專利名稱：：四環(huán)三萜類的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及達瑪化合物(dammaracompounds)及其藥物應(yīng)用。達瑪化合物是公認的三萜類化合物并且其特征在于具有式I的四環(huán)基本結(jié)構(gòu)。在已知的達瑪化合物中該基本結(jié)構(gòu)通常被取代，一般是在3-位上的單取代，例如被羥基(達瑪-3-醇類)或氧(達瑪-3-酮類)取代。達瑪化合物也通常在17-位被單取代，例如在人參根和其它植物中發(fā)現(xiàn)的達瑪烯，并且通常在17-位帶有含一個或多個(例如1或2個)烯(-C＝C-)鍵的烴基。對于這種情況，多數(shù)達瑪烯17-烴基取代基含有可以被進一步取代(例如被一個或多個羥基取代)的C8-烯基或二烯基。達瑪化合物在基本結(jié)構(gòu)的其它位置上也可以帶有一個或多個另外的取代基，通常是羥基，或者可在基本結(jié)構(gòu)中含有一個或多個不飽和鍵，例如雙鍵。然而，在式I所示的達瑪化合物中，環(huán)狀結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)構(gòu)型以及4-，10-，8-和14-位上的甲基分布沒有改變。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，達瑪化合物具有所需的藥物特性，特別是免疫抑制和消炎特性。因此，首先，本發(fā)明提供a1)用作藥物例如作為免疫抑制劑或消炎藥的達瑪化合物；a2)用于治療用藥物如免疫抑制劑或消炎藥制備的達瑪化合物；和/或a3)對需要免疫抑制或消炎治療的患者進行治療的方法，包括給所述患者使用有效量的達瑪化合物。在上述a1)-a3)的定義中所述的具體免疫抑制和/或消炎表現(xiàn)或征狀特別包括下文將要具體說明的那些。此處所用術(shù)語“達瑪化合物”指包括上面所述的式I的基本結(jié)構(gòu)的化合物，即具有式I所示特定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)構(gòu)型和甲基取代基分布。在一定程度上式I所示的立體化學(xué)構(gòu)型保留不變。該術(shù)語應(yīng)被理解為帶有一個或多個其它取代基，特別是在3-和/或17位帶有取代基的具有式I基本結(jié)構(gòu)的所有化合物，以及包含在基本結(jié)構(gòu)中的一個或多個碳-碳鍵是不飽和的例如烯不飽和的化合物。因此該術(shù)語應(yīng)被理解為既包括達瑪-3-醇類也包括達瑪-3-酮類化合物。特別地，此處所用術(shù)語“達瑪化合物”包括17C-達瑪化合物，即在17-位被通過碳原子連接在17-位上的基團所取代的達瑪化合物。這種17C-達瑪化合物可在17-位上被單或雙取代，更常被單取代。本發(fā)明所用優(yōu)選達瑪化合物為達瑪-3-醇類及其生理上可水解及可接受的酯和達瑪-3-酮類，特別是，17C-達瑪化合物。因此，本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物為17C-3-醇類及其生理上可水解及可接受的酯和17C-達瑪-3-酮類，例如式IA化合物，其中a是＞CH-OR1，其中R1是氫或生理上可裂解及可接受的酰基，或是＞C＝O，而R為通過碳原子連接在17-位碳原子上的基團。此處所用術(shù)語“生理上可水解及可接受的酯”指在生理條件下可裂解為酸并且該酸本身在所給藥劑量是生理上可耐受的任何酯。因此，該術(shù)語指現(xiàn)有技術(shù)中已知的藥物前體，例如乙酸酯等。如上面定義的達瑪-3-醇類，該術(shù)語指其中3-羥基被3-酰氧基所置換的化合物，其中的酰基為生理上可裂解及可接受的，即在生理條件下能裂解產(chǎn)生游離的達瑪-3-醇和在所給藥劑量是生理上可耐受的酸。應(yīng)當理解，達瑪化合物中的不在3-位上的羥基同樣可以被酯化，因此這樣的酯也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。17C-達瑪化合物通常在17-位含有不對稱碳原子，因此這樣的化合物以非對映體形式存在。在例如17C-達瑪-3-醇類情況下，在3-位上還存在不對稱碳原子，產(chǎn)生另外的立體異構(gòu)體變體。如果存在這樣的異構(gòu)體，本發(fā)明則還包括非對映體混合物和單一差向異構(gòu)體的使用。一般地，優(yōu)選達瑪化合物以純的或基本純的形式使用，例如純的或基本純的單一差向異構(gòu)體，如包含至少90％，例如至少95％的純化合物/差向異構(gòu)體(即含有10％或更少，優(yōu)選5％或更少的其它達瑪化合物和差向異構(gòu)雜質(zhì))。對于達瑪-3-醇類或其酯，在3-位上的羥基或酯基優(yōu)選具有β-構(gòu)型。如上所述，各種達瑪化合物是已知的并且在文獻中有所描述。對于已知的達瑪化合物，在17-位上的取代基的特征為β-構(gòu)型。17-位上的取代基為α-構(gòu)型的達瑪化合物是新的并且包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。17α達瑪化合物比相應(yīng)的17β達瑪化合物明顯地顯示出更好的性質(zhì)，例如，特別是在體內(nèi)具有更好的穩(wěn)定性和更強的生物活性。因此，另一方面本發(fā)明還提供b)17α-達瑪化合物，例如17αC-達瑪化合物；以及c)17α-達瑪化合物，例如17αC-達瑪化合物的如上述a1)中所述的應(yīng)用，如上面a2)中所述藥物的制備或如上面a3)中所述的治療方法中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)選的17α-達瑪化合物是17α-達瑪-3-醇類及其生理上可水解及可接受的酯，和17α-達瑪-3-酮類，例如17αC-達瑪-3-醇類及其生理上可水解及可接受的酯，和17αC-達瑪-3-酮類。本發(fā)明一組具體的17α-達瑪化合物包括-17αβH-達瑪化合物(即其中17α取代基是17-位上唯一取代基的達瑪化合物)；-17α，12βH-達瑪化合物(即其中12-位上的任何取代基均為α構(gòu)型的達瑪化合物)；-17α，12HH-達瑪化合物(即其中12位是未取代的達瑪化合物)；-17α-達瑪化合物，其中在17-位被取代，以及任意地僅在3-位被取代；特別是包括任何相應(yīng)的17αC-達瑪化合物，-達瑪-3-醇或其生理上可水解及可接受的酯，或-達瑪-3-酮，以及這組化合物的任意組合，例如17αβH，12βH-達瑪化合物，-達瑪-3-醇等。根據(jù)本發(fā)明，一組特別的17α-達瑪化合物包括式IB化合物其中a和R如式IA中定義。在本發(fā)明所用的17C-達瑪化合物以及17αC-達瑪化合物的17C取代基，例如在式IA和IB中的R基團，宜為烴基，特別是脂族烴基。這種脂族基可以是支鏈的或直鏈的，飽和的或不飽和的，并且可以帶有一個或多個其它取代基，特別是一個或多個羥基。優(yōu)選的脂族基是未取代的或羥基取代的脂族基，特別是烯基或二烯基。此后所說適宜的這種脂族基包括至多8個碳原子。上述的這類脂族基團宜包括至多8個碳原子。因此適宜的R為任意含有1或2個雙鍵并且任意被至少1個羥基取代的C8-脂族基。本發(fā)明既包括單個差向異構(gòu)體17α達瑪化合物也包括它們的非對映異構(gòu)體混合物，例如17α-達瑪-3-醇類的單個差向異構(gòu)體及其非對映異構(gòu)體混合物。一般地，例如對于本發(fā)明的藥物應(yīng)用，優(yōu)選17α-達瑪化合物以純的或基本純的形式(即沒有或基本上沒有17β-達瑪化合物雜質(zhì))使用，例如包括至少90％，例如至少95％的17α-達瑪化合物(即含有少于10％，如少于5％17β-達瑪化合物雜質(zhì))。當17α-達瑪化合物本身以多于一種差向異構(gòu)體形式存在時，優(yōu)選使用純的或基本上純的單一差向異構(gòu)體，例如，含有至少90％，如至少95％純差向異構(gòu)體(例如含有少于10％，優(yōu)選少于5％的其它差向異構(gòu)體雜質(zhì))的產(chǎn)品。對于17α-達瑪-醇類及其酯，3-位上的羥基或酯基優(yōu)選宜具有β-構(gòu)型。本發(fā)明優(yōu)選化合物為式IC化合物，((17α)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇)為游離的或生理上可水解及可接受的酯形式。按照本發(fā)明已經(jīng)從Palmyrah棕櫚，BorassusflabelliferL.嫩枝粉中分離出該新的式IC化合物。Palmyrah棕櫚廣泛分布在亞洲大陸的亞熱帶地區(qū)并且是一些國家的日常食物中的主要成分。在斯里蘭卡，當?shù)胤Q為Kottakilangu的嫩枝的外部既可以被當作蔬菜，也可將其干燥并磨粹成粉。這種粉提供了式IC化合物分離的便宜來源。式IC化合物的分離及鑒定將在實施例1中詳細描述。因此，本發(fā)明還包括制備式IC化合物的方法，該方法包括從植物例如Palmyrah棕櫚，BorassusflabelliferL.中分離該化合物。優(yōu)選的分離方法包括用有機溶劑如乙酸乙酯萃取，隨后用一步或多步色譜法純化。許多其中17-位取代基為β-構(gòu)型的達瑪化合物是已知的，例如達瑪烯，并且可作為天然產(chǎn)物得到，例如，植物源的萃取物。例如許多17β-達瑪化合物可從達瑪樹脂(從FlukaAG，CH-9470Buchs，Switzerland得到)和其它植物源可以得到(參見，例如甾族化合物詞典(DictionaryofSteroids，編輯Hill，Kirk，Makin&Murphy，Chapman&Hall出版，第一版，1991，p218-222和536)。達瑪化合物也可以合成產(chǎn)生，例如將天然的達瑪烯進行適當?shù)难苌托揎?。一般用于合?7α-和17β-達瑪化合物的流程圖示如下。在上面流程中，上面5個步驟與17α-差向異構(gòu)體有關(guān)。當然，這些步驟同樣適用于17β-差向異構(gòu)體。步驟1為羥基保護基Y的引入。Y可以是適合于下面各反應(yīng)步驟例如對后續(xù)反應(yīng)步驟穩(wěn)定的任何羥基保護基。適宜的Y為甲硅烷基羥基保護基，例如三(C1-4烷基)甲硅烷基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基。羥基保護基Y可用本領(lǐng)域中任何常規(guī)方法引入，例如通過式II與TBDMSC(叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物)在咪唑中反應(yīng)引入。化合物III經(jīng)過步驟2-4進行差向異構(gòu)化。步驟2為?；蚣坠柰榛Ｗo基W的引入。適宜的?；蚣坠柰榛Ｗo基可以是任何本領(lǐng)域中已知的、例如用有機鋰化合物或烷基格林尼亞試劑容易裂解為烯醇的基團。W宜為?；缫阴；?，例如通過式III與乙酸酐在對甲苯磺酸的存在下反應(yīng)引入。步驟3為式IV與有機鋰化合物，如甲基鋰，或格林尼亞試劑反應(yīng)得到相應(yīng)的金屬烯醇鹽，其中V中的M一般為鎂，或優(yōu)選鋰。步驟4為將V質(zhì)子化得到非對映異構(gòu)體混合物III+VI。反應(yīng)可以用任何適當?shù)馁|(zhì)子化劑進行，例如氯化烷基銨或水楊酸甲酯?？梢岳斫猓ㄟ^變化各種參數(shù)，例如質(zhì)子化劑和反應(yīng)條件的選擇，可以使步驟4變得有利于例如差向異構(gòu)體VI的產(chǎn)生。如流程A所示，從步驟4中得到的非對映異構(gòu)體混合物宜在步驟4之后用色譜法進行分離。步驟5為式VI的三氟甲磺?；?triflation)，其中式VII中的Tf是CF3-SO2-。三氟甲磺?；m合例如通過式VI與KHMDSA(六甲基二硅氮烷鉀(potassiumhexamethyldisylazane))和PhNTf2[N-苯基-二(三氟甲磺酰亞胺)]反應(yīng)進行。步驟6為式VII與金屬有機硫酸鹽，例如銅酸三烷基錫，如銅酸三丁基錫反應(yīng)，其中式VII中的Z1代表如三丁基錫。銅酸三丁基錫宜就地形成，如后面實施例2中所述。步驟7包括式VIII與適當?shù)挠H電子試劑例如在Pd(CH3CN)2Cl2存在下的StiHe偶合。在流程A中，選擇親電子試劑可得到具體的式IC終產(chǎn)物。步驟8為將式IX脫保護以除去羥基保護基Y。脫保護可以使用任何本領(lǐng)域中已知和常用的方法，例如可以用Bu4NF(氟化四丁基銨)處理除去甲硅烷基保護基。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，上述反應(yīng)流程可以進行適當?shù)淖兓援a(chǎn)生不同的17α和/或17β-達瑪化合物。可以理解，根據(jù)需要，通過適當選擇步驟7中所用的親電子試劑或者對開始在17位的取代基的修飾可以改變終產(chǎn)物的17位取代基的性質(zhì)。對于差向異構(gòu)化和親電子取代，例如通過改變3-羥基(如為得到相應(yīng)的酮基化合物)或通過起始原料II的選擇，如其中17-位上的乙酰基被不同的?；虻葍r的反應(yīng)官能團取代，或其中3-位被氧取代，以及例如通過將氧代基團轉(zhuǎn)化為保護基，如等價的非反應(yīng)官能團，可以得到其它達瑪化合物。例如，在步驟7之后(而不是步驟4)可以分離出非對映異構(gòu)體產(chǎn)物，而17β-差向異構(gòu)體則可以從式II直接經(jīng)過前面5個步驟制備。改變的流程B如下所示，可將流程A步驟4的產(chǎn)物經(jīng)過Shapiro偶合方法進行親電子取代。步驟9為式III或VI或其混合物與三異丙基苯磺酰肼鹽酸鹽(trishydrazinehydrochloride)反應(yīng)。當該反應(yīng)被用于17α-達瑪化合物及其合成時，優(yōu)選在溫和的酸性條件下進行，例如，在緩沖劑存在下進行。隨后將步驟9的Xa/Xb與堿金屬有機化合物，例如烷基鋰化合物如丁基鋰，進行步驟10反應(yīng)，產(chǎn)生XIa/XIb，其中Z2為堿金屬，例如鋰原子。然后將XIa/XIb經(jīng)過類似前述流程A步驟7和8的過程，首先與CuCN反應(yīng)將Z2轉(zhuǎn)化為銅/堿金屬(例如銅/鋰)復(fù)合物形式，隨后與選擇的親電子試劑反應(yīng)并且脫保護。當然，上述方法(例如前面所述流程A)的變體是可能的，特別是通過在步驟10使用不同的親電子試劑以在終產(chǎn)物17-位上產(chǎn)生不同的取代和選擇不同的起始原料。通過前面所述可以理解，本發(fā)明提供了制備17C-達瑪化合物，包括17αC-和17βC-達瑪化合物的新方法。廣義上講，該方法包括17羰基-達瑪化合物如17?；?達瑪化合物(如果需要，可以用其保護形式)與親電子試劑如適當?shù)南┻^氧化物偶合，并且如果需要，除去保護基或功能基。例如，式XII化合物與親電子試劑R3-H偶合，其中a’為＞CH-OH或＞C＝O的保護形式，R2和R3為烴基，R2和R3的碳原子數(shù)總和等于在17-位上所需取代基的碳原子數(shù)總和，除去保護基或功能基，并且如果需要，用適當酸?；卯a(chǎn)物得到如前定義的式IA化合物。雖然偶合反應(yīng)可用任何適當?shù)姆椒ㄟM行，但反應(yīng)流程A和B的過程將通過17(有機金屬-C)-達瑪化合物(即17C-達瑪化合物，其中直接連接在17位上的17C-取代基的碳原子被有機金屬基團，例如三烷基錫基(如流程A化合物VIII的Z1)取代)或17(堿金屬-C)-達瑪化合物(即17C-達瑪化合物，其中直接連接在17位上的17-取代基的碳原子被堿金屬例如鋰原子取代，如流程B的化合物XIa和XIb)實現(xiàn)，例如，通過式XIII活性中間體，實現(xiàn)，式中a’如式XII中定義，Z為堿金屬原子或有機金屬基團。優(yōu)選Z為Li或三C1-4烷基錫。活性中間體可通過偶合步驟制備，或在偶合過程中僅形成過渡態(tài)。17β-羰基-達瑪化合物，例如流程A式II化合物，是已知的[例如，參見植物化學(xué)(Phytochemistry)26，(12)，3365(1987)和四面體(Tetrahedron)29，2105(1973)]，或用已知化合物的類似的方法制備或衍生。17α-羰基-達瑪化合物如流程A式IV化合物是新的?？梢岳斫猓景l(fā)明還提供了制備17α-羰基-達瑪化合物的方法，該方法包括根據(jù)需要將相應(yīng)的17β-羰基-達瑪化合物的保護形式進行差向異構(gòu)化，并且如果需要，除去保護基或功能基。例如，將式XIIa化合物進行差向異構(gòu)化，其中a’和R2具有式XII中的含義，并且如果需要，除去保護基或功能基，得到XIIb化合物其中a”為＞CH-OH或＞C＝O或其保護形式，R2具有式XII中的含義。進行有效差向異構(gòu)化的具體方法如前面流程A中步驟1-4所述，并且可根據(jù)步驟8的一般方法任選脫保護步驟。如上所述，17α-羰基-達瑪化合物如式XIIb和VI是新的。在17位上的取代基分別為式IV，V，VII-IX，Xa/b和XIa/b中代表的17αC-達瑪化合物也是新的。它們可用作中間體并且包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在這些化合物中，17α羰基-達瑪化合物是特別令人感興趣的，特別是作為中間體。因此，本發(fā)明還特別提供d)17α羰基-達瑪化合物。優(yōu)選的達瑪化合物d)是17α?；?達瑪化合物，例如式XIIb化合物，如17α乙?；?達瑪化合物，即由式VI化合物代表的化合物。17(有機金屬-C)-和17(堿金屬-C)-達瑪化合物，包括17β-，特別是17α-(有機金屬-C)-和-(堿金屬-C)-達瑪化合物也是特別感興趣的化合物，特別是作為中間體。因此，在另一個特別方面，本發(fā)明還提供e)17(有機金屬-C)-和17(堿金屬-C)-達瑪化合物。優(yōu)選的化合物e)為例如由式XIII代表的17(1-有機金屬-亞乙烯基)-和17(1-堿金屬-亞乙烯基)-達瑪化合物，例如，由式VIII，XIa和XIb代表的17(1-有機金屬-乙烯基)-和17(1-堿金屬-乙烯基)-達瑪化合物。適宜的有機金屬基團和堿金屬原子如前所述，其中17(鋰-C)-，例如17(1-鋰-亞乙烯基)-，如17(1-鋰-乙烯基)-達瑪化合物是特別優(yōu)選的。考慮到從上述化合物得到終產(chǎn)物的優(yōu)點，上述e)中定義的17α-達瑪化合物是優(yōu)選的。在本發(fā)明范圍內(nèi)的17α羰基-，17(有機金屬-C)-和17(堿金屬-C)-達瑪化合物d)和e)的具體化合物包括所有在前面與17α-達瑪化合物有關(guān)的定義中的那些，通常包括例如，17α羰基-、17(有機金屬-C)-和17(堿金屬-C)-達瑪-3-醇類和-達瑪-3-酮類，其游離形式和保護形式，以及17α羰基，βH-和17α，12βH-達瑪化合物等。從上述方法可以理解，17(有機金屬-C)-達瑪化合物可以例如這樣制備三氟甲磺酰化17羰基-達瑪化合物，得到17(三氟甲基甲磺酸酯-C)-達瑪化合物，并將其與金屬有機銅酸鹽反應(yīng)，其中若適宜起始原料被保護，隨后任意脫保護，例如除去保護基或功能基，例如三氟甲磺?；?如上面反應(yīng)流程A，步驟5所述)上述定義的式XII化合物，例如其中R2-CO-代表酰基，如C1-4?；?，如乙?；?，并且將所得產(chǎn)物與堿金屬有機化合物反應(yīng)(如上面反應(yīng)流程A，步驟6所述)，然后任意將產(chǎn)物脫保護，如除去保護基或功能基，得到式XIIIa化合物其中a”具有式XIIb中的含義，Z為有機金屬基團，如三烷基錫，如三丁基錫基團。17(堿金屬-C)-達瑪化合物可通過17-羰基-達瑪化合物與三異丙基苯磺酰肼HCl反應(yīng)并將所得產(chǎn)物與堿金屬有機化合物如丁基鋰反應(yīng)制備，其中若合適，起始原料被適當保護，然后任意脫保護，如除去保護基或功能基。例如，將上述定義的式XII化合物，例如其中R2-CO-代表酰基，如C1-4酰基，如乙酰基，與三異丙基苯磺酰肼HCl反應(yīng)并將所得產(chǎn)物與堿金屬有機化合物反應(yīng)，例如如上所述，然后任意對產(chǎn)物脫保護，如除去保護基或功能基，得到上述的式XIIIa化合物，其中a”具有式XIIb中的含義，Z為堿金屬原子，如鋰原子?？梢岳斫?，作為藥物應(yīng)用的本發(fā)明達瑪化合物將是生理上允許的或藥物上可接受的，例如考慮到要治療的疾病或癥狀，以無毒或基本無毒的劑量給藥，或以毒性水平是可接受的劑量給藥。通過已知技術(shù)的應(yīng)用和在藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)應(yīng)用可以有效地選擇作為藥物應(yīng)用的適當?shù)倪_瑪化合物。達瑪化合物，特別是上述17α-達瑪化合物，如式I，IA，IB或IC化合物具有如下試驗證明的藥物活性。1.淋巴細胞對同種基因刺激的增殖響應(yīng)兩種途徑的MLR(鼠之混合淋巴細胞反應(yīng))將Balb/c鼠(雌性，8-10周齡)的脾細胞(0.5×106)與0.5×106CBA鼠(雌性，8-10周齡)的脾細胞一起培養(yǎng)5天。在響應(yīng)者脾細胞種群中同種基因細胞誘發(fā)增殖響應(yīng)(通過測量摻入DNA的標記前體)。將試驗化合物在培養(yǎng)開始時以各種濃度加入并且與未處理的對照組比較增殖響應(yīng)。在該試驗中達瑪化合物的IC50一般約為100-10nM或更低(與環(huán)孢菌素AIC50約為2nM比較)。參考文獻T.Meo(1979)TheMLRinthemouse.In“ImmunologicalMethods”，L.LefkovitsandB.Pernis，Eds.，AcademicPress，N.Y.pp.227-2392.用轉(zhuǎn)化的人體T-細胞系(Jurkat)測定細胞毒性和抑制細胞生長活性將5×104Jurkat細胞在終體積0.2ml中生長72小時，之后通過酶分析——用對硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷作為底物——進行細胞計數(shù)。將試驗化合物以不同濃度在開始培養(yǎng)時加入，并且與對照組比較細胞毒性，發(fā)現(xiàn)達瑪化合物在濃度高達5μM時是非活性的，說明其免疫抑制活性是特異性的。3.用P-815肥大細胞瘤細胞系體外測定細胞毒性和抑制細胞生長活性在充滿培養(yǎng)基(100μl/孔)的Costar96孔板中，將試驗化合物以每孔25μl加到頂排中并混合，然后從每個孔中抽出25μl加到下一排相應(yīng)的孔中。再加入培養(yǎng)基并混合，再轉(zhuǎn)移25μl到下一排，重復(fù)直到該板的最后一排孔。棄去最后的25μl。將100μl細胞懸浮液(P-815肥大細胞瘤細胞，30,000細胞/孔)加到每個孔中，并在空氣加5-7％CO2的潮濕氣氛和37℃下培養(yǎng)48小時。用細胞計數(shù)器或者用酶比色法評價細胞增殖將板在3000rpm(ECCentra-7R)離心10分鐘。小心棄去上清液，用PBS(Dulbecco，沒有鈣和鎂)洗滌細胞一次，以50μl/孔加入0.5％Triton-X100溶液(0.5mlTritonX-100在99.5ml水中)，并在室溫振搖該板5-10分鐘。加入底物(對硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷，50μl/孔)，然后在37℃培養(yǎng)60分鐘。加入150μl緩沖液2，然后在405nm進行讀數(shù)。將試驗化合物以不同濃度在培養(yǎng)開始時加入并與對照組比較細胞增殖。在濃度高達5μM時沒有發(fā)現(xiàn)達瑪化合物影響增殖，說明免疫抑制活性是特異性的。參考文獻H.Staehelin(1962)Asimplequantitativetestforcytostaticagentsusingnon-adheringcellsinvivo.Med.exp.792-1024.鼠局部移植物抗宿主(GvH)反應(yīng)[Ford等人，TRANSPL.PROC.10(1979)258]將6周齡雌性Wistar/Furth(WF)鼠的脾細胞(1×107)在0天皮下注射到體重約100g的雌性(F344×WF)F1鼠的左后爪上。將動物連續(xù)處理4天，在第7天取下腘淋巴結(jié)并稱重。將兩個淋巴結(jié)重量之差作為評價反應(yīng)的參數(shù)。將試驗化合物每天以不同的劑量口服給藥，共4天并且與對照組比較抑制活性。在該試驗?zāi)Ｐ椭锌诜?0μg-10mg/kg/天劑量，達瑪化合物是活性的(抑制GvH反應(yīng))。發(fā)現(xiàn)17α-達瑪化合物(例如式IC化合物)的活性比相應(yīng)的17β-差向異構(gòu)體的活性高至多達約100倍。5.鼠腎同種異體移植反應(yīng)將雌性Fisher344鼠的一只腎用邊-邊吻合術(shù)移植到單側(cè)(左側(cè))腎切除WF鼠的腎管上。尿道吻合術(shù)也是邊邊術(shù)。從移植那天開始以不同劑量口服試驗化合物，連續(xù)14天。移植后7天進行另一側(cè)腎切除，這時受者依靠供給腎生存。將與對照組比較的移植物存活率作為功能移植參數(shù)。在該試驗中以10μg-10mg/kg/天劑量口服達瑪化合物延長了移植物存活率。因此17α-達瑪化合物比17β-達瑪化合物更有效(高達約100-1000倍)。6.實驗誘發(fā)鼠過敏性腦脊髓炎(EAE)[Levine等人，AM.J.PATH.47(1965)61；McFarlin等人，J.IMMUNOL.113(1974)712；Borel，TRANSPLANT&CLIN.IMMUNOL.13(1981)3]在雄性Wistar鼠的后爪上注射牛脊髓和全Freund佐劑的混合物。一般在16天內(nèi)出現(xiàn)疾病癥狀(尾和兩個后退癱瘓)。記錄發(fā)病動物的數(shù)量和疾病的發(fā)作時間。出現(xiàn)過敏后口服不同劑量的試驗化合物12天。在該試驗?zāi)Ｐ椭?，口?0μg-10mg/kg/天劑量達瑪化合物來抑制疾病的發(fā)作。發(fā)現(xiàn)17α-達瑪化合物比17β-達瑪化合物更有效(約100-1000倍)。7.Freund佐輔劑誘發(fā)關(guān)節(jié)炎[Winter和Nuss，關(guān)節(jié)炎和風濕病(ARTHRITISANDRHEUMATISM)9(1966)394；Billingham和Davies，實驗藥理學(xué)手冊(HANDBOOKOFEXPERIMENTALPHARMACOL)(Vane和FerreiraEds，SpringerVerlag，Berlin，)50/II，(1979)108-144]在OFA和Wistar鼠(雄性或雌性，體重150g)的尾根或后爪中注射(i.c.)0.1ml含0.6mg凍干熱殺性包皮垢分支桿菌的礦物油。在該開發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中，注射佐劑后立即開始用試驗化合物處理(1-18天)；在公認的關(guān)節(jié)炎模型中，當繼發(fā)性炎癥已經(jīng)形成時(14-20天)，在第14天開始治療。在試驗結(jié)束時，用微型兩腳規(guī)測量關(guān)節(jié)的腫脹。在開發(fā)的或公認的試驗?zāi)Ｐ椭?，日劑量?0μg-10mg/kg時，達瑪化合物能抑制疾病的發(fā)展。發(fā)現(xiàn)17α-達瑪化合物比17β-達瑪化合物有效得多。8.羊紅血細胞原發(fā)性體液免疫響應(yīng)(MD，Mishell-Dutton)在終體積為1ml的24孔板中，將鼠脾細胞(OF1，雌性，8-10周齡，1×107)和羊紅細胞(SRBC，3×107)一起培養(yǎng)3天。收集淋巴細胞，洗滌并且與新鮮抗原(SRBC)一起以1×106的細胞密度鋪在軟瓊脂上。培養(yǎng)60-90分鐘后加入補體(豚鼠血清)并再培養(yǎng)60分鐘，然后用計數(shù)(顯微鏡)蝕斑方法評價該試驗。在3天的培養(yǎng)期間，淋巴細胞被致敏為抗原(SRBC)，當再與抗原一起培養(yǎng)時，B-淋巴細胞分泌結(jié)合在分泌淋巴細胞附近抗原上的特異性抗體。添加補體引起抗體包衣紅細胞的溶解，產(chǎn)生蝕斑。每個蝕斑代表單一抗體產(chǎn)生細胞。在培養(yǎng)開始以不同濃度加入試驗化合物。在該試驗?zāi)Ｐ椭?，濃度?0-100nM時，達瑪化合物能抑制蝕斑形成。參考文獻R.I.Mishell和R.W.Dutton(1966)正常小鼠脾細胞懸浮液體外免疫作用，科學(xué)1531004-1006；和R.I.Mishell和R.W.Dutton(1967)正常小鼠的解離的脾細胞培養(yǎng)物的免疫作用，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)126423-442.9.由SRBC-TH細胞誘發(fā)DTH(延遲型超敏)將50微升1∶1(v/v)TH(已接觸羊紅血細胞)細胞克隆(2×106)和10％羊紅血細胞(SRBC)懸浮液的混合物注射(s.c.)至雌性C57BL/6小鼠(6-12周齡)的右后腳墊上。將50μlSRBC細胞懸浮液(用PBS稀釋1∶1v/v)注射(s.c.)到左后腳墊(以測量由于該注射操作而造成的腳墊腫脹的非特異性增加)。24小時后測定左、右后腳墊的厚度。在發(fā)作前24小時和2小時以不同劑量口服實驗化合物。在實驗結(jié)束時計算右腳墊對左腳墊厚度增加的百分數(shù)。[右腳墊厚度＝x；左腳墊厚度＝y(tǒng)；％特異性增加＝z∶z＝((x-y)/y)×100]。在該試驗?zāi)Ｐ椭锌诜┝繛?-100μg/kg時，17-α達瑪化合物能抑制DTH反應(yīng)。劑量為1-100mg/kg時，17-β達瑪化合物能抑制DTH反應(yīng)。參考文獻A.T.J.Bianchi，H.Hooijkaas，R.Brenner，R.Tees，AA.Nordin和M.H.Schreier(1981)輔助T細胞中間抗原特異性H-2限制DTH的克隆，自然，29062-63；和P.Herrmann，M.H.Schreier，J.-F.Borel和C.Feurer(1988)由克隆的輔助T細胞誘導(dǎo)的延遲型超敏的效應(yīng)期中的主要現(xiàn)象-肥大細胞脫顆粒，Int.ArchsAllergyappl.Immun.86102-105.10.鼠(NZB/NZW)全身紅斑狼瘡(SLE)雌性新西蘭黑/白(NZB/NZW)F1小鼠自發(fā)形成為類似全身紅斑狼瘡癥狀。2-3個月它們形成抗細胞核的抗體，5-6個月形成全身免疫腎炎和尿蛋白，8-9個月齡時其慢性腎炎死亡率是可以預(yù)料的。當動物出現(xiàn)蛋白尿時在24周齡時開始治療。在12周內(nèi)每周口服給化合物3次。每兩周測定一次動物癥狀，且在實驗結(jié)束時進行組織學(xué)評價。10只小鼠為一組。在該試驗?zāi)Ｐ椭忻績商炜诜┝?-100μg/kg，17α-達瑪化合物對于預(yù)防疾病的發(fā)作是活性的。每兩天口服劑量為1-100mg/kg時，17-β達瑪化合物具有相同的活性。參考文獻B.S.Andrews，R.A.Eisenberg，A.N.Theofilopoulos，S.Izui，C.B.Wilson，P.J.McJ.B.Roth和F.J.Dixon(1978)自發(fā)性鼠狼瘡樣綜合癥在若干品系中的臨床表現(xiàn)，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1481198。因此，達瑪化合物例如上述17α-達瑪化合物，如式I，IA，IB或IC化合物可用作藥物，例如可用作免疫抑制劑及消炎藥。作為免疫抑制劑，它們特別可用于預(yù)防急性和/或慢性器官或組織移植排異反應(yīng)，例如治療心臟，肺，心肺一起，肝，腎，胰腺，皮膚和角膜移植接受者。它們也可用于預(yù)防移植物抗宿主疾病，如骨髓移植后疾病。作為免疫抑制劑和消炎藥，本發(fā)明化合物也可用于治療自身免疫疾病和炎癥，特別是其病因包括自身免疫成分的炎癥，如關(guān)節(jié)炎(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎，慢性進育型(progrediente)關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)炎)和風溫病。用達瑪化合物可以治療的具體的自身免疫疾病包括血液學(xué)自身免疫疾病(包括如溶血性貧血，再生障礙性貧血，純紅細胞貧血和自發(fā)血小板減少癥)，全身性紅斑狼瘡，多軟骨炎，硬皮病，韋格內(nèi)氏肉芽腫病，皮膚肌炎，慢性活動性肝炎，重癥肌無力，牛皮癬，Steven-Johnson綜合征，自發(fā)口炎性腹瀉，自身免疫性炎性腸疾病(包括例如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn病)，內(nèi)分泌性眼病，Graves病，類肉瘤病，多發(fā)性硬化，原發(fā)膽汁性肝硬化，青少年糖尿病(I型糖尿病)，眼色素層炎(前和后)，干性角膜結(jié)膜炎和青春期角膜結(jié)膜炎，間歇式肺纖維化，牛皮癬關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎(有和沒有腎病變綜合征，例如包括自發(fā)性腎病變綜合征或最低變化性腎病)。達瑪化合物，例如上述17α-達瑪化合物，還可用于治療脫發(fā)/促進毛發(fā)生長和治療哮喘，例如通過吸入給藥。達瑪化合物，例如上述17α-達瑪化合物，還可用于治療可使用皮質(zhì)類固醇治療的疾病。當然，對于上述適應(yīng)癥，適當?shù)膭┝繉⒁罁?jù)欲治療的患者，給藥方式和欲治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度和要達到的效果而變化。然而一般地，對于動物，口服劑量為約0.001-10mg/kg/天可獲得滿意結(jié)果。對于較大的哺乳動物，例如人，口服化合物日劑量約為0.05-500mg，一次或最好分幾次服用，例如2-4次/天。因此，對于17α-達瑪化合物，所需劑量為上述范圍的上限；對于17-β達瑪化合物，所需劑量為上述范圍的下限。對于人體器官移植，其劑量方案是在手術(shù)前4-12小時開始單劑量口服0.05-10mg/kg本發(fā)明化合物，術(shù)后以日劑量維持1-2周，然后根據(jù)血壓情況逐漸減少直到維持0.02-2mg/kg/天的劑量。當本發(fā)明化合物與其它免疫抑制劑一起使用時，例如作為三種或四種治療藥物的一部分，可使達瑪化合物，例如上述17α-達瑪化合物，可通過任何常規(guī)途徑給藥，特別是腸內(nèi)給藥，例如口服，如以口服溶液，片劑，或膠囊形式使用，或腸胃外給藥，例如以注射溶液或懸浮液形式使用。通常對于系統(tǒng)給藥，口服劑型為優(yōu)選的，盡管對于某些疾病，如預(yù)防肝移植排異反應(yīng)，靜脈注射形式是理想的。本發(fā)明化合物也可以局部或皮膚給藥，例如，皮膚霜或凝膠等制劑，或者用于眼部治療的眼膏，凝膠或滴眼劑。用于口服的適宜單位劑型每劑量包含例如0.05-10mg或12.5mg本發(fā)明化合物。達瑪化合物，例如上述的17α-達瑪化合物的藥用組合物可用任何已知方法或制劑領(lǐng)域常規(guī)方法制備，例如通過將本發(fā)明化合物與適當?shù)乃幬锷峡山邮艿南♂寗┗蜉d體包括藥物或可注射用水緊密混合。如前所述，含有達瑪化合物如17α-達瑪化合物的藥物組合物宜含有純的或基本純的達瑪化合物，例如純的或基本上純的單一差向異構(gòu)體形式的達瑪化合物。根據(jù)上述，本發(fā)明還提供f)藥物組合物，含有達瑪化合物，如上述17α-達瑪化合物，例如式I，IA，IB或IC化合物，及與其結(jié)合的藥物上可接受的稀釋劑或載體。本發(fā)明進一步通過以下實施例說明，其中涉及附圖附圖1為用Palmyrah粉末提取物樣品和對照樣品進行的延遲型超敏(DTH)試驗結(jié)果圖；附圖2為在實施例1中分離的化合物的質(zhì)子NMR譜；附圖3為在實施例1中分離的化合物的13C-NMR譜。實施例實施例1式IC化合物的分離和鑒定初步研究-將4等份，每份10gPalmyrah嫩枝粉(BorassusflabelliferL.)用200ml下列溶劑萃取，以確定適合的萃取方法。-乙酸乙酯(A)-石油醚(B)-甲醇(C)-水(D)-將1等份600g用索格利特提取器和己烷(沸點60-70℃)萃取16小時，隨后用沸騰的二氯甲烷萃取16小時。真空蒸發(fā)后產(chǎn)生1.1639g己烷萃取物(E)和0.335g二氯甲烷萃取物(F)。將各部分溶于乙醇并用Mishell-Dutton鑒定(體外對SRBC的初級體液免疫響應(yīng)，MD)進行混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)和P-815肥大細胞瘤細胞系的細胞毒性試驗。萃取物試驗結(jié)果萃取物A，B和E體外對于活化的淋巴細胞顯示抑制活性(上述MD試驗8)，其中萃取物A)活性最大(IC50約在低于1∶4000稀釋度的濃度)?；钚宰畹偷牟糠质禽腿∥顴(IC50約在1∶200稀釋度)。在P-815肥大細胞瘤試驗(上述試驗3)中毒性最低的是萃取物B。但是，活性與毒性比最佳的是萃取物A)，在抑制混合淋巴細胞反應(yīng)(上述試驗1)中活性最大。所得結(jié)果見下面表1，2和3。表1.初級體液免疫應(yīng)答(MD)表2.混合淋巴細胞反應(yīng)<表3.肥大細胞瘤(細胞毒性試驗對各種萃取物亦進行體內(nèi)延遲型超敏反應(yīng)(上述試驗9)評價，以得到用于確定哪些萃取劑應(yīng)用于大規(guī)模萃取的附加信息。為此，將等分萃取物(從10g粉末中提取的)在注射抗原1小時前給5只小鼠口服一次。注射抗原后觀察24小時反應(yīng)。將環(huán)孢菌素A作為陽性對照。結(jié)果如圖1所示。只有A/B萃取物(萃取物A和B結(jié)合)在體內(nèi)顯示出明顯的抑制活性。萃取物A(乙酸乙酯)在體外和體內(nèi)顯示最有希望的效果，因此乙酸乙酯被選擇用于大規(guī)模萃取。式IC化合物的分離和鑒定將50kgPalmyrah粉末(BorassusflabelliferL.)分成5×10kg，每份用20L乙酸乙酯在室溫萃取，1小時后過濾。用15L乙酸乙酯重復(fù)上述步驟。將合并的濾液(175L)真空濃縮，得到95.5g棕色油狀殘余物。將其在90％甲醇水溶液(500ml)和己烷(1L)溶劑系統(tǒng)中分配3次，將下層真空蒸發(fā)后得到19.8g固體粗品。將該固體裝入約有2kg硅膠60的8×35cm柱子上，用甲基-叔丁基醚/甲醇混合物進行色譜分離，甲醇含量逐步從2％增加至50％。收集主要在MLR試驗中具有活性的3個流分1，2，和3(每個450ml)。將流分2和3(1.92g)再裝入5.5×36cm的硅膠柱上，用己烷/丙酮混合物洗脫，丙酮含量逐步從20％增加至50％。將從該柱得到的22個流分進行TLC鑒定，并將該生物活性流分與在上述色譜步驟中保留的MLR活性流分1(0.28g)合并。下一個純化步驟是在SephadexLH-20柱(5×85cm)上用二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脫并用UV在220nm監(jiān)測，得到6個生物活性流分，為809mg產(chǎn)物。將該產(chǎn)物在SpherisorbODS-2RP18(5μm)的20×250mm柱上再進行3個等程制備性HPLC。使用線性(70％-＞100％)梯度的乙腈/甲基-叔丁基醚(9∶1)的水溶液，并且用UV在220nm監(jiān)測回收流分。收集6個MLR活性流分(32mg)并在上述HPLC柱上如上述分離，用甲醇/水/甲基叔丁基醚(7∶2∶1)同一混合物進行洗脫，在220nm監(jiān)測，得到7個活性流分，共9.3mg。將此步驟在相同HPLC柱上重復(fù)，用同一乙腈/水(87∶13)洗脫并在220nm監(jiān)測。監(jiān)測到4個活性流分(1.3mg)。將一份100μg的上述流分在LiChrospherRP18(5μm)的4×250mmHPLC柱上進行最后分離，用乙腈(1.5ml/min)洗脫。根據(jù)同時在220nm和240nm進行二極管矩陣UV監(jiān)測收集流分。在幾個波長時，在具有單和純HPLC峰的流分中顯示具有MLR活性，其保留時間約為11.6分鐘。用完全相同的方法，用11等份100μg流分測定上步驟的其余活性(1.1mg)。收集和濃縮單峰流分后得到0.5g白色無定形化合物。該化合物的性質(zhì)和物理特性列于下面表4。測定該分離的化合物在鼠混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)(試驗1)和Jukat和P-815細胞毒性/抑制細胞生長活性(試驗3)中的活性，并與相同試驗中環(huán)孢菌素A和silicicolin的活性比較。所得結(jié)果列于下面表5。表4性質(zhì)1.外觀無色粉末2.質(zhì)譜(FAB)m/e＝443(MH+)3.分子式C30H50O24.UV光譜(MeOH)末端吸收5.質(zhì)譜NMR，500MHz，CDCl3，見附圖2，CHCl3為內(nèi)標6.13C-NMR，125.7MHz，CDCl3，見附圖3，CDCl3為內(nèi)標7.溶解性溶于氯仿和甲醇，不溶于水8.HPLCa(Rt)11.6分鐘aMerckLiChrospher100RP-18(5μm)，4×250mm；乙腈，1.5ml/分鐘；用Waters996發(fā)光二極管矩陣檢測器在210nm檢測。表5分離的化合物與環(huán)孢菌素A和Silicicolin體外生物活性比較IC50(ng/ml)</tables>環(huán)孢菌素A用作參考免疫抑制劑Silicicolin用作參考細胞生長抑制劑實施例2(17α)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇(式IC化合物)的合成a)操作步驟1，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17α-乙酰基-六去甲-達瑪烷在氬氣下，用25.0g叔丁基二甲基氯代硅烷處理12.0g化合物A(Phytochemistryloc.cit.)和13.6g咪唑的450ml二甲基甲酰胺中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌過夜，用乙醚稀釋并用5％碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。用硫酸鈉干燥有機相并減壓除去溶劑。二氧化硅色譜分離(己烷/乙酸乙酯)得到標題化合物B為白色泡沫狀物。Rf(二氧化硅)0.53(己烷/乙酸乙酯9∶1)1H-NMR(CDCl3)特征峰3.15(1H，dd，J＝5/12，H-C(3))，2.65-2.45(1H，m，H-C(17))，2.10(3H，s，H3CCO).b)操作步驟2，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17-乙酰基-六去甲-達瑪烷-烯醇乙酸酯將1.0g對甲苯磺酸水合物的乙酐(200mL)溶液加熱至140℃30分鐘。室溫加入3.0g化合物B并將反應(yīng)混合物加熱至140℃3小時。在反應(yīng)過程中慢慢蒸出乙酸。減壓濃縮反應(yīng)混合物至約100mL，用乙醚稀釋并用冷的5％碳酸氫鈉水溶液萃取。用硫酸鈉干燥有機相并減壓除去溶劑?？焖俣趸枭V分離(己烷/乙酸乙酯，95∶5)得到標題化合物C為白色固體(兩種非對映異構(gòu)烯醇乙酸酯的混合物)。Rf(二氧化硅)0.41(己烷/乙酸乙酯9∶5)1H-NMR(CDCl3)特征峰3.15(1H，dd，J＝5/12，H-C(3))，2.50-2.00(3H，m，H-C(13)，H2-C(16))，2.07和2.06(3H，s，非對映異構(gòu)H3CCOO).c)操作步驟3+4，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17β-乙酰基-六去甲-達瑪烷在0℃和氬氣下，用3.75mL1.6M甲基鋰的乙醚溶液處理445mg化合物C的無水乙醚(10mL)溶液。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時，冷卻至-78℃并用150mg水楊酸甲酯處理。將反應(yīng)混合物在-78℃攪拌30分鐘，用水處理并用乙醚萃取。用硫酸鈉干燥有機相并減壓除去溶劑。二氧化硅色譜純化(己烷/乙酸乙酯，4∶1)得到標題化合物D為白色泡沫狀物。Rf(二氧化硅)0.34α-酮，0.26β-酮(己烷/乙酸乙酯95∶5)1H-NMR(CDCl3)特征峰3.15(1H，dd，J＝5/12，H-C(3))，3.00-2.94(1H，m，H-C(17))，2.11(3H，s，H3CCO).d)操作步驟5，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-20-三氟甲磺酰氧基-17α-六去甲-達瑪-20-烯在-78℃和氬氣中，將4.0mL二(三甲基甲硅烷基)氨化鉀溶液(15％的甲苯溶液)加到化合物D(236mg)的THF(四氫呋喃)(25mL)溶液中。將反應(yīng)混合物溫熱至5℃，在該溫度攪拌0.5小時然后冷卻至-30℃，快速加入在10mLTHF中的1.25gN-苯基三氟甲磺酰亞胺。將反應(yīng)混合物溫熱至0℃，在0℃攪拌5分鐘，倒入pH7的緩沖液中并用乙醚萃取三次。用硫酸鈉干燥合并的乙醚相，蒸發(fā)至干并在二氧化硅上色譜純化(乙醚/己烷3∶97)得到標題化合物H(203mg；67％)為無色結(jié)晶。1H-NMR(360MHz，CDCl3)；特征峰2.85-2.94(bq，1H，βH-C(17)；3.20(dd，1H，αH-C(3))；5.12(bd，1H，J＝4，Ha-C(21)；5.20(d，1H，J＝4Hz，Hb-C(21).e)操作步驟6，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-20-三-正丁基甲錫烷基-17α-六去甲-達瑪-20-烯在-78℃和氫氣中，將44mL正丁基鋰溶液(1.6N的己烷溶液)加到3.15gCuCN的THF(200mL)懸浮液中。在-50℃攪拌10分鐘后，在-78℃用18.6mL正-Bu3SnH處理所得綠色溶液。10分鐘后加入在30mLTHF中的2.14g三氟甲磺酸乙烯基酯并將反應(yīng)混合物在-78℃攪拌10分鐘，劇烈攪拌下倒入25％NH4Cl/己烷(0.751/0.5l)水溶液，濾出沉淀，用己烷萃取三次。將合并的有機相用Na2SO4干燥，蒸發(fā)至干并用二氧化硅色譜純化(己烷)，得到標題化合物J(53％)為無色粘稠油狀物。1H-NMR(360MHz，CDCl3)；特征峰2.82-2.92(bq，1H，βH-C(17)；3.14(dd，1H，αH-C(3)；5.18(bs，1H，H-C(21)；5.80(bs，1H，H-C(21).f)操作步驟7，流程A3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17α-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-25-醇在室溫將24mgPd(CH3CN)2C12在0.3mLH2O和12mLDMF中的溶液加到0.4g2，2-二甲基-3-乙烯基環(huán)氧乙烷(Tetrahedron，1989，45，979)和1.36g化合物J的THF(12mL)溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌過夜。將微混的黃色溶液倒入水中并用乙醚萃取。用Na2SO4干燥合并的有機相并蒸發(fā)至干得到標題化合物K為黃色蠟狀固體，不用純化直接用于下-步。g)操作步驟8，流程A(17α)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇用100mL氟化四丁基銨(1MTHF溶液)在60℃處理1.45g化合物K的THF(60m1)溶液1.5小時。將反應(yīng)混合物倒入1L半飽和的NaHCO3水溶液中并用乙醚萃取。用Na2SO4干燥合并的有機相，蒸發(fā)至干并用二氧化硅色譜純化(丙酮/乙醚/己烷；5/40/55)，得到670mg達瑪二烯二醇L(兩步共83％)為無色結(jié)晶。將樣品用乙醚/己烷重結(jié)晶。M.p.90.6-91.4°C.[α]58925＝-7.45°.[α]30225＝-119.2°.[α]29625＝-109.5°.[α]28025＝-38.7°；(EtOH，c＝1.06).該合成物質(zhì)的1H-NMR譜與從Palmyrah嫩枝粉(BorassusflabelliferL.)中分離出的天然化合物的一致。1H-NMR(360MHz，CDCl3)ppm0.73(bd.1H，J＝12.5and1.3；H-C(5))；0.78(s，3H，H-C(28))；0.85(s，3H，H-C(19))；0.90(s，3H，H-C(30))；0.95(s，3H，H-C(18))；0.98(s，3H，H-C(29))；1.33(s，6H，H-C(26，27))；1.19-1.74(m，15H，H-C(1，2，6，7，9，11，12，15))；1.75-1.84(m，2H，H-C(16))；1.98-2.05(m，1H，H-C(13))；2.59-2.64(m，1H，βH-C(17))；2.66(bd，1H，J＝6.3Hz，H-C(22))；2.79(bs)，2.82(dd，1H，H-C(22))；3.18-3.23(m，1H，αH-C(3))；4.88(s，1H，H-C(21))；4.95(s，1H，H-C(21))；5.59-5.62(m，2H，H-C(23，24)).實施例2’以化合物A為起始原料，用類似實施例2步驟a)和d)到g)的方法制備化合物(17β)-23E-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇。該產(chǎn)物的物理數(shù)據(jù)如下面實施例3所述。實施例3(17β)-23E-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇(式IC化合物的β差向異構(gòu)體)的合成a)操作步驟9，流程B3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17β-乙?；?六去甲-達瑪烷-三異丙基苯磺酰腙(tristylhydrazone)在室溫用150μL濃鹽酸處理1.6g化合物B(如實施例2a中制備)和3.3g2，4，6-三異丙基苯磺酰肼的乙腈(50mL)懸浮液。將該懸浮液在室溫攪拌30分鐘，用乙醚稀釋并用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機層用硫酸鈉干燥并減壓除去溶劑。二氧化硅色譜分離(己烷/乙酸乙酯，4∶1)得到標題化合物E為白色非晶型泡沫狀物(e/z非對映異構(gòu)體混合物)。Rf(二氧化硅)0.61(己烷/乙酸乙酯，4∶1)1H-NMR(CDCl3)特征峰7.24和7.12(3H，s，H-C(arom.))，4.22-4.08(2H，m，H-C-C(arom.))，3.15-3.05(1H，m，H-C(3))，2.92-2.78(1H，m，H-C-C(arom.))，2.35-2.22(1H，m，H-C(17))，1.67(1H，s，H3CCN).b)操作步驟10+7，流程B3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17β-23(E)-達瑪-20，23-二烯-25-醇在-78℃和氫氣中，用0.5mL1.6M丁基鋰的己烷溶液處理161mg化合物E的無水乙醚(5mL)溶液。在-20℃攪拌該黃/棕色溶液直到氣體完全放出。在-78℃加入15mg氰化亞銅后，加入160uL1，1-二甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙烷并將反應(yīng)混合物在-20℃攪拌2小時。用乙醚稀釋反應(yīng)混合物并用飽和氯化銨水溶液(pH＝9)處理。用硫酸鈉干燥有機相并減壓除去溶劑得到190mg無定形固體。該物質(zhì)直接用于除去甲硅烷基保護基，無需純化。c)操作步驟8，流程B(17β)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇在氫氣中，用1mL1M氟化四丁基銨的THF溶液處理190mg甲硅烷基醚F的無水THF(5mL)溶液。將反應(yīng)混合物在50℃攪拌12小時，用乙醚稀釋并用碳酸氫鈉水溶液萃取。除去溶劑并二氧化硅色譜分離(己烷/乙酸乙酯，4∶1)得到35mg標題化合物為白色結(jié)晶產(chǎn)物。1H-NMR(CDCl3)特征峰5.60-5.50(2H，m，H-C(23+24))，4.70(1H，s，H-C(21))，4.62(1H，s.H-C(21))，3.13(1H，dd，J＝5/12，H-C(3))，2.65-2.55(2H，m，H-C(22))，2.18-2.12(1H，m，H-C(17)).實施例3’以實施例2c)的化合物D為起始原料，用類似實施例3的步驟a)到c)的方法，即通過以下中間體-3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17α-乙酰基-六去甲-達瑪烷-三異丙基苯磺酰腙；及-3β-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-17α-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-25-醇制備化合物(17α)-23E-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇。該產(chǎn)物的物理數(shù)據(jù)如上面實施例2所述。如上所述，本發(fā)明所用達瑪化合物的劑量將依據(jù)給藥途徑，欲治療的疾病，特別是，所用的具體達瑪化合物而變化。根據(jù)前述試驗9和10測定的式IC的17-α達瑪化合物，及其17β-差向異構(gòu)體[(17β)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇]的ED50值，以及已知的消炎/免疫抑制劑環(huán)孢菌素A的典型結(jié)果如下表所示</tables>因此，用于消炎和免疫抑制，例如用于自身免疫性疾病治療的口服劑量應(yīng)為-對于式IC化合物，其用量為環(huán)孢菌素A的千分之一至萬分之一，例如，約0.4或0.5至4.0或5.0μg/kg/天。-對于式IC化合物的17β-差向異構(gòu)體，其用量為環(huán)孢菌素A的1/4至1/10，例如，約0.4或0.5至1.0或1.25mg/kg/天。權(quán)利要求1.用作藥物的達瑪化合物。2.一種藥物組合物，含有達瑪化合物及藥物上可接受的稀釋劑或載體。3.達瑪化合物在制備用作免疫抑制劑或消炎藥的治療藥物方面的用途。4.一種對需要免疫抑制或消炎治療的患者進行治療的方法，包括給所述患者施用有效量的達瑪化合物。5.權(quán)利要求1的化合物，權(quán)利要求2的組合物，權(quán)利要求3的用途或權(quán)利要求4的方法，其中達瑪化合物為式IA化合物，其中a是＞CH-OR1，其中R1是氫或生理上可裂解及可接受的?；?，或是＞C＝O，和R為任意含有1或2個雙鍵及任意被至少1個羥基取代的C8脂族基團。6.17α-達瑪化合物。7.式IB化合物，其中a和R如權(quán)利要求5中定義。8.式IC化合物[(17α)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇]或其生理上可水解及可接受的酯。9.NMR譜與附圖2或3所示的NMR譜有相同特征的化合物。10.權(quán)利要求1的化合物，權(quán)利要求2的組合物，權(quán)利要求3的用途或權(quán)利要求4的方法，其中達瑪化合物為權(quán)利要求6-8之任一項中定義的化合物。11.17α羰基-達瑪化合物。12.根據(jù)權(quán)利要求11的式XIIb化合物，其中a”為游離的或保護的＞CH-OH或＞C＝O，并且取代基在17位，R2CO-為?；?。13.17(有機金屬-C)-或17(堿金屬-C)-達瑪化合物。14.根據(jù)權(quán)利要求13的式XIIIa化合物，其中a”如權(quán)利要求11中定義，Z為堿金屬原子或有機金屬基團。15.如權(quán)利要求13的化合物，其中Z為鋰或三烷基錫。16.一種制備17α-達瑪化合物的方法，該方法包括a)差向異構(gòu)化17β羰基-達瑪化合物得到17α羰基-達瑪化合物，及如果需要，b)利用前述任何技術(shù)、方法或過程進一步衍生化所述17α羰基-達瑪化合物。17.一種制備17C-達瑪化合物的方法，該方法包括將17羰基-達瑪化合物，如果需要，使用保護形式，與親電子試劑偶合，并且如果需要，除去保護基或功能基。全文摘要具有免疫抑制和消炎活性的達瑪化合物，該化合物可用作藥物，特別是用作免疫抑制劑和消炎藥。17α-達瑪化合物是新的，而且本身包括，例如，式IC化合物[(17α)-23-(E)-達瑪-20，23-二烯-3β，25-二醇]，該化合物可從Palmyrah棕櫚(BorassusflabelliferL.)的嫩枝粉中獲得。另外，本發(fā)明還公開了該化合物和其它達瑪化合物及其中間體的合成方法。文檔編號A61K31/565GK1154113SQ95194373公開日1997年7月9日申請日期1995年7月24日優(yōu)先權(quán)日1995年7月24日發(fā)明者P·希斯坦德,R·內(nèi)夫,H·U·內(nèi)格利,L·奧伯爾,L·雷韋斯,H·J·羅思申請人:山道士有限公司