專利名稱：：具有雙涂層的含鐵納米級顆粒及其在診斷和治療中的應(yīng)用，的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有單元結(jié)構(gòu)的含鐵納米級顆粒、它們的制備及其在診斷和治療中的應(yīng)用。一種物質(zhì)，由于熱能抵消了自發(fā)磁化Weiss’磁疇的永久排列(permanentalignment)，即使在低場強(qiáng)下也能顯示最大磁化(高飽和磁化)，而且在外部磁場關(guān)閉后沒有剩余磁感應(yīng)，這種物質(zhì)被稱為超順磁物質(zhì)。這類物質(zhì)包括研制成非腸道磁共振(MR)對比材料的含鐵晶體。所述物質(zhì)的特性是其對質(zhì)子弛豫時(shí)間的強(qiáng)沖擊以及在診斷步驟中用作對比介質(zhì)的巨大效力。在醫(yī)學(xué)診斷學(xué)中，檢查超順磁物質(zhì)的重點(diǎn)放在了具有在磁鐵礦或磁赤鐵礦(尖晶石、反向尖晶石)發(fā)現(xiàn)的“磁鐵礦類”晶體結(jié)構(gòu)的氧化鐵上。由于用作磁共振對比材料的超順磁氧化鐵強(qiáng)烈地影響著近距離的質(zhì)子弛豫(高弛豫)，而且它們是具有“磁鐵礦類”晶體結(jié)構(gòu)的顆粒，所以它們具有類似的性能。已經(jīng)公開了許多方法用于制備具有超順磁性能的含鐵晶體(氧化鐵)，這些方法可根據(jù)各個方面進(jìn)行分類，有兩種制備超順磁晶體的基本方法是可以區(qū)分的在高溫下燒結(jié)，再機(jī)械粉碎；或者溶液中的濕法化學(xué)合成。迄今為止，只有由濕法合成制備的那些顆粒被研制為醫(yī)用，而燒結(jié)方法被描述為制備用于技術(shù)(聲音載體、顏料和有機(jī)調(diào)色劑)和生物技術(shù)應(yīng)用如磁分離方法[SchostekS，BeerA；DE3,729,697A1；BorelliNF，LudererAA，PanzarinoJN；US4,323,056；OsamuI，TakeshiH，ToshihiroMetal.；JP60,260,463A2]的氧化鐵。濕法化學(xué)合成可分成小類。有一種“兩罐合成法”，該方法首先制備含鐵核(氧化鐵)，再加入穩(wěn)定劑以保證其物理和蓋倫試劑性質(zhì)。利用離子交換劑制備鐵核是“兩罐合成法”的衍生。在“一罐合成法”中，氧化鐵是在穩(wěn)定劑存在系下制備的，所述穩(wěn)定劑已在成核和氧化鐵沉淀過程中涂在了核上，因此預(yù)防了毫微晶體的聚集和沉淀。在所述方法中，除了“兩罐”和“一罐”的分類方法，還有一種基于所用溶劑類型的分類方法，被稱為水法[HasegawaM，HokukokuS；US4,101,435；FujiRebioK.K.；JP59,195,161]和非水法[PorathJ，MatsL；EP179,039A2；ShigeoA，MikioK，ToshikatzuM；J.Mater.Chem.2(3)；277-280；1992；NorioH，SaturoO；JP05,026,879A2]。使用非水溶劑在“兩罐”方法中制備的顆粒主要在工程上使用。由于醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)原因，用作人體診斷對比材料的磁性氧化鐵需要水分散劑。對于在非水溶劑中制備且在制備后分散到水介質(zhì)中時(shí)是穩(wěn)定的那些顆粒，在這種分類中有特殊的位置。目前這類顆粒一般用在體外診斷如磁分離工程中[ChagnonMS，GromanEV，JosephsonL，etal.；US4,554,088]，但已有建議用于體內(nèi)診斷中[PilgrimmH；US5,160,725]。由“兩罐”法制備的顆粒主要用在早先直至二十世紀(jì)中葉的實(shí)驗(yàn)檢查中，而當(dāng)今涉及氧化鐵的試驗(yàn)僅僅是為由“一罐合成法”制備的材料描述的。基于物理和化學(xué)性質(zhì)以及藥物/蓋倫試劑穩(wěn)定性，由于由“一罐”法制備的超順磁含鐵氧化物優(yōu)于“兩罐”法，所以“一罐”法已被普遍接受用于制備人體診斷應(yīng)用的超順磁含鐵氧化物的制備。根據(jù)“一罐法”在水合介質(zhì)中制備的顆粒的藥物穩(wěn)定懸浮液/溶液可再分為不同尺寸的氧化鐵。毫米范圍的顆粒可用于生物技術(shù)[SchroderU，MosbachK；WO83/01738或SchroderU；WO83/03426]，甚至要求保護(hù)其在體內(nèi)診斷和治療方面的應(yīng)用[WidderKJ，SenyeiAE；US4,247,406或JacobsenT，KlavenessJ；WO85.043301]。然而，對于在醫(yī)學(xué)診斷中的方法，納米范圍的顆粒是目前公開的主要顆粒。根據(jù)優(yōu)選的用途，此范圍也可再分為“大顆粒”(總體顆粒直徑大約＞50nm)和“小顆?！?總體顆粒直徑大約＜50nm)。肝和脾的磁共振診斷是主要的應(yīng)用領(lǐng)域，這是由于這種尺寸的顆?？裳杆俨缀跬耆贿@些器官的大噬菌體溶解[KresseM，PfeffererD，LawaczeckR；EP516,252A2或GromanEV，JosephsonL；US4,770,183]。進(jìn)一步地，已有建議將其用作臨床高溫治療中的增強(qiáng)物質(zhì)[HasegawaM，HiroseK，HokukokuS，etal.；WO92/22586A1和GordonRT；US4,731,239]。目前，幾乎所有的醫(yī)用顆粒都是氧化鐵，這種氧化鐵是在葡聚糖用作穩(wěn)定物質(zhì)[BacicG，NiesmannMR，MaginRLetal.；SMRM-Bookofabstracts328；1987；OhgushiM，NagayamaK，WadaAetal.；J.MagneticResonance29；599-601；1987；PouliquenD，LeJeuneJJ，PerdrisotRetal.；MagneticResonanceImaging9；275-283；1991或FerrucciJT，StarkDD；AJR155；311-325；1990]條件下制備的，但是，也公開了使用其它多糖，例如阿拉伯半乳聚糖[JosephsonL，GromanEV，MenzEetal.；MagneticResonanceImaging8；616-637；1990]、淀粉[FahlvikAK，HoltzE，SchroderUetal.；Invest.Radiol.25；793-797；1990]、葡糖氨基聚糖[PfeffererD，SchimpfkyC，LawaczeckR；SMRM-Bookofabstracts773；1993]或蛋白質(zhì)[WidderDJ，GriefWL，WidderKJetal.；AJR148；399-404；1987]。合成的具體條件如所涉及的鐵鹽、溫度、涂層聚合物(穩(wěn)定劑)、滴定速率、堿的選擇、純化等影響著產(chǎn)品的化學(xué)和物理性能，因而影響其藥物和蓋倫試劑性質(zhì)以及醫(yī)用價(jià)值。在研制中，引起特定應(yīng)用的有效使用的重要步驟是由Weissleder和Papisov完成的[WeisslederR；PapisovMI；ReviewsofMagneticResonanceinMedicine4；1-20；1992]，他們能揭示磁性氧化鐵的“靶向能力”與顆粒大小成反比。這方面的問題就在于效力(磁共振效果)隨著顆粒大小的減小而降低的事實(shí)。近來已經(jīng)公開了在沒有任何分級步驟的條件下制備尺寸特別小的磁性氧化鐵[HasegawaM，ItoY，YamadaH，etal.；JP4,227,792]。對于尺寸特別小的顆粒，關(guān)于“功能性成像”的實(shí)驗(yàn)被稱為MIONs。利用高碘酸鹽氧化所述顆粒的葡聚糖涂層(磁性標(biāo)簽)，然后與特定的分子(抗肌漿球蛋白；多克隆抗體)偶合[WeisslederR，LeeAS；KhawBAetal.；Radiology182；381-385；1992，或WeisslederR，LeeAS，F(xiàn)ishmanAetal.；Radiology181；245-249；1991]。Menz等人研制了一種特殊的方法[MenzET，RothenbergJM，GromanEV，etal.；WO90/01295]，他們利用具有生物因子細(xì)胞的聚合物(阿拉伯半乳聚糖)涂布大的納顆粒，他們要求保護(hù)如Gordon[GordonRT；US4,735,796]的通過受體媒介的細(xì)胞攝粒作用的特殊吸附機(jī)理；Gordon利用高碘酸鹽氧化葡聚糖穩(wěn)定的顆粒，然后通過還原胺化，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白偶合。用作肝脾磁共振診斷對比材料的“大顆粒”超順磁氧化鐵的制備是本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，所述材料的診斷利益已被證實(shí)。這些氧化鐵中的部分已被研制成臨床目的[AMI-25；AdvancedMagneticsInc.；Cambridge；Mass.；USA；PhaseIII/IVandSHU555A；ScheringAGBerlin；Germany；PhaseII]。用于特定(肝外的)方法如磁共振淋巴系造影術(shù)或磁共振血管造影術(shù)的氧化鐵水壓直徑(hydrodynamicdiameter)的重要性是已知并且被檢驗(yàn)過的。在血液中的半衰期隨著顆粒直徑的減小而增加，否則是相等的。制備小顆粒氧化鐵的合成方法可從文獻(xiàn)中得知。在研制基于超順磁氧化鐵的特殊對比材料中遇到的基本問題在于在沒有可接受的物理和化學(xué)參數(shù)共同缺陷的條件下，還不可能改善靶向性能，即在靶向器官中的聚集和分布，這是因?yàn)樽钸m用于制備靶向目的的含鐵核的穩(wěn)定劑非常有限。另外，盡管合成后的物質(zhì)必須保留一些靶向性能(生物活性)，但是所有重要且非常特別的分子(蛋白質(zhì)、肽、低核苷酸，還有多數(shù)低聚糖和多糖)不能用作制備相中的穩(wěn)定劑，所以合成過程中的反應(yīng)條件(酸堿pH、溫度、涉及鐵鹽的氧化還原反應(yīng))降低了潛在穩(wěn)定劑的選擇。從至今使用的(化學(xué))“鈍感”聚合物，主要是葡聚糖，可以知道，合成條件中存在著各種非控制性反應(yīng)，例如pH酸性范圍內(nèi)的解聚反應(yīng)(例如在工業(yè)質(zhì)量中由酸解生產(chǎn)低分子量葡聚糖)，以及在堿性范圍(沉淀步驟)內(nèi)可能破壞(糖-)聚合物的各種其它反應(yīng)?？紤]到糖化學(xué)和所需的反應(yīng)條件，可以設(shè)想因?yàn)楸M管葡聚據(jù)用于穩(wěn)定，但在合成后卻不留下任何葡聚糖，所以現(xiàn)有技術(shù)中的“葡聚糖磁鐵礦”根本就不是葡聚糖磁鐵礦。如果從藥物和贊賞觀點(diǎn)來觀察，這就意味著基本成分-由于穩(wěn)定劑形成涂層，因此穩(wěn)定劑很大程度上確定了生物性能-是未知或未公開的。所導(dǎo)致的另一實(shí)際問題在于如果表面本身未知，那么在將來的研制中將不能優(yōu)化表面性能。利用已深刻研究過的如磁共振淋巴系造影劑的應(yīng)用可以表明，一方面由于使用葡聚糖作為穩(wěn)定劑(至今還沒有出版關(guān)于使用其它聚合物制備小顆粒氧化鐵的資料)的現(xiàn)有技術(shù)中的顆粒大小優(yōu)化使得顆粒聚集非常容易，所以這種大小優(yōu)化確實(shí)推動了應(yīng)用；但是另一方面，對于臨床應(yīng)用，其在淋巴結(jié)中的分布不夠均勻[Taupitz，Metal.；SMRM-Bookofabstracts500；NewYork；USA；1993]。這種有力卻是不均勻的聚集使得由重新優(yōu)化水力直徑的另一改性成為不大可能。靶向器官的小體積是研制特殊診斷物質(zhì)的重要問題，例如，淋巴結(jié)的總重量還不到體重的1％。因此診斷物質(zhì)必須主要集中在靶向組織中(特殊性)，而且在低濃度下具有強(qiáng)的對比-增強(qiáng)效果。由于超順磁氧化鐵當(dāng)今代表了在磁共振中具有最強(qiáng)對比性的物質(zhì)，所以這些顆粒特別適用于特殊應(yīng)用。然而，由于顆粒大小對生物性能具有本質(zhì)的影響，所以形成所述物質(zhì)特征的氧化鐵晶體核是一個問題。小顆粒大小能改善靶向能力，但是由于顆粒大小和磁矩的相互依賴，因此對比材料的效力降低了，從而必須尋求(物理)對比效果與(生物)靶向能力之間的折衷辦法。根據(jù)一般規(guī)則，為了達(dá)到高的效力，含鐵核應(yīng)當(dāng)盡可能地大，而總體直徑應(yīng)當(dāng)維持很小。本發(fā)明所涉及的問題是提供一種含鐵納米級顆粒，該顆粒利用優(yōu)化的特殊納米級顆粒能夠滿足物理和生物要求。令人驚奇的是，本發(fā)明納米級顆粒的靶向能力優(yōu)越于現(xiàn)有技術(shù)中的氧化鐵顆粒。對比材料和/或治療物質(zhì)/空前“靶向能力”的支持系統(tǒng)能夠通過結(jié)合物理性能與納米級顆粒的改性靶向能力而制得。納米級顆粒是由單個模具(單元設(shè)計(jì))制備的，這種方法保證了含鐵核(物理效應(yīng)；對比)與靶向成分(生物性能)結(jié)合時(shí)的最大靈活性。由于單元結(jié)構(gòu)允許由存放的(含鐵核)成分和可能是高感度的靶向分子“正好及時(shí)地”裝配完整的納米級顆粒，所以這種結(jié)合具有優(yōu)勢。這種與臨床放射藥物學(xué)中的感冒藥盒(coldkits)的相似性促進(jìn)了例如使用患者的血清成分作為靶向分子(如自身抗體)。由于本發(fā)明顆粒的強(qiáng)烈著色，因此也可通過眼睛檢測所述顆粒。上述著色是必要的，例如當(dāng)這種顆粒用作手術(shù)中的可見標(biāo)記物質(zhì)時(shí)。進(jìn)一步地，這里描述的納米級顆粒還可治療用途，例如用于在與活性物質(zhì)磁性連接釋放的結(jié)合靶體積之上利用外部磁鐵的磁性靶向探測中。納米級顆粒可聚集在如腫瘤中，因此該顆?？稍诰植扛邷刂杏米魈厥獾脑鰪?qiáng)劑。本發(fā)明的納米級顆粒含有含鐵核、形成優(yōu)化大小納米級顆粒的第一涂層(合成聚合物)和第二涂層(靶向聚合物)，以及任意的藥物助劑、藥物和/或吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑。含鐵核可以是顆粒、膠體或晶體形式。納米級顆粒包含由核制備的合成聚合物，該聚合物作為第一涂層涂布在核上，所述聚合物在控制物理和/或藥物/蓋倫試劑性能的制備中是需要的。然后通過解吸方法將合成聚合物與鐵的比例調(diào)節(jié)至所需的數(shù)值。對于在代表納米級顆粒表面且包圍核和第一涂層基本結(jié)構(gòu)單元的特殊診斷中，需要吸附靶向聚合物。為改善吸附，可在第一涂層與第二涂層之間存在吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑。納米級顆粒的其它成分可以是藥物助劑或藥物。圖1為本發(fā)明納米級顆粒的結(jié)構(gòu)剖面圖。所述基本結(jié)構(gòu)單元(含鐵核加上第一涂層)在溶液中的水力直徑小于100nm，且不大于5倍含鐵核直徑，優(yōu)選小于50nm。本發(fā)明納米級顆粒的進(jìn)一步特征在于其可以優(yōu)選的穩(wěn)定膠體溶膠形式得到，但是該顆粒也可以制成凍干粉，所述凍干粉能利用藥物中的普通溶劑(電解液、血漿膨脹劑、葡萄糖液、生理鹽水等等)溶成溶液；或在于基本結(jié)構(gòu)單元以及靶向成分和任意的助劑是分開的溶液或凍干劑，它們可在任何所需地點(diǎn)及時(shí)地混合而得到給藥的溶液。含鐵核的磁矩比鐵(II)或鐵(III)離子大。由于含鐵核的磁性，所以當(dāng)物質(zhì)用作磁共振X線體層照相術(shù)的對比材料時(shí)，含鐵核能促進(jìn)對比-增強(qiáng)效果；達(dá)到優(yōu)化對比效果必須是超順磁的或者至少含有超順磁部分。這就意味著所述核必須是晶體或多原子配合物(“顆粒”)，因?yàn)檫@種類型的磁力現(xiàn)象只發(fā)生在固體物質(zhì)中。本發(fā)明的含鐵核可以由磁鐵礦或赤鐵礦組成或含有磁鐵礦或赤鐵礦。所述核中至多有25％重量的鐵可由其它金屬離子替代。所述非鐵離子是順磁、抗磁或其二者混合。本發(fā)明納米級顆粒的進(jìn)一步特征在于含鐵核的由電子顯微鏡測量的直徑小于30nm，優(yōu)選小于15nm，該核含有至少50種金屬原子，其中至少90％含鐵核的顆粒直徑分布在平均0.7×至平均1.3×的范圍內(nèi)。納米級顆粒中合成聚合物的含量為存在的金屬離子總重量的0.01至1倍。優(yōu)選含量為總重量的0.25至0.75倍。單體或聚合物質(zhì)、或者這些物質(zhì)的混合物或衍生物、或者含官能團(tuán)的衍生物、或者另外取代且分子量小于100,000Da的衍生物均可以用作合成聚合物。優(yōu)選的物質(zhì)具有分子量小于10,000或5000Da。對于用作合成聚合物，葡聚糖或葡聚糖混合物和/或葡聚糖衍生物特別優(yōu)選。合成聚合物可在其分子中含有一個或幾個酸基或幾個官能團(tuán)，其中優(yōu)選含有N、S、P或O原子。用作靶向聚合物和合成聚合物的物質(zhì)或物質(zhì)的混合物可以相同或不同；由于靶向聚合物不曝露在合成及合成中的合成聚合物副反應(yīng)中，因此靶向聚合物保留其生物狀態(tài)。含鐵核和第一涂層的母體物質(zhì)確定了納米級顆粒的物理性質(zhì)，而靶向聚合物確定了納米級顆粒的生物性質(zhì)。納米級顆粒中所含的靶向聚合物重量為存在的金屬離子重量的0.5至50倍，優(yōu)選1至25倍。本發(fā)明的納米級顆?？珊形浇橘|(zhì)/增強(qiáng)劑，其量小于或等于所含金屬離子的總重量。這些吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑增強(qiáng)或使靶向聚合物吸附在含有含鐵核/(剩余)合成聚合物的基本結(jié)構(gòu)單元上。優(yōu)選的吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑為具有下述結(jié)構(gòu)或其部分結(jié)構(gòu)的肽RRTVKHHVN、RRSRHH或RSKRGR[氨基酸的單字母編碼]。包括所有納米級顆粒成分的水力直徑不大于10倍含鐵核直徑且不大于1.2倍基本結(jié)構(gòu)單元直徑。本發(fā)明的納米級顆粒包括單個單元如能隨時(shí)組合的基本結(jié)構(gòu)單元、靶向聚合物、藥物和吸附介質(zhì)。納米級顆粒制劑是納米范圍的穩(wěn)定含鐵核顆粒的低粘性水合膠體溶液或懸浮液。納米級顆粒溶液不含有任何更大的聚集體并可通過靜脈內(nèi)給藥，該制劑能夠滿足國際藥典中的非腸道給藥要求。一般地，基本結(jié)構(gòu)單元可通過加熱處理進(jìn)行無菌化。最終納米級顆粒的“無菌化”方法取決于第二涂層的敏感度，但是無論在何種情況下，消毒和無菌制備都是有保證的。由于顆粒的尺寸很小，所以過濾無菌化總是可行的。另一種保證實(shí)際上無菌的給藥溶液的方法是將敏感的靶向聚合物與無菌基本結(jié)構(gòu)單元在使用前很短的時(shí)間內(nèi)結(jié)合。當(dāng)用作如磁共振對比介質(zhì)時(shí)，納米級顆粒是非常有耐藥力的，而且在診斷與致命劑量之間具有非常滿意的安全界限。依賴于特殊應(yīng)用的診斷劑量為每千克體重5μmol至200μmol(鐵)，而致命劑量大約為每千克體重(小鼠)20mmol至50mmol。物質(zhì)是完全生物降解的。溶解含鐵核，然后將鐵引入生理鐵池。用作合成和靶向的聚合物能通常降解代謝分解成基本單元(糖、氨基酸)。納米級顆粒溶液非常穩(wěn)定，在制成制劑后測不出物理參數(shù)(顆粒大小、磁性性能)的變化。當(dāng)在無菌條件下制成制劑時(shí)，溶液可保存很長一段時(shí)間；例如，在12個月時(shí)間內(nèi)觀察不到不穩(wěn)定現(xiàn)象如聚集或沉淀。由于含鐵晶體具有很強(qiáng)的顏色，使用所述溶液或懸浮液具有微紅褐至黑的顏色。這種特征顏色可用于可見監(jiān)測，從而所述物質(zhì)可用于外科藥物中的標(biāo)記。當(dāng)用作磁共振X線體層照相術(shù)中的對比介質(zhì)時(shí)，納米級顆粒為超順磁或含有超順磁部分。即使在低磁場強(qiáng)度下，該顆粒也能顯示出高的飽和磁化，而且在外磁關(guān)閉后沒有剩余磁感應(yīng)。納米級顆?？芍瞥扇芤?懸浮液)，能在不進(jìn)行進(jìn)一步制備下應(yīng)用。由于納米級顆粒與常用醫(yī)用溶劑如生理鹽水、電解質(zhì)溶液或葡萄糖溶液相容，所以該顆?？筛鶕?jù)需要稀釋，并可為特殊應(yīng)用而注射或灌輸。從存放的觀點(diǎn)出發(fā)，凍干粉是制成溶液的另一種制劑。將基本結(jié)構(gòu)單元凍干，然后再懸浮在溶解的靶向聚合物中，或者在吸附之后，將基本結(jié)構(gòu)單元和納米級顆粒凍干，然后在使用之前將其再溶解在生理鹽水或注射用無菌水中。另一種儲存所述物質(zhì)的方法是將基本結(jié)構(gòu)單元和靶向聚合物分別存放在溶液中，在使用之前混合。特殊或膠體含鐵核是通過變換，由單分子溶解的鐵前體制得的，接著一罐合成，調(diào)節(jié)pH值，使其在穩(wěn)定劑物質(zhì)(合成聚合物)存在下沉淀。在制備中，合成聚合物分離了晶體核，故可用于控制顆粒大小。合成聚合物不但決定了晶體核的物理和藥物/蓋倫試劑性能，而且決定了整個納米級顆粒的物理和藥物/蓋倫試劑性能。因?yàn)樗龊朔蛛x到了不存在聚集的程度(無菌穩(wěn)定)，所以合成聚合物促進(jìn)了溶液的穩(wěn)定(懸浮液)。當(dāng)獲得含鐵核顆粒時(shí)，通過吸附調(diào)節(jié)合成聚合物，從而給出合成聚合物與鐵的比例。鐵核和作為第一涂層包圍和穩(wěn)定含鐵核的合成聚合物殘留物的溶液(懸浮液)代表了單元系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)單元?；窘Y(jié)構(gòu)單元的特征在于其高的物理和蓋倫試劑性能。第二重要的成分是合成后被基本結(jié)構(gòu)單元吸附且作為第二涂層包圍核和第一涂層的靶向聚合物。第二涂層是納米級顆粒的表面，該涂層決定了體內(nèi)性能?；窘Y(jié)構(gòu)單元和靶向聚合物可在任何時(shí)間混合，也可進(jìn)行“正好及時(shí)”的制備。合成聚合物殘留物和靶向聚合物之間的吸附方法可通過中間步驟得到改性或提高加入吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑。吸附介質(zhì)/增強(qiáng)劑也可加入到含靶向聚合物的混合物中。藥物助劑或藥物可按類似的方法在任何時(shí)間加入。本發(fā)明的特殊優(yōu)點(diǎn)是明顯的，本發(fā)明的方法第一次使得以最優(yōu)的方式滿足特殊納米級顆粒的物理和生物兩者的要求成為可能。基于顆粒的單元結(jié)構(gòu)，即分別制備基本結(jié)構(gòu)單元(含鐵核+第一涂層)和靶向聚合物(第二涂層)，本發(fā)明具有最適合物理性能的合成聚合物是選自沒有任何納米級顆粒所需生物靶向能力限制的合成物；因此是第一次不需要折衷納米級顆粒的物理和藥物性能與其所需的生物效果。靶向聚合物不要暴露在有害的合成條件中?？梢允褂迷S多起作第一涂層作用的靶向物質(zhì)。類似地，不需要合成后的反應(yīng)，所述合成后的反應(yīng)可能需要恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件并降低配體的完整性；例如，不需要如在高碘酸鹽氧化，然后再還原胺化中涉及含二硫化物橋的蛋白質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，仍維持生物活性。由于不需要分離的反應(yīng)溶液如高碘酸鹽，所以另一基本優(yōu)點(diǎn)在于無需進(jìn)行基本結(jié)構(gòu)單元/靶向聚合物的純化。本方法允許當(dāng)場制備，包括在使用之前立即“正好及時(shí)地”制備納米級顆粒；這種方法可能是需要或必要的，例如對于“個體”對比介質(zhì)(如自身抗體)或者如果靶向聚合物在溶液中只保留很短時(shí)間的穩(wěn)定。由于納米級顆粒的“表面”可分別改性/優(yōu)化，而且可利用先進(jìn)的分析方法如核磁共振或紅外光譜進(jìn)行分析，所以本發(fā)明方法具有進(jìn)一步優(yōu)化的優(yōu)點(diǎn)。如果存在特殊核，這些方法均不能應(yīng)用。由于表面是由特定的方法制備并可進(jìn)行充分的分析，因此使表面性能的系統(tǒng)優(yōu)化成為可能；而作為顆粒以整體進(jìn)行處理的現(xiàn)有技術(shù)中的制備方法，表面是未知的且只能用試湊法進(jìn)行優(yōu)化。由此，納米級顆粒是由幾個步驟制備的。一般地，含鐵核是由“一罐”法合成的，也就是在穩(wěn)定劑(合成聚合物)存在下。穩(wěn)定劑(合成聚合物)溶解在水中，與單分子鐵化合物混合。通過增加pH值將鐵鹽轉(zhuǎn)變成優(yōu)選的氧化物。在另一種方法中，將穩(wěn)定劑溶液堿化，然后與鐵鹽混合?；旌衔锘亓骷訜岵⒅泻停蛘叻催^來也一樣。純化粗物質(zhì)，通過解吸方法調(diào)節(jié)剩余物或未固定吸附/粘合的合成聚合物至精確的鐵與穩(wěn)定劑重量比。包含氧化鐵核和(殘余)合成聚合物的純化和解吸堿性物質(zhì)代表(單元結(jié)構(gòu))納米級顆粒的基本結(jié)構(gòu)單元。作為選擇，接著可進(jìn)行加熱無菌化。在需要或在維持“存放”時(shí)，通過基本結(jié)構(gòu)單元吸附選擇的靶向聚合物，結(jié)構(gòu)單元選擇性帶有中間吸附或者助吸附的媒介劑/增強(qiáng)劑。其它成分如藥物助劑或藥物可任意地加入。圖2給出了一般制備方法的概況。注意根據(jù)下文描述的含鐵核的“一罐”法，合成總是在穩(wěn)定劑存在下進(jìn)行的?；旌献鳛榍绑w的化學(xué)計(jì)量量的鐵(II)鹽和鐵(III)鹽，制備含鐵核。使用的鹽將影響著所得晶體的質(zhì)量；根據(jù)文獻(xiàn)介紹，主要使用鹽酸鹽，即氯化亞鐵和氯化鐵。但是一般地，所有強(qiáng)酸鹽包括硫酸鹽和硝酸鹽均可使用。由于鐵(II)鹽非常容易氧化，所以當(dāng)使用這些鹽時(shí)，不容易保證精確的化學(xué)計(jì)量。這里優(yōu)選使用更加復(fù)雜的鹽如Mohr’鹽，這種鹽對氧化較不敏感。令人驚奇地，由于無機(jī)離子可用作穩(wěn)定劑或輔助穩(wěn)定劑，因此使用有機(jī)鹽優(yōu)于使用無機(jī)鹽。已證實(shí)葡糖酸鐵(II)或檸檬酸鐵(III)特別適合；但是也可使用其它有機(jī)離子物如富馬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽或水楊酸鹽。不必要滯留高度氧化敏感的鐵(II)鹽且減少“外來離子”數(shù)量、僅僅依賴鐵(III)鹽的合成方法使得制備變得容易。合成方法僅從鐵(III)鹽開始，而鐵(II)鹽是在通過計(jì)算還原劑量的反應(yīng)中就地產(chǎn)生。一般地，盡管可以使用所有能化學(xué)計(jì)量精度地還原鐵(III)的還原劑，但是由于反應(yīng)的羥胺能定量地轉(zhuǎn)變成一氧化二氮并能容易地完全從反應(yīng)混合物中分離，因此優(yōu)選羥胺。如果更詳細(xì)地研究鐵鹽的化學(xué)，先前描述的方法的缺點(diǎn)將會變得明顯。這就是將化學(xué)計(jì)量組成中的鐵(II)和鐵(III)轉(zhuǎn)變成具有指定結(jié)構(gòu)晶體的沉淀步驟的目的。增加pH值，將形成所需的氧化物。然而，如果考慮到在pH大約為2時(shí)，鐵(III)離子[pKLFe(OH)3大約371]1(1pKL值取決于濃度，數(shù)據(jù)是指10-2mol/l的溶液)會形成微溶的氫氧化物，而當(dāng)pH為8時(shí)，鐵(II)離子才開始以氫氧化物沉淀[pKLFe(OH)2大約13.5]，由此可見直接生成所需的晶體幾乎是不可能的，反應(yīng)路徑必須包括氫氧化物的后續(xù)反應(yīng)步驟?？墒褂眠m當(dāng)?shù)呐湮粍┦硅F化合物的沉淀點(diǎn)移動至相互關(guān)聯(lián)起來，從而在氧化鐵晶體的不同陣點(diǎn)上同時(shí)沉淀和插入。通過選擇適當(dāng)?shù)呐湮粍稍诤軐挿秶鷥?nèi)控制所使用的鐵化合物的沉淀點(diǎn)。除了表1中的“經(jīng)典”物質(zhì)，上述有機(jī)離子可用作配位劑。在任何需要時(shí)將鐵(II)和鐵(III)的配鹽、有機(jī)離子鹽和無機(jī)鹽組合起來。表1當(dāng)在赤鐵礦合成中pH值增加時(shí)，選擇用于移動沉淀點(diǎn)的配合劑和螯合劑<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="886">配位劑(螯合劑)鐵(II)logK1*鐵(III)logK1*COTA反式-1，2-二氨基-環(huán)己基-N，N，N’，N’-四乙酸16.2728.05EDTA乙二胺四乙酸14.3325.10EGTA乙二醇-O，O’-二-(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸11.9220.50DTPA二亞乙基三胺五乙酸16.5028.60HEDTAN-(2-羥乙基)-乙二胺-N，N’，N’-三乙酸12.2019.80NTA次氮基三乙酸8.8415.87TTHA三亞乙基四胺-N，N，N，N’，N’，N’-六乙酸17.1026.80</table></tables>*K1為絕對穩(wěn)定常數(shù)，與pH無關(guān)。它是指螯合劑的去質(zhì)子化形式K1＝[ML]/[M]·[L]，其中[ML]、[M]和[L]為螯合物、金屬離子和螯合劑(配位體)的濃度。表1列舉的螯合劑只是用來證明適當(dāng)范圍的化合物，不能僅僅限制于解釋這些物質(zhì)。在合成方法中，首先分別生成氫氧化鐵(II)和氫氧化鐵(III)。驚奇的是，通過結(jié)合分別制備的氫氧化鐵溶液可成功地制備氧化鐵晶體；加熱結(jié)合的溶液，可加速轉(zhuǎn)變和結(jié)晶。沉淀是會鐵核制備中的重要步驟。通過增加pH值，可由低分子量鐵化合物形成特殊鐵化合物；在考慮形成中，膠體氫氧化鐵是任意的中間產(chǎn)物。能夠提高溶解的酸性鐵前體的任何物質(zhì)均可適用于增加pH值。除了氫氧化鈉濃溶液，優(yōu)選使用氣體氨或銨鹽、堿性胺或揮發(fā)性緩沖物來增加pH值。令人驚奇的是，用于沉淀的堿以如下方式影響整個性能“生物”效果如人體器官中考慮分布的差異變得很明顯。堿性物質(zhì)的濃度必須在0.1至10N之間；由于pH值快速增加可優(yōu)選地形成小核尺寸的顆粒，因此優(yōu)選大約1至4N的濃溶液。在30分鐘內(nèi)加入堿，優(yōu)選在30秒鐘內(nèi)加入。鐵化合物在0-120℃溫度范圍內(nèi)沉淀在顆粒上，優(yōu)選50-80℃。根據(jù)一般規(guī)則，當(dāng)直接形成氧化鐵時(shí)，溫度可低一些；而當(dāng)所述形成包括作為中間步驟的氫氧化物時(shí)，溫度必須高一些。沉淀后中和產(chǎn)物，接著，特別是當(dāng)形成作為中間產(chǎn)物的氫氧化物時(shí)，回流原物質(zhì)；加熱時(shí)間必須在0分鐘至24小時(shí)之間，一些30分鐘至1小時(shí)。中和和回流可以以相反的順序進(jìn)行。當(dāng)用作外科可見監(jiān)測的對比介質(zhì)(光學(xué)標(biāo)記物質(zhì))時(shí)，物質(zhì)的本身顏色是非常需要的。在磁共振X線體層照相術(shù)中的應(yīng)用需要由納米級顆粒磁性性能確定的高效性。由于氧化鐵磁鐵礦和赤鐵礦在應(yīng)用于臨床磁共振X線體層照相術(shù)的場強(qiáng)中顯示出高的飽和磁化，所以當(dāng)納米級顆粒用作磁共振對比材料時(shí)，氧化鐵磁鐵礦和赤鐵礦似乎是特別適合的。特殊鐵核晶體結(jié)構(gòu)確定了特殊磁性性能，但是，令人驚奇的是，外來離子也可以插入到該晶體結(jié)構(gòu)中，仍可得到類似于磁鐵礦的晶體結(jié)構(gòu)。這種與非含鐵金屬離子摻和可通過兩種方法進(jìn)行。一方面，鐵(II)和/或鐵(III)離子在其網(wǎng)格位置上由其它順磁金屬離子置換；另一方面，利用抗磁離子替代。為了更好地理解，應(yīng)當(dāng)記住，由于鐵(III)離子占據(jù)了平行/逆平行網(wǎng)格位置，以致于其各自磁矢量被中和了，因此磁鐵礦晶體中的磁化只產(chǎn)生于鐵(II)離子。凈磁化量可通過使用具有比鐵更高磁矩的離子而增加，或通過使用順磁或抗磁離子改變由鐵(III)離子占據(jù)平行/逆平行網(wǎng)格位置的平衡而增加。如果所述替代涉及具有高磁矩的順磁金屬如釓，磁矩的增加量等于與置換鐵比較的磁矩之差。如果由抗磁金屬替代鐵(III)，將不再有鐵(III)離子的補(bǔ)償量能夠貢獻(xiàn)給總磁矩。作為一種變化方法，抗磁或順磁離子可一起插在類似于磁鐵礦的晶體網(wǎng)格中。與非鐵離子的摻和可在合成中通過部分取代低分子量含鐵母體化合物而進(jìn)行。制備含鐵核的一般方法是合成類似于磁鐵礦的晶體網(wǎng)格。用于此目的的鐵(II)和鐵(III)離子的比例范圍為1∶1至1∶20。利用精確的1∶2化學(xué)計(jì)量比可很容易地完成合成。在合成中，通過使用還原劑可維持鐵(II)與鐵(III)的比例。鐵(II)和鐵(III)離子可由高達(dá)總鐵離子量25％(重量)的其它金屬離子替代。除了順磁離子如釓或錳之外，也可使用抗磁離子如鋰、鎂或鈣或者順磁和抗磁離子混合物。磁鐵礦或類似于磁鐵礦的結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。例如，如果所述制備首先得到氫氧化物，或者將磁鐵礦晶體轉(zhuǎn)變成其它晶體如通過氧化，將磁鐵礦轉(zhuǎn)變成赤鐵礦，這種所謂的尖晶石或反尖晶石可作為副產(chǎn)物而形成。用作磁共振X線體層照相術(shù)對比材料的納米級顆粒的特殊性能需要超順磁特性。超順磁只存在于金屬物質(zhì)中；因而另一要求就是晶體具有金屬性能，也就是它們是特殊晶體或至少為多原子群。最少的鐵含量必須為每個晶體含50個鐵原子(或金屬原子)。通過改變合成條件可在很寬范圍(由1至大約30nm)內(nèi)控制含鐵核大小，但是，合成具有直接小于15nm且最少90％顆粒在0.7倍平均直徑至1.3倍平均直徑范圍內(nèi)(平均直徑由電子顯微鏡測定)的小顆粒為優(yōu)選。本發(fā)明制備方法的一個特點(diǎn)在于該方法在選擇合成聚合物方面具有很大的靈活性；術(shù)語“聚合物”不能理解為字面含義，低分子量物質(zhì)及低分子量和多分子量的混合物均可用于制備含鐵核。特別優(yōu)選使用分子中含負(fù)電荷載體的低分子和多分子物質(zhì)。下列物質(zhì)優(yōu)選羧酸鹽或類似物、磷酸鹽(或其它含磷基團(tuán))和硫酸鹽(或其它含硫基團(tuán))。這些衍生物可簡單地含有一個官能團(tuán)或含有幾個官能團(tuán)。此理論的基礎(chǔ)基于含鐵核表面親和力是由于氧化鐵表面正電荷與合成聚合物中的負(fù)電荷之間的相互作用的假設(shè)。如果合成聚合物含有幾個這種基團(tuán)，那么相互作用特別特殊(“多向接觸”)。由于具有許多合適的物質(zhì)，所以這里不能全部列舉。在合成過程中特別適合于穩(wěn)定的幾類物質(zhì)有低分子量物質(zhì)如羧基多元醇、聚羧基多元醇、聚羧基醇、羧基醇、醇、單糖、低聚糖，以及合成聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇和混合物(嵌段共聚物)、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乳酸(聚交酯、聚交酯縮水甘油)，以及天然或特別是部分合成或化學(xué)和/或酶解修飾的天然聚合物如葡聚糖及其衍生物、阿拉伯糖酸、葡糖氨基聚糖及合成類似物、淀粉及其衍生物以及明膠衍生物。特別優(yōu)選含負(fù)電荷載體的葡聚糖低分子量衍生物。(單)羧基葡聚糖可作為一個實(shí)例，其合成公開在如Bremner等人[Bremner，I.；Cox，JSG；Moss，GF；CarbohrdateReseach11；77-84；1969]中；另一優(yōu)選實(shí)例是多羧基葡聚糖，該葡聚糖是通過6-溴己酸與葡聚糖羥基之間的醚鍵制備的[Noguchi，A.；Takashida，M.；Sezaki，H；Bioconjugatechemistry3；132-137；1992]。由于多羧基葡聚糖的許多負(fù)電荷，因此多羧基葡聚糖能夠通過“多向接觸”與氧化鐵表面相互作用。制備中用于穩(wěn)定的合成聚合物的量為含在每批容量中的金屬離子總重量的0.5至20倍；當(dāng)使用合成聚合物時(shí)，其在反應(yīng)混合物中的總百分?jǐn)?shù)選擇應(yīng)保證混合每批容量的粘度(＜50％g/V)。使用的合成聚合物重量必須優(yōu)選地超過金屬離子總重量的3至15倍。在粗物質(zhì)制備后，可通過解吸過程減少每批容量中的合成聚合物成分。色譜方法、磁分離方法、滲析、離心或超濾或其它適宜的方法可用于吸附。在與一種解吸方法結(jié)合中，解吸可在升溫下進(jìn)行。另一種影響解吸程度的方法是使用解吸物質(zhì)如脂溶液或表面活性劑。解吸粗物質(zhì)后，可獲得一種穩(wěn)定的物理優(yōu)化溶液/懸浮液，它代表了用于制備特殊納米級顆粒的基本結(jié)構(gòu)單元。該基本結(jié)構(gòu)單元是由含鐵核和(殘余)合成聚合物組成。根據(jù)解吸過程調(diào)節(jié)的比例，殘余合成聚合物的量為0.01至1，其中以0.25至0.75為優(yōu)選，這是因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)可達(dá)到基本結(jié)構(gòu)單元穩(wěn)定性與吸附性之間的最佳折衷?；窘Y(jié)構(gòu)單元的總尺寸(水力直徑)隨著含鐵核的大小變化，因此所用的合成聚合物應(yīng)小于100nm，優(yōu)選小于50nm。優(yōu)選制備總直徑小于5倍核直徑的基本結(jié)構(gòu)單元?；窘Y(jié)構(gòu)單元與靶向聚合物結(jié)合產(chǎn)生最終納米級顆粒。合成聚合物/含鐵核單元周圍的吸附靶向聚合物形成第二涂層，由此該涂層主要地決定了系統(tǒng)的表面，以及顆粒的特殊性質(zhì)和體內(nèi)性能。這種制備方法的特別優(yōu)點(diǎn)在于可被基本結(jié)構(gòu)單元吸附的每種物質(zhì)可用于控制納米級顆粒的生物性能。由于靶向聚合物不暴露于合成中，所以敏感物質(zhì)和至今不能使用的物質(zhì)可用作控制生物性能的支持分子。下列是適宜靶向聚合物的實(shí)例天然低聚糖或多糖如分子量小于100,000Da的葡聚糖、不同葡聚糖的混合物、不同由來的葡聚糖、特別純化的葡聚糖(FP＝無熱源性能)、巖藻依聚糖、阿拉伯半乳聚糖、軟骨素及其硫酸鹽、皮膚素、肝素、類肝素、透明質(zhì)酸、角質(zhì)素、聚半乳糖醛酸、聚葡糖醛酸、聚甘露糖醛酸、菊粉、聚乳糖、聚乳胺、聚肌苷酸、多糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖元、葡萄糖、黑曲酶多糖、支鏈淀粉、鳶尾素、天冬酰胺素、海蔥糖、麥黃酮素、critesin、裸麥果糖膠、sitosin、地衣淀粉、異地衣糖、半乳聚糖、galactocaolose、淡黃青霉多糖、甘露聚糖、甘露多糖、石臍素、昆布多糖、氧雜蒽、木聚糖及共聚物、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、左旋糖(果聚糖)、teichinicacid、血型多糖、瓜拉那糊(guaran)、卡如賓、苜蓿、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖、磷酸甘露聚糖、胱氧半乳聚糖、果膠、環(huán)糊精、藻酸、黃蓍膠及其它膠、殼多糖、聚氨基葡糖、瓊脂、furcellaran、角叉菜、纖維素、纖維素糖醛酸或阿糖膠酸。另外，所列物質(zhì)的化學(xué)和/或酶解制備的衍生物以及多分子化合物的低分子量分解產(chǎn)物是要求保護(hù)的。任意地，這些物質(zhì)或衍生物可被其它物質(zhì)所取代。聚氨基酸和假聚氨基酸也是適合的。合成低聚物和聚合物的實(shí)例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯醚、磺酸聚對丙烯基茴香醇酯、聚乙烯亞胺、聚馬來酰亞胺、聚乙烯醇、聚氯乙烯、乙酸聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯硫酸鹽、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙交酯、聚丙交酯縮水甘油。單糖至低聚糖及相關(guān)物質(zhì)如醛糖和丙酮糖至醛糖和庚酮糖、辛酮糖和壬酮糖、脫水糖、主鏈含5或6個碳原子的單羧酸及衍生物、二溴芐、氨基和二氨基糖、脫氧糖、氨基脫氧糖和氨基糖羧酸、氨基二溴芐、單體至低聚物的含磷衍生物。具有抗腫瘤性能的單體或低聚物羧酸鹽或衍生物(高級植物、真菌、地衣和細(xì)菌)如脂多糖或含有一個或多個下列結(jié)構(gòu)β-2，6-果聚糖、β-1，3-葡聚糖、甘露葡聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、β-1，3/1，6-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖、β-1，3/1，4-葡聚糖、阿糖基木聚糖、半纖維素、β-1，4-木聚糖、阿糖基葡聚糖、阿糖基半乳聚糖、阿糖基巖藻葡聚糖、α-1，6/1，3-葡聚糖、α-1，5-阿拉伯糖、α-1，6-葡聚糖、β-2，1/2，6-果聚糖、β-2，1-果聚糖。抗腫瘤多糖作用的一個重要的必要條件是在水中的溶解性，這可由β-1，3/1，6-葡聚糖6位上的支鏈得到保證。在水中不溶的多糖的溶解性可通過親水基團(tuán)和水解很好的基團(tuán)而得到改善。氨基、乙酰基、羧甲基或硫酸鹽基團(tuán)可用作取代基，其中包括甲基和乙基。表面活性劑或表面活性物質(zhì)如鈮表面活性劑、烷基葡糖苷、葡酰胺、烷基麥芽糖苷、單和多分散的聚氧乙烯、季銨鹽、膽汁酸、烷基硫酸酯、甜菜堿、CHAP衍生物。作為實(shí)例，為了說明大量控制選擇及單元系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，用于控制體內(nèi)性能(特殊性)的分子還可以是細(xì)胞片斷，細(xì)胞，細(xì)菌片斷，選自大量植物血凝素、激素和媒介物質(zhì)，蛋白質(zhì)和新蛋白質(zhì)，肽和多肽，抗體，抗體片斷或整合蛋白(ELAM、LECAM、VCAM等等)或特殊受體物質(zhì)(如Lewis-X、Sialyl-Lewis-X等等)“分子識別單元”，或大量血液/血漿/血清成分和調(diào)理素，低聚核苷酸和合成低聚核苷酸，DNA和RNA或其衍生物或片斷或類似物(PNA)和同系物，低聚多糖，脂蛋白質(zhì)，甘油酯，膽固醇和酯，細(xì)胞生長抑制劑，醫(yī)用物質(zhì)，醫(yī)用物質(zhì)結(jié)合物，化學(xué)治療物質(zhì)和細(xì)胞生長抑制劑。除了或替代上述物質(zhì)外，也可使用化學(xué)和/或酶解制備的衍生物和分解產(chǎn)物作為靶向聚合物。衍生物或“天然”靶向聚合物可包括另外的官能團(tuán)。這些官能團(tuán)可位于基本靶向分子的一端或兩端或位于其它位置。官能團(tuán)可以相同或者是不同基團(tuán)的組合。優(yōu)選的衍生物及官能團(tuán)為含N、S、O或P原子的衍生物或基團(tuán)，酸或類似物，羥基，醚基或酯基。納米級顆粒的精確組成取決于適應(yīng)癥的需要。靶向聚合物可能是單個的物質(zhì)或如合成或非合成、低分子或多分子、衍生或非衍生的靶向聚合物的任何組合。特殊的合成方法是使用相同的聚合物作為合成和靶向聚合物。正如已經(jīng)描述，合成后存在的合成聚合物不再與合成中使用的聚合物相同，所以這就意味著靶向聚合物與合成中使用的聚合物是相同的。盡管靶向聚合物與所述的合成聚合物相同，但是由于靶向聚合物不暴露于存在于合成中的關(guān)鍵的深度條件中，因此仍維持“生物”狀態(tài)。最終納米級顆粒溶液中的靶向聚合物含量可在很寬范圍內(nèi)變化，一般在所含金屬離子總重量的0.5至50倍之間變化，優(yōu)選1至25倍重量。吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑是能改善或促進(jìn)靶向聚合物或靶向聚合物混合物被含鐵核表面或含鐵核和第一涂層表面吸附的所有物質(zhì)。一般地，吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑必須具有雙功能性質(zhì)一部分分子具有基本結(jié)構(gòu)單元的親和力；另一部分分子可能與第一功能部分相同，具有靶向分子的親和力。適宜的物質(zhì)是那些具有雙官能團(tuán)或具有疏水和親水分子部分的物質(zhì)。具有鐵核或鐵核加上第一涂層親和力的肽是優(yōu)選的吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑。這類肽可選自使用先進(jìn)生化方法的肽庫(peptidelibraries)。優(yōu)選的肽含有或其分子中部分含有RRTVKHHVN或RRSRHH或RSKRGR序列[氨基酸的單字母編碼；參見如Stryer，Biochemistry；FreemanandComp.；NewYork；1988]。使用肽作為吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑的優(yōu)點(diǎn)在于不需要親和力的分子部分可與靶向聚合物或聚合物任意地共價(jià)偶合，這就使得靶向聚合物的親和力具有選擇性能。所用吸附調(diào)節(jié)劑的量取決于所使用的物質(zhì)(吸附媒介強(qiáng)度)和靶向聚合物和聚合物的性能；總量小于或等于核中所含金屬離子的總重量。根據(jù)功能的不同，將可含在納米級顆粒溶液中的藥物添加劑或助劑分為五類防腐劑、pH穩(wěn)定劑、抗氧化劑、等滲添加劑、解膠劑和硫醇溶解加速劑。其它助劑可以是醫(yī)用溶劑如糖溶液、血漿增容劑、電解質(zhì)溶液、生理鹽水或注射用水，以及非腸道應(yīng)用的油狀“溶劑”?？珊诩{米級顆粒溶液中的藥物的實(shí)例總結(jié)如下抗過敏劑、抗過敏原劑或預(yù)防劑、血管舒張藥或血管收縮藥、影響血流物質(zhì)、影響納米級顆粒代謝物質(zhì)、影響納米級顆粒藥物動力學(xué)物質(zhì)、改變鐵平衡物質(zhì)、酶誘導(dǎo)劑或抑制劑物質(zhì)，或者一般介體和抗介體。在用于治療的醫(yī)用物質(zhì)中，主要感興趣的物質(zhì)是細(xì)胞生長抑制劑、化學(xué)治療劑、激素和抗糖尿病劑。藥物可作為任選的成分加入到納米級顆粒溶液中去，或者可以與靶向聚合物偶合；然后聚合物和醫(yī)用物質(zhì)的結(jié)合物用作靶向聚合物。納米級顆粒的“生理”分布不可能僅僅通過影響“生理”因素如血流、淋巴液流和淋巴液產(chǎn)生等等的藥物改變；體內(nèi)分布可通過簡單的理療手段變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如對于室內(nèi)患者，可直接通過散步或在測力計(jì)上鍛煉的運(yùn)動和與其相反的靜止和/或在麻醉等條件下應(yīng)用，其結(jié)果將會導(dǎo)致完全不同的分布性能和分布形式。進(jìn)一步地，這里必須提及熱輸入，它可通過對整個身體或身體的部分施加紅外線而完成。特別優(yōu)選用在許多臨床的高溫治療設(shè)備，該設(shè)備用于腫瘤輔助治療目的的熱輸入。有目的的局部加熱有助于伴隨理療手段中的“選擇性”。單元制備設(shè)計(jì)的很大靈活性在于允許靶向聚合物、吸附介質(zhì)、藥物助劑和藥物的自由組合，以及伴隨理療手段的不同納米級顆粒組成的應(yīng)用。納米級顆?；蛉芤嚎砂ㄔS多不同成分，所以只能通過總結(jié)的方式描述取決于特定應(yīng)用的精確組成表2本發(fā)明納米級顆粒的組成(百分?jǐn)?shù)/量)<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="759">相對份(重量)基本結(jié)構(gòu)單元鐵＝1總計(jì)＝1與其它金屬摻和≤0.25合成聚合物0.01-1吸附調(diào)節(jié)劑≤1靶向聚合物0.5-50藥物根據(jù)需要藥物助劑根據(jù)需要</table></tables>包括所有添加劑的納米級顆粒總體直徑(利用動態(tài)激光線散射DLS測量)不大于10倍含鐵核直徑(利用轉(zhuǎn)換電子顯微術(shù)TEM測量)。下述組合是優(yōu)選的在這些組合中，基本結(jié)構(gòu)單元(核+第一涂層)的直徑只根據(jù)靶向聚合物或靶向聚合物加上任意助劑的組合增加至較小的程度。DLS測量直徑可最多超過基本結(jié)構(gòu)單元直徑的20％。能夠適用于需要很高生物特殊性和很高物理性能(顆粒大小、磁性性能)的具有史無前例靈活性和性能的納米級顆粒可通過基本結(jié)構(gòu)單元的優(yōu)化物理性能與許多潛在靶向聚合物的組合而制備。單元設(shè)計(jì)和許多允許的組合使其具有非常廣泛的應(yīng)用。由于納米級顆粒通過相當(dāng)于不同問題的靶向聚合物(第二涂層)的靈活調(diào)節(jié)(單元設(shè)計(jì))，將高物理性能與優(yōu)良的靶向能力結(jié)合起來了，所述顆粒能夠適用于許多特殊適應(yīng)證如靜內(nèi)或局部間質(zhì)給藥后的磁共振淋巴照相術(shù)、腫瘤造影術(shù)、機(jī)能或機(jī)能失常造影術(shù)、蝕斑造影術(shù)(動脈粥樣硬化成像)、血栓和血管閉合、磁共振血管造影術(shù)、灌注成像、梗塞造影術(shù)、內(nèi)皮損傷造影術(shù)、受體成像、血腦屏障完整性造影術(shù)等等，以及用于不同的診斷，特別是用于區(qū)分增生組織腫瘤/轉(zhuǎn)移瘤。由于納米級顆粒的格外制備靈活性，該顆粒也能夠適用于大多數(shù)不同的體外診斷應(yīng)用，例如用作用于EIAs(酶-免疫測定法)中磁分離檢查的特殊載體。血液特殊因子的選擇性排放(體外血液脫氧)是治療路線的體外方法的結(jié)合。本發(fā)明納米級顆粒顯示出明顯的本身顏色。當(dāng)與能夠在淋巴結(jié)中形成特別高濃度的靶向聚合物結(jié)合時(shí)，這些顆粒非常適合用作淋巴結(jié)染色的手術(shù)中標(biāo)記物質(zhì)。由于淋巴結(jié)經(jīng)常與腫瘤手術(shù)切除，納米級顆粒的預(yù)給藥使得外科醫(yī)師更加容易分辨這些組織周圍的淋巴結(jié)，所述淋巴結(jié)可能相當(dāng)小。納米級顆粒具有為此目的的特別長的時(shí)間窗口，可在手術(shù)前大約60分鐘至多于24小時(shí)內(nèi)應(yīng)用。除了淋巴結(jié)造影術(shù)之外，腫瘤內(nèi)的應(yīng)用或腫瘤外周的應(yīng)用促進(jìn)了腫瘤外周的染色，有助于將腫瘤從周圍組織中區(qū)分出來；另外，腫瘤區(qū)域中的顆粒通過相同的淋巴脈管帶走，由此腫瘤細(xì)胞將會轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。顆粒使優(yōu)選轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的淋巴脈管或淋巴結(jié)染色。除了用作靜脈內(nèi)應(yīng)用的對比材料外，顆?？删植繎?yīng)用。在如乳腺癌情況下，由于只需要造影有限的區(qū)域，因此局部應(yīng)用具有優(yōu)勢；局部給藥有助于形成靶向區(qū)域內(nèi)對比材料的高濃度，而且不影響系統(tǒng)的其它部分。為了證實(shí)靜脈內(nèi)給藥后猜疑或懷疑的診斷，需要對某些淋巴結(jié)周圍的間質(zhì)組織間接應(yīng)用。納米級顆粒的另一應(yīng)用領(lǐng)域是其用作體內(nèi)診斷的增強(qiáng)物質(zhì)，所述診斷是基于確定磁化或磁場/通量密度高感度測量方法(SQUID)的。該領(lǐng)域中研制的高感度測量方法有助于體內(nèi)追蹤磁性顆粒，因此，類似于閃爍法中使用的放射活性物質(zhì)的磁性顆?？捎米鳈C(jī)能失常和損傷診斷。在治療領(lǐng)域中，顆?？捎米麽t(yī)用物質(zhì)的載體。納米級顆粒的特性是用于醫(yī)用物質(zhì)到其作用位置的傳輸。醫(yī)用物質(zhì)可摻和到含鐵核中或化學(xué)鍵合到合成聚合物和/或靶向聚合物中。這可看著是聚合物和醫(yī)用物質(zhì)的結(jié)合物的吸附或醫(yī)用物質(zhì)與吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑的鍵合。例如，可制備對氧化鐵表面具有高親和力的特殊肽序列。根據(jù)治療需要，例如對于許多涉及存在于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞的微生物的疾病，可能的征兆應(yīng)當(dāng)是吞噬細(xì)胞中低分子量化學(xué)治療劑的高濃度聚集。在所有治療方法中，納米級顆粒和醫(yī)用物質(zhì)系統(tǒng)可通過使用內(nèi)部磁場可選擇地聚集在其靶向區(qū)域。對于治療非常特殊的疾病，可選擇在靶向區(qū)域如腫瘤區(qū)植入局部控制的小磁鐵。除了將納米級顆粒用作醫(yī)用物質(zhì)到特殊組織的傳輸介質(zhì)，可以制備以改性活性劑釋放為特征的藥物類型?；钚詣┑尼尫趴赏ㄟ^使用生物可分解結(jié)合劑或通過在具有不同生物降解能力的各種納米級顆粒成分中摻入醫(yī)用物質(zhì)而得到控制。潛在的征兆是將納米級顆粒用作施用激素的貯藏處。將納米級顆粒用于新的治療系統(tǒng)中也是可相信的。在所述系統(tǒng)中，納米級顆粒的磁性性能通過可在外部控制的“磁性開關(guān)”誘導(dǎo)和控制醫(yī)用物質(zhì)的釋放。一個重要應(yīng)用領(lǐng)域是研制用于控制胰腺糖尿病治療中抗糖尿病劑釋放的治療系統(tǒng)。適用于通過納米級顆粒直接傳輸至其作用位置的醫(yī)用物質(zhì)首先是化學(xué)治療劑和細(xì)胞生長抑制劑。抗菌治療也經(jīng)常需要將醫(yī)用物質(zhì)傳輸至其作用位置(例如結(jié)核、存在于巨噬細(xì)胞中的微生物)。特別地，適合于通過納米級顆粒磁性釋放的醫(yī)用物質(zhì)為抗菌劑、激素、抗糖尿病劑、細(xì)胞生長抑制劑和化學(xué)治療劑。納米級顆?？稍谧鳛獒t(yī)用物質(zhì)本身的間接治療用途之外用作如高溫或Mossbauer核吸收治療中的吸收劑，或者如果適當(dāng)?shù)嘏c硼或釓摻和，用于中子捕獲治療(neutroncapturetherapy)。另一應(yīng)用是醫(yī)用放射治療，其中納米級顆粒在核中與放射性元素?fù)胶突蛟诨窘Y(jié)構(gòu)單元中吸附有含同位素的適當(dāng)分子。在放射治療中，納米級顆粒的優(yōu)選應(yīng)用是(例如)納米級顆粒含有放射性55Fe同位素的“自放射源”，或者是納米級顆粒含有通過外部“活化”誘導(dǎo)出放射性同位素的同位素。例如，核中含有能夠通過中子外部活化的157Gd。在放射治療中，納米級顆粒的另一應(yīng)用是基于下述事實(shí)引起的其核、合成或靶向聚合物或吸附介質(zhì)可修飾為含有自放射源如123I或125I。另外，納米級顆?？珊型ㄟ^外部激發(fā)能夠轉(zhuǎn)變成放射性同位素的同位素。另一實(shí)例是利用碘和碘-K邊界(iodine-Kedge)的外部活化標(biāo)記靶向聚合物，所述活化利用了單能X-光輻射。通過借助于由與納米級顆粒本身相互作用或與RES相互作用辨別結(jié)合物/吸附介質(zhì)引起的滅活和接著的細(xì)胞內(nèi)失活，本發(fā)明納米級顆粒還可用于從脈管中消除細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素和外毒素?；谙率鰧?shí)施例以及附圖1至35，將更詳細(xì)地說明本發(fā)明，其中圖1具有含鐵核、第一涂層(合成聚合物)和第二涂層(靶向聚合物)的納米級顆粒結(jié)構(gòu)剖面2合成本發(fā)明納米級顆粒的總流程3單羧基葡聚糖及其母體化合物葡聚糖4的FTIR光譜圖4多羧基葡聚糖及其母體化合物葡聚糖T10和6-溴己酸的FTIR光譜圖5大鼠的瓊脂糖包埋的淋巴結(jié)磁共振X線體層照片圖6不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度的定量評估(由圖5)圖7不同大鼠淋巴結(jié)中SE135/15/15°相對信號強(qiáng)度的定量評估(由圖5)圖8在質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片圖9在質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片圖10不同兔24hp.i.淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度圖11在T2*-負(fù)荷的梯度回聲序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆區(qū)域的正面前后對比磁共振X線體層照片圖12在T2*-負(fù)荷梯度回聲序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片圖13改性物質(zhì)與原物質(zhì)不同兔24hp.i.淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度圖14兔的瓊脂糖包埋的淋巴結(jié)體外磁共振X線體層照片圖15不同兔24小時(shí)p.i.淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度圖16不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為注射納米級顆粒后應(yīng)用24小時(shí)的劑量的函數(shù)圖17相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用納米級顆粒24小時(shí)后不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°的劑量的函數(shù)圖18不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用(對照物質(zhì))后時(shí)間的函數(shù)圖19不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用特殊納米級顆粒后時(shí)間的函數(shù)圖20不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用(對照物質(zhì))后時(shí)間的函數(shù)圖21不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用特殊納米級顆粒后時(shí)間的函數(shù)圖22淋巴結(jié)中由熱輸入引起的聚集作用圖23大鼠腹部的橫斷動力學(xué)研究，所述研究是在靜內(nèi)注射實(shí)施例D2的特殊納米級顆粒(劑量20μmolFe/kg)后利用T1-重量SE序列(T1-weightedSEsequence)(TR200ms，TE10ms)進(jìn)行的圖24對實(shí)施例D2特殊納米級顆粒和實(shí)施例C2非特殊對照物質(zhì)在靜脈血管和肝臟實(shí)體中SETR/TE200ms/10ms的相對信號強(qiáng)度的比較圖25對實(shí)施例D2特殊納米級顆粒和實(shí)施例C2對照物質(zhì)的3D快速X線體層照片(TR40ms，TE6ms，F(xiàn)A60°)的冠狀MIPS(最大強(qiáng)度投影)圖26作為淋巴結(jié)可見檢測“手術(shù)中”標(biāo)記物質(zhì)的納米級顆粒(詳圖)圖27作為淋巴結(jié)可見檢測“手術(shù)中”標(biāo)記物質(zhì)的納米級顆粒(詳圖)圖28兔中轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)可見檢測的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的論證圖29與非特殊對照物質(zhì)(不含轉(zhuǎn)鐵蛋白的納米級顆粒)對比的特殊納米級顆粒(含轉(zhuǎn)鐵蛋白)的細(xì)胞X線體層照片圖30含修飾D7的兔的主動脈動脈粥樣硬化斑塊的體外磁共振X線體層照片31具有Prussian藍(lán)染色的兔主動脈的動脈粥樣硬化膜中鐵的組織學(xué)檢測圖32Watanabe兔主動脈中實(shí)施例E6納米級顆粒聚集的組織化學(xué)檢測(Prussian藍(lán)染色)圖33靜脈內(nèi)注射實(shí)施例D2納米級顆粒(200μmolFe/kg)后腫瘤信號行為的橫斷T1-負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲動力學(xué)研究(TR300ms，TE15ms)圖34腫瘤相對信號強(qiáng)度(聚集)曲線圖35應(yīng)用實(shí)施例D2納米級顆粒(200μmolFe/kg)后取決于時(shí)間的橫斷質(zhì)子-密度負(fù)荷(SE2000/15)X線體層照片實(shí)施例制備和應(yīng)用A制備合成聚合物A1合成(單)羧基葡聚糖(CDx)將100g葡聚糖4(Serva，Germany)溶解在500ml水中并加熱至60℃，攪拌的同時(shí)加入大約55ml的約10N的濃氫氧化鈉溶液。反應(yīng)5小時(shí)后將溶液(部分)中和至pH8。在混合床離子交換器(AmberliteIRA-400和IR-120)上純化褐色溶液，收集具有酸性性能的溜分，并在40℃下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上真空濃縮，然后將其凍干。表3分析數(shù)據(jù)改性葡聚糖(＝羧基葡聚糖)的FTIR光譜(溴化鉀)如圖3所示。A2合成多羧基葡聚糖(P-CDx)將10g葡聚糖T10(Pharmacia，Germany)稱入250ml二頸燒瓶中，與100ml4NNaOH混合。在單頸燒瓶上安裝回流冷凝器，將溶液加熱至大約80℃。在常速攪拌下(磁性攪拌器)通過第二頸口分批加入30g6-溴己酸(Aldrich，Germany)。加入物質(zhì)后塞上頸口，再攪拌反應(yīng)3小時(shí)。利用6NHCl在通風(fēng)櫥下中和反應(yīng)混合物，然后在旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器(60℃，真空)上通過預(yù)先濃縮還原。通過乙醇沉淀進(jìn)行未轉(zhuǎn)化反應(yīng)物的分離或清洗改性的羧基葡聚糖。洗滌白色沉淀，在二次蒸餾水中再溶解，最后通過0.22μm濾紙(SchleicherandSchull，Germany)過濾并凍干。表4</tables>多羧基葡聚糖的FTIR光譜如圖4所示(參見附圖)。B制備原物質(zhì)B1利用氨氣由Cdx制備將具有分子量大約為2000Da的5.0g單羧基葡聚糖(CDx，實(shí)施例A1)溶解在17.5ml二次蒸餾水中，溶液通過吹入氮?dú)饷摎狻Ｔ谠嚬苤兄苽?.7ml1-mol氯化鐵(III)六水合物溶液，利用氮?dú)饷摎?。向鐵(III)溶液中加入648mg氯化鐵(II)四水合物，溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加熱至大約75℃，加入鐵溶液(暴露在氮?dú)庵?。通過由氣體圓筒快速引入氨氣，調(diào)節(jié)加熱的反應(yīng)混合物至堿性，同時(shí)徹底攪拌。然后回流反應(yīng)溶液大約1小時(shí)。接著在開口燒瓶中再加熱10分鐘，除去未轉(zhuǎn)化的氨。冷卻后在2500g下離心30分鐘，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)至大約7ml；如果需要，檢查pH值并中和。確定濃度后，用二次蒸餾水調(diào)節(jié)溶液至大約1-mol鐵濃度，利用0.22μm濾紙過濾。溶液可在高壓釜中滅菌(方法A121)。表5分析數(shù)據(jù)注釋1至3確定血液中的半衰期·從血液中清除的半衰期將裝有肝素化氯化鈉溶液(0.2ml)的長50.5cm導(dǎo)管插在醚麻醉的實(shí)驗(yàn)動物(大鼠，大約200g)中并推入離心臟大約1.5cm處。引出導(dǎo)管的自由段并由組織丙烯酸鹽固定。手術(shù)結(jié)束后大約1小時(shí)，通過尾側(cè)靜脈應(yīng)用試驗(yàn)物質(zhì)i.v.(大約1ml/分鐘)。動物蘇醒后，根據(jù)所需的試驗(yàn)物質(zhì)排除速率，在不同時(shí)刻取出血液樣品。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過染色腔靜脈血液，在麻醉下處死動物。·T1和T2作用的半衰期在2900rmp(1000g)下離心血液樣品15分鐘。吸出0.250ml上清液，利用二次蒸餾水將樣品裝至2.0ml，然后混合物在40℃下恒溫。通過利用cp120應(yīng)力松弛計(jì)(Bruker，Germany)測量T1，2弛豫時(shí)間來確定降低的血液濃度。測量是利用180°-90°-IR(inversionrecovery)序列(T1)或CPMG序列(T2)進(jìn)行的。在藥物代謝動力學(xué)兩室模型基礎(chǔ)上分析結(jié)果；利用TOPFIT藥物代謝動力學(xué)計(jì)算機(jī)程序計(jì)算數(shù)據(jù)，所述程序是以T1，2時(shí)間倒數(shù)(弛豫速率)減去空白讀數(shù)為計(jì)算式，在時(shí)間上延伸濃度。TOPFIT首先可以利用由“濃度”和時(shí)間浮點(diǎn)標(biāo)志的線性回歸計(jì)算直線的斜率，然后由所得的數(shù)值計(jì)算有效半衰期。·鐵含量的半衰期利用移液管吸取用于確定弛豫時(shí)間的800μl溶液，用濃硝酸溶解，用二次蒸餾水裝至10.0ml。然后用原子發(fā)射光譜(AES)定量鐵含量。將結(jié)果轉(zhuǎn)化為血液濃度并利用TOPFIT的濃度-時(shí)間圖分析，其中應(yīng)當(dāng)考慮相對稀釋因子。B2利用NaOH和檸檬酸鐵(III)及葡糖酸鐵(II)制備P-CDx將具有分子量大約為12000Da的5.0g多羧基葡聚糖(實(shí)施例A2)溶解在17.5ml二次蒸餾水中，溶液通過吹入氮?dú)饷摎狻Ｔ谠嚬苤兄苽?.7ml1-mol檸檬酸鐵(III)一水合物溶液，加入1.635g葡糖酸鐵(II)三水合物并溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加熱至大約75℃，加入鐵溶液(暴露在氮?dú)庵?。在30秒內(nèi)向熱的反應(yīng)混合物中加入大約12ml3N濃氫氧化鈉，同時(shí)徹底攪拌。然后利用大約6N鹽酸中和并回流大約1小時(shí)。接著在開口燒瓶中再加熱10分鐘，除去未轉(zhuǎn)化的氨。冷卻后在2500g下離心30分鐘，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)至大約7ml；如果需要，檢查pH值并中和。確定濃度后，用二次蒸餾水調(diào)節(jié)溶液至大約1-mol鐵濃度，利用0.22μm濾紙過濾。溶液可在高壓釜中滅菌(方法A121)。表6分析數(shù)據(jù)*P-CDx含量是由葡萄糖當(dāng)量乘以1.64計(jì)算而來的(100mgP-CDx＝61mg葡萄糖當(dāng)量)B3利用Fe(III)NTA和氫氧化銨由CDx制備將具有分子量大約為2000Da的5.0g(單)羧基葡聚糖(CDx，實(shí)施例A1)溶解在35ml二次蒸餾水中，溶液通過吹入氮?dú)饷摎?。在加熱和徹底攪拌的同時(shí)向反應(yīng)混合物中加入濃氫氧化銨(32％)，直至pH值調(diào)至11。在試管中制備6.85ml1-mol鐵(III)溶液，與等摩爾量的NTA混合，利用氮?dú)饷摎?。向鐵(III)溶液中加入667mg氯化鐵(II)四水合物并溶解在氮蒸汽中。在20秒內(nèi)將鐵溶液加入到堿性聚合物溶液中，然后利用大約6N鹽酸中和并回流大約1小時(shí)。冷卻后在2500g下離心30分鐘，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)至大約6ml，測量pH值。確定濃度后，用二次蒸餾水調(diào)節(jié)溶液至大約1-mol鐵濃度，利用0.22μm濾紙過濾。溶液可在高壓釜中滅菌(方法A121)。表7分析數(shù)據(jù)</tables>B4利用鐵(III)和還原劑、濃氫氧化鈉由CDx制備將具有分子量大約為12000Da的5.0g多羧基葡聚糖(實(shí)施例A2)溶解在17.5ml二次蒸餾水中，溶液通過吹入氮?dú)饷摎?。將聚合物溶液中加?0ml1-mol氯化鐵(II)六水合物溶液，然后利用氮?dú)饫^續(xù)脫氣。聚合物溶液加熱至大約75℃，在氮?dú)庀录尤?13.6mg羥胺HCl。在30秒內(nèi)向熱的反應(yīng)混合物中加入大約12ml3N濃氫氧化鈉，同時(shí)徹底攪拌。然后利用大約6N鹽酸中和并回流大約1小時(shí)。冷卻后在2500g下離心30分鐘，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)至大約7ml；檢查pH值。確定濃度后，用二次蒸餾水調(diào)節(jié)溶液至大約1-mol鐵濃度，利用0.22μm濾紙過濾。溶液可在高壓釜中滅菌(方法A121)。表8分析數(shù)據(jù)</tables>B5利用葡聚糖4和葡聚糖15混合物制備將具有分子量各自大約為6,000-4,000Da和15,000-20,000Da的5.0g1∶1葡聚糖4和葡聚糖15(均出自Serva，Germany)混合物多羧基葡聚糖溶解在20ml二次蒸餾水中，利用3N濃氫氧化鈉將無色聚合物溶液調(diào)至pH值大約12，回流1小時(shí)，用大約6NHCl中和。微赤褐色溶液通過吹入氮?dú)饷摎?。在試管中制?.7ml1-mol氯化鐵(III)六水合物溶液并利用氮?dú)饷摎?。向鐵(III)溶液中加入648mg氯化鐵(II)四水合物并溶解在氮蒸汽中。聚合物溶液加熱至大約75℃，加入鐵溶液(暴露在氮?dú)庵?。在30秒內(nèi)向熱的反應(yīng)混合物中加入大約11.5ml3N濃氫氧化鈉，同時(shí)徹底攪拌。然后反應(yīng)混合物回流大約1小時(shí)。冷卻后在2500g下離心30分鐘，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)至大約8ml；檢查pH值。確定濃度后，用二次蒸餾水調(diào)節(jié)溶液至大約1-mol鐵濃度，利用0.22μm濾紙過濾。溶液可根據(jù)方法A121在高壓釜中滅菌。表9分析數(shù)據(jù)C制備基本物質(zhì)C1水滲析將5ml實(shí)施例B1的溶液裝入Visking滲析管(Servia，Germany)中，滲析五次，每次6小時(shí)，用1l新鮮二次蒸餾水。通過二次蒸餾水稀釋，將滯留物調(diào)節(jié)至鐵濃度為200mmol/l，并且通過0.22μl濾紙(醋酸纖維素酯，“Rotrand”，F(xiàn)a.Schleicher&amp;Schull，Germany)每5ml為一批地裝入10ml無菌小瓶內(nèi)。解吸溶液可在高壓釜中滅菌。C220mMol檸檬酸鈉滲析將5ml實(shí)施例B1的溶液裝入Visking滲析管(Servia，Germany)中，滲析五次，每次6小時(shí)，用1l新鮮乳酸鈉溶液(20mmol/l，pH7)。滲析重復(fù)兩次，每次5稀釋，用1l新鮮二次蒸餾水。通過二次蒸餾水稀釋，將滯留物調(diào)節(jié)至鐵濃度為200mmol/l，并且通過0.22μl濾紙每5ml為一批地裝入10ml無菌小瓶內(nèi)。C3利用超視粒(Amicon)超濾利用移液管將5ml實(shí)施例B1的溶液移至制備超濾裝置中，用二次蒸餾水(Centriprep100，Cutoff100kDa，F(xiàn)a.Amicon，Germany)裝至15ml界線，在1000g下超濾1小時(shí)。然后排除濾液，用二次蒸餾水將滯留物容器裝至15ml，再超濾。此步驟重復(fù)兩次。通過二次蒸餾水稀釋，將滯留物調(diào)節(jié)至鐵濃度為200mmol/l，并且通過0.22μl濾紙(醋酸纖維素酯)每5ml為一批地裝入10ml無菌小瓶內(nèi)。C4色譜分離在S5400HRsephacryl柱(100×5cm)上，將5ml實(shí)施例B1的溶液裝在超環(huán)(superloop)(Fa，Pharmacia)中，在50mM檸檬酸/250mM甘露糖醇中以300ml/h流速洗脫。收集450ml至840ml的溜分并在真空中、在60℃下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至大約50ml。濃縮液用二次蒸餾水滲析三次、6小時(shí)，再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮，調(diào)節(jié)至確定后的鐵濃度為200mmol鐵/l。通過二次蒸餾水稀釋，將滯留物調(diào)節(jié)至鐵濃度為200mmol/l，并且通過0.22μl濾紙每5ml為一批地裝入10ml無菌小瓶內(nèi)。解吸溶液可在高壓釜中滅菌。表10實(shí)施例C1-C4的基本化合物的分析數(shù)據(jù)關(guān)于磁性性能和顆粒大小的物理化學(xué)數(shù)據(jù)對應(yīng)于母體化合物(實(shí)施例B1)數(shù)值。D用于應(yīng)用的溶液D1葡聚糖T10在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的33.6mg葡聚糖T10溶解在6.0ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為1(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。該制劑中含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振淋巴系造影術(shù)中的應(yīng)用。D2葡聚糖FP1由2溶液制備在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的302.4mg葡聚糖FP1溶解在6.0ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為5(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。該制劑中含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振淋巴系造影術(shù)中的應(yīng)用。D3作為凍干劑的葡聚糖FP1在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的302.4mg葡聚糖FP1溶解在6.0ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為5(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。該溶液在注射瓶中凍干，此瓶子塞上塞子。通過加入10ml生理鹽水制備應(yīng)用的溶液；此瓶中含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振淋巴系造影術(shù)中的應(yīng)用。D4葡聚糖FP1將作為靶向聚合物的252mg葡聚糖FP1稱入5ml注射瓶中，裝入5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液，塞緊燒瓶。通過轉(zhuǎn)動注射瓶溶解葡聚糖FP1。聚合物與鐵重量之商為5(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝252mg)。該制劑中現(xiàn)在含有10ml200mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振淋巴系造影術(shù)中的應(yīng)用。D5昆布多糖在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的33.6mg昆布多糖溶解在6.0ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為1(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。該制劑中含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振淋巴系造影術(shù)中的應(yīng)用。D6含轉(zhuǎn)鐵蛋白在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的33.6mg人的Fe2轉(zhuǎn)鐵蛋白溶解在6.0ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為1(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。該制劑中含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于造影增生細(xì)胞(腫瘤)的特殊對比介質(zhì)。D7含內(nèi)皮素激動劑在10ml小瓶中制備5ml濃度為200mmolFe/l(對應(yīng)于56mg總鐵含量)的實(shí)施例C1溶液。作為靶向聚合物的33.6mg內(nèi)皮素受體專一七肽[cys-his-leu-asp-ile-ile-trp]溶解在6ml蒸餾水中并在無菌條件下，利用含過濾裝置(0.22μm)的注射器將5ml此溶液加入到氧化鐵溶液中。聚合物與鐵重量之商為1(殘余合成聚合物＝28mg+靶向聚合物＝28mg)。該制劑中現(xiàn)在含有10ml100mmol(鐵)溶液，此制劑可立即適用于靜脈內(nèi)磁共振斑塊成像(動脈粥樣硬化成像)的應(yīng)用。E應(yīng)用應(yīng)用實(shí)施例E1·大鼠中的磁共振淋巴系造影術(shù)目的在大鼠中進(jìn)行母體化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)與根據(jù)解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之間的淋巴結(jié)的不同淋巴結(jié)/組中的相對信號強(qiáng)度的比較。物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D5)；比較＝實(shí)施例C1的基本結(jié)構(gòu)單元(＝?jīng)]有靶向聚合物的D5)劑量100μmolFe/kg體重(體重wt)時(shí)間24小時(shí)p.i.(注射之后)磁共振方法裝置SiemensMagnetom1.5TMR具有末端旋管的全身磁共振掃描儀磁共振參數(shù)觀察區(qū)域(FOV)＝150mm，型片＝256×256；片厚＝3mm，剖面取向＝正面序列1質(zhì)子密度負(fù)荷旋轉(zhuǎn)回聲序列(SE)TR＝2000ms，TE＝15ms序列2T2負(fù)荷的梯度回聲序列(GE)TR＝135ms，TE＝15ms；FA＝15°體外模型·在大鼠和兔淋巴結(jié)中的聚集將體外瓊脂人體模型用于檢查物質(zhì)在淋巴結(jié)的不同淋巴結(jié)/組中的聚集和分布。該體外模型的優(yōu)點(diǎn)在于即使是很小的實(shí)驗(yàn)動物(小鼠、大鼠、兔)，也可測定不同中樞和末梢淋巴結(jié)或淋巴結(jié)組中的聚集；還可能得到分布均勻的結(jié)論；信號抵觸可定量化。通過尾側(cè)(小鼠、大鼠)或耳朵(兔)靜脈，在實(shí)驗(yàn)動物中注射(靜脈注射造影劑)納米級顆粒溶液。處死動物后24小時(shí)，制備不同淋巴結(jié)或淋巴結(jié)組(腘、髂骨、腋窩、下頜骨、腹溝股淋巴結(jié))。然后將淋巴結(jié)置于瓊脂人體模型中并維持冷凍直至進(jìn)行磁共振測量(最多24小時(shí))。·體外瓊脂人體模型的制備將10g微生物瓊脂-瓊脂懸浮在500ml二次蒸餾水中，其中已加入了0.5mlmagnevist(0.5mol/l釓DTPAdimeglumin)，得到磁共振X線體層照片的均質(zhì)信號背景。煮沸懸浮液，將瓊脂溶液的一半注入一塑料碟中，形成具有0.5至1cm厚的薄層。溶液冷卻后，標(biāo)本安排在瓊脂層上(根據(jù)左/右各半個身體，或以從頭部到底部的“生理順序”)并由少量瓊脂溶液固定(巴斯德移液管)。然后在組織樣品上倒入第二層瓊脂溶液。在24小時(shí)內(nèi)測量人體模型并維持冷凍直至測量進(jìn)行完畢。為了參照，同時(shí)進(jìn)行沒有注射納米級顆粒的動物，同等制備組織，或者制備對應(yīng)的人體模型。除了進(jìn)行造影檢測，各組織中的相對信號降低可根據(jù)下式定量測量后小心地從瓊脂溶液中除去組織樣品，在濃鹽酸中分解，利用ICPAES(inductivelycoupledplasmaatomicemissionspectroscopy)定量其鐵含量?？瞻字悼捎刹皇褂萌魏渭{米級顆粒的適當(dāng)處理的對照動物確定，而且當(dāng)確定樣品鐵含量時(shí)，應(yīng)考慮空白值。結(jié)果圖5大鼠的瓊脂糖包埋的淋巴結(jié)磁共振X線體層照片；切除術(shù)是在應(yīng)用對照物質(zhì)(實(shí)施例C2，左)或?qū)嵤├鼶2改性物質(zhì)(右)24小時(shí)之后進(jìn)行的；劑量各種情況下為100μmolFe/kg圖6改性物質(zhì)對原始物質(zhì)應(yīng)用赤鐵礦(100μmolFe/kg)24小時(shí)之后不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度的定量評估(由圖5)圖7改性物質(zhì)對原始物質(zhì)應(yīng)用赤鐵礦(100μmolFe/kg)24小時(shí)之后不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度的定量評估(由圖5)包含特殊顆粒相對淋巴結(jié)信號強(qiáng)度(圖6＝SE；圖7＝GE)抵觸的分析明確表明與原始物質(zhì)相比，改性物質(zhì)更均勻地聚集在淋巴結(jié)上。由具有葡聚糖FP1第二涂層的改性物質(zhì)引起的下頜骨、腋窩、髂骨、國骨淋巴結(jié)的淋巴信號降低以及在整個淋巴結(jié)組中的平均聚集量與非特殊母體化合物(圖6和7)大不相同(T-試驗(yàn)，p＜0.05)。通過觀察圖5中各個淋巴結(jié)的“黑化”(圖5)可令人信服地揭示本發(fā)明特殊顆粒的優(yōu)勢。在所有被檢測的淋巴結(jié)中的均勻分布是非常顯著的。應(yīng)用實(shí)施例E2·兔中磁共振淋巴系造影術(shù)目的進(jìn)行母體化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)與根據(jù)解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之間的淋巴結(jié)的不同淋巴結(jié)/組中的相對信號強(qiáng)度的比較。物質(zhì)特殊納未級顆粒(實(shí)施例D2)；比較＝實(shí)施例C2的基本結(jié)構(gòu)單元(＝?jīng)]有靶向聚合物的D2)劑量150μmolFe/kg體重(體重wt)時(shí)間24小時(shí)p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X線體層照相術(shù)(SE和GE方法)(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)體內(nèi)模型具有誘導(dǎo)的淋巴結(jié)增生的兔體外模型瓊脂糖人體模型結(jié)果圖8在質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片。(左對比前；右特殊物質(zhì)D2(150μmolFe/kg))。圖9在質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(proton-densityweightedspinechosequence)(SE2000/15)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片。(左對比前；右特殊物質(zhì)D2(150μmolFe/kg))。圖10特殊納米級顆粒對非特殊顆粒不同兔24小時(shí)p.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度。(根據(jù)圖8和9的定量評估)。圖11在T2*-負(fù)荷的梯度回聲序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片。(左對比前；右特殊物質(zhì)D2(150μmolFe/kg))。圖12在T2*-負(fù)荷的梯度回聲序列(weightedgradientechosequence)(GE135/15/15°)中兔的骨盆區(qū)域的正面對比前后磁共振X線體層照片。(左對比前；右特殊物質(zhì)D2(150μmolFe/kg))。圖13改性物質(zhì)對原物質(zhì)不同兔24hp.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度。(根據(jù)圖11和12定量評估)圖14兔的瓊脂糖包埋的淋巴結(jié)體外磁共振X線體層照片(GE序列)；劑量150μmolFe/kg；左非特殊對照顆粒；右特殊納米級顆粒。圖15特殊納米級顆粒對非特殊顆粒不同兔24小時(shí)p.i.(150μmolFe/kg，n＝3)淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度包含特殊顆粒相對淋巴結(jié)信號強(qiáng)度(圖8、9＝SE；圖11、12＝GE)抵觸的分析明確表明與原始物質(zhì)相比，改性物質(zhì)更均勻地聚集在淋巴結(jié)上。由具有葡聚糖FP1第二涂層的改性物質(zhì)引起的髂骨下、髂骨、國骨淋巴結(jié)的淋巴信號降低(GE序列)以及在整個淋巴結(jié)組中的平均聚集量與未改性的對照顆粒(圖13)大不相同(成對t-試驗(yàn)，p＜0.05)。在瓊脂糖包埋的淋巴結(jié)的磁共振X線體層照相術(shù)圖片(圖14)中可清楚地看到更均勻的淋巴結(jié)信號之間的抵觸；與在大鼠中觀察到的類似，對照物質(zhì)顯示出了很強(qiáng)的信號降低，所述降低僅限于腸系膜淋巴結(jié)。應(yīng)用實(shí)施例E3·在大鼠中，淋巴結(jié)聚集對劑量的依賴關(guān)系目的進(jìn)行作為應(yīng)用劑量函數(shù)的母體化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)與根據(jù)解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之間的淋巴結(jié)的不同淋巴結(jié)/組中的相對信號強(qiáng)度的比較。物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)；比較＝實(shí)施例C2的基本結(jié)構(gòu)單元(＝?jīng)]有靶向聚合物的D2)劑量50-200μmolFe/kg體重；(n＝3/劑量)時(shí)間24小時(shí)p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X線體層照相術(shù)(SE和GE方法)(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)體外模型瓊脂糖人體模型(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)結(jié)果圖16實(shí)施例D2特殊納米級顆粒對非特殊顆粒不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為注射納米級顆粒后靜脈內(nèi)應(yīng)用24小時(shí)的劑量的函數(shù)圖17實(shí)施例D2特殊納米級顆粒對非特殊顆粒相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用顆粒24小時(shí)后不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°的劑量的函數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在半劑量(200μmolFe/kg(C2)對100μmolFe/kg(D2))時(shí)，對于除了腸系膜和腹溝股淋巴結(jié)之外的所有淋巴結(jié)組，信號降低(p＜0.05)隨著實(shí)施例D2母體化合物改性而大大地改性。當(dāng)觀察所有淋巴結(jié)的平均信號抵觸時(shí)，這種顯著差異也是明顯的(參見表11)。表11作為所應(yīng)用的物質(zhì)和劑量函數(shù)的所有淋巴結(jié)平均相對信號強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)用實(shí)施例E4·大鼠中淋巴結(jié)聚集的時(shí)間依賴關(guān)系目的進(jìn)行作為應(yīng)用后時(shí)間函數(shù)的母體化合物(合成聚合物＝靶向聚合物)與根據(jù)解吸-吸附-方法制得的改性物(合成聚合物≠靶向聚合物)之間的淋巴結(jié)的不同淋巴結(jié)/組中的相對信號強(qiáng)度的比較。物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)；比較＝實(shí)施例C2的基本結(jié)構(gòu)單元(＝?jīng)]有靶向聚合物的D2)劑量200μmolFe/kg體重(體重wt)；(n＝3/時(shí)間)時(shí)間4-168小時(shí)p.i.(注射之后)方法磁共振X線體層照相術(shù)(SE和GE方法)(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)體外模型瓊脂糖人體模型(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)結(jié)果圖18實(shí)施例C2的對照物質(zhì)不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用后時(shí)間的函數(shù)。圖19實(shí)施例D2的特殊納米級顆粒不同大鼠淋巴結(jié)中SE2000/15相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用后時(shí)間的函數(shù)。圖20實(shí)施例C2的對照物質(zhì)不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用后時(shí)間的函數(shù)。圖21實(shí)施例D2的特殊納米級顆粒不同大鼠淋巴結(jié)中GE135/15/15°相對信號強(qiáng)度作為應(yīng)用后時(shí)間的函數(shù)。對靜脈內(nèi)應(yīng)用物質(zhì)后的淋巴結(jié)信號降低的與時(shí)間有關(guān)的磁共振X線體層照相研究清楚地表明與實(shí)施例D2的特殊改性物質(zhì)相比，非特殊母體物質(zhì)在淋巴結(jié)中形成了較不均勻的信號降低。應(yīng)用實(shí)施例E5·與物理治療手段的結(jié)合溫度目的進(jìn)行作為由熱浴調(diào)節(jié)的體溫的函數(shù)，在淋巴結(jié)的各種淋巴結(jié)/組中相對信號強(qiáng)度比較物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)；劑量100μmolFe/kg體重(體重wt)；(n＝3/組)時(shí)間24小時(shí)p.i.(注射之后)磁共振方法磁共振X線體層照相術(shù)(SE和GE方法)高溫模型為了研究熱對各種淋巴結(jié)組中對比介質(zhì)的聚集影響，將大鼠麻醉3-4小時(shí)，然后部分置于水浴中2小時(shí)。大鼠身體的左側(cè)放在熱板上，右側(cè)放在不加熱的相同高度的合成絕緣板上。這種安排使得大鼠身體左側(cè)和右側(cè)上水溫不同。大鼠左肩下的初始水溫為41.0-41.5℃，30分鐘后達(dá)到恒定值41.5-42.0℃。大鼠左肩下的初始水溫為37.0-37.5℃，30分鐘后達(dá)到恒定值37.5-38.0℃。置于水浴中30分鐘后，以劑量為100μmolFe/kg體重wt在大鼠靜脈內(nèi)注射(靜脈注射造影劑)納米級顆粒。再在恒溫水浴中維持1.5小時(shí)之后，將大鼠放回籠內(nèi)，注射24小時(shí)后制備淋巴結(jié)并利用磁共振X線體層照相術(shù)檢查。結(jié)果圖22在淋巴結(jié)中有意應(yīng)用熱對聚集的影響。評估左側(cè)對比前圖片中的亮點(diǎn)只可能是國淋巴結(jié)。右側(cè)圖片深刻地說明了熱處理的影響。動脈粥樣硬化大鼠的左側(cè)躺在絕緣合成板上并具有正常體溫，而右側(cè)置于41.5-42.0℃的水浴中加熱。“冷的”一側(cè)顯示很少或沒有聚集，而熱的一側(cè)在淋巴結(jié)內(nèi)顯示出均勻的納米級顆粒聚集。(實(shí)施例D2的納米級顆粒；100μmolFe/kg體重；24hp.i.；GE135/15/15)。體內(nèi)X線體層照片(圖22)清楚地表明了熱處理的作用。冷的未經(jīng)處理的大鼠身體左側(cè)國淋巴結(jié)中沒有可觀察到的聚集，而在熱的右側(cè)國淋巴結(jié)中卻顯示出了很高且均勻的檢測信號降低(聚集)。將大鼠麻醉并將其置于熱浴中可特別清楚地顯示熱的作用。麻醉可造成末梢肌肉活性停止，消除了淋巴的流動，降低了血管的滲透性。因此在不加熱下實(shí)際上測不到納米級顆粒的聚集。應(yīng)用實(shí)施例E6·磁共振血管造影術(shù)物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)劑量20μmolFe/kgi.v.時(shí)間0-2小時(shí)p.i.磁共振設(shè)備儀器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X線體層照片磁共振參數(shù)利用T1-負(fù)荷的SE序列(TR200ms，TE10ms)進(jìn)行橫斷動力學(xué)研究，觀察區(qū)域(FOV)＝170mm，型片256×256；SD3mm；3D快速冠狀MIPS(TR40(60)ms，TE6ms，F(xiàn)A60(40)°)FOV240mm，型片256×256；；SD17mm；磁共振評估用戶定義的感興趣的血管(腔靜脈)、肝臟、脂肪和肌肉區(qū)域中的信號強(qiáng)度。信號強(qiáng)度是標(biāo)準(zhǔn)化的且是指背景。結(jié)果圖23大鼠腹部的橫斷動力學(xué)研究，所述研究是在靜脈內(nèi)注射實(shí)施例D2的特殊納米級顆粒(劑量20μmolFe/kg)后利用T1-負(fù)荷SE序列(T1-weightedSEsequence)(TR200ms，TE10ms)進(jìn)行的；在肝內(nèi)血管和腔靜脈中增強(qiáng)清楚的信號(1分鐘p.i.)。圖24對實(shí)施例D2特殊納米級顆粒和實(shí)施例C2非特殊對照物質(zhì)在靜脈血管和肝臟實(shí)體中SETR/TE200ms/10ms的相對信號強(qiáng)度的比較；劑量為20μmolFe/kg。圖25對實(shí)施例D2特殊納米級顆粒(左)和實(shí)施例C2非特殊顆粒(右)的3D快速X線體層照片(TR40ms，TE6ms，F(xiàn)A60°)的冠狀MIPS(最大強(qiáng)度投影)圖23和25清楚地表明了與實(shí)施例C2母體物質(zhì)相比的特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)的優(yōu)點(diǎn)。腔靜脈或肝臟實(shí)體中的總結(jié)性信號時(shí)間歷程圖形(圖24)揭示了用作磁共振血管造影術(shù)中對比介質(zhì)的特殊納米級顆粒的優(yōu)良性能。增量比參照物質(zhì)高3倍，發(fā)亮作用(brighteningeffect)持續(xù)很長時(shí)間且很穩(wěn)定(診斷時(shí)間窗口＞60分鐘)。應(yīng)用實(shí)施例E7·健康大鼠及攜帶腫瘤的兔中淋巴結(jié)的造影術(shù)目的證明本發(fā)明納米級顆粒用作外科藥物可見標(biāo)記物質(zhì)的適用性物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)動物大鼠，SPFHan-Wistar，大約150g；俄羅斯兔(ChbbHM，ThomaeGmbh)，移植了V×2腫瘤(DeutschesKrebsforschungszentrum腫瘤庫，Heidelberg)，大約2.6kg。腫瘤是通過在股骨尾部外側(cè)肌肉中注射3×106個肝腫瘤細(xì)胞植入的。移植后吸收20天。劑量大鼠靜脈內(nèi)注射500μmolFe/kg體重兔每爪間質(zhì)應(yīng)用20μmol時(shí)間大鼠1、4和24小時(shí)p.i.兔12小時(shí)p.I.結(jié)果圖26說明作為健康大鼠中淋巴結(jié)可見檢測中“手術(shù)內(nèi)”標(biāo)記物質(zhì)適應(yīng)性的本發(fā)明納米級顆粒(全圖)圖27說明作為健康大鼠中淋巴結(jié)可見檢測中“手術(shù)內(nèi)”標(biāo)記物質(zhì)適應(yīng)性的本發(fā)明納米級顆粒(詳圖)圖28兔中轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)可見檢測的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的論證。轉(zhuǎn)移瘤可通過淋巴結(jié)中的亮的凹進(jìn)部分辨認(rèn)，淋巴結(jié)的其它部分為黑色。大鼠成像(圖26和27)顯示大量改變的淋巴結(jié)/淋巴結(jié)組可通過單獨(dú)地靜脈內(nèi)應(yīng)用納米級顆粒溶液而染色。淋巴結(jié)可清楚地從周圍組織中分辨出來，因此如果需要的話，可通過容易地用于檢測外科手術(shù)摘除。VX2攜帶腫瘤兔的研究表明間質(zhì)應(yīng)用后，支流區(qū)域中的淋巴結(jié)可被特殊納米級顆粒均勻地染色；小的轉(zhuǎn)移瘤可在染黑的健康淋巴組織中以亮隱窩形式可見分辨(圖28)。應(yīng)用實(shí)施例E8·證實(shí)特殊納米級顆粒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖C實(shí)具有轉(zhuǎn)鐵蛋白第二涂層(靶向聚合物)納米級顆粒的特殊細(xì)胞吸收(受體媒介的細(xì)胞攝粒作用)物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D6)比較實(shí)施例C1的基本物質(zhì)(沒有轉(zhuǎn)鐵蛋白的D6)濃度0.5mmolFe/l介質(zhì)時(shí)間37℃下培養(yǎng)18小時(shí)；5％CO2-95％空氣細(xì)胞培養(yǎng)·人體骨髓瘤細(xì)胞的吸收在至少1×106細(xì)胞/mlRPMI164010％FCS(胎兒腓腸血清)和0.05mmol/L2-巰基乙醇(37℃，5％二氧化碳；225cm2培養(yǎng)燒瓶)濃度下培養(yǎng)人體骨髓瘤細(xì)胞(ATCCCRL9068；細(xì)胞系NCI929)。當(dāng)細(xì)胞濃度到達(dá)大約1.5×106細(xì)胞/ml時(shí)，將其離心并在新鮮間質(zhì)中再懸浮。細(xì)胞與納米級顆粒一起在濃度為0.5mmol/l(以鐵計(jì)算)下培養(yǎng)18小時(shí)。將細(xì)胞制成小丸并用PBS洗滌。然后確定細(xì)胞數(shù)量(Neubauer計(jì)數(shù)室)。通過加熱將細(xì)胞丸溶解在濃度為500μl硝酸/100μl過氧化氫溶液中并裝至體積為5.0ml。然后利用原子發(fā)射光譜(AES，檢測極限為0.1ppm)確定鐵濃度。結(jié)果圖29與非特殊對照物質(zhì)(不含轉(zhuǎn)鐵蛋白的納米級顆粒)對比的特殊納米級顆粒(含轉(zhuǎn)鐵蛋白)的細(xì)胞X線體層照片。NCI細(xì)胞(人的骨髓瘤細(xì)胞系)聚集了接近兩倍于對照顆粒的特殊顆粒。特殊納米級顆粒清楚地更大程度地被NCI骨髓瘤細(xì)胞吸收。低于50％不含靶向聚合物的納米級顆粒被吸收的事實(shí)證實(shí)了本發(fā)明的特殊納米級顆粒設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用實(shí)施例E9·Watanabe兔中動脈粥樣硬化成像(斑塊造影)目的利用納米級顆粒在兔中進(jìn)行動脈粥樣硬化斑塊造影，所述納米級顆粒根據(jù)解吸-吸附方法涂有對斑塊具有親和力的肽(第二涂層，靶向聚合物)。物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D7)劑量200μmolFe/kg體重(體重wt)時(shí)間5小時(shí)p.i.(注射之后)磁共振方法儀器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X線體層照片磁共振參數(shù)觀察區(qū)域(FOV)＝150mm，型片256×256；片厚＝3mm；剖面取向＝正面序列1質(zhì)子-密度-負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(SE)，TR＝2000ms和TE＝15ms序列2T2-負(fù)荷的梯度回聲序列(GE)，TR＝135ms和TE＝15ms，F(xiàn)A＝15°體外模型瓊脂糖人體模型(參見應(yīng)用實(shí)施例E1)切除主動脈，小心地切開并用冷的PBS溶液沖洗，從而除去游離的納米級顆?；蛭幢晃盏哪切┘{米級顆粒。然后將主動脈二等分，倒入瓊脂糖人體模型中并利用磁共振X線體層照相術(shù)檢查。組織學(xué)Prussian藍(lán)染色結(jié)果圖30含實(shí)施例D7改性納米級顆粒(劑量200μmolFe/kg，主動脈切除5hp.i.)的兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊的體外磁共振X線體層照片圖；左側(cè)質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列；右側(cè)T*負(fù)荷梯度回聲序列。圖31具有Prussian藍(lán)染色的兔主動脈的動脈粥樣硬化膜中鐵的組織學(xué)檢測(上)。與磁共振X線體層照片(GE135/15/15°)比較表明由于納米級顆粒的聚集，組織學(xué)檢測的鐵位于成像中清楚信號降低的地方。在靜脈內(nèi)給予200μmolFe/kgD7特殊納米級顆粒5小時(shí)后切除主動脈。圖32Watanabe兔主動脈中實(shí)施例E6納米級顆粒聚集的組織化學(xué)檢測(Prussian藍(lán)染色)。圖的上面部分給出了在瓊脂上制備的主動脈全圖，下面部分上面了主動脈弓中鐵染色(藍(lán)色顆粒)與可見檢測斑塊之間的良好對應(yīng)關(guān)系，所述斑塊已改變到了相當(dāng)?shù)某潭取Ｖ苽渲鲃用}的磁共振X線體層照片(“體內(nèi)X線體層照片”)描述了作為黑點(diǎn)的斑塊(信號降低)。當(dāng)與磁共振X線體層照片(GE135/15/15°)相比，通過Prussian藍(lán)染色(鐵)方法的組織學(xué)證據(jù)顯示檢測的鐵位于成像顯示由納米級顆粒聚集引起的明顯信號降低的地方。磁共振X線體層照片的結(jié)果與清楚可見的斑塊是一致的。最廣闊的斑塊位于主動脈弓處，這已由磁共振X線體層照片和組織學(xué)觀察所證實(shí)；在磁共振X線體層照片和組織學(xué)圖片中也可很好地檢測更小的斑塊。應(yīng)用實(shí)施例E10·在攜帶腫瘤的小鼠中研究腫瘤中的聚集目的證明納米級顆?？删奂谀[瘤中。試驗(yàn)表明一方面，顆粒是化學(xué)治療劑的適合載體，另一方面，納米級顆?？蓭椭鷻z查治療劑是否到達(dá)所需的作用地點(diǎn)即腫瘤，因此這是一個診斷和治療的結(jié)合應(yīng)用。物質(zhì)特殊納米級顆粒(實(shí)施例D2)動物具有植入治療的瑞士裸體小鼠；(n＝5/劑量)(LS174T，s.c.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用10天)麻醉法Rompun/Ketavet(1∶1)，大約0.5ml/kg體重i.m.劑量200μmolFe/kg體重(體重wt)時(shí)間應(yīng)用后0-120分鐘和12或24小時(shí)磁共振方法儀器SiemensMagnetom1.5TMR，具有末端旋管的全身X線體層照片磁共振參數(shù)觀察區(qū)域(FOV)＝150mm，型片256×256；片厚＝3mm；剖面取向＝正面序列1質(zhì)子-密度-負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(SE)，TR＝2000ms和TE＝15ms序列2T2-負(fù)荷的梯度回聲序列(GE)，TR/TE＝300ms/15ms磁共振評估用戶定義的感興趣的腫瘤、肌肉、脂肪和背景區(qū)域中的信號強(qiáng)度。不同組織中的相對信號強(qiáng)度是標(biāo)準(zhǔn)化的且是指脂肪中的信號強(qiáng)度。結(jié)果圖33靜脈內(nèi)注射實(shí)施例D2納米級顆粒(200μmolFe/kg)后腫瘤信號行為的橫斷T1-負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲動力學(xué)研究(TR300ms，TE15ms)。X線體層照片表明隨著空間要求清楚的邊界的增長，腫瘤中與時(shí)間有關(guān)的信號增量(聚集)也慢慢地增長。圖34腫瘤中相對信號強(qiáng)度(聚集)的過程對劑量為200μmolFe/kg體重wt的信號(增量)時(shí)間歷程(SE2000/15)。圖35應(yīng)用實(shí)施例D2納米級顆粒(200μmolFe/kg)后與時(shí)間有關(guān)的橫斷質(zhì)子-密度負(fù)荷(SE2000/15)X線體層照片。在T1負(fù)荷和質(zhì)子-密度負(fù)荷的旋轉(zhuǎn)回聲序列(圖33、35)中發(fā)現(xiàn)腫瘤中納米級顆粒的聚集與信號增量在時(shí)間上的線性增長有關(guān)。注射135分鐘后可觀察到35至40％的信號增量，這就可以明顯地區(qū)分腫瘤與健康組織并確定納米級顆粒的聚集。與這里觀察到的現(xiàn)象不同，血管照相術(shù)研究發(fā)現(xiàn)由灌注法形成的腫瘤中的增量將在最多30分鐘之后完全消失(p.i.)。權(quán)利要求1.納米級顆粒，其特征在于所述顆粒是由含鐵核、第一涂層(合成聚合物)和第二涂層(靶向聚合物)以及任意的藥物助劑、藥物和/或吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1的納米級顆粒，其特征在于含鐵核和第一涂層的基本結(jié)構(gòu)單元在溶液中的流體動力學(xué)直徑小于100nm且不大于所述含鐵核直徑的5倍。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的納米級顆粒，其特征在于含鐵核是由磁鐵礦和/或赤鐵礦組成，或者含有這兩種化合物中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的納米級顆粒，其特征在于含鐵核中最多有25％重量的鐵被其它金屬離子取代。5.根據(jù)權(quán)利要求4的納米級顆粒，其特征在于非鐵金屬離子為順磁、抗磁或順磁和抗磁金屬離子的混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5至少之一的納米級顆粒，其特征在于由電子顯微鏡測定的含鐵核直徑為小于30nm，所述核含有最少50個金屬離子，所述顆粒大小分布為至少90％的含鐵核在0.7×平均直徑至1.3×平均直徑倍之間。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6至少之一的納米級顆粒，其特征在于所述顆粒中合成聚合物含量為存在的總體金屬離子的0.01至1倍之間[w/w]。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7至少之一的納米級顆粒，其特征在于合成聚合物為單體或聚合物物質(zhì)、或這些物質(zhì)或衍生物的混合物、或具有官能團(tuán)的衍生物的混合物、或另外取代的衍生物的混合物，所述合成聚合物的分子量小于100,000Da。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8至少之一的納米級顆粒，其特征在于合成聚合物為葡聚糖或其衍生物或葡聚糖和/或葡聚糖衍生物的混合物。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的納米級顆粒，其特征在于合成聚合物分子中含有一個或幾個酸基團(tuán)或幾個含N、S、P或O原子的官能團(tuán)。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10至少之一的納米級顆粒，其特征在于靶向聚合物和合成聚合物為相同或不同物質(zhì)或?yàn)檫@些物質(zhì)的混合物。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11至少之一的納米級顆粒，其特征在于靶向聚合物含量為存在的總體金屬離子的0.5至50倍[w/w]。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12至少之一的納米級顆粒，其特征在于所述顆粒中吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑含量小于或等于所含金屬離子總重量。14.根據(jù)權(quán)利要求13的納米級顆粒，其特征在于所述顆粒含有作為吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑的肽。15.根據(jù)權(quán)利要求1至14至少之一的納米級顆粒，其特征在于所有成分的流體動力學(xué)直徑不大于含鐵核直徑的10倍及基本結(jié)構(gòu)單元直徑的1.2倍。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15至少之一的納米級顆粒，其特征在于所述顆粒是由各個單元如基本結(jié)構(gòu)單元、靶向聚合物、藥物和吸附調(diào)節(jié)劑組成，這些單元可在任何時(shí)間組合。17.制備權(quán)利要求1納米級顆粒的方法，其特征在于第一步為在合成聚合物存在下，利用堿處理，制得含鐵核；第二步為通過解吸方法改變離子與合成聚合物的比例；第三步為吸附靶向聚合物，以及任意地，加入吸附調(diào)節(jié)劑/增強(qiáng)劑、藥物助劑和/或藥物。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于鐵(II)和鐵(III)鹽用于制備含鐵核，其中二價(jià)與三價(jià)離子的比例為1∶1至1∶20。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其特征在于將鐵(III)鹽混合物與還原劑一起用于制備含鐵核，其中還原劑的量以能夠產(chǎn)生鐵(II)與鐵(III)比例為1∶1至1∶20為準(zhǔn)。20.根據(jù)權(quán)利要求17至19至少之一的方法，其特征在于所用的鐵化合物表示無機(jī)和有機(jī)鹽的任何混合物及其配合物。21.根據(jù)權(quán)利要求17至20至少之一的方法，其特征在于含鐵晶體是通過混合分別產(chǎn)生的氫氧化鐵(II)和氫氧化鐵(III)溶液制得的。22.根據(jù)權(quán)利要求17至21至少之一的方法，其特征在于含鐵核中最多有25％重量的鐵被其它金屬離子取代。23.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于非鐵金屬離子為順磁、抗磁或順磁和抗磁金屬離子的混合物。24.根據(jù)權(quán)利要求17至23至少之一的方法，其特征在于能夠?qū)⒂沙恋懋a(chǎn)生的晶體分離開來的物質(zhì)或物質(zhì)的組合物用作合成聚合物，在反應(yīng)混合物中合成聚合物的量大于所含金屬離子重量的0.5至20倍，但不大于反應(yīng)混合物的50％(g/v)。25.根據(jù)權(quán)利要求17至24至少之一的方法，其特征在于0.1至10N的堿用于沉淀鐵化合物，所述堿是快速加入的。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于氨氣或鹽、胺或胺衍生物或揮發(fā)性緩沖劑用于沉淀鐵化合物。27.根據(jù)權(quán)利要求17至26至少之一的方法，其特征在于基本結(jié)構(gòu)單元是在0℃至120℃溫度范圍內(nèi)合成的。28.根據(jù)權(quán)利要求17至27至少之一的方法，其特征在于鐵與合成聚合物的比例為1∶0.01至1∶1[w/w]。29.根據(jù)權(quán)利要求17至28至少之一的方法，其特征在于靶向聚合物的加入量是以存在的金屬離子與靶向聚合物的比例為1∶0.5至1∶50為準(zhǔn)選擇的。30.根據(jù)權(quán)利要求17至29至少之一的方法，其特征在于納米級顆粒是穩(wěn)定溶膠或凍干劑，可利用簡單的溶劑恢復(fù)成溶液，或者基本結(jié)構(gòu)單元、靶向聚合物和任意的助劑是可得到的分開的溶液或凍干劑，它們可在特定的時(shí)間混合制得可應(yīng)用的溶液。31.根據(jù)權(quán)利要求17至30至少之一的方法，其特征在于納米級顆粒的各個單元可在任何時(shí)間組合。32.作為診斷對比介質(zhì)的納米級顆粒的用途，用作醫(yī)學(xué)如手術(shù)中可見標(biāo)記物質(zhì)，以及用作活性劑的載體或用作治療目的的活性劑。全文摘要本發(fā)明公開了單元含鐵納米級顆粒及其制備和在診斷和治療中的應(yīng)用。所述顆粒的特征在于其具有含鐵核、第一涂層(合成聚合物)和第二涂層(靶向聚合物)，以及任意的輔助性藥用物質(zhì)、藥物和/或吸附介質(zhì)。文檔編號A61K47/02GK1155844SQ95194525公開日1997年7月30日申請日期1995年7月10日優(yōu)先權(quán)日1994年8月4日發(fā)明者M(jìn)·克里斯,D·普費(fèi)夫里爾,R·拉瓦澤克,S·瓦格納,W·埃伯特,V·埃爾斯特,W·塞姆勒,M·塔尤皮茲,J·加達(dá),A·赫爾曼,M·朱克爾,U·斯維德斯基申請人:柏林弗賴恩大學(xué)診斷研究學(xué)院有限公司