道7是從正常受試者分泌階段分離到的PM中的cDNA，PCR產(chǎn)物由計算得到的大小在右邊給出。flt特異性熒光激活細(xì)胞的分選(FACS)操作規(guī)程采用由兩組患者分離到的PM。首先在血清中溫育細(xì)胞以封閉非特異性染色，然后細(xì)胞在4℃下在flt抗體(1∶50)或事先用原來的抗原肽類預(yù)吸收的flt抗體中溫育30分鐘。后面的樣本用作對照。然后細(xì)胞在FITC標(biāo)記的二級抗體(1∶200)中在4℃下溫育30分鐘。溫育后，細(xì)胞用2％多聚甲醛固定，再進(jìn)行FACS掃描分析。各步驟之間用PBS洗細(xì)胞兩次。用抗體Leu M3(針對CD14產(chǎn)生)確定巨噬細(xì)胞。這一步緊接著去除二級抗體之后做。
結(jié)果由圖7的圖a-c給出，圖7a顯示對照樣本的染色，包含用肽類預(yù)吸收的抗flt抗體標(biāo)記的細(xì)胞，7b顯示用抗flt抗體對實(shí)驗(yàn)樣本的染色，7c顯示用抗flt和抗CD14雙染色的細(xì)胞。圖片a和b的x軸是flt染色的熒光強(qiáng)度的對數(shù)，y軸是細(xì)胞數(shù)目。圖c中x軸是flt染色的熒光強(qiáng)度的對數(shù)，y軸是對巨噬細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度的對數(shù)。兩組患者的flt陽性腹膜巨噬細(xì)胞百分比未見有顯著差別。兩組中均約有63％的腹膜巨噬細(xì)胞樣品呈現(xiàn)flt陽性。
flt陽性腹膜巨噬細(xì)胞百分比正?；颊呓M患子宮內(nèi)膜異位的患者63±1163.41±10.4n＝6 n＝6KDR特異性熒光激活細(xì)胞的分選操作規(guī)程如前面對flt所述，如果合適的話，不使用KDR抗體及其抗原肽。
結(jié)果由圖8的圖a-c給出。
圖a顯示對照(用肽類預(yù)吸收的抗KDR抗體標(biāo)記的細(xì)胞)，圖b顯示從正常實(shí)驗(yàn)者的分泌階段分離出來的細(xì)胞與抗KDR抗體溫育的結(jié)果。圖c顯示從患子宮內(nèi)膜異位的患者的分泌階段分離出來的細(xì)胞的結(jié)果。圖a-c中，x軸代表KDR染色的熒光強(qiáng)度的對數(shù)，y軸代表細(xì)胞數(shù)目。
兩組患者中均見到KDR陽性腹膜巨噬細(xì)胞數(shù)目的周期依賴性變化，分泌階段PM有最高的KDR陽性細(xì)胞百分比?；甲訉m內(nèi)膜異位的婦女的分泌階段PM比周期相配的正常婦女有顯著增高的KDR陽性PM百分比。
KDR陽性腹膜巨噬細(xì)胞百分比正?；颊呓M 患子宮內(nèi)膜異位的患者增殖 分泌 增殖 分泌4.23±2.3 34+21+22.6±11.778±15.8++*(n＝4) (n＝6) (n＝4)(n＝6)+p＜0.01 與正常增殖期有顯著差異++p＜0.01 與患子宮內(nèi)膜異位者增殖期有顯著差異*p＜0.01 與正常分泌期有顯著差異這些結(jié)果以圖的形式由圖9給出。圖9顯示了在月經(jīng)周期中增殖階段和分泌階段正常和患子宮內(nèi)膜異位的受試者KDR+巨噬細(xì)胞的百分比。趨化性檢測操作規(guī)程采用從兩個患者組中分離的PM樣本。PM與不同濃度的VEGF接觸，用膜將細(xì)胞與VEGF隔開。含有相適合的受體的細(xì)胞將趨向于移向VEGF并透過膜。對透過膜的細(xì)胞染色并計數(shù)，其中包括了各種陽性與陰性對照。37℃溫育90分鐘。
結(jié)果由圖10給出。圖10顯示了VEGF(分別是)5，1，0.5和0.1ng/ml時患子宮內(nèi)膜異位的受試者(實(shí)心柱)或正常受試者(陰影柱)的趨化性指數(shù)(為對照樣本的百分比)。
在5或1ng/ml VEGF時只有子宮內(nèi)膜異位PM(來自周期的分泌階段)表現(xiàn)對VEGF的顯著的趨化反應(yīng)(p＜0.01)?；寂c不患子宮內(nèi)膜異位的婦女的腹膜液中VEGF濃度操作規(guī)程用發(fā)明人研制的ELISA系統(tǒng)確定腹膜液中VEGF濃度。平板用識別完整人類rVEGF165(Boocock等，1995)的多克隆抗VEGF抗體(100μg/ml)包被，4℃溫育過夜，然后用含3％ BSA的TBS室溫下封閉2小時。人類rVEGF165(1-64ng/ml之間)或PF樣本加入包被的小池中，室溫溫育2小時。平板然后用生物素化的多克隆抗VEGF抗體溫育。將底物溶液加入平板，顯色后，加入硫酸終止反應(yīng)，用平板檢測儀確定409nm的吸收。每步之間用含0.01％吐溫20的TBS洗滌平板。用VEGF峰值標(biāo)準(zhǔn)(spiked standard)及無關(guān)的生長因子驗(yàn)證ELISA系統(tǒng)的合理性并最優(yōu)化。該系統(tǒng)靈敏度極限為4ng/ml，吸收值對人類VEGF濃度的對數(shù)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍4-58ng/ml時為線性段。
結(jié)果由圖11給出，圖11顯示來自正常與患子宮內(nèi)膜異位的受試者在月經(jīng)周期的增殖和分泌階段的腹膜液中個體樣本里的VEGF濃度(ng/ml)。在患與不患子宮內(nèi)膜異位的婦女中均發(fā)現(xiàn)VEGF，來自周期中增殖階段的子宮內(nèi)膜異位PF比來自分泌階段的PF以及未患子宮內(nèi)膜異位的婦女周期中兩個階段的PF含有明顯多的VEGF。
正?；颊呓M 患子宮內(nèi)膜異位的患者增殖 分泌 增殖 分泌15+8 15.1±9.230±131，2，310.8±4.81 p＜0.01 比子宮內(nèi)膜異位分泌期顯著地多2 p＜0.01 比正常增殖期顯著地多3 p＜0.01 比正常分泌期顯著地多用巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基將3H胸腺嘧啶摻入HUVEC操作規(guī)程人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)接觸PM調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，確定3H胸腺嘧啶的攝入。這能提供一種內(nèi)皮細(xì)胞增殖的指示。用特異性抗VEGF抗體的抑制研究可以評價VEGF對PM誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的貢獻(xiàn)。
結(jié)果由圖12的直方圖給出。該圖顯示了HUVEC接觸來自患子宮內(nèi)膜異位的受試者(左柱)或正常受試者(右柱)的PM調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基后氚標(biāo)記的胸腺嘧啶的摻入。實(shí)心柱是只有PM調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基，陰影柱表示從用抗VEGF抗體處理過的PM調(diào)節(jié)培養(yǎng)基得到的結(jié)果。單+號代表比對照有顯著多的3H摻入(p＜0.05)；++代表與子宮內(nèi)膜異位巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基相比有顯著少的3H摻入(p＜0.05)；**代表與正常巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基相比有顯著多的3H摻入(p＜0.05)。
兩組受調(diào)節(jié)培養(yǎng)基與對照相比產(chǎn)生顯著大的3H胸腺嘧啶刺激。子宮內(nèi)膜異位培養(yǎng)基比正常培養(yǎng)基產(chǎn)生顯著大的3H胸腺嘧啶摻入刺激，也是唯一的3H胸腺嘧啶的摻入被抗VEGF的作用顯著降低的一組。
由前述，可得出結(jié)論a)VEGF存在于腹膜液中(由HUVEC培養(yǎng)物及ELISA結(jié)果顯示)；b)患子宮內(nèi)膜異位的患者與正常受試者相比其腹膜液中有較多的VEGF；c)VEGF由i)子宮內(nèi)膜組織植入物和ii)(占優(yōu)勢地)腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。
d)VEGF受體flt和KDR存在于腹膜巨噬細(xì)胞并且i)flt mRNA(由RT-PCR判定)存在于整個月經(jīng)周期；ii)KDR mRNA(由RT-PCR判定)只存在于分泌階段。
e)由FACS分析的結(jié)果i)flt免疫反應(yīng)性在月經(jīng)周期中不改變；ii)KDR+群體在分泌階段顯著增長；iii)KDR量在患子宮內(nèi)膜異位的患者中升高。
f)腹膜巨噬細(xì)胞的VEGF的趨化性反應(yīng)只有在分泌階段并且只有在從患子宮內(nèi)膜異位患者分離到的細(xì)胞中有顯著增強(qiáng)。
本發(fā)明人相應(yīng)地認(rèn)為VEGF不僅通過其對血管形成的效應(yīng)也通過其對巨噬細(xì)胞功能(例如激活狀態(tài)、遷移、蛋白酶和/或細(xì)胞激動素的釋放)的效應(yīng)參與到子宮內(nèi)膜異位的病理中。討論子宮內(nèi)膜異位的致病過程尚不清楚。子宮內(nèi)膜可通過一些機(jī)制廣泛地散布，不過臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明逆行性行經(jīng)是子宮內(nèi)膜進(jìn)入腹膜腔的最可能機(jī)制。(Lieu和Hitchcock，1968，前已引用；Blumenkrantz等，1981，產(chǎn)科和婦科，57，667)。除了卵巢激素，對導(dǎo)致子宮內(nèi)膜植入的其它因素知之甚少。
已知從外周單核細(xì)胞分化出來的腹膜巨噬細(xì)胞在患子宮內(nèi)膜異位的婦女中數(shù)目與活性均提高(Halme等1983；Olive等，均見上面引文)。本研究中，患子宮內(nèi)膜異位患者的腹膜巨噬細(xì)胞對VEGF強(qiáng)烈染色，原位雜交表明有大量mRNA，而正?；颊叩母鼓ぞ奘杉?xì)胞和兩組病人的循環(huán)單核細(xì)胞對VEGF染色均非陽性。
在正?；颊咧邪l(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶活性較低表明其具有比子宮內(nèi)膜異位患者要低的活化狀態(tài)，表明激活是VEGF合成的必要條件。因此，腹膜巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)可能在子宮內(nèi)膜異位的致病過程，尤其在VEGF表達(dá)和血管形成中是決定性因素。然而，近來發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位患者的單核細(xì)胞可能對培養(yǎng)物中子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖有直接的刺激效應(yīng)(Braun.等，1994，生育和不育，61，78-84)，因而表明至少對于子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，單核細(xì)胞成熟激活不是唯一的機(jī)制。
本研究表明編碼VEGF的mRNA在子宮內(nèi)膜組織的基質(zhì)和腺上皮中的個體細(xì)胞中的定位。用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行的VEGF肽的相似定位，確證該肽存在于該組織中。對系列切片用抗體Leu M3染色及形態(tài)觀察表明產(chǎn)生VEGF的細(xì)胞幾乎肯定是巨噬細(xì)胞。這些細(xì)胞可能存在于常位子宮內(nèi)膜中，后來被沉積到腹膜腔中。
備選地，腹膜液巨噬細(xì)胞可能滲入異位組織。本研究中，免疫組織化學(xué)染色未能在相應(yīng)的常位子宮內(nèi)膜鑒定到任何表達(dá)VEGF的巨噬細(xì)胞群體，表明在異位子宮內(nèi)膜組織中找到的表達(dá)VEGF的巨噬細(xì)胞具有另一來源。這些巨噬細(xì)胞更可能是由腹膜液滲入。Klein及其他研究工作者(1993，美國人類生育雜志，30，74-81)最近表明與正常組織相比，子宮內(nèi)膜異位組織中常駐白細(xì)胞的增多，并得出結(jié)論這些白細(xì)胞來源于腹膜白細(xì)胞群體。其次，子宮內(nèi)膜異位組織可分泌諸如γ-干擾素等因子(Klein等，引文見上)。γ-干擾素對白細(xì)胞有趨化性(Tabizadeh，1991，引文見上)。此外VEGF本身對白細(xì)胞有趨化性(Clauss等，1991，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，172，1535-1545)，在本研究中子宮內(nèi)膜異位腺上皮分泌白細(xì)胞。第三，我們已表明患子宮內(nèi)膜異位的婦女的腹膜液含有大量VEGF表達(dá)巨噬細(xì)胞。根據(jù)這些觀察結(jié)果，分泌VEGF的巨噬細(xì)胞滲入異位子宮內(nèi)膜是十分有可能的。
綜上所述，已表明VEGF在子宮內(nèi)膜異位組織中表達(dá)，在巨噬細(xì)胞陽性細(xì)胞中免疫染色強(qiáng)烈，在腺上皮染色稍弱。我們對分離到的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的研究表明只有來自患子宮內(nèi)膜異位的婦女的腹膜液產(chǎn)生VEGF。這可能導(dǎo)致這種強(qiáng)力血管形成因子在子宮內(nèi)膜異位患者腹膜液中的高水平及產(chǎn)生VEGF的巨噬細(xì)胞滲入異位子宮內(nèi)膜組織。這兩種情況增加了VEGF，導(dǎo)致常位組織及周圍腹膜的血管化，可能對子宮內(nèi)膜異位外植體的成功植入和維持至關(guān)重要。
權(quán)利要求
1.一種用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，其含有一種能干擾VEGF的產(chǎn)生和/或活性的藥劑和一種生理可接受的載體物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中的藥劑能抵制子宮內(nèi)膜異位組織及其周圍的巨噬細(xì)胞中的VEGF表達(dá)。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其含有一種選自類固醇/抗類固醇藥物；VEGF反義RNA；抗VEGF mRNA核酸酶的藥劑。
4.權(quán)利要求1，2，3中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其含有一種能抑制VEGF對子宮內(nèi)膜異位組織的作用的藥劑，
5.權(quán)利要求4的組合物，其含有一種能抑制VEGF對子宮內(nèi)膜異位組織及其周圍的巨噬細(xì)胞的作用的藥劑。
6.權(quán)利要求4或5的組合物，其含有一種選自抗VEGF抗體或其有效部分、VEGF拮抗物、以及酪氨酸激酶抑制物的藥劑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中的藥劑是flt或KDR受體的可溶性截短形式，該受體結(jié)合VEGF并作為一種拮抗物起作用。
8.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其含有一種能抑制子宮內(nèi)膜異位組織或其周圍的細(xì)胞中flt和/或KDR的表達(dá)的藥劑，
9.權(quán)利要求8的組合物，其含有一種選自flt或KDR反義RNA、抗flt或抗KDR mRNA核酸酶、以及一種顯性陰性flt或KDR受體基因的藥劑。
10.上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其中的藥劑特異性地定向到子宮內(nèi)膜異位組織或其周圍的巨噬細(xì)胞上。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中的藥劑與一種巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物的配體相聯(lián)。
12.一種用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，其含有一種能抑制腹膜巨噬細(xì)胞的激活和/或募集的藥劑和一種生理可接受的載體物質(zhì)。
13權(quán)利要求12的組合物，其中的藥劑選自免疫調(diào)節(jié)藥劑、反義RNA、核酸酶、以及巨噬細(xì)胞激活信號化合物拮抗物。
14.權(quán)利要求1至11中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步含有權(quán)利要求13的藥劑。
15.一種治療子宮內(nèi)膜異位的方法，其包括給患者施用有效量的上述權(quán)利要求中任一權(quán)項(xiàng)的組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中組合物是通過子宮內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑施用的。
17.一種制造用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物的方法，其包括將一種生理可接受的載體物質(zhì)與一種能干擾VEGF的產(chǎn)生和/或活性的藥劑混合。
18.一種制造用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物的方法，其包括將一種生理可接受的載體物質(zhì)與一種能抑制腹膜巨噬細(xì)胞的激活和/或募集的藥劑混合。
全文摘要
本發(fā)明公開的是一種用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，包括一種能干擾VEGF的產(chǎn)生和/或活性的藥劑，和一種生理可接受的載體物質(zhì)；一種治療子宮內(nèi)膜異位的組合物，包括一種抑制腹膜巨噬細(xì)胞活化和/或募集的藥劑，和一種生理可接受的載體；以及制備該組合物的方法及其在子宮內(nèi)膜異位治療中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/00GK1162261SQ9519435
公開日1997年10月15日 申請日期1995年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月26日
發(fā)明者D·S·查諾克-瓊斯, J·麥克拉倫, A·普倫蒂斯, S·K·史密斯 申請人:麥特里斯醫(yī)療有限公司