專利名稱：在干燥和其后的貯藏期間使生物物質(zhì)保持穩(wěn)定的改進(jìn)方法和它的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及在干制劑的干燥和貯藏期間增加生物物質(zhì)穩(wěn)定性的方法。還提供了穩(wěn)定的生物物質(zhì)的組合物。
背景技術(shù)：
貯藏穩(wěn)定性是生物物質(zhì)干制劑的最終目的。干制劑優(yōu)于含水制劑是因為作為水解反應(yīng)中的親核試劑和增塑劑的水增大了活性化學(xué)物質(zhì)的分子遷移率，內(nèi)在地使生物物質(zhì)的水劑不如它們的干制劑穩(wěn)定。干制劑的這種增加的穩(wěn)定性將注意力集中在干燥技術(shù)上，致使開發(fā)冷凍干燥作為一種除水的常用方法。見Pikal(1990a)生物制藥.(Biopharm)318-27；Pikal(1990b)生物制藥(Biopharm)326-30和Franks(1990)低溫通訊(Cryoletters)1193-100。然而盡管它使用廣泛，但許多冷凍干燥產(chǎn)品在室溫下仍不穩(wěn)定。見Carpenter和Crowe(1988)低溫生物學(xué).25244-255；和Crowe等(1990)低溫生物學(xué).27219-231。對冷凍干燥期間的物理化學(xué)過程的詳細(xì)理論分析已產(chǎn)生許多有關(guān)冷凍保護(hù)劑(lyoprotetant)被用作穩(wěn)定賦形劑的文獻(xiàn)。見Pikal(1990b)；Carpenter和Crowe(1988)；Crowe等(1990)；和Levine和Slade(1988)純應(yīng)用化學(xué)601841-1864。各種碳水化合物已被提議作為冷凍干燥中的穩(wěn)定賦形劑，這些被提出通過在冷凍步驟中產(chǎn)生一個無定形的，玻璃狀的固態(tài)來起作用。見Pikal(1990b)；Franks(1990)；Levine和Slade(1988)和Franks等(1992)美國專利號5,098,893。然而，冷凍步驟仍為一主要的易變因素，這已被各種碳水化合物賦形劑的最大冷凍濃縮不凍基質(zhì)(T’g)的實驗測得的玻璃化溫度的不定值而證實。見Franks(1990)；Levine和Slade(1988)；Ablett等(1992)化學(xué)協(xié)會雜志法拉第學(xué)報(J.Chem.Soc.Farady.Trans.)88789-794；和Roos(1993)碳水化合物研究(Carbo.Res.)23839-48。
在冷凍干燥期間處于高于玻璃化或崩潰溫度之上可導(dǎo)致顯著的活性降低。而且，在冷凍干燥期間，冷凍被認(rèn)為是破壞蛋白質(zhì)的主要原因，由于冷凍干燥中的活性的降低，近來的注意力已集中在室溫干燥技術(shù)上。這不僅省去了冷凍步驟，而且在干燥除去水時更快并且節(jié)能。見Crowe等(1990)；Roser(1991)生物制藥447-53；Roser和Colaco(1993)現(xiàn)代科學(xué)家13824-28，Blakely等(1990)柳葉刀336854-55；Colaco等(1990)國際生物技術(shù)pp.345-350，CenturyPress，倫敦；Colaco等(1992)生物技術(shù)101007-1011；Franks(1991)生物制藥1438-55；Franks和Hatley(1993)在“酶的穩(wěn)定性及穩(wěn)性”中，編者Van den Tweel等，Elsevier，Amsterdam(1993)pp.45-54；和Franks(1994)生物/技術(shù).12253-256；Roser，美國專利號4,891,319和Roser等(1991)WO 91/18091。
本文在上下文引用的所有參考文獻(xiàn)在這里均被本文引作參考。
尤其在室溫或較高溫度下，干燥的生物物質(zhì)的穩(wěn)定仍然是一個課題。一種碳水化合物，海藻糖(α-D-吡喃葡糖-α-D-吡喃葡糖苷)已被發(fā)現(xiàn)在室溫或較高溫度下將干燥蛋白質(zhì)和其它生物物質(zhì)的貯存期限延長至持續(xù)很久的時間方面異常有效。通過再水化時生物活性的恢復(fù)來評價穩(wěn)定性。見Roser(1991)；Roser和Colaco(1993)；Blakely等(1990)；Colaco等(1990)；Colaco等(1992)；和Carpenter和Crowe(1988)低溫生物學(xué)25459-470。在與海藻糖保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件相同的條件下對其它糖類，多元醇和低聚糖的研究表明這種穩(wěn)定程度只有海藻糖才具有。然而一些賦形劑具有部分保護(hù)性，因為它們本身在干燥過程中保護(hù)生物分子免受破壞，并且給予對于高溫的較有限的耐受性。見Crowe等(1990)；Roser(1991)；Colaco等(1990)；Crowe等(1987)；Carpenter等(1987)；和Carpenter和Crowe(1988)。
對于海藻糖穩(wěn)定生物分子的分子機(jī)理已假設(shè)有兩種主要假說。見Clegg(1985)在膜，代謝和干有機(jī)物中，編者Leopold，Cornell大學(xué)出版社，Ithaca，NY，pp.169-187；Burke(1985)在膜，代謝和干有機(jī)物中，編者Leopold，Cornell大學(xué)出版社，Ithaca，NY，pp.358-363；Green和Angell(1989)物理化學(xué)雜志932280-2882；Levine和Slade(1992)生物制藥536-40；和Crowe等(1990)生物制藥628-37。水取代理論認(rèn)為作為多羥基化合物，海藻糖可產(chǎn)生多個外部的氫鍵，該氫鍵可取代與生物分子氫鍵鍵合的必需的結(jié)構(gòu)水分子，從而維持它們的分子結(jié)構(gòu)。見Clegg(1985)；和Crowe等(1993)。玻璃態(tài)理論假設(shè)由于干燥海藻糖溶液經(jīng)過玻璃化轉(zhuǎn)化，這樣產(chǎn)生了一個無定形的連續(xù)相，其中分子運(yùn)動以及由此的降解性分子反應(yīng)為動力學(xué)不重要。見Burke(1985)；Green和Angell(1989)；和Levine和Slade(1992)。以前得到的結(jié)果和本文描述的那些與任一個作為對海藻糖作用機(jī)理的充分唯一的解釋的那些假說都不一致。
水取代理論認(rèn)為對于多羥基化合物，非海藻糖的糖類作為穩(wěn)定賦形劑也應(yīng)該有效，并且如果羥基的特定空間組合是關(guān)鍵的特征的話，那么葡萄糖也應(yīng)和海藻糖一樣有效，然而，以前得到的及本文所示的結(jié)果表明作為多羥基化合物的葡萄糖在各種測試的糖類中最不有效(見表1)，其它測試的多羥基化合物中沒有發(fā)現(xiàn)一個與海藻糖一樣有效(

圖1和表1)。而且，如果水的分子擬態(tài)是重要的話，對于水取代可能期望如此，那么青蟹肌醇(scylloinositol)(它所有的羥基都處于直立)從理論上應(yīng)該為最有效的碳水化合物，但是實際上它是其中最不有效的。因此，水取代理論不可能是對海藻糖作用機(jī)理的完美解釋。
類似地，僅玻璃態(tài)理論不能解釋由海藻糖帶來的穩(wěn)定性。高溫下的貯存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)報道于上面圖1中，通過差示掃描量熱法測得在海藻糖中被干燥至水含量為2.6-3.6％的樣品的玻璃轉(zhuǎn)化溫度均低于37℃。因此正好在它們的玻璃轉(zhuǎn)化溫度上，它們保持穩(wěn)定性，并且雖然與已被接受的觀點(Franks等(1992)；和Franks(1994))相反，玻璃態(tài)在其它體系中可能是重要的，但它在干燥于海藻糖中的生物分子的長期高溫穩(wěn)定性中不是一個因素。
雖然目前的看法是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性幾乎只取決于玻璃轉(zhuǎn)化溫度，但已提出了一些在存在糖類的情況下降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的可能產(chǎn)生影響的反應(yīng)。見Franks(1994)。這些可能的反應(yīng)沒有被分析，并且被認(rèn)為如果存在，對蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性產(chǎn)生很小影響。見Franks等(1994)；和Akers和Nail(1994)制藥技術(shù)1826-36。
發(fā)明概述本發(fā)明包括在干燥時增加生物物質(zhì)穩(wěn)定性的方法以及由其產(chǎn)生的干燥組合物的穩(wěn)定性的方法。一種方法包括在存在有效量的穩(wěn)定被干燥的生物物質(zhì)的碳水化合物賦形劑以及足以防止氨基和活性羰基的縮合作用的有效量的美拉德反應(yīng)抑制劑的情況下，干燥生物物質(zhì)。另一種方法包括通過在存在足夠量的穩(wěn)定生物物質(zhì)的碳水化合物賦形劑以及足以防止氨基和活性羰基的縮合作用的足夠量的美拉德反應(yīng)抑制劑的情況下，貯存被干燥的生物物質(zhì)來增加被干燥的生物物質(zhì)的貯藏穩(wěn)定性。還包括由生物物質(zhì)，碳水化合物和美拉德反應(yīng)抑制劑組成的組合物。
附圖簡述圖1.限制性酶PstI的加速老化研究。圖2.用于加速老化研究的樣品的非酶促褐化。圖3.美拉德反應(yīng)的簡圖。圖4.存在果糖和葡萄糖時被干燥的堿性磷酸酶的褐化。圖5.在存在葡萄糖或海藻糖時被干燥的胰高血糖素的HPLC分析。圖6.典型賦形劑中殘余的水含量對化學(xué)反應(yīng)的影響。圖7.堿性磷酸酶在葡萄糖干燥和貯存以及增加量的賴氨酸中的活度。
發(fā)明的描述在存在碳水化合物賦形劑時穩(wěn)定干燥蛋白質(zhì)制劑的以前的工作著重于穩(wěn)定賦形劑取代結(jié)構(gòu)水和/或提供干燥狀態(tài)的無定形或玻璃狀固體基質(zhì)的能力。這些研究未能認(rèn)識到在干燥以及在干燥之后的貯藏中的化學(xué)反應(yīng)的作用和本質(zhì)。如本文提供的實施例中所示，可能在干燥時發(fā)生的這些反應(yīng)在貯藏期間被大大增強(qiáng)，這些實施例表明在存在碳水化合物賦形劑時，美拉德反應(yīng)是在干燥的生物物質(zhì)的干燥和貯藏期間發(fā)生的主要化學(xué)反應(yīng)。本文描述的方法和制劑防止了貯存期間的美拉德反應(yīng)，并由此增加了貯藏的干燥生物物質(zhì)的貯存期限。
美拉德反應(yīng)實際上是由活性羰基和氨基可逆自發(fā)縮合形成席夫堿啟動的級聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。起始縮合形成席夫堿的活化能僅為10-15kcal數(shù)量級，在水存在時為可逆的，并且在含水環(huán)境中平衡極有利于反應(yīng)體。見Reynolds(1965)高級食品研究14167-283；Finot等(1990)食品加工中的美拉德反應(yīng)，人類營養(yǎng)和生理學(xué)Birkhauser，Basel；和Lendl和Schleicher(1990)Ang.Chem.29565-594。美拉德反應(yīng)的組分的簡圖示于圖3中。席夫堿的形成是導(dǎo)致有關(guān)蛋白質(zhì)的交聯(lián)和棕色類黑素色素的產(chǎn)生的后續(xù)反應(yīng)的級聯(lián)。接著自發(fā)的席夫堿的Amadori或Henys重排是不可逆的，并且引發(fā)最終導(dǎo)致產(chǎn)生棕色類黑素色素以及使有關(guān)蛋白質(zhì)裂解和交聯(lián)的一系列復(fù)雜反應(yīng)。在食品工業(yè)中，美拉德反應(yīng)已被廣泛研究，因為它是在貯存期間，尤其是干燥食品變壞的眾多原因之一。它甚至已在高蛋白和糖含量的食品的冷凍貯藏期觀察到。美拉德反應(yīng)是干燥食品中的一個特殊問題，因為由于水的喪失，反應(yīng)平衡被迫向形成席夫堿的方向進(jìn)行，并且在低水活性時，加速許多后續(xù)反應(yīng)，見Lendl和Schleicher(1990)；和Nursten(1986)在食品濃縮和干燥中的干燥食品中的美拉德褐化反應(yīng)中，編者M(jìn)cCarthy ElsevierApplied Science，London。
本發(fā)明包括在干燥和貯藏期間增加生物物質(zhì)穩(wěn)定性的方法以及其具有增加的貯藏穩(wěn)定性的干燥組合物。在該方法和組合物中，雖然可采用單一形式，但也可存在多于一種的碳水化合物，多于一種的生物物質(zhì)和多于一種的美拉德反應(yīng)抑制劑。這些化合物的有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的范圍內(nèi)。
生物物質(zhì)可來自天然來源或化學(xué)合成。一般它們具有生物活性，或能發(fā)揮生物作用。然而，還包括中間體或活性化合物和其中間體的混合物。而且本發(fā)明還包括其中摻入了生物物質(zhì)的碳水化合物和美拉德反應(yīng)抑制劑的制劑。生物物質(zhì)可為本領(lǐng)域任何人已知，雖然可采用單一形式，但它可包括，但不限于亞細(xì)胞組合物，細(xì)胞，和病毒，包括，但不限于含有游離氨基，亞氨基和胍基側(cè)鏈的那些分子。這些分子包括，但不限于藥物制劑、脂類、有機(jī)物、肽、蛋白質(zhì)、激素(肽、甾類化合物、皮質(zhì)甾類)、低聚糖、合成肽類、D和L氨基酸聚合物、核酸、蛋白質(zhì)核酸結(jié)合物和小分子。適宜的蛋白質(zhì)包括，但不限于，酶、生物藥物、生長激素、生長因子、單克隆抗體和細(xì)胞因子。有機(jī)物包括，但不限于，帶有氨基、亞氨基或胍基基團(tuán)的具藥物活性的化學(xué)物質(zhì)。
干燥方法可為本領(lǐng)域任何人員已知，但不限于冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、環(huán)境溫度和常壓干燥、環(huán)境溫度減壓干燥、升溫常壓干燥和升溫減壓干燥。雖然可采用任何適宜溫度，在冷凍干燥時，一般將樣品在-70～-30℃下冷凍，在-50～-80℃的冷凝溫度下干燥。冷凍可采用本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行，包括，但不限于浸入液氮中，放置在可能為-4℃～-80℃的冷凍器中，干冰以及醇冰浴。環(huán)境溫度或升溫干燥時，可采用凝固溫度以上的任何溫度，只要它不是太高使生物物質(zhì)變性即可；優(yōu)選溫度為小于80℃，較優(yōu)選小于65℃，更優(yōu)選為20-50℃。優(yōu)選溫度為環(huán)境溫度至50℃。噴霧干燥時，溫度范圍為小于250℃，較優(yōu)選范圍為150-220℃，最優(yōu)選為180-200℃。
如本文所采用，對于貯存或干燥，環(huán)境溫度或“室溫”通常為約20℃，升高的溫度為凝固之上的溫度。溫度“大于環(huán)境溫度”為大于20℃。
如本文所采用，術(shù)語“碳水化合物”包括但不限于，二糖、三糖、低聚糖以及它們對應(yīng)的糖醇、多羥基化合物，例如碳水化合物衍生物和化學(xué)修飾的碳水化合物，羥乙基淀粉以及糖共聚物(Ficoll)?？刹捎肈和L形成的碳水化合物。當(dāng)生物物質(zhì)以藥物制劑形式使用時，選擇的碳水化合物是生理上可接受的。碳水化合物可為非還原或還原形式。如本文所示的實施例中所描述的，現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)在干燥組合物的貯藏中非還原的碳水化合物可水解形成還原的碳水化合物，并且用其中所貯存的物質(zhì)引發(fā)席夫堿的形成。這種縮合導(dǎo)致了使系統(tǒng)塑化的水的形成，這樣產(chǎn)生了增加的化學(xué)本體的流動性，由此增加了包括美拉德反應(yīng)的降解反應(yīng)的速率。因此本發(fā)明尤其對非還原碳水化合物有用。
適用于本發(fā)明的還原的碳水化合物為本領(lǐng)域人員已知，包括，但不限于，葡萄糖、麥芽糖、乳糖、maltulose，異-maltulose和乳果糖。
非還原的碳水化合物包括，但不限于，選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原的苷。其它有用的碳水化合物包括棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和糖醇。糖醇苷優(yōu)選為單糖醇苷，尤其為通過二糖如乳糖、麥芽糖、乳果糖和maltulose還原得到的化合物。糖苷基團(tuán)優(yōu)選為葡糖苷或半乳糖苷，糖醇優(yōu)選為山梨糖醇(葡糖醇(glucitol))。尤其優(yōu)選的碳水化合物為麥芽糖醇(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)、異-maltulose、palatinit和它的同分異構(gòu)體(GPS，α-D-吡喃葡糖基-1→6-山梨糖醇和GPM，α-D-吡喃葡糖基-1→6-甘露糖醇)，來自異maltulose(palatinose)的糖醇(6-α-D-吡喃葡糖基-甘露糖醇和6-α-D-吡喃葡糖基-山梨糖醇)、蔗糖和它們的糖醇。
美拉德抑制劑可為本領(lǐng)域人員已知。當(dāng)生物物質(zhì)以藥物制劑形式使用時，選擇的抑制是生物學(xué)上可接受的。抑制劑以足夠量存在以防止或基本防止氨基和活性羰基縮合。一般地，氨基存在于生物物質(zhì)中，羰基存在于碳水化合物中。然而，氨基和羰基可在生物物質(zhì)或碳水化合物分子內(nèi)。業(yè)已知多類化合物對美拉德反應(yīng)顯示出抑制作用，因此可用于本文描述的組合物中。這些化合物通常為競爭性或非競爭性抑制劑。競爭性抑制劑包括，但不限于，氨基酸殘基(D和L)，氨基酸殘基和肽的混合物。尤其優(yōu)選的為賴氨酸、精氨酸、組氨酸和色氨酸。賴氨酸和精氨酸最為有效。有許多已知的非競爭性抑制劑。包括，但不限于氨基胍衍生物，兩性霉素B和下面所列的。EP-A-0433679描述了下式化合物的4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物。
(a)式(I)的4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物或其鹽
其中R1和R2各自為氫、甲基、三氟甲基、羧基、甲氧羰基或乙氧羰基和R3為氫或羥基；(b)式(II)的4，5，8-三羥基喹啉衍生物或其鹽
其中R1，R2和R3如下定義(c)式(III)的3-氧代吩噁嗪衍生物或其鹽
其中R4和R5各自為氫或通過C1和C2碳原子參入形成任意被羥基和/或羧基取代的稠合[2，1-b]吡啶環(huán)，和R6為氫或羥基；或(d)式(IV)的3-氧代吩噁嗪N-氧化物或其鹽
其中R4，R5和R6如本文所定義。
EP-A-0430045類似地公開了稱為下式化合物的具有美拉德反應(yīng)抑制作用的抗壞血酸生育酚基磷酸二酯，或其鹽
其中R1，R2和R3各自獨(dú)立地為氫或甲基。
EP-A-0325936還描述了下面通式的氨基胍衍生物
(其中R1b代表未取代或被1至3個選自鹵原子、具有1至4個碳原子的烷基或烷氧基、硝基、苯氧基、氨基、羥基和具有2至4個碳原子的酰氨基的基團(tuán)取代的碳環(huán)或雜環(huán)，Xb代表單鍵、具有1至4個碳原子的亞烷基，具有2至4個碳原子的亞烯基或R1b與Xb一起代表具有1至4個碳原子的烷基，R2b代表氫原子，具有1至4個碳原子的烷基或未被取代或被1至3個選自鹵原子、具有1至14個碳原子的烷基或烷氧基、羥基和硝基的基團(tuán)取代的苯基或其酸加成鹽。
在一個優(yōu)選的實施方案中，干燥方法為冷凍干燥，美拉德抑制劑為競爭性抑制劑。在另一個優(yōu)選的實施方案中，干燥的方法為冷凍干燥，美拉德抑制劑為非競爭性抑制劑。在另一個優(yōu)選的實施方案中，干燥方法為環(huán)境溫度或升溫干燥，美拉德抑制劑為競爭性抑制劑。在另一個優(yōu)選的具體方案中，干燥方法為在環(huán)境溫度或升溫進(jìn)行，美拉德抑制劑為非競爭性抑制劑。
本發(fā)明還包括增加貯藏在升高的溫度之下的干燥生物物質(zhì)的“貯存期限”或貯存穩(wěn)定性的方法。增加的貯存穩(wěn)定性通過加速老化試驗中生物活性的恢復(fù)來確定。該方法包括干燥或另外在存在至少一種足夠量的碳水化合物賦形劑以穩(wěn)定生物物質(zhì)的情況下?lián)饺胫辽僖环N生物物質(zhì)和至少一種美拉德反應(yīng)抑制劑。組合物中可加入其它適宜的緩沖液，鹽類，輔助劑等。該組合物可貯藏在任何適宜溫度下。優(yōu)選組合物貯存在0℃-80℃下。較優(yōu)選，該組合物貯藏在20℃-60℃下。最優(yōu)選該組合物貯藏在環(huán)境溫度之上。
本發(fā)明還包括具有增加的貯藏穩(wěn)定性的組合物，它包括一種生物物質(zhì)，一種為足以穩(wěn)定干燥的生物物質(zhì)的量的碳水化合物和一種美拉德反應(yīng)抑制劑，其中碳水化合物以足以穩(wěn)定處于干燥的生物物質(zhì)的量存在，抑制劑以足以基本防止生物物質(zhì)中的氨基與它其中的，或碳水化合物穩(wěn)定賦形劑中或其中所產(chǎn)生的活性羰基縮合。優(yōu)選地，在0℃-250℃下，該組合物具有增加的貯藏穩(wěn)定性。較優(yōu)選地，在20℃-50℃下，該組合物具有增加的貯藏穩(wěn)定性。最優(yōu)選地，在環(huán)境溫度之上該組合物具有增加的穩(wěn)定性。
優(yōu)選地，該組合物幾乎被完全干燥以致通過降低貯藏期間的美拉德反應(yīng)來增加分子的穩(wěn)定性。一些水或其它含水溶劑可保留在組合物中，但優(yōu)選地，不超過20％。如本文所采用的，“干燥”，“干燥的”和“基本上干燥的”包括具有約0-20％水的那些組合物。優(yōu)選地，存在小于約20％的水，較優(yōu)選存在小于約10％的水，最優(yōu)選存在小于約5％的水。
可通過上述任何方法獲得組合物，并且它可含有上述任何成分。雖然沒有給出組合物各成分的實際重量和百分?jǐn)?shù)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員已知不需過度實驗即可確定本文公開所提供的。
實施例1海藻糖對生物分子的穩(wěn)定作用前面已指出在存在海藻糖時被空氣干燥的抗體沒有被破壞，再水化時全部生物活性又恢復(fù)，甚至在室溫或37℃時貯藏數(shù)年之后。見Roser(1991)；Blakely等(1990)；和Colaco等(1990)。對于許多酶、激素和血液凝集因子也獲得了類似的結(jié)果，這表明該方法可能普遍適用于生物物質(zhì)。見Roser(1991)；Roser和Colaco(1993)；Blakely等(1990)；Colaco等(1990)；和Colaco等(1992)。作為保存不穩(wěn)定的生物物質(zhì)的這項技術(shù)的有說服力的試驗，詳細(xì)研究了分子生物學(xué)中使用的酶，該酶眾所周知為脆弱的，因此通常在-20℃或低于-20℃下運(yùn)輸和貯藏。以前已證明可在環(huán)境溫度下將限制性內(nèi)切酶和DNA修飾酶從海藻糖溶液中干燥出來而不失去其活性。而且，這些干燥的酶甚至在升溫時也顯示出延長時間的貯存穩(wěn)定性。見Colaco等(1992)。
為了確定非海藻糖的碳水化合物保存蛋白質(zhì)中的活性的能力，用真空干燥的限制性酶PstI，并輔助加熱至多種碳水化合物賦形劑中的殘余水含量為2.6-3.6％，在37℃，55℃或70℃下貯存1個月來進(jìn)行加速老化研究。
所得結(jié)果示于表1和圖1中。將5單位新鮮酶對照(道1)的切割λ噬菌體DNA的能力與2.5單位(圖1，偶數(shù)編號的道)或5單位(圖1，奇數(shù)編號的道)使用各種碳水化合物賦形劑干燥并在37℃(圖1，上圖)，55℃(圖1，中圖)，和70℃(圖1，下圖)貯存35天的酶進(jìn)行比較。使用的碳水化合物賦形劑為吡喃葡糖基甘露糖醇(圖1，道3和4)或山梨糖醇(圖1，道5和6)，還原的異麥芽糖(圖1，道7和8)，蔗糖(圖1，道9和10)，麥芽糖(圖1，道11和12)以及海藻糖(圖1，道13和14)。從圖1可以看出，在所研究的兩個較高溫度下，僅有海藻糖顯示出所有穩(wěn)定效果。
雖然在37℃下，一些碳水化合物賦形劑在干燥和貯藏期使酶穩(wěn)定(圖1，上圖，表1)，但在55℃或70℃貯藏時，僅有使用海藻糖穩(wěn)定的樣品保持活性(圖1，中圖和下圖，表1)。這些結(jié)果現(xiàn)已與實時數(shù)據(jù)相應(yīng)，并強(qiáng)調(diào)了這種發(fā)現(xiàn)，即對于長期穩(wěn)定性，海藻糖與在相同干燥和貯藏條件下測試的其它碳水化合物相比，為更好的穩(wěn)定賦形劑(表1)。所有單糖，無論是還原或非還原的，都不起作用，聚合物如菊淀粉，ficoll和葡聚糖也是如此(表1)。還原糖類，例如乳糖和麥芽糖在研究的最低溫度37℃下一個月內(nèi)失效，同樣非還原的二糖蔗糖也是如此(表1)。化學(xué)性質(zhì)上比較穩(wěn)定的非還原糖，糖醇比它們的還原的對應(yīng)物顯示出更好的穩(wěn)定性，但仍在55℃時在一個月內(nèi)失效(表1)。
表1在各種碳水化合物賦形劑中干燥的PST 1的穩(wěn)定性碳水化合物化學(xué)命名 呈紅色溫度 時間 活性的糖 ℃ 天單糖和糖醇葡萄糖α-D-吡喃葡萄糖+ 37℃ 1 +″ 14 -山梨糖醇 葡萄糖的糖醇 -″ 14 +″ 35 +″ 70 -半乳糖α-D-吡喃半乳糖+″ 1 -半乳糖醇 半乳糖的糖醇 -″ 1 -甘露糖α-D-吡喃甘露糖+″ 1 -甘露糖醇 甘露糖的糖醇 -″ 1 -二糖海藻糖α-D-吡喃葡糖基--α-D-吡喃葡糖苷″ 98 +++55℃70 +++70℃35 +++麥芽糖4-O-α-D-吡喃葡+糖基-D-葡萄糖 ″ 14 ++″ 7 -
表1(續(xù))碳水化合物 化學(xué)命名 呈紅色溫度 時間活性的糖 ℃ 天麥芽三糖 O-α-D-吡喃葡糖基(1→4) +″14 --O-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖乳糖 4-O-β-D-吡喃半乳糖基 +″14 --D-吡喃葡萄糖乳果糖 4-O-β-D-吡喃半乳糖基 +″14 +-D-果糖 35 -蔗糖 β-D-呋喃果糖基-α-D- - 37℃ 14 ++吡喃葡糖苷 ″35 -聚合物菊淀粉 1-O-β-D-呋喃果糖基-D--″7-果糖的聚合物葡聚糖 α-(1→6)-D-吡喃葡萄糖+″7-(1→3，1→4分支)的聚合物Ficoll β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃 -″7+葡萄糖的聚合物活性定量 還原性質(zhì)-沒有可檢測活性 +還原糖+一些活性(10-20％滴定度) -非還原糖++部分活性(25-40％滴定度)+++全部活性實施例2貯藏期間干制劑的非酶促褐化海藻糖的相對化學(xué)穩(wěn)定性和非還原性在它的作用機(jī)理中看來可能是重要的特征，尤其對于在高溫時觀察到的長期的穩(wěn)定性。這首先由上面圖1中描述的在加速老化試驗中觀察到的出人意料的特征來提示。如圖2中所示，在圖1中報道的用于加速老化研究中的樣品在37℃，(上圖)，55℃(中圖)和70℃(下圖)下貯存2周后觀察到非酶促褐化。所用的碳水化合物賦形劑為海藻糖(第1行)，蔗糖(第2行)，麥芽糖(第3行)，還原的異maltulose(第4行)，吡喃葡糖基-山梨糖醇(第5行)和吡喃葡糖基-甘露糖醇(第6行)。
所得結(jié)果表明棕色著色的產(chǎn)生在所有三種溫度下，在貯藏樣品僅二周后在許多樣品井中形成。而且，著色的程度看來與這些樣品中的酶活性的降低相關(guān)。在貯存于較高溫度下的(圖2)，也表現(xiàn)出活性最大降低(圖1)的樣品中觀察到增加的著色。這種著色極易使人想起在食品加工和貯存過程中見到的非酶促褐化。這種非酶褐化是食品天然組分的還原糖和蛋白質(zhì)之間的自發(fā)反應(yīng)的結(jié)果，它在稱為美拉德反應(yīng)的保護(hù)下在食品化學(xué)中已被廣泛研究。
實施例3干制劑中的美拉德反應(yīng)的證據(jù)對生物活性的變化與棕色色素的產(chǎn)生的相關(guān)性進(jìn)行研究，這在對限制性酶的加速老化研究中已觀察到(圖2)。這些研究是針對堿性磷酸酶樣品來進(jìn)行的，該樣品在上面實施例1中描述的條件下，從含有葡萄糖，果糖，麥芽糖或海藻糖的溶液中干燥而來，并在再次分析酶活性之前在55℃下貯存幾段時間。在存在各種碳水化合物賦形劑的條件下確定干燥的堿性磷酸酶樣品中的以及在55℃貯存后用量熱法測定的殘余活性。
將通過277-290nm之間的吸光度測得的棕色著色的產(chǎn)生與在55℃貯存后的在果糖和葡萄糖中干燥的堿性磷酸酶樣品的酶活性的損失相比較。圖5顯示在O.D為277-290顯色處獲得的結(jié)果；(·)為葡萄糖，(+)為果糖，酶活性(O.D.405)；以及描述如下(*)葡萄糖，(□)果糖。類黑素色素的產(chǎn)生的出現(xiàn)在量熱法測得酶活性損失之后(圖4)。這與這一事實一致，即棕色類黑素色素的產(chǎn)生出現(xiàn)在美拉德反應(yīng)的最后階段，并且由于早期的級聯(lián)反應(yīng)，而不能用來預(yù)測酶的失活(圖3)。類似地，SDS-PAGE對樣品的分析顯示除開海藻糖中干燥的樣品外的所有樣品中的蛋白質(zhì)斷裂和交聯(lián)的復(fù)雜類型，這些類型的復(fù)雜性排除了將這個方法用于確定通過美拉德反應(yīng)修飾蛋白質(zhì)的程度。
從上述研究中的樣品的剩余糖含量的分析中獲得一個出人意料的結(jié)果。當(dāng)被在葡萄糖或果糖中干燥時，僅在立即進(jìn)行二次干燥的樣品中可測得單獨(dú)的糖類。然而，高溫貯存后致使損失酶活性時，這些樣品被發(fā)現(xiàn)含有兩種糖的混合物，這些結(jié)果示于表2中。
由于麥芽糖的部分水解，在立即進(jìn)行二次干燥的發(fā)現(xiàn)含有葡萄糖和麥芽糖混合物的樣品中觀察到類似的異構(gòu)化現(xiàn)象。高溫貯存后致使酶活性喪失時，這些樣品被發(fā)現(xiàn)含有葡萄糖和果糖以及麥芽糖的混合物(表2)。在這些非酶異構(gòu)化中沒有檢測到任何甘露糖的產(chǎn)生表明有涉及一個共同的席夫堿中間體的化學(xué)反應(yīng)途徑，它類似于在費(fèi)歇爾反應(yīng)中脎的形成。
表2在各種賦形劑中干燥的制劑中的碳水化合物的HPLC分析用于兩種制劑中的干燥后 干燥后的 2周后 貯存2周后的碳水化合物賦形劑的活性糖分析的活性 HPLC分析1.葡萄糖樣品A + 葡萄糖 - 葡萄糖+果糖2.葡萄糖樣品B + 葡萄糖 - 葡萄糖+果糖3.山梨糖醇樣品A++ 山梨糖醇 - 山梨糖醇4.山梨糖醇樣品B++ 山梨糖醇 - 山梨糖醇5.果糖樣品A+ 果糖 - 果糖+葡萄糖6.果糖樣品B+ 果糖 - 果糖+葡萄糖7.麥芽糖樣品A +++麥芽糖+ - 麥芽糖+葡萄葡萄糖 糖+果糖8.麥芽糖樣品B +++麥芽糖 +/-麥芽糖+葡萄糖+“其它”9.蔗糖樣品A+++++ 蔗糖 +++蔗糖10.蔗糖樣品B +++++ 蔗糖 ++ 蔗糖11.海藻糖樣品A +++++ 海藻糖 +++++ 海藻糖12.海藻糖樣品B +++++ 海藻糖 +++++ 海藻糖實施例4胰高血糖素的與美拉德反應(yīng)有關(guān)的修飾為了舉例說明碳水化合物賦形劑對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾的普遍性，研究了有關(guān)的藥理模型系統(tǒng)。研究了治療肽和胰高血糖素的蛋白質(zhì)修飾，該肽和胰高血糖素在30微托真空下從溶液中干燥18小時，存放溫度為25℃升至42℃。用反相高效液相色譜分析來分析含有各種碳水化合物賦形劑的制劑。從貯存不同時間的葡萄糖和蔗糖的比較中獲得的結(jié)果示于圖5中。
圖5描繪的結(jié)果表明大于98％的未處理的胰高血糖素作為單體保留時間為約20分鐘(圖5A)。在葡萄糖中干燥之后，在單體峰之前立即有一個被非酶促糖基化的胰高血糖素(陰影)的單峰(圖5B)。在60℃，在葡萄糖中在4天內(nèi)大多數(shù)胰高血糖素被非酶促糖基化和交聯(lián)所破壞(陰影，圖5C)。在蔗糖中貯存2周后，非酶促糖基化的胰高血糖素的峰剛好在主要單峰的前面(陰影，圖5D)，盡管干燥后樣品中的這種峰不明顯。
這些結(jié)果表明在為葡萄糖時(一種還原糖)，在干燥期間形成席夫堿，而在為蔗糖時(一種非還原糖)，席夫堿在貯存時形成。作為非還原糖，蔗糖被預(yù)期在干燥或貯存期均不形成席夫堿，這說明還原糖和非還原糖都發(fā)生美拉德反應(yīng)，因此本發(fā)明適用于還原糖和非還原糖。這些結(jié)果進(jìn)一步說明在蔗糖作為賦形劑時，還原糖通過水解產(chǎn)生，該水解過程可由貯存的物質(zhì)來催化。而且，由還原糖產(chǎn)生的席夫堿的形成釋放出水，水不僅使體系增塑，而且直接加速進(jìn)一步的水解反應(yīng)和美拉德級聯(lián)(見實施例5，下文)。因此，根據(jù)本文所提供的結(jié)果，使用美拉德抑制劑尤其有用于生物物質(zhì)干燥貯存中與非還原糖的連接。
實施例5水對貯存穩(wěn)定性的影響為了直接考查殘留水對化學(xué)反應(yīng)性的影響，采用含有賴氨酸和兩種非還原賦形劑海藻糖和山梨糖醇被干燥，并以三種不同的規(guī)定的殘留水含量貯存的模型系統(tǒng)。通過用5％痕量的葡萄糖強(qiáng)化干燥混合物來保證化學(xué)反應(yīng)性，它與賴氨酸的反應(yīng)通過貯存在50℃后測定剩余的葡萄糖的量來測得。
圖6顯示10％w/v賴氨酸和5％葡萄糖在85％海藻糖中(a)或在85％的山梨糖醇中的水溶液用-50℃下的初級干燥冷凍干燥48小時，用20℃下的二級干燥再冷凍干燥24小時所獲得的結(jié)果。通過貯存在20℃下的無水P2O5中，接著暴露于飽和水蒸氣氣氛中達(dá)0小時，8小時或25小時來獲得所需水含量。樣品的實際最后的水含量通過使用Kahn微量平衡的(microbalance)熱重量分析法來確定。圖6描述如下的結(jié)果a)(□)4.59％水，(◇)15.09％水，(X)22.89％水；和b)(□)5.42％水，(◇)13.12％水，(X)23.62％水。
所得結(jié)果表明在海藻糖樣品中，由于殘余水含量降低，化學(xué)反應(yīng)性降低，在水含量為5％左右時，基本上沒有觀察到反應(yīng)性(圖6a)。相反，在山梨糖醇樣品中，在最干燥的條件下，化學(xué)反應(yīng)性增強(qiáng)(圖6b)。結(jié)果表明在干燥產(chǎn)品貯存期間，美拉德類型的反應(yīng)極為重要，因為無論水活性是否被限制，在系統(tǒng)中這些反應(yīng)不得不完成。
實施例6美拉德反應(yīng)的非競爭性抑制劑的作用從含有還原糖的溶液中干燥牛血清清蛋白，并將其在存在或缺乏各種濃度的美拉德抑制劑氨基胍的情況下在55℃下溫育3周。通過棕色著色的形成在277-290nm處用分光光度法定量測定美拉德反應(yīng)的程度。
所得結(jié)果示于表3中。
表3糖(25mM) 可能的抑制劑糖∶抑制劑的比例褐化的吸(以摩爾為基礎(chǔ)) 光度大小葡萄糖無 0.709葡萄糖氨基胍 3∶10.603葡萄糖氨基胍 2∶10.205葡萄糖氨基胍 1∶10.212葡萄糖氨基胍 1∶20.211葡萄糖氨基胍 1∶30.154無氨基胍 1∶30.186果糖 無 2.5果糖 氨基胍 1∶30.173
所得結(jié)果表明將美拉德反應(yīng)抑制劑加入到正在干燥的蛋白質(zhì)制劑中防止了在升高溫度下干燥的蛋白質(zhì)產(chǎn)品在貯存期間的降解。
實施例7美拉德反應(yīng)的競爭性抑制劑的作用為了確定干燥組合物貯存時競爭性抑制劑降低美拉德反應(yīng)的作用的效果，進(jìn)行了下面實驗。結(jié)果示于圖7中。
在室溫時，真空(80微米)下，從含有15％葡萄糖作為碳水化合物賦形劑和0，7.5，15以及25％被加入作為競爭性美拉德反應(yīng)抑制劑的賴氨酸的制劑中將堿性磷酸酶(0.25mg/ml)干燥16小時。在55℃下，將樣品貯存4天，通過10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用磷酸α-萘酯和堅牢藍(lán)BB(分別為1mg/ml和1.33mg/ml，在0.38M含有0.5mMMgCl2的Tris-HCl(pH10.3中)對酶活性進(jìn)行染色來進(jìn)行分析(圖7，分別為道1-4)。試驗用的對照為含水緩沖液中的酶和海藻糖中干燥的酶(圖7，分別為道8-9)，雖然在葡萄糖加上賴氨酸的樣品中只有部分活性被恢復(fù)，但這表明隨著加入的賴氨酸的濃度增加，恢復(fù)的活性增加。在有葡萄糖但無賴氨酸加入的樣品中，沒有酶活性被恢復(fù)。
因此，當(dāng)被用蛋白質(zhì)和碳水化合物的混合物來干燥時，美拉德反應(yīng)的競爭性抑制劑增加了干燥產(chǎn)品的干燥和貯存期間的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
總之，我們的結(jié)果表明美拉德反應(yīng)在確定含有碳水化合物作為穩(wěn)定賦形劑的干燥蛋白質(zhì)制劑的長期貯存穩(wěn)定性時是一個極其重要的因素。盡管不被任一理論所束縛，但這可能是由于在干燥期間水的除去使得平衡從初始氨基羰基縮合反應(yīng)朝席夫堿形成的方向移動以及在低的水活性時后續(xù)反應(yīng)的加快，見Lendl和Schleicher(1990)和Nursten(1986)。
雖然為了理解的目的，上述發(fā)明已被通過舉例說明和實施例而詳細(xì)描述，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可以進(jìn)行某些改變和修改是顯而易見的。因此，這些描述和實施例不應(yīng)被認(rèn)為是對所附權(quán)利要求描述的本發(fā)明范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種增加生物物質(zhì)在干燥期間穩(wěn)定性的方法，包括向該物質(zhì)的水溶液或懸浮液中加入一種足以穩(wěn)定該物質(zhì)的量的碳水化合物賦形劑，有效量的美拉德反應(yīng)抑制劑以基本上防止氨基和活性羰基的縮合作用，并干燥所得組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物物質(zhì)選自亞細(xì)胞成分，細(xì)胞和病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物物質(zhì)選自含有游離氨基，亞氨基和胍基側(cè)鏈的分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物物質(zhì)選自藥物制劑、脂類、有機(jī)物、肽、蛋白質(zhì)、激素、糖類、低聚糖、合成肽、D和L氨基酸聚合物、核酸、蛋白質(zhì)核酸雜交體和小分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中蛋白質(zhì)選自酶、生物藥物、生長激素、生長因子、單克隆抗體和細(xì)胞因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥的方法選自冷凍干燥、噴霧干燥、流化床(fluidized bed)干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、環(huán)境溫度常壓干燥、環(huán)境溫度減壓干燥、升溫常壓干燥和升溫減壓干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中碳水化合物選自二糖、三糖、低聚糖及其糖醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中碳水化合物為還原的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中碳水化合物選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、maltulose，異maltulose和乳果糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中碳水化合物為非還原的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中碳水化合物為選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中碳水化合物選自棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和糖醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中碳水化合物選自麥芽糖醇(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)、異-maltulose、palatinit和它們的同分異構(gòu)體(GPS，α-D-吡喃葡糖基-1→6-山梨糖醇和GPM α-D-吡喃葡糖基-1→6-甘露糖醇)，來自異maltulose(palatinose)的糖醇(6-α-D-吡喃葡糖基-甘露糖醇和6-α-D-吡喃葡糖基-山梨糖醇)、蔗糖和相應(yīng)的糖醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中碳水化合物為生理上可接受的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抑制劑為競爭性的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中抑制劑為具有至少一個伯、仲或叔胺基團(tuán)的分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抑制劑為非競爭性的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中抑制劑選自氨基胍基衍生物、兩性霉素B、4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物、4，5，8-三羥基喹啉衍生物、3-氧代吩噁嗪衍生物、3-氧代吩噁嗪N-氧化物、抗壞血酸生育酚基磷酸二酯和其鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥方法為冷凍干燥，抑制劑為競爭性抑制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥方法為冷凍干燥，抑制劑為非競爭性抑制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥方法不為冷凍干燥，抑制劑為競爭性抑制劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干燥方法不為冷凍干燥，抑制劑為非競爭性抑制劑。
23.一種增加生物物質(zhì)貯存穩(wěn)定性的方法，包括加入一種有效量的碳水化合物賦形劑以增加生物物質(zhì)的穩(wěn)定性，加入有效量的美拉德反應(yīng)抑制劑以基本上防止氨基和活性羰基的縮合，干燥得到的組合物并貯存該組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中生物物質(zhì)選自亞細(xì)胞片段、細(xì)胞和病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中生物物質(zhì)選自含有游離氨基、亞氨基和胍基側(cè)鏈的分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中生物物質(zhì)選自藥物制劑、脂類、有機(jī)物、蛋白質(zhì)、激素、糖類、低聚糖、合成肽、D和L氨基酸聚合物，核酸，蛋白質(zhì)核酸雜交體和小分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中蛋白質(zhì)選自酶，生物藥物、生長激素、生長因子、單克隆抗體和細(xì)胞因子。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中干燥方法選自冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、環(huán)境溫度常壓干燥、環(huán)境溫度減壓干燥、升溫常壓干燥和升溫減壓干燥。
29.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中碳水化合物選自二糖、三糖、低聚糖和它們的糖醇。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中碳水化合物為還原的。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中碳水化合物選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、maltulose、異maltulose和乳果糖。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，碳水化合物為非還原的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中碳水化合物為選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中碳水化合物選自棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和糖醇。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中碳水化合物選自麥芽糖醇(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)、異-maltulose、palatinit和它的同分異構(gòu)體(GPS，α-D-吡喃葡糖基-1→6-山梨糖醇和GPM α-D-吡喃葡糖基-1→6-甘露糖醇)，來自異maltulose(palatinose)的糖醇(6-α-D-吡喃葡糖基-甘露糖醇和6-α-D-吡喃葡糖基-山梨糖醇)、蔗糖和對應(yīng)的糖醇。
36.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中碳水化合物為生理上可接受的。
37.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中抑制劑為競爭性的。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中抑制劑為具有至少一個伯、仲或叔胺基團(tuán)的分子。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中抑制劑選自至少一個氨基酸殘基、氨基酸殘基的混合物或由氨基酸殘基組成的短肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中抑制劑為非競爭性的。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中抑制劑選自氨基胍衍生物、兩性霉素B、4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物、4，5，8-三羥基喹啉衍生物、3-氧代吩噁嗪衍生物、3-氧代吩噁嗪N-氧化物、抗壞血酸生育酚基磷酸二酯和其鹽。
42.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中貯存于0℃-80℃下。
43.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中貯存于0℃-65℃下。
44.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中貯存于10℃-60℃下。
45.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中貯存于20℃-50℃下。
46.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中貯存于環(huán)境溫度以上。
47.一種增加干燥生物物質(zhì)貯存穩(wěn)定性的方法，包括混合生物物質(zhì)，有效量的碳水化合物賦形劑以增加生物物質(zhì)的穩(wěn)定性，加入有效量的美拉德反應(yīng)抑制劑的基本上防止氨基和活性羰基的縮合，并貯存該組合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中生物物質(zhì)選自亞細(xì)胞片段、細(xì)胞和病毒。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中生物物質(zhì)選自含有游離氨基、亞氨基和胍基側(cè)鏈的分子。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中生物物質(zhì)選自藥物制劑、脂類、有機(jī)物、肽、蛋白質(zhì)、激素、糖、低聚糖、合成肽、D和L氨基酸聚合物、核酸、蛋白質(zhì)核酸雜交體和小分子。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中蛋白質(zhì)選自酶、生物物質(zhì)、生長激素、生長因子、單克隆抗體和細(xì)胞因子。
52.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中干燥方法選自冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、環(huán)境溫度常壓干燥、環(huán)境溫度減壓干燥、升溫常壓干燥和升溫減壓干燥。
53.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中碳水化合物選自二糖、三糖、低聚糖和其糖醇。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中碳水化合物為還原的。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中碳水化合物選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、maltulose，異maltulose、和乳果糖。
56.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中碳水化合物為非還原的。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中碳水化合物為選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中碳水化合物選自棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和糖醇。
59.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中碳水化合物選自麥芽糖醇(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)、異-maltulose、palatinit和它的同分異構(gòu)體(GPS，α-D-吡喃葡糖基-1→6-山梨糖醇和GPM，α-D-吡喃葡糖基-1→6-甘露糖醇)，來自異maltulose(palatinose)的糖醇(6-α-D-吡喃葡糖基-甘露糖醇和6-α-D-吡喃葡糖基-山梨糖醇)、蔗糖和對應(yīng)的糖醇。
60.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中碳水化合物為生理上可接受的。
61.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中抑制劑為競爭性的。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中抑制劑為具有至少一個伯、仲，叔胺基團(tuán)的分子。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中抑制劑選自至少一個氨基酸殘基、氨基酸殘基的混合物或由氨基酸殘基組成的短肽。
64.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中抑制劑為非競爭性的。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中抑制劑選自氨基胍衍生物、兩性霉素B、4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物、4，5，8-三羥基喹啉衍生物、3-氧代吩噁嗪衍生物、3-氧代吩噁嗪N-氧化物、抗壞血酸生育酚基磷酸二酯和其鹽。
66.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中貯存于0℃-80℃下。
67.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中貯存于0℃-65℃下。
68.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中貯存于10℃-60℃下。
69.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中貯存于20℃-50℃下。
70.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中貯存于環(huán)境溫度以上。
71.一種基本上干燥的組合物，包括至少一種生物物質(zhì)，至少一種碳水化合物和一種美拉德反應(yīng)抑制劑，其中碳水化合物以足以穩(wěn)定生物物質(zhì)的量存在，抑制劑以足以基本上防止氨基和活性羰基縮合的量存在。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)選自亞細(xì)胞片段，細(xì)胞和病毒。
73.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)選自含有游離氨基，亞氨基和胍基側(cè)鏈的分子。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的組合物，其中生物物質(zhì)選自藥物制劑、脂類、有機(jī)物、蛋白質(zhì)、肽、激素、糖、低聚糖、合成肽、、D和L氨基酸聚合物、核酸、蛋白質(zhì)核酸雜交體和小分子。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中蛋白質(zhì)選自酶、生物藥物、生長激素、生長因子、單克隆抗體和細(xì)胞因子。
76.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中組合物的干燥選自冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥、環(huán)境溫度常壓干燥、環(huán)境溫度減壓干燥、升溫常壓干燥和升溫減壓干燥。
77.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中碳水化合物選自二糖、三糖、低聚糖和其糖醇。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的組合物，其中碳水化合物為還原的。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的組合物，其中碳水化合物選自葡萄糖、麥芽糖、乳糖、maltulose、異maltulose、和乳果糖。
80.根據(jù)權(quán)利要求77的組合物，其中碳水化合物為非還原的。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的組合物，其中碳水化合物為選自糖醇和其它直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原葡糖苷。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中碳水化合物選自棉子糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和糖醇。
83.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中碳水化合物選自麥芽糖醇(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡糖醇)、乳糖醇(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)、異-maltulose、palatinit和它的同分異構(gòu)體(GPS，α-D-吡喃葡糖基-1→6-山梨糖醇和GPM，α-D-吡喃葡糖基-1→6-甘露糖醇)，來自異maltulose(palatinose)的糖醇(6-α-D-吡喃葡糖基-甘露糖醇和6-α-D-吡喃葡糖基-山梨糖醇)、蔗糖和對應(yīng)的糖醇。
84.根據(jù)權(quán)利要求77的組合物，其中碳水化合物為生理上可接受的。
85.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中抑制劑為競爭性的。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的組合物，抑制劑為具有至少一個伯、仲，叔胺基團(tuán)的分子。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的組合物，其中抑制劑選自至少一個氨基酸殘基、氨基酸殘基的混合物或氨基酸殘基組成的短肽。
88.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中抑制劑為非競爭性的。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的組合物，其中抑制劑選自氨基胍衍生物、兩性霉素B、4-羥基-5，8-二氧代喹啉衍生物、4，5，8-三羥基喹啉衍生物、3-氧代吩噁嗪衍生物、3-氧代吩噁嗪N-氧化物、抗壞血酸生育酚基磷酸二酯和其鹽。
90.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)在0℃-80℃下貯存穩(wěn)定。
91.根據(jù)權(quán)利要求70的組合物，其中生物物質(zhì)在0℃-65℃下貯存穩(wěn)定。
92.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)在10℃-60℃下貯存穩(wěn)定。
93.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)在20℃-50℃下貯存穩(wěn)定。
94.根據(jù)權(quán)利要求71的組合物，其中生物物質(zhì)在環(huán)境溫度以上貯存穩(wěn)定。
95.一種增加生物物質(zhì)貯存穩(wěn)定性的組合物，包括至少一種碳水化合物和一種美拉德反應(yīng)抑制劑，其中碳水化合物以足以使生物物質(zhì)穩(wěn)定的量存在，抑制劑以足以基本上防止氨基和活性羰基縮合的量存在。
全文摘要
一種在干燥期間增加生物物質(zhì)穩(wěn)定性的方法，包括向該物質(zhì)的水溶液或懸浮液中加入一種以足以穩(wěn)定該物質(zhì)量存在的碳水化合物賦形劑，以有效地基本防止氨基和活性羰基縮合的量存在的美拉德反應(yīng)抑制劑，并干燥所得組合物。
文檔編號A61K31/155GK1160345SQ9519560
公開日1997年9月24日 申請日期1995年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月19日
發(fā)明者C·科拉克, B·J·羅澤爾, S·森 申請人:廓德倫特控股劍橋有限公司