專利名稱：信號(hào)蛋白質(zhì)和肽的漸進(jìn)修飾，超激動(dòng)劑與拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的科學(xué)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物活性蛋白質(zhì)和肽的化學(xué)修飾技術(shù)的領(lǐng)域。特別是關(guān)于應(yīng)用化學(xué)修飾以得到具有優(yōu)良的性質(zhì)或具有新的甚至拮抗性質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽。且，本發(fā)明還涉及一種用漸進(jìn)化學(xué)修飾，一種生物原則，作結(jié)構(gòu)-功能分析的新方法，也就是信號(hào)肽的催化活性及成功的消除導(dǎo)致為一種很有效的急性骨髓性白血病細(xì)胞的抑制劑。
如所說明，但并非作為局限，我們出示人類IL-3的化學(xué)修飾，一種經(jīng)修飾后也具實(shí)質(zhì)的治療價(jià)值的蛋白質(zhì)。本專利說明書也包括本發(fā)明治療范圍內(nèi)的特定實(shí)例。應(yīng)用的方面有兩個(gè)對(duì)一發(fā)明來說是重要的可能應(yīng)用方面一個(gè)方面是具有優(yōu)良性質(zhì)的IL-3(超激動(dòng)劑)或另一方面是具有相反作用或新的性質(zhì)的IL-3(拮抗劑)。在本專利說明書中超激動(dòng)劑為例如一種具有低抗原性和/或較高生物活性和/或較高穩(wěn)定性的IL-3。
IL-3超激動(dòng)劑的可能應(yīng)用為-脊髓切除治療后，如骨髓移植誘導(dǎo)治療后或放射意外事故后的紅細(xì)胞相減少。
-具有IL-3受體的細(xì)胞同步細(xì)胞周期的誘導(dǎo)，例如白血病的化學(xué)治療。
-從細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的活性兩方面增強(qiáng)依賴IL-3的細(xì)胞后代的誘導(dǎo)，用于治療疾病如蠕蟲感染，結(jié)核病真菌感染和某些病毒感染。
-選擇性的向除淋巴細(xì)胞外的含核細(xì)胞派生骨髓，例如用于燒傷和非同源的皮膚移植。
一些，但非所有的，信號(hào)物質(zhì)拮抗劑(具有拮抗或細(xì)胞抑制活性)的應(yīng)用實(shí)例，特別是IL-3，為-骨髓移植中骨髓細(xì)胞的抑制和/或中和(neutralization)。
-自動(dòng)免疫疾病，癌癥和造血器官中的髓抑制，如鐮刀細(xì)胞貧血和地中海貧血(thallisemia)。
-治療涉及具有IL-3受體細(xì)胞的所有癌癥，特別是幾乎所有類型的急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病，B-細(xì)胞淋巴癌，和被IL-3刺激的其他類型的癌，例如某些濾泡細(xì)胞癌。
-向自動(dòng)免疫性疾病如關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組織通過抑制或消除含有IL-3受體的淋巴細(xì)胞來誘導(dǎo)自身耐受性。這也能導(dǎo)致效應(yīng)器細(xì)胞如嗜酸性粒性白細(xì)胞的生成減少和消除。最后，與這些細(xì)胞的直接相互作用使其直接治療嗜酸性細(xì)胞綜合癥也是可能的。這在蠕蟲感染急性期和例如對(duì)醫(yī)藥的過敏性反應(yīng)也是非常重要的。
-例如用殺死效應(yīng)器細(xì)胞或抑制其數(shù)目治療嗜酸性細(xì)胞綜合癥如嗜酸性細(xì)胞胃炎和腸炎，肋膜炎，肉芽腫，竇炎，肺炎，哮喘，Churg Strauss綜合癥和其他脈管炎休克綜合癥的處治。
-消除或抑制具有IL-3受體的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和/或效應(yīng)器細(xì)胞如嗜酸性粒性白細(xì)胞，以治療過敏癥。在這些情況下抑制過敏，和誘導(dǎo)對(duì)抗原的耐受性兩者都是可能的。
-其他涉及IL-3作用的過敏性反應(yīng)。
-處治以阻止由IL-3調(diào)節(jié)的粘連刺激的轉(zhuǎn)移。
-處治傳染性疾病，例如抑制在血流中有過量生長因子存在的急性期。
-由抑制B-細(xì)胞和B-細(xì)胞抗體的產(chǎn)生(它們保護(hù)HIV-病毒對(duì)抗宿主細(xì)胞的抵抗)治療HIV-感染和/或AIDS。
對(duì)其它生長因子，如其它白細(xì)胞介素1-8，GM-CSF，TNF和γ-IFN，上述這些應(yīng)用的一種或多種也可以提述，這些生長因子也是按照本發(fā)明修飾的良好候選物。以此“IL-3”將被其他信號(hào)物質(zhì)所代替。因?yàn)楦鞣N不同物質(zhì)在各種疾病中的相互作用模式可以因物質(zhì)而不同，也可發(fā)生一些協(xié)同的效應(yīng)。所以這些也包括在本發(fā)明中。最后，可以增加或特指下列的應(yīng)用。
-抑制IL-1以抑制IL-1刺激的黑素瘤的轉(zhuǎn)移和肺癌的形成。
-抑制IL-1以抑制阿爾茨海默疾病。
-抑制IL-2以抑制毛細(xì)血管破裂綜合癥。
-抑制IL-2以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制IL-4刺激的病毒，例如小鼠的放射白血病病毒。
-抑制IL-5以抑制IL-5刺激的呼吸道感染。
-抑制IL-6以抑制風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
-抑制IL-10抑制分枝桿菌感染。
體內(nèi)的實(shí)例表明存在有效地抑制AIDS-病毒感染的可能性。這種抑制是基于減低抗體水平，這是由抑制產(chǎn)生抗體的B-細(xì)胞而達(dá)到的。這種能導(dǎo)致有效的抑制AIDS的事實(shí)可歸因于下列的原因(1)HIV-病毒感染間質(zhì)(hystiocytic)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞)，這種感染優(yōu)選的是經(jīng)抗體的調(diào)理素作用。趨巨噬細(xì)胞性和這些間質(zhì)細(xì)胞感染的必要性以持續(xù)感染已在AIDS Res.and Human Retroviruses 9669(1993)和參考文獻(xiàn)中加以描述。減少抗體水平，這種類型的感染可被抑制。(2)拮抗體能夠保護(hù)HIV和/或HIV-感染的細(xì)胞，抵抗細(xì)胞的免疫性。這解釋了HIV感染無癥狀期的總體抵抗力的缺陷，盡管在體外中和抗體水平很高并顯示出細(xì)胞的抵抗力。如實(shí)例中所說明的，抗體水平的降低能造成有效的細(xì)胞免疫性以對(duì)抗病毒和病毒感染的細(xì)胞并甚至消除病毒。因此，例如以拮抗劑抑制B-細(xì)胞，能導(dǎo)致HIV感染的治療。
因?yàn)橐部捎煞肿由飳W(xué)產(chǎn)生修飾的信號(hào)蛋白質(zhì)，因此這些突變的蛋白質(zhì)，DNA-組建和它們的用途也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，應(yīng)是可以理解的。以此，可以包括含有這種肽和/或蛋白質(zhì)密碼組建的基因治療。基因治療的用途在于產(chǎn)生和排泄超激動(dòng)劑或拮抗劑的細(xì)胞。所以，在一個(gè)實(shí)例中也有關(guān)于組建具有減低穩(wěn)定性的生長因子可能性的細(xì)致工作。這特別能夠用于與拮抗作用的聯(lián)合，形成一種選擇性給藥，因此，拮抗劑的高速降解能將作用限制在很局部的環(huán)境中。這在實(shí)體腫瘤的基因治療中特別有興趣，如果有這樣一個(gè)細(xì)胞在腫瘤中或靠近腫痛，特別是此腫瘤將經(jīng)受最大效應(yīng)的暴露。如果產(chǎn)生的信號(hào)肽有附加的不穩(wěn)定性，那么肽的效應(yīng)會(huì)非常受局限，則可期望其產(chǎn)生很少的副反應(yīng)。在實(shí)例中有一個(gè)是說明產(chǎn)生低穩(wěn)定性的信號(hào)肽是可能的。因?yàn)檫@種肽也能用缺失和/或取代突變產(chǎn)生，因此這種基因治療的應(yīng)用和基因治療組建也被認(rèn)為是包括在本發(fā)明應(yīng)用的范圍之內(nèi)的。
本專利說明書在化學(xué)修飾的應(yīng)用，蛋白酶處理和質(zhì)譜法方面也詳細(xì)說明。這種方法可應(yīng)用于每一種肽或蛋白質(zhì)的每一個(gè)修飾，只要它能夠特異性地例如用蛋白酶斷裂。本說明書的定量的結(jié)構(gòu)-功能分析部分包括漸進(jìn)化學(xué)修飾，蛋白酶處理，激光解吸質(zhì)譜法與生物測(cè)定成功的聯(lián)合應(yīng)用。所以，此方法應(yīng)用于任何能被修飾的，特異性斷裂的和具有生物活性的肽和/或蛋白質(zhì)的分析，也被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可能應(yīng)用其他的質(zhì)譜分析技術(shù)如電子噴射質(zhì)譜法，這種方法特別適合于例如用外蛋白酶(exoprotease)處理后。
最后，本發(fā)明的說明書也公開了帶有多于一價(jià)電荷的金屬離子，特別是鋅離子的重要性，其重要性特別表現(xiàn)在催化活性和隨之而來的效用方面。因此由控制(局部)金屬離子的濃度來影響生長因子的作用是可能的。因?yàn)橐话憬饘匐x子濃度的效應(yīng)有最適宜值，所以任何低于或超出此適宜值的濃度均導(dǎo)致生長因子效用的降低。這可以控制生長因子的效用。用這種方法也可用金屬，優(yōu)選的為鋅離子，達(dá)到間接治療的效果。這可用油膏的形式治療皮膚疾病，如Wrath′s。使用吸入噴霧劑型用于治療肺部疾患也是可能的。本發(fā)明的背景人類白細(xì)胞介素-3白細(xì)胞介素-3，首次由T-細(xì)胞中分離出來，為一種糖蛋白，表明作用于骨髓細(xì)胞。已經(jīng)表明在有或沒有其他生長因子的情況下，可以由這些骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)各種血液細(xì)胞的形成。人類IL-3在1987年被Dorssers等人克隆，它們應(yīng)用人類cDNA庫并與小鼠DNA探針雜交(Gene 55115(1987))。人類白細(xì)胞介素-3的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系已經(jīng)發(fā)表了一些關(guān)于人類白細(xì)胞介素-3的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的文章(J.Biol.Chem.26621310(1991)；J.Clin.Invest.901879(1992)；J.Immunol.14683(1991)；EMBO J.102125(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911842(1992))。
在他們的研究中，他們?nèi)际褂梅肿由飳W(xué)技術(shù)，如缺失和取代突變的生成。在應(yīng)用取代突變時(shí)，選擇是基于IL-3與其他種類(小鼠，羅猴，猴，長臂猿)氨基酸的同源性，或基于慎重改變極性或結(jié)構(gòu)。缺失突變時(shí)是通過除去蛋白質(zhì)的各部分，考察其生物活性的重要性。因?yàn)樯婕巴蛔兊鞍踪|(zhì)(突變蛋白)精制的實(shí)際問題，這些突變蛋白質(zhì)均未核對(duì)其主結(jié)構(gòu)的變化。這是一個(gè)主要的問題，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)的變化通常是會(huì)發(fā)生。如所描述的，有時(shí)它們甚至是有意引入的。結(jié)果，關(guān)于涉及各種氨基酸與生物活性的關(guān)系，只能在有最大的保留的情況下才能說明。
本發(fā)明用不同的途徑。天然的IL-3用為起始原料。使用逐步漸進(jìn)地增加修飾，在化學(xué)反應(yīng)中引入超選擇性。與第一次生物活性變化同時(shí)發(fā)生的修飾可以用特異的蛋白酶和新形式的質(zhì)譜法容易地定域。結(jié)果，重要的氨基酸殘基可被快速的定位，同時(shí)最小的變化(因此最大的控制)可在引入或改變期望的性質(zhì)中達(dá)到。不需要純化修飾的物質(zhì)因此也沒有在精制中損失的問題。這也能使二級(jí)結(jié)構(gòu)的確認(rèn)變得容易。因此本發(fā)明與分子生物技術(shù)比較是一種改進(jìn)，這是因?yàn)楸就緩奖确肿由锏耐緩礁奖?，更好確認(rèn)和更快。修飾的生長因子超激動(dòng)劑經(jīng)過對(duì)各種生長因子的許多結(jié)構(gòu)-功能的研究，發(fā)現(xiàn)了具有改進(jìn)活性的突變蛋白。例如在歐洲專利申請(qǐng)EP-131816中其敘述的目標(biāo)為得到提高生物活性和/或低副反應(yīng)的β-干擾素。也提供了許多化學(xué)修飾的各種例子例如歐洲專利申請(qǐng)EP-236987敘述IL-2的修飾得到一種低毒性和低免疫性的并具有改進(jìn)的體內(nèi)清除動(dòng)力學(xué)的物質(zhì)。專利申請(qǐng)EP-0442724敘述PEG化的IL-6，其為一種具有較長半留存期和增強(qiáng)了生物活性的產(chǎn)物。專利申請(qǐng)W088/01511敘述IL-2琥珀?；?，由此成功地提高了溶解度。在這些專利應(yīng)用中除了使用誤差學(xué)試驗(yàn)方法即隨機(jī)適度地修飾，得到一種或幾種分子的修飾外沒有任何的修飾策略。況且，會(huì)發(fā)生精制中實(shí)質(zhì)上的損失，在IL-6琥珀酰化的例子中也有這種情況，只得到10％收率的期望蛋白質(zhì)。在這些發(fā)明中沒有做過修飾定位的工作。
本發(fā)明中幾乎沒有損失并且能夠很好地進(jìn)行修飾定位。更且，漸進(jìn)化學(xué)修飾甚至使在分子中一個(gè)位置進(jìn)行一個(gè)氨基酸殘基特定的修飾成為可能，正如實(shí)施例1和2所說明的。雖然大多數(shù)修飾是使用的非可逆的試劑，但也可以使用可逆的試劑，這也能進(jìn)行其他殘基的很特異的修飾。拮抗劑在歐洲專利申請(qǐng)EP-0413383A1中敘述了人類IL-3拮抗作用的突變體。然而在這個(gè)案例中只涉及保留的活性與其受體結(jié)合能力的比較關(guān)系，而并未顯示真正的對(duì)天然IL-3的活性抑制。
在專利申請(qǐng)PCT/US93/11197和PCT/US93/11198中權(quán)利要求涉及所有種類的IL-3突變體，但在這些案例中也沒有真正抑制活性的支持內(nèi)容。加之，具有最低活性的突變體不可能也是最好的抑制劑，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)變形的機(jī)遇要比特定地消除其催化活性的機(jī)遇高的多。
有其他受體的真正拮抗劑的報(bào)道牛生長激素(Endocrinology 1302284(1992))，小鼠白細(xì)胞介素-2(EMBO J.113905(1992))，人肝細(xì)胞生長因子(Biochemistry319555(1995))，IL-1(Scand J.Immunol.3627(1992))和IL-4(J.Exp.Med.1782213(1993))。在所有這些出版物中沒有敘述修飾的策略拮抗劑均為結(jié)構(gòu)-功能分析研究的副產(chǎn)物。更且，達(dá)到明顯抑制作用所需的抑制劑濃度平均要比天然生長因子的濃度高100倍。此濃度對(duì)這些拮抗劑的臨床價(jià)值是有害的。
生成生長因子拮抗劑的僅有策略曾應(yīng)用于人類的生長激素(Science2561677(1992))。這是基于破壞激素兩個(gè)受體結(jié)合部位中的一個(gè)部位。同樣，在此案例中受體結(jié)合能力降低系數(shù)為50，所以對(duì)比于生長因子需要使用成問題的過量抑制劑。
然而，用本發(fā)明可以得到可能應(yīng)用于臨床的抑制，甚至可能得到增強(qiáng)受體結(jié)合能力的抑制。這可用生長因子在與受體結(jié)合后顯示其某種催化活性的假說來加以解釋。此假設(shè)可由IL-3含有催化的鋅離子的事實(shí)加以支持(Biochem.Biophgs.Res.Commun.187859(1992))。生長因子不必含有完整的催化中心。只有在生長因子-受體結(jié)合中使催化中心成為完整是完全可能的。所以，有關(guān)的化學(xué)修飾應(yīng)盡可能特異性地指向那些直接或間接參與這種與鋅結(jié)合和/或催化的殘基而不使與受體的結(jié)合能力成為不正常。起始原料可以是任何含蛋白質(zhì)或肽的物質(zhì)?？墒?，因?yàn)殇\離子能保護(hù)蛋白質(zhì)不變性，或許需要使分子可逆地變性并加入螯合劑從分子中除去。做為一種說明，但不是作為對(duì)本發(fā)明的一種局限。敘述了IL-3用碘代-乙酸鹽修飾。在有關(guān)的pH下此修飾是指向His-殘基的烷基化?？墒沁@中方法也可由本領(lǐng)域人員用其他的試劑容易地進(jìn)行。關(guān)于其它參與催化活性和/或鋅結(jié)合的氨基酸的修飾也可同樣用所述的方法。這些殘基也可以用其他化學(xué)方法或分子生物學(xué)方法，例如用缺失或取代突變，容易地修飾。更且這個(gè)僅只限于IL-3。在各種細(xì)胞因子超家族受體中具有明顯的同源性例如白細(xì)胞介素2-7Epo和GM-CSF。在特異性鋅結(jié)合上也發(fā)現(xiàn)IL-2 IL-6 GM-CSF和γ-IFN具有相同的作用。本發(fā)明可應(yīng)用于更多的信號(hào)肽和/或蛋白質(zhì)也是可以想象的，因?yàn)槔缫葝u素，人類生長激素和催乳激素也具有特異的鋅結(jié)合性質(zhì)。更且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞系的IL-3可被例如胰島素代替。最后，生長因子的烷基化在生成拮抗劑或細(xì)胞抑制劑方面也可能有其它的機(jī)制。所以，一般烷基化，優(yōu)選的為碘代-乙酸鹽被認(rèn)為是本發(fā)明的獨(dú)立途徑。所以，所有上述的應(yīng)用和/或修飾的物質(zhì)和/或DNA-組建和它們的應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？笰IDS治療如已經(jīng)討論過的，本發(fā)明可能應(yīng)用于對(duì)抗AIDS。必須提供比現(xiàn)行可能性更好的與AIDS對(duì)抗的方法
在Csatary等人的專利USA 5215745中敘述了一種免疫治療抗AIDS的特異方法。在此案例中，鳥類副粘液病毒(avian paramyxovims)感染和/或鳥類輪狀病毒(avianrotavims)的特異病毒感染方法用來增加CD4正性細(xì)胞的數(shù)量。這能在最大限度的導(dǎo)致延緩疾病，因?yàn)樾律傻腃D4正性細(xì)胞在短時(shí)間后將被HIV感染。相反，我們的發(fā)明導(dǎo)致有效的細(xì)胞免疫-應(yīng)答，以對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)。
Berzofsky等人的專利USA 5081226是以特異免疫一應(yīng)答對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行治療。在此案例中，例如產(chǎn)生抗HIV糖蛋白160/120復(fù)合物的抗體。在我們的相當(dāng)本發(fā)明的研究中，這種途徑可導(dǎo)致保護(hù)HIV和它在間質(zhì)細(xì)胞(histiocytic cells)中結(jié)合，因此甚至可促進(jìn)疾病。結(jié)果此方法不能說明是有效的。
為此，專利USA 5256767敘述一種無包膜病毒亞單位疫苗。這種方法的倒退是基于這種事實(shí)，即親脂性的核部分不能在很低濃度下在MHC中最好地表達(dá)，所以不能提供有效的保護(hù)。
疫苗是基于結(jié)合上述兩個(gè)專利的目的的滅活病毒。
與上述問題相反，在我們的實(shí)施例7中我們敘述了在體內(nèi)HTL
(AIDS Researchand Reference Reagent Program Catalog，NIH Publication No．91-1536，Bethesda，MD，USA)在低水平的抗體下在體內(nèi)被消除。在正常條件下，已知寡克隆密集HTL
引起持續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。這也從John Moore組內(nèi)的一同工作的人因針意外事故被
感染來說明(AIDS.Res.Hum.Retrovir.6:307(1990)和J.Clin.Invest.91:1987(1992))。相反，從我們的例子可以推論如果抗體水平低，這些病毒能被消除。B-細(xì)胞的產(chǎn)生和隨之而來的抗體產(chǎn)生能被各種生長因子所刺激(例如IL-1-7和IL-11)。所以，用這些生長因子的拮抗劑來完成抗AIDS的治療是符合邏輯的。如此，AIDS的治療也被認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用?；瘜W(xué)修飾乙酸，二氧雜環(huán)己烷，賴氨酸鹽酸鹽和MES得自Sigma，修飾劑自Fluka得到。
緩沖劑乙酸鹽/NaOH用于pH5.0的修飾，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修飾。pH7.0用NaH2PO4/NaOH緩沖液。制備10倍濃度的貯備液，用0.22微米的過濾器直接過濾。
反應(yīng)混合物包括50mM緩沖液，2mg/ml hIL-3和分別為3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍濃度的貯備液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制。hIL-3的修飾在30℃進(jìn)行過夜。修飾后用SDS-電泳測(cè)定，說明IL-3未被降解。生物活性的測(cè)定MO-7細(xì)胞為Dr.I.P.Touw(Erasmus University of Rotterdam，荷蘭)贈(zèng)送的禮品，RPM1培養(yǎng)基得自Gibco(Paisly，UK)，補(bǔ)料小牛血清得自Hyclone(Logan，Utah，USA)。細(xì)胞培養(yǎng)基由帶10％牛血清的RPM1組成。在正常細(xì)胞組織培養(yǎng)中也加入100ng/ml的IL-3。
首先制備10倍的貯備液；在細(xì)胞培養(yǎng)基中含有從10μg/ml到1ng/ml范圍，以3倍連續(xù)稀釋制備，完全混勻后，25微升的貯備液加入到225微升的細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨后在37℃培養(yǎng)。六天組織培養(yǎng)用2×105MO7細(xì)胞/ml，10天組織培養(yǎng)用4×103MO7細(xì)胞/ml。在組織培養(yǎng)后，過夜用氚標(biāo)記胸苷摻入測(cè)定生物活性。從至少二個(gè)獨(dú)立的生長-應(yīng)答曲線測(cè)定出50％最大刺激濃度的平均值(和范圍)。修飾物的相對(duì)活性分別以修飾物的50％濃度和天然IL-3的50％濃度比值([IL-3修飾]50％/[IL-3天然]50％)測(cè)定。天然IL-3在第6天的標(biāo)準(zhǔn)活性為1.0百萬單位/mg蛋白質(zhì)(n＝10，σ(n-1)＝20％)。在第10天為0.2百萬單位/mg蛋白質(zhì)(n＝10，σ(n-1)＝30％)。結(jié)果關(guān)于按照組平均數(shù)的更精確特性的所有結(jié)果，特異性和在分子中修飾的位置將在本專利說書明的以后部分?jǐn)⑹?。生物測(cè)定的結(jié)果如表1所示表1乙?；疘L-3的相對(duì)生的活性乙酰化的pH 組織培養(yǎng)的平均相對(duì)活性(和活性范圍)6天后 10天后pH＝5.01.5(1.4-2.1)1.4(0.8-1.5)pH＝6.00.9(0.8-1.0)0.9(0.7-1.1)pH＝6.50.5(0.4-0.6)0.2(0.2-0.3)pH＝7.00.9(0.9-0.9)0.6(0.6-0.6)從上表可以得出結(jié)論，即在pH6.5和pH7.0修飾后6天與10天間相對(duì)活性有顯著的差別。所以可以設(shè)想，這表明產(chǎn)生了穩(wěn)定性顯著降低的物質(zhì)。在pH5時(shí)可能有增強(qiáng)的生物活性。更多的方面將在實(shí)施例5和6中討論。實(shí)施例2IL-3以琥珀酸酐的漸進(jìn)化學(xué)修飾產(chǎn)生一種具有增強(qiáng)活性和穩(wěn)定性的改進(jìn)IL-3。化學(xué)修飾乙酸，二氧雜環(huán)己烷，賴氨酸鹽酸鹽和MES得自Sigma，修飾試劑得自Fluka。
緩沖劑乙酸鹽/NaOH用于pH5.0的修飾，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修飾，在pH7.0用NaH2PO4/NaOH緩沖液。制備10倍濃度貯備液，用0.22微米的過濾器直接過濾。
反應(yīng)混合物包含50mM緩沖液，2mg/ml hIL-3和分別為3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍濃度的貯備液是在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮制備的。hIL-3的修飾在30℃進(jìn)行過夜。修飾后用SDS-電泳測(cè)定說明IL-3來被降解。結(jié)果關(guān)于按照組平均數(shù)的更精確特性的所有結(jié)果，特異性和在分子中修飾的位置將在本專利說明書的以后部分?jǐn)⑹觥Ｉ餃y(cè)定的結(jié)果(按實(shí)施例1進(jìn)行)如表2所示表2 琥珀?；疘L-3的相對(duì)活性琥珀?；膒H 組織培養(yǎng)的平均相對(duì)活性(和活性幅度)6天后 10天后pH＝5.01.7(1.6-2.0)1.6(1.3-2.5)pH＝6.01.4(1.2-1.8)1.3(1.3-1.4)pH＝6.50.4(0.4-0.5)0.4(0.4-0.5)pH＝7.00.3(0.3-0.3)0.3(0.2-0.3)從表2可以得出結(jié)論即在pH5琥珀?；瘜?dǎo)致活性的顯著增強(qiáng)同時(shí)在pH＝＞6琥珀酰化導(dǎo)致較低的活性。實(shí)施例3生物活性肽或蛋白質(zhì)化學(xué)修飾生成蛋白質(zhì)或肽拮抗劑的方法。材料和方法尿素，EDTA，MES和NaOH得自Sigma，碘代乙酸鈉得自Fluka。緩沖液MES/NaOH用于pH6.0的修飾。10倍濃度貯備液制備成含8M尿素，并在此后直接用0.22微米過濾器過濾滅菌。反應(yīng)混合物含50mM緩沖液，5.5M尿素和50mM EDTA。由這些試劑配制的10倍濃度在8M尿素中的貯備液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制。1.hIL-3的適度化學(xué)修飾碘代乙酸鹽以3，10和30mM的濃度加入。IL-3的濃度為2mg/ml。修飾在37℃進(jìn)行24，48和72小時(shí)，隨后以非變性電泳研究。2天后和30mM碘代乙酰鹽為最大的修飾，修飾的物質(zhì)沒有條帶的嚴(yán)重扭曲(分子嚴(yán)重變性的指示)。在這種情況下，留下的超始原料少于2％。因?yàn)樵谶@種情況下期望得到?jīng)]有發(fā)生蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性的最低的生物活性，此樣品用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。隨后，SDS電泳用于說明修飾后分子沒有降解。2.部分化學(xué)修飾為了使修飾的hIL-3有適當(dāng)?shù)囊种颇芰σ策M(jìn)行部分修飾。為此目的1mg/ml IL-3用10，30和100mM碘代乙酸鹽在37℃修飾18小時(shí)。在非變性電泳后考巴斯染色，100mM樣品得到最大的修飾時(shí)，凝膠帶沒有過量的扭曲，大約仍存在5％的起始原料。因?yàn)橹挥羞@個(gè)樣品在活性測(cè)試中顯示出抑制活性，此樣品用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。3.活性和抑制分析活性測(cè)試按實(shí)施例1敘述的進(jìn)行。對(duì)照和烷基化的IL-3生長應(yīng)答曲線((n＞＝2)是從1000至1ng/ml的范圍以10倍連續(xù)稀釋做成的。烷基化的IL-3的抑制活性是以與對(duì)照IL-3相同的滴定進(jìn)行的，但現(xiàn)在是在3ng/ml烷基化的IL-3存在下進(jìn)行的。
為了測(cè)定具有最大受體結(jié)合能力部分修飾的IL-3在有3ng/ml天然IL-3存在下以連續(xù)7倍稀釋來滴定。滴定范圍為15μg/ml至0.1ng/ml，同時(shí)滴定僅在4000 MO7/細(xì)胞/ml下進(jìn)行以排除饑餓現(xiàn)象。結(jié)果

圖1顯示修飾的IL-3能夠以10-100因數(shù)抑制對(duì)照的IL-3。更且3ng/ml的修飾IL-3能夠抑制30-100ng/ml對(duì)照IL-3胸苷摻入的80～90％。所以，修飾的IL-3不是只有抑制活性，它也具有增強(qiáng)的受體結(jié)合能力。這在部分修飾IL-3的滴定中也加以肯定(圖2)只需0.1ng的部分修飾的IL-3就足夠抑制3ng/ml天然IL-3活性的幾乎50％。實(shí)施例4為產(chǎn)生具有改變的穩(wěn)定性和/或活性的修飾IL-3使用的漸進(jìn)酶性外蛋白酶處理的方法。材料和方法外蛋白酶處理是用得自Boehringer的組織蛋白酶-C(Cathepsine-C)和羧肽酶-Y(Carboxypeptidase-Y)進(jìn)行的。1mg/ml的IL-3在37℃在蛋白酶存在下孵育18小時(shí)。組織蛋白酶-C是以1/2至1/128mg/ml的范圍連續(xù)兩倍稀釋加入。其他反應(yīng)條件如制造者所述。
生物活性按實(shí)施例1所述測(cè)定。結(jié)果此方法導(dǎo)致表3中的結(jié)果。表中未顯示修飾未導(dǎo)致生物活性的改變表3漸進(jìn)外蛋白酶處理后活性的變化蛋白酶處理 [蛋白酶] 組織培養(yǎng)的平均相對(duì)活性(和范圍)(mg/m1) 6天后 10天后羧肽酶Y 1/40 0.6 (0.5-0.7)1.0 (0.7-1.5)1/20 0.08 (0.07-0.10) 0.2 (0.13-0.21)1/10 ＜0.05(＜0.05) ＜0.05(＜0.05)組織蛋白酶C 1/322(2-6)1.0 (0.7-1.5)1/165(3-6)1.0 (0.9-1.1)1/8 3(2-4)1.3 (0.9-1.7)1/4 3(2-4)1.3 (0.9-2.1)從此表可得出結(jié)論，即用羧肽酶Y處理，在濃度為1/40和1/20時(shí)生成一種具有在第6天的相對(duì)活性低于在第10天的物質(zhì)。所以這表明與天然IL-3比較，此物質(zhì)的穩(wěn)定性較高。
從表中也可以得出結(jié)論，即組織蛋白酶C在第6天顯著增強(qiáng)了活性而不是在第10天。所以此物質(zhì)也有較低的穩(wěn)定性。實(shí)施例5用蛋白酶處理和質(zhì)譜法結(jié)合在肽或蛋白質(zhì)的定位修飾。材料和方法蛋白酶處理對(duì)于修飾殘基的定位修飾的物質(zhì)用適當(dāng)?shù)木彌_劑透析并隨后用Endo Glu-C或Endo-Lyy-C裂解，如制造者所述(Boehringer Mannheim，Germany)。2mg/ml hIL-3蛋白質(zhì)與蛋白酶的比例為30，在37℃孵育過液。激光解吸質(zhì)譜法(LDMS)預(yù)處理
2，5二羥基苯甲酸(DHB，Mr＝154.12；10g/l)溶于milli Q水的溶液是在每次實(shí)驗(yàn)前新鮮配制的。修飾和未修飾的IL-3溶液和它們的消化液稀釋成0.1mg/ml。這些稀釋的溶液0.5μl與0.5μl DHB溶液在靶上混合。隨后此靶在室溫和慢的空氣流中干燥。質(zhì)譜法矩陣輔助的激光解吸質(zhì)譜法是在裝有脈沖氮?dú)饧す?337nm，脈沖寬度3ns)的Finnegan MAT Vision 200激光解吸質(zhì)譜儀進(jìn)行的。樣品在剛達(dá)到解離閾(106-107W/cm2)以上時(shí)即離去。加速電壓6.5kV。離子為了電子放大，在10kV的轉(zhuǎn)換倍增器電極進(jìn)行后加速。標(biāo)準(zhǔn)精確度約為0.05％，但由于實(shí)驗(yàn)條件此值可惡化到0.1-0.2％。結(jié)果盡管是較高的分子量，但因?yàn)長DMS的信號(hào)是足夠的，使所有修飾的定位成為可能。給出兩個(gè)例子1、以Endo Lys-C處理和LDMS用琥珀酸酐修飾(pH5.0)的定位在pH＝5.0琥珀酸酐修飾隨后Endo Lys-C消化，一個(gè)峰從1085d位移至1185d，1108d峰(1085+23L來自Na+)也位移至1208d?；诘鞍酌傅奶貙?dǎo)性和氨基酸序列，此1085d峰只能相當(dāng)于Ala1-Lys10。因?yàn)槿粼贚ys10上修飾則將使此氨基酸的消化成為不可能，也就是不會(huì)有任何的Ala1-Lys10片段。所以，被修飾的氨基酸殘基是末端Ala1的氨基。
2、用Endo Glu-C處理隨后用LDMS和Endo Lys-C處理隨后用LDMS兩者對(duì)以乙酸酐修飾Lys28的測(cè)定在pH7以乙酸酐修飾，隨后Endo Glu-C處理，1598d峰位移至1640d。此位移準(zhǔn)確相當(dāng)于1個(gè)乙?；馁|(zhì)量。同樣，在此情況下，氨基酸序列使其定位于Ile23-Asp36。因?yàn)長ys28是這個(gè)片段的唯一氨基殘基，可以推論這就是被修飾的殘基。這又被用Endo Lys消化所肯定，在此消化中出現(xiàn)了5815d片段。此片段只能解釋為若Lys28為修飾的殘基則使在此殘基后的消化成為不可能。
其他修飾已用相似方法分析，列于表4表4IL-3修飾的定位修飾的pH 修飾后被修飾基團(tuán)的號(hào)數(shù)用乙酸酐用琥珀酸酐5.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％6.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±45％ Lys18 ±45％Lys66 ±20％ Lys66 ±20％Lys100±40％ Lys100±25％Lys116±40％ Lys116±40％6.5Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±70％ Lys28 ±55％Lys66 ±50％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±50％Lys116±80％ Lys116±90％7.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys10 ±20％Lys28 ±55％ Lys28 ±70％Lys66 ±35％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±70％Lys116±40％ Lys116±90％此表說明兩種修飾在蛋白質(zhì)中具有胡同的靶殘基。僅有的不同為乙酸酐在pH＞＝5.5時(shí)修飾度稍高，同時(shí)在pH7時(shí)與琥珀酸酐修飾物相反，Lys10被部分地修飾。
表4也說明在pH 7時(shí)Lys116至少是部分被保護(hù)了的。因?yàn)樵诖藀H時(shí)使用磷酸鹽緩沖液，磷酸基結(jié)合在這個(gè)位置以此屏蔽了Lys116的修飾的可能性是存在的。為證實(shí)此假設(shè)，hIL-3在50mM、由MES和磷酸鹽組成的緩沖物質(zhì)中被修飾。在pH6.8用乙酸酐(分別為1，2和3mM)修飾，此pH正好在兩種緩沖劑的緩沖范圍之間。在有10mM或以上的磷酸鹽存在時(shí)，有1個(gè)基團(tuán)Lys116被保護(hù)。在磷酸鹽濃度低于1mM時(shí)此保護(hù)并不存在。因?yàn)?0mM為生理磷酸鹽濃度，可以設(shè)想，現(xiàn)有的定位方法說明生物顯著的磷酸結(jié)合和定位是可能的。所以很可以想象使磷酸結(jié)合變形，可以產(chǎn)生拮抗性或細(xì)胞生長的抑制劑。因此，這也被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可以說明Lys28和Lys66殘基也有被磷酸輕微的保護(hù)，提示在3-D結(jié)構(gòu)中它們是緊密靠近的。因此，這種方法甚至可以提供結(jié)構(gòu)信息。
最后，也可以說明漸進(jìn)化學(xué)修飾可以在這樣最低程度上進(jìn)行，即可實(shí)現(xiàn)特異性，不只局限于一些類型的殘基，不只限于氨基殘基，甚至能在整個(gè)分子的一個(gè)氨基殘基，如Ala1上進(jìn)行。所以此特異性也包括在權(quán)利要求之中。實(shí)施例6用漸進(jìn)化學(xué)修飾蛋白酶處理和激光解吸質(zhì)譜法進(jìn)行定量結(jié)構(gòu)功能分析研究。材料和方法QSAR策略此實(shí)施例用hIL-3賴氨酸修飾加以說明。此策略由5步組成，其中第一步是涉及蛋白質(zhì)的漸進(jìn)化學(xué)修飾。雖然各種殘基在3-D結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境是未知的，但可以預(yù)期僅在氨基酸序列中就有差別。其3-D結(jié)構(gòu)可預(yù)料差別更大。
我們研究了hIL-3的乙?；磻?yīng)(步驟1)。由逐步增加修飾反應(yīng)的pH使?jié)u進(jìn)化學(xué)修飾只發(fā)生在未帶電荷的Lys殘基上成為可能。
第二步是監(jiān)測(cè)修飾反應(yīng)。為了研究足夠數(shù)目的可能條件以得到適宜的條件，一種溫和和靈敏和監(jiān)測(cè)方法是需要的。此法為非變性電泳(Electrophoresis 15251(1994))。然而，電子噴射質(zhì)譜也能成為替代的方法。這可由圖3說明在pH5-7琥珀?；疘L-3的電子噴射質(zhì)譜。特別是兩者的結(jié)合可說明氨基殘基的完全特異性。
第三步是全部結(jié)構(gòu)整體的確定。圓二色散光譜法可用于此目的(Electrophoresis 15251(1994))。雖然用此方法不能看出小的差別，但實(shí)質(zhì)上的結(jié)構(gòu)改變?nèi)缱冃钥梢郧宄y(cè)出。
第四步是修飾殘基的特征和定位，為此使用以下的技術(shù)用特異蛋白酶非變性消化，電泳，電子噴射質(zhì)譜法，和LDMS。反應(yīng)的特異性由非變性電泳和電子噴射質(zhì)譜法聯(lián)合測(cè)定。定位化用內(nèi)蛋白酶和LDMS，如以前所述的例子進(jìn)行。
第五步即最后一步是蛋白質(zhì)的各種修飾形式的生物活性的測(cè)試。在此活性測(cè)定以后可以推論真正涉及各種定位的殘基。結(jié)果化學(xué)修飾，結(jié)構(gòu)確定和反應(yīng)監(jiān)測(cè)hIL-3用琥珀酸酐或乙酸酐的化學(xué)修飾和監(jiān)測(cè)按以前敘述的方法進(jìn)行。隨后，用圓二色散光譜法發(fā)現(xiàn)琥珀酸酐修飾，在pH大于7時(shí)導(dǎo)致整個(gè)結(jié)構(gòu)的改變(變性)。所以，在進(jìn)一步的研究中只有pH或以下進(jìn)行修飾。修飾的特性和定位見以前的例子。蛋白質(zhì)各種修飾形式的活性測(cè)試和生物學(xué)上重要的殘基的定位兩種方法和生物活性測(cè)試的結(jié)果在實(shí)施例1和2中已經(jīng)敘述。這些結(jié)果的配合和修飾殘基的定位結(jié)果(表1和表2和前面的實(shí)例)能夠說明一些殘基的參與。以此，從未修飾的到在pH5修飾的是重要的變化，它伴隨著活性的增強(qiáng)。其他重要的變化是從pH6到pH6.5(活性降低2個(gè)因數(shù))和從6.5到7(活性增加2個(gè)因數(shù))因?yàn)樵趐H5琥珀酸酐修飾時(shí)伴隨著僅1個(gè)基團(tuán)的修飾，即末端氨基(Ala1)，可以得出結(jié)論，即這個(gè)基團(tuán)有某種限制或調(diào)節(jié)作用?；钚缘脑鰪?qiáng)在用缺失突變的結(jié)構(gòu)一功能研究中也曾發(fā)現(xiàn)過(J.Biol.Chem.266，21310(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8911842(1992))，但從為指定只是第一個(gè)殘基。
從pH6至pH6.5之間的差別看，有更復(fù)雜的模式對(duì)乙酸酐，活性降低2-4個(gè)因數(shù)是伴隨以Lys28基團(tuán)45％至70％的修飾，Lys66基團(tuán)20％至50％的修飾和Lys100基團(tuán)40％至65％的修飾。最后，發(fā)生在Lys116基團(tuán)40％至80％的修飾，它與未修飾組對(duì)比活性降低60％至20差值為3個(gè)因數(shù)。因?yàn)檫@個(gè)差與活性的降低精確地相關(guān)，Lys116對(duì)生物活懷是最好的候選者。這被在pH7時(shí)修飾減低了因數(shù)3(與pH6.5比較)。而伴隨著活性增加因數(shù)3所肯定。所以Lys116對(duì)生物活性是重要的。這也被用琥珀酸酐修飾全部肯定。在這種情況，當(dāng)與pH6.5修飾的物質(zhì)比較時(shí)，pH7修飾的物質(zhì)在修飾上沒有降低。伴隨這種現(xiàn)象，活性也沒有增強(qiáng)。
如此，已經(jīng)說明即Lys116殘基和末端氨基是生物顯著的，而末端氨基似乎具有抑制和調(diào)節(jié)影響，Lys116對(duì)生物活性似乎是重要的。更且，Lys116也被磷酸保護(hù)，提示磷酸被這個(gè)殘基結(jié)合。因?yàn)榇藲埢鶎?duì)白細(xì)胞介素的生物活性也是重要的，這提示磷酸結(jié)合對(duì)IL-3的作用方式是重要的，同時(shí)如果這個(gè)過程對(duì)IL-3是重要的，它對(duì)于其他的肽和蛋白質(zhì)也是重要的。
總結(jié)，本方法使生物重要的殘基的定位成為可能，同時(shí)表明磷酸結(jié)合也使一種可能的重要生理過程的建立的定位成為可能。所以，本發(fā)明也包含一種蛋白質(zhì)或肽的修飾，借助蛋白質(zhì)或肽的磷酸結(jié)合方法引入一種新的，優(yōu)選的是拮抗的活性。實(shí)施例7抗體的降低水平致體內(nèi)有效的細(xì)胞抵抗力。材料和方法試驗(yàn)系統(tǒng)由人類嵌合的4周齡“X-連接免疫缺損(X-linked immunodeficient)”小鼠組成。嵌合是經(jīng)整體輻射(total bosy irradiation，TBI)誘導(dǎo)和移植4百萬人類外周血液淋巴細(xì)胞/克受體形成。CBA/N小鼠的TBI為9Gyγ射線。這些小鼠也接受0.5百萬自身骨髓細(xì)胞靜脈(iv)注射的血液支持處理。比較輻射，人血液和移植操作見Eur.J.Immunol 22197(1992)。小鼠每天腹腔注射(ip)10,000 I.U.的人類白細(xì)胞介素-2(Eurocetus，Amstelveen，Benelux)。感染是在移植人細(xì)胞后1小時(shí)以最低劑量的10倍經(jīng)ip進(jìn)行，是在“感染中心試驗(yàn)(infectious center test)”或ICT中的靜止感染(still infectious)。
經(jīng)處理的CBA/N小鼠以250微克單克隆抗體抗-HIV-1 GP13(抗CD4-結(jié)合部位)，或抗HTL VIIIBF58H3指向V3-環(huán)經(jīng)ip預(yù)處理。
ICT是以CB15細(xì)胞雙倍進(jìn)行(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893116(1992))。每孔一萬細(xì)胞并在5-7天后對(duì)HIVp24蛋白(Organon Technica，Oss，荷蘭)進(jìn)行ELISA。通常在移植后兩周處死動(dòng)物以停止抗體的產(chǎn)生(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。在處死小鼠的這天細(xì)胞以含有肝素(Organon Technica，Oss，荷蘭)的介質(zhì)從腹腔中沖洗出來。對(duì)這些細(xì)胞在CB15細(xì)胞和100 I.U.人類白細(xì)胞介素-2/ml培養(yǎng)介質(zhì)存在下進(jìn)行ICT。滴定是從2.5百萬至O的范圍以連續(xù)5倍稀釋雙倍進(jìn)行。5-7天后培養(yǎng)基上清液中HIV-p24蛋白進(jìn)行ELISA-試驗(yàn)。CD4+細(xì)胞存在的對(duì)照FACScan分析是按Eur.J.Immunol.22197(1992)所述進(jìn)行的。結(jié)果結(jié)果示于表5。表5 抗體對(duì)HIVIIIB病毒的保護(hù)抗體 1/IC×104移植后5天移植后8天平均值(范圍) 平均值(范圍)無 2(0.4-2) ＞200 ＞200GP13 4 (0.4-100)20 (2-50)F58H3 ＞200 (＞200)＝＞200 (0.5-＞200)表中所示HTLVIIIB在這些情況下持續(xù)5天。然而移植8天后甚至在豐富的CD4+細(xì)胞存在下似乎被消除了。這說明移植人T-細(xì)胞可消除病毒。然而，如果把任一特異的抗HIV-1抗體結(jié)藥至嵌合小鼠，病毒仍歸持續(xù)(表5)，說明HIV-感染的持續(xù)是由抗體造成的。
由此可以推論，降低HIV-感染的人的抗體水平可使T-細(xì)胞消除病毒。由此提供感染的治療。可由抑制B-細(xì)胞降低這些抗體的水平。所以B-細(xì)胞的抑制是生長因子拮抗劑的有關(guān)興趣的應(yīng)用領(lǐng)域。
尚有其他抑制HIV感染的可能性也能單獨(dú)使用1、血漿提出法(Plasmaphoresis)造成抗體水平的降低。通常的臨床實(shí)踐是血漿的完全取代。例如重癥肌無力的實(shí)驗(yàn)治療是所謂的選擇性血漿復(fù)原。在這種情況下，病人的血漿在回到病人體內(nèi)之前經(jīng)過精制，除掉有害的抗體。在體外HIV-反應(yīng)也可選擇此法，特別是HIV-包膜活性受體。
2、白細(xì)胞除去法(Leukophoresis)，以降低B-細(xì)胞的數(shù)量。此法優(yōu)選除去HIV-活性的B-細(xì)胞。白細(xì)胞可從HIV感染的人體內(nèi)全部被除去。這種白細(xì)胞除去在臨床實(shí)踐中對(duì)其他疾病是常規(guī)的工作。然而對(duì)HIV感染的病人還從未敘述過。選擇性地返回沒有B-細(xì)胞的白細(xì)胞可以容易地做到。選擇性也能包括T-細(xì)胞的正選擇或其亞群。
3、體內(nèi)耗竭抗體。本發(fā)明也包括選擇性的，也可非選擇性的形成免疫復(fù)合物，在體內(nèi)耗竭抗體。非選擇性的移除，優(yōu)選的方法是經(jīng)抗體-特異的抗體來做到的。選擇性的移除優(yōu)選的方法是用病毒，滅活病毒，病毒亞單位和/或病毒樣或等同的蛋白質(zhì)或肽來做到的。這些物質(zhì)優(yōu)先地與促進(jìn)從體內(nèi)清除的物質(zhì)結(jié)合。
4、體內(nèi)耗竭B-細(xì)胞。這種體內(nèi)耗竭優(yōu)選的方法是用B-細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)的抗體，非選擇性地移除B-細(xì)胞特異性抗體來進(jìn)行。這也能用雙特異的抗體，優(yōu)選地是CD19/CD3反應(yīng)性組合來進(jìn)行。此法已在Academic Hospital Utrecht(Utrecht，荷蘭)用于B-細(xì)胞腫瘤病人的I期臨床試驗(yàn)。此治療導(dǎo)致B-細(xì)胞數(shù)量的很顯著的降低(私人通信F.A.van Houton Academic Hospital Utrecht，荷蘭)。選擇性的移除B-細(xì)胞方法，優(yōu)選的是以病毒，滅活病毒，病毒亞單位和/或病毒樣或等同的蛋白質(zhì)或肽，或者用抗體來達(dá)到。優(yōu)選的是這些物質(zhì)與促進(jìn)B-細(xì)胞耗竭的物質(zhì)相結(jié)合。
5、抑制體內(nèi)抗體產(chǎn)生的其他方法。一個(gè)實(shí)例是用轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。
HIV和其他病毒在宿主基因組中整合成原病毒。所以它能在這些細(xì)胞中以潛伏狀態(tài)存在一段較長的時(shí)間。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選的是給宿主以IL-2，以活化這種原病毒。
HIV在間質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)存在，同時(shí)能產(chǎn)生低濃度的病毒，它可能逃脫宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別。因此最好是延長處治的期限至少至這些細(xì)胞的生命期。更且，最好是同時(shí)進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，優(yōu)選的是用未被HIV感染的物體的免疫球蛋白。所以，此被動(dòng)免疫治療被認(rèn)為是本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
雖然本發(fā)明是基于對(duì)遞轉(zhuǎn)錄病毒如HIV有限的知識(shí)的形式敘述的，它是很明顯可以做某些修改而不脫離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種人類白細(xì)胞介素-3的修飾方法，優(yōu)選引入一種或多種的下列特點(diǎn)增強(qiáng)的生物活性，增強(qiáng)的穩(wěn)定性，抑制的抗原性，獲得的抵抗活性或細(xì)胞抑制活性。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中，修飾是漸進(jìn)的修飾，優(yōu)選的是在逐漸變化的條件下進(jìn)行，其中變化下列條件的一種或多種pH5.0和7.0之間，優(yōu)選的步長為0.5個(gè)pH單位，和/或時(shí)間，或試劑濃度。
3.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，底物不是人類IL-3，而是一種或多種的下列優(yōu)選人類的蛋白質(zhì)或肽其他白細(xì)胞介素，造血生長因子，肽類激素或蛋白質(zhì)激素，信號(hào)肽或信號(hào)蛋白質(zhì)，生物活性蛋白質(zhì)或肽。
4.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，是以屏蔽由抗原應(yīng)答誘導(dǎo)蛋白質(zhì)或肽中氨基酸的相互作用來降低抗原性。
5.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或我項(xiàng)的方法，其中，因?yàn)槠帘瘟诵纬傻鞍酌傅慕Y(jié)合部位氨基酸的可能相互作用而改變了穩(wěn)定性。
6.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，通過屏蔽降低其受體結(jié)合的殘基，而使肽或蛋白質(zhì)的受體結(jié)合加強(qiáng)。
7.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，通過引進(jìn)一新的化學(xué)相互作用，優(yōu)選的為電荷，最好是負(fù)電荷，而使肽或蛋白質(zhì)的受體結(jié)合力加強(qiáng)。
8.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，修飾特定于少數(shù)類型的氨基酸，一種形式的氨基酸，例如胺-殘基和/或甚至肽或蛋白質(zhì)中的一個(gè)胺-殘基，例如N-末端。
9.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，修飾特定于涉及催化活性的一個(gè)或多個(gè)殘基，優(yōu)選的為His-殘基。
10.一種按照前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，修飾特定于涉及催化活性的一個(gè)或多個(gè)殘基，優(yōu)選的為His-殘基，以引入抵抗的和/或細(xì)胞抑制活性。
11.一種用于蛋白質(zhì)和肽的化學(xué)或非化學(xué)修飾方法，通過破壞磷酸結(jié)合以引入拮抗的和/或細(xì)胞抑制活性。
12.一種應(yīng)用漸進(jìn)化學(xué)修飾和可逆試劑對(duì)肽或蛋白質(zhì)上選擇的氨基酸作特異性化學(xué)修飾的方法。
13.一種用非變性電泳來測(cè)定電荷的變化，蛋白酶處理和質(zhì)譜，優(yōu)選的為激光解吸質(zhì)譜法對(duì)化學(xué)修飾的氨基酸定位的方法。
14.一種用如前述權(quán)利要求所述的化學(xué)修飾，優(yōu)選的為漸進(jìn)的方式，非變性電泳，活性測(cè)定和修飾殘基的定位來定位蛋白質(zhì)或肽上生物學(xué)上重要的殘基的方法。
15.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所敘述的生物活性蛋白質(zhì)或肽的漸進(jìn)化學(xué)修飾方法，其中，修飾可用很特異的方式，通過用前述敘述的在蛋白質(zhì)或肽上定位涉及生物活性殘基的方法來進(jìn)行。
16.僅在下列一個(gè)或多個(gè)殘基上進(jìn)行修飾的人類白細(xì)胞介素-3，即Ala1，His26，Lys28，Lys66，His95，His98，Lys100或Lys116。
17.含有按前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)制備的一種修飾的肽或蛋白質(zhì)(以混合形式或化學(xué)結(jié)合形式)的任何制劑。
18.一種修飾的信號(hào)物質(zhì)，優(yōu)選的為蛋白質(zhì)激素，肽類激素，生長因子，造血生長因子，干擾素，白細(xì)胞介素和/或克隆刺激因子，其中，修飾是處在或緊靠近部分的或全部活性中心。
19.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，催化活性發(fā)生了改變。
20.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，修飾是處于或緊靠近金屬結(jié)合中心，優(yōu)選的為鋅結(jié)合中心。
21.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，金屬離子是處于或緊靠近催化中心。
22.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，金屬離子在未修飾的物質(zhì)中具有催化功能。
23.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，金屬結(jié)合性質(zhì)已被改變。
24.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，信號(hào)物質(zhì)對(duì)受體的親和力沒有降低到大于因數(shù)10，保持相同的或甚至增加了親和力。
25.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，其具有加強(qiáng)的生物活性，抵抗活性和/或細(xì)胞抑制活性。
26.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，修飾是修飾一個(gè)氨基酸，這可以是化學(xué)修飾，更優(yōu)選的為烷基化和或酰化或是分子生物學(xué)的修飾，如缺失突變和/或取代突變。
27.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，修飾的氨基酸是涉及與金屬離子結(jié)合的，優(yōu)選的為組氨酸殘基。
28.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中信號(hào)肽為鋅結(jié)合信號(hào)肽，優(yōu)選的為下列的一種或多種IL-2，IL-3，IL-6，IFN-γ，生長激素，催乳素和/或胰島素。
29.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，信號(hào)肽為生長因子，其受體來自相同的(細(xì)胞因子)超家族，作為IL-3的受體，優(yōu)選為IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，GM-CSF和/或Epo。
30.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，該物質(zhì)的穩(wěn)定性得到改變，優(yōu)選的為增強(qiáng)穩(wěn)定性。
31.一種如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的物質(zhì)，其中，該物質(zhì)具有降低的穩(wěn)定性，優(yōu)選的是結(jié)合有拮抗活性。
32.含有如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)和/或肽的基因密碼的DNA-組建物。
33.含有如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的或是按前述權(quán)利要求的一項(xiàng)和多項(xiàng)制備的一種或多種物質(zhì)(混合形式或化學(xué)結(jié)合形式)的任何制劑。
34.如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的任何制劑的應(yīng)用。
35.如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所敘述的任何制劑的應(yīng)用，優(yōu)選的為在本專利說明書中應(yīng)用領(lǐng)域所敘述的一種或多種應(yīng)用。
36.通過抑制由B-細(xì)胞產(chǎn)生的抗體和/或抑制B-細(xì)胞的產(chǎn)生和/或成熟，優(yōu)選的是用前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的一種制劑以抑制和/或治療HIV感染。
37.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中優(yōu)選的是用血漿去除法，部分的或全部血漿復(fù)原或選擇性的血清返回以降低抗體的水平。
38.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中在體外選擇性的通過移除抗體，優(yōu)選HIV-活性抗體，更優(yōu)選的是HIV-包膜活性抗體。
39.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，進(jìn)行白細(xì)胞除去。
40.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，達(dá)到了B-細(xì)胞數(shù)量的降低，優(yōu)選的是抗HIV-抗體產(chǎn)生的B-細(xì)胞，更優(yōu)選的是抗HIV-包被抗體產(chǎn)生的B-細(xì)胞。
41.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，優(yōu)選是在體內(nèi)耗竭抗體，優(yōu)選的是耗竭抗HIV抗體，更優(yōu)選的是耗竭抗HIV-包膜抗體。
43.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，例如用其它抗體，達(dá)到了在體內(nèi)抗體的耗竭。
44.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，雙-特異性抗體的應(yīng)用，優(yōu)選的是直接對(duì)抗CD19/CD3和或CD20/CD3的結(jié)合。
45.一種如前述權(quán)利要求多項(xiàng)中敘述的方法和/或產(chǎn)物，其中，其為誘導(dǎo)B-細(xì)胞程序死亡的物質(zhì)，優(yōu)選的是APO-1的應(yīng)用。
46.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，其為其他B-細(xì)胞抗體產(chǎn)生抑制作用，優(yōu)選的是用TGF-β的應(yīng)用。
47.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，以進(jìn)行HIV感染的物體的原病毒的激活，優(yōu)選的是給以生長因子，較優(yōu)選的為細(xì)胞因子，更優(yōu)選的是以IL-2激活。
48.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，包括被動(dòng)免疫治療，優(yōu)選的是用HIV-未感染物體的免疫球蛋白。
49.一種如前述權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，其為金屬離子的應(yīng)用，優(yōu)選的是鋅，以得到如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的效果和/或結(jié)果和/或應(yīng)用。
50.包含如前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)敘述的一種或多種方法的任何治療。
51.按前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的任何制劑的應(yīng)用，包括刺激干細(xì)胞的復(fù)制。
52.按前述權(quán)利要求的一項(xiàng)或多項(xiàng)的任何制劑與其他信號(hào)蛋白質(zhì)和肽聯(lián)合的應(yīng)用。
53.任何前述權(quán)利要求的兩項(xiàng)或多項(xiàng)的可想到的無論是導(dǎo)致或不導(dǎo)致協(xié)同活性的聯(lián)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及信號(hào)蛋白質(zhì)和肽的特異的漸進(jìn)修飾。以修飾及其定位，用蛋白酶處理和與新類型的質(zhì)譜法相結(jié)合，可以達(dá)到蛋白質(zhì)或肽的很特異修飾。這使得期望的生物活性變化，優(yōu)選的是增強(qiáng)的活性，拮抗活性和/或細(xì)胞抑制活性的引入成為可能。用化學(xué)修飾，即有特異性的對(duì)His殘基烷基化，這些殘基位于或靠近人類白細(xì)胞介素3催化的和/或Zn結(jié)合中心，可以實(shí)現(xiàn)拮抗的或細(xì)胞抑制活性。本領(lǐng)域人員也可以容易地應(yīng)用本發(fā)明來產(chǎn)生抑制劑和/或拮抗劑，優(yōu)選的方法為用分子生物修飾，化學(xué)修飾和/或烷基化反應(yīng)，優(yōu)選的為用碘代-乙酸鹽。優(yōu)選的是這些修飾是直接對(duì)His殘基，其它催化殘基和/或Zn結(jié)合殘基。從所附的結(jié)果和數(shù)據(jù)可以推論即本發(fā)明也可容易地應(yīng)用于其他信號(hào)物質(zhì)。此結(jié)果也可以DNA-組建很好的完成，其中也包括基因治療。如此，提出的方法，得到的物質(zhì)及其應(yīng)用均包括在本發(fā)明之中。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1163620SQ95194849
公開日1997年10月29日 申請(qǐng)日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日
發(fā)明者維克托·斯米特, 威廉·胡佩斯 申請(qǐng)人:法瑪基公司