專利名稱：：白細(xì)胞介素－6活性抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一段能夠抑制白細(xì)胞介素-6(IL-6)活性的核苷酸序列、其治療用途以及包含該序列的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：IL-6是細(xì)胞因子類蛋白質(zhì)，它被證明在生物體的免疫應(yīng)答和造血刺激中起著關(guān)鍵作用。實(shí)際上，在肝臟及其它靶器官和靶細(xì)胞中，許多生物功能被發(fā)現(xiàn)與造血系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)中的IL-6有關(guān)。這些功能中有些是有利的，有些則與病理狀態(tài)有關(guān)。在后一種功能中，IL-6被發(fā)現(xiàn)是多發(fā)性髓細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長因子；抗IL-6抗體被證明能夠在白血病患者體內(nèi)暫時(shí)抑制髓細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖(參見Klein等，《血液)》(Blood)78，(5)，pp.1198-1204，1991和Lu等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)22，pp.2819-24，1992)。升高的IL-6水平是與自身免疫疾病和炎性疾病相關(guān)聯(lián)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腎小球性腎炎，牛皮癬和Castelman氏病(參見Graeve等，臨床研究(Clin.Investig.)17，pp.664-71，1993)。IL-6還被證明對骨損失和血鈣過多有直接作用(參見Poli等，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EmboJ.)13，(5)，pp.1189-96和Yoneda等，癌癥研究(CancerRes.，53，pp.737-40，1993.2))。所以，開發(fā)IL-6活性抑制劑已成為人們大力研究的課題。為此已找到多種不同的方法，其中包括使用抗IL-6的抗體(Klein等，同上)，gp130或gp80；使用可溶性gp130；或使用IL-6的突變蛋白或IL-6受體。由于以上方法可能在臨床應(yīng)用中關(guān)系到特定的不希望產(chǎn)生的作用(如Lu等所述，同上)，因此需要確立抑制IL-6活性的其它方法。所以，本申請研究了另一種抑制IL-6活性的方法即通過阻斷胞內(nèi)介導(dǎo)IL-6信號的蛋白質(zhì)。人們已經(jīng)對應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)IL-6信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行了廣泛的研究。Fowlkes等(美國科學(xué)院院報(bào))(PNASUSA)，81，pp.2313-6，1984)首次假設(shè)了在大鼠血纖蛋白原基因的兩側(cè)存在著DNA應(yīng)答元件。此后，Kunz等(核酸研究(Nuc.Ac.Res.)，17，(3)，1121-37，1989)證明在大鼠的α2-巨球蛋白基因中有一個(gè)應(yīng)答IL-6的應(yīng)答元件，其核心序列與大鼠血纖蛋白原基因的(CTGGGA)相同。在編碼人C反應(yīng)蛋白(CRP)(參見Toniatti等，分子生物醫(yī)學(xué)(Mol.Biol.Med.)7，pp.199-212，1990)、人觸珠蛋白(參見Oliviero等，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EmboJ.)6，(7)，pp.1905-12，1987)的基因和編碼其它由IL-6誘導(dǎo)的急相蛋白的基因(參見Heinrich等，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)265，pp.621-36，1990)中也鑒定到了與前文序列相關(guān)的DNA應(yīng)答元件，由此確定了一段核心共有序列，即CTGGGAW或CTGGRAA，其中的W代表A或T，R代表A或G。Hock等(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)12，(5)，pp.2282-94，1992)指出，在應(yīng)答IL-6的野生型基因的調(diào)控區(qū)可能存在與前文核心序列類似的多種相關(guān)核心序列，而且正是這種多樣性引起了應(yīng)答反應(yīng)的擴(kuò)大，正如利用報(bào)道基因測定進(jìn)行的功能性分析的結(jié)果。最近，Wegenka等(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)13，(1)，pp.1657-68，1994)提出一種活躍于肝癌細(xì)胞中的擴(kuò)展形式的核心共有序列，稱為急相蛋白元件(APRE)，可以由通式KTMYKGKAA表示，其中的M代表C或A，K代表T或G，Y代表C或T。Yuan等(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)14，(3)，pp.1657-68，1994)證明，這類APRE樣序列與分子量約90KD的一種蛋白轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最近已克隆得到這種因子，稱為APRF(參見Akira等，細(xì)胞(Cell)77，pp.63-71，1994)。實(shí)際上，活化的APRF與APRE序列的結(jié)合導(dǎo)致了IL-6應(yīng)答細(xì)胞中IL-6誘導(dǎo)型(含有APRE序列)基因的活化。因此，APRE元件可以按照以下方式在IL-6應(yīng)答細(xì)胞中用作靶基因的增強(qiáng)子在IL-6應(yīng)答細(xì)胞中，IL-6處理誘導(dǎo)APRF蛋白的合成，APRF與APFE元件結(jié)合，這種結(jié)合激活靶基因的表達(dá)。SerolupiCrescenzi等(第12屆歐洲免疫會(huì)議公報(bào)(Posteratthe12thEuropeanImmunol.Meeting，)Barcelona，1994年6月14-17日)證明，在HepG2人肝癌細(xì)胞中，APREDNA序列(M8)的8倍重復(fù)引起50-100倍IL-6對報(bào)道基因的誘導(dǎo)作用。實(shí)際上已經(jīng)揭示了各個(gè)此類轉(zhuǎn)錄因子的雙鏈寡核苷酸。發(fā)明綜述本發(fā)明的主要目的是提供一段能夠抑制IL-6活性的核苷酸序列，它包含i)至少一段通式為ZXMYKGKAA的APRE元件核苷酸序列，其中Z代表T或G，也可以缺失，X代表T或者缺失，M代表C或A，Y代表C或T，K代表T或G，該序列連接于ii)至少一段作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)但非APRE元件的核苷酸序列，例如啟動(dòng)子區(qū)域中的那些。后一類核苷酸序列的實(shí)例包括TATA框和AP-1(參見Riabowol等，美國科學(xué)院院報(bào)(PANSUSA)，89，pp.157-61，1992)、AP-2、HNF-1(參見Clusel等，核酸研究(Nuc.Ac.Res.)，21(15)，pp.3405-11)、SP-1(參見Wu等，基因(Gene)，89，pp.203-9，1990)、NF-KB(參見Bielinska等，科學(xué)(Science)，250，pp.997-1000，1990)、Oct-1、E-2之類轉(zhuǎn)錄因子和SRF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式之一中，具有前文通式的APRE元件(i)和/或核苷酸序列(ii)都被重復(fù)至少2次，3至10次更好，8次還要好。在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，元件(i)包含至少兩種不同的APRE元件，和/或核苷酸序列(ii)包含至少兩種不同的作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)但非APRE元件的寡核苷酸序列。核苷酸序列(ii)以SV40早期啟動(dòng)子為佳。APRE元件(i)包含例如以下核苷酸序列TTCTGGGAA。圖2報(bào)道了本發(fā)明范圍之內(nèi)根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例的核苷酸序列，該核苷酸也稱為SEQIDNO1，它是本發(fā)明的目的之一。本發(fā)明目的之二是包含本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)粒載體。本發(fā)明另一方面的內(nèi)容是本發(fā)明核苷酸序列在因IL-6致病的病癥中作為抑制IL-6作用的治療工具的用途。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核苷酸序列或質(zhì)粒載體的藥物組合物。這類組合物可以配制成口服、直腸、靜脈或局部用劑。本發(fā)明的配方可包含使用本發(fā)明中任何一種病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)體配方、受體介導(dǎo)的DNA傳送和/或活性核苷酸抑制序列的啞鈴結(jié)構(gòu)的組合。已經(jīng)利用報(bào)道基因測定法測定了本發(fā)明核苷酸序列的抑制作用。本發(fā)明的報(bào)道基因測定法以APRE元件作為IL-6應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)任何(如前文所述)基因的增強(qiáng)子的能力為基礎(chǔ)。此時(shí)，APRE元件被用作IL-6應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)(例如HepG2肝癌細(xì)胞)靶報(bào)道基因(例如螢光素酶基因)的增強(qiáng)子。然后用IL-6處理細(xì)胞如果足量APRF蛋白被過量的本發(fā)明核苷酸序列所捕獲，靶基因就不會(huì)被激活。根據(jù)該測定法，構(gòu)建了包含本發(fā)明核苷酸序列的抑制劑質(zhì)粒。圖1報(bào)道了這類質(zhì)粒的實(shí)例及其構(gòu)建方法。本申請還意欲將包含本發(fā)明核苷酸序列的該質(zhì)粒和其它質(zhì)粒作為本發(fā)明的另一實(shí)施方式?，F(xiàn)在，將利用以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，但是不能將這些實(shí)施例作為對本發(fā)明的限定。實(shí)施例將參照以下附圖。圖1.質(zhì)粒pM8SV的構(gòu)建方法。用SalI和HindIII消化pM8SVL，利用Klenow反應(yīng)將粘端轉(zhuǎn)化為平端。產(chǎn)生的3.2kb的DNA片段利用瓊脂糖凝膠電泳純化，然后進(jìn)行自身連接。由此生成質(zhì)粒pM8SV，其中包含M8序列(約170bp)和來自SV40病毒早期啟動(dòng)子的序列(約190bp)，但是沒有螢光素酶基因。圖2.質(zhì)粒pM8SV的BamHI-HindIII抑制劑DNA片段序列。所示核苷酸上半段上方的連續(xù)線表示M8序列。核苷酸序列下半段上方的粗連續(xù)線表示SV40啟動(dòng)子序列。同時(shí)給出BamHI和HindIII限制性位點(diǎn)。圖3.T47D細(xì)胞和M1細(xì)胞內(nèi)的IL-6報(bào)道基因測定。不同的含M8質(zhì)粒的測試。記錄的光發(fā)射值是獲自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重復(fù)測定cps30秒積分值的平均值(AUC＝曲線下方面積)。每一直方柱代表三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞平均值±SEM。圖4.用IL-6處理后，轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞內(nèi)螢光素酶受誘導(dǎo)性的時(shí)間進(jìn)程。每一直方柱代表兩個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均值±SEM。圖中顯示二次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖5.IL-6的HepG2報(bào)道基因測定。以pM8作為抑制劑質(zhì)粒，對作為報(bào)道基因質(zhì)粒的pM8SVL進(jìn)行的測試。每一直方柱代表三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均值±SEM。圖中顯示了四次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖6.IL-6的HepG2報(bào)道基因測定。以pN8SV作為抑制劑質(zhì)粒，對作為報(bào)道基因質(zhì)粒的pM8SVL進(jìn)行的測試。每一直方柱代表三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均值±SEM。圖中顯示了四次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將結(jié)果表示為相對于不用抑制劑質(zhì)粒而用pC載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的抑制百分比。圖7.IL-6的HepG2報(bào)道基因測定。以pSV和pM8SV作為抑制劑質(zhì)粒，對作為報(bào)道基因質(zhì)粒的pM8SVL進(jìn)行的測試。每一直方柱代表三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均值±SEM。圖中顯示了四次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將結(jié)果表示為相對于不用抑制劑質(zhì)粒而用pC載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的抑制百分比。圖8.在以來自人觸珠蛋白基因啟動(dòng)子的IL-6誘導(dǎo)型調(diào)控序列調(diào)控下的螢光素酶基因?yàn)榛A(chǔ)的HepG2報(bào)道基因測定中，抑制劑質(zhì)粒pM8和pM8SV對IL-6活性的抑制測試。每一直方柱代表三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均值±SEM。圖中顯示了四次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將結(jié)果表示為相對于不用抑制劑質(zhì)粒而用pC載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的抑制百分比。用0.1μg報(bào)道質(zhì)粒DNA和所示的摩爾過量抑制劑質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在使用載體質(zhì)粒時(shí)保持被轉(zhuǎn)染DNA總量一致。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用1ng/ml的IL-6處理18小時(shí)。本發(fā)明的詳細(xì)說明實(shí)施例1質(zhì)粒的構(gòu)建。如下構(gòu)建IL-6應(yīng)答性螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒，首先化學(xué)合成38bp的一段雙鏈寡核苷酸，其中在5’平端具有完整的BamHI位點(diǎn)，在3’端具有突出的可與BglII和BamHI位點(diǎn)匹配的4個(gè)核苷酸的下游鏈。該合成寡核苷酸被命名為M2，它具有兩段相同的來自大鼠α2-巨球蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的APRE序列。其核苷酸序列如下(上游鏈的5’至3’)(SEQIDNO2)GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG該核苷酸被克隆在質(zhì)粒pGL2-pv(PromegaCorporation提供)的SmaI-BglII位置，在該質(zhì)粒中由SV40病毒早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)，由此在自身連接后形成質(zhì)粒pM2SVL。合成寡核苷酸還通過其5’平端與相同的pGL2-pv質(zhì)粒的SmaI位點(diǎn)連接，然后用HindIII剪切形成線性連接產(chǎn)物。將生成的線性載體用作克隆以下DNA片段的受體1)來自質(zhì)粒pM2SVL的238bp的BamHI-HindIII片段，自身連接后形成質(zhì)粒pM4SVL；2)來自質(zhì)粒pM4SVL的280bp的BamHI-HindIII片段，自身連接后形成質(zhì)粒pM6SVL；3)來自質(zhì)粒pM6SVL的322bp的BamHI-HindIII片段，自身連接后形成質(zhì)粒pM8SVL。如下構(gòu)建pMgL質(zhì)粒，用SfanI消化pM8SVL，并利用Klenow酶的補(bǔ)平反應(yīng)將粘端轉(zhuǎn)化為平端。BamHI消化后，將生成的163bp的M8DNA片段與16bp的BamHI-KpnI合成銜接頭連接，將其克隆到pGL2-b載體(ProgegaCorporation提供)經(jīng)BamHI+KpnI消化而得到的5.6kbDNA片段中。質(zhì)粒pGL2-b與前文pGL2-pv質(zhì)粒相同，但是pGL2-b中沒有SV40啟動(dòng)子序列。16bp的銜接頭中包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它是利用以下序列化學(xué)合成的上游鏈5’CGCGGCCGCCTCGAGG3’(SEQIDNO3)；下游鏈5’GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC3’(SEQIDNO4).以上構(gòu)建而成的質(zhì)粒是pM8L，它具有不帶啟動(dòng)子的M8DNA序列，包含在位于螢光素酶基因上游的一個(gè)多克隆位點(diǎn)內(nèi)。如下制備螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pM8TKL，用XbaI和BglII剪切質(zhì)粒pGEM-TK-CAT(Cohen等，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志，7(5)，pp.1411-9，1988)。生成的181bp片段包含病毒HSV胸腺嘧啶激酶基因的TK啟動(dòng)子序列，將其與pM8L載體5.8Kb的NheI-BglII片段連接，使之位于M8和螢光素酶DNA序列之間。如下構(gòu)建螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pHPSVL，首先利用PCR擴(kuò)增來自人基因組DNA中觸珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域的841bp片段。PCR擴(kuò)增片段的3’末端對應(yīng)于距人觸珠蛋白基因(Maeda等，生物化學(xué)雜志，260(11)，pp.6698-709，1985年6月10日)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-36的位置。利用分別包含MluI和BglII限制性位點(diǎn)的上游引物和下游引物制備該P(yáng)CR產(chǎn)物。用于觸珠蛋白啟動(dòng)子區(qū)域的基因組擴(kuò)增的合成DNA引物具有以下序列上游引物5’CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT3’(SEQIDNO5)；下游引物5’CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC3’(SEQIDNO6)；將由此獲得的PCR片段插入前文螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pGL-2pv的MluI和BglII位置，位于SV40早期啟動(dòng)子的上游。生成的質(zhì)粒是pHPSVL。為了構(gòu)建抑制劑質(zhì)粒pM8，用SalI和BglII消化前文質(zhì)粒pM8L，并利用Klenow反應(yīng)將形成的粘端修補(bǔ)成平端。利用瓊脂糖凝膠電泳純化由此生成的沒有螢光素酶基因序列的3.1Kb片段，然后將其自身連接成抑制劑質(zhì)粒pM8。抑制劑質(zhì)粒pM8SV的制備如圖1所示。用SalI和HindIII消化pM8SVL，并利用Klenow反應(yīng)將形成的粘端修補(bǔ)成平端。利用瓊脂糖凝膠電泳純化由此生成的3.2Kb片段，然后進(jìn)行自身連接。由此生成含有M8序列(約170bp)和來自SV40病毒早期啟動(dòng)子的序列(約190bp)但沒有螢光素酶基因的質(zhì)粒pM8SV。如下制備抑制劑質(zhì)粒pSV，從前文pGL2-pv質(zhì)粒中切除包含螢光素酶基因的SalI-HindIII片段。得到的3.1Kb片段用Klenow酶進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳純化，然后自身連接，由此生成包含SV40啟動(dòng)子但沒有螢光素酶基因的質(zhì)粒pSV。如下制備載體質(zhì)粒pC，用SalI和HindIII限制性酶剪切前文質(zhì)粒pGL2-b。得到的2.9Kb片段用Klenow酶進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳純化，然后自身連接，由此生成質(zhì)粒pC。上述質(zhì)粒全部被通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(AusubelR.等，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology.)GreenePublishingAssociates和WileyInterscience，紐約)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue。利用少量制備性堿裂解法(Ausubel同上)抽提質(zhì)粒DNA。利用限制性酶切分析和瓊脂糖凝膠電泳挑選質(zhì)粒DNA。挑選出合適形式的克隆。為了獲得用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的純化質(zhì)粒制備物，制備300ml選定的大腸桿菌XL1-Blue轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物。然后按照制造商的說明，利用QIAGENtip500離子交換微型柱純化質(zhì)粒。實(shí)施例2細(xì)胞系和培養(yǎng)條件。將HepG2人肝癌細(xì)胞(ATCC)培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％FCS、5mML-谷氨酰胺、20mMHEPES、100U/ml青霉素/鏈霉素的MEM中。將T47D人乳腺癌細(xì)胞(ATCC)培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％FCS、5mML-谷氨酰胺、20mMHEPES、100U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM中。將M1鼠骨髓白血病細(xì)胞(ATCC)培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％FCS、5mML-谷氨酰胺、20mMHEPES、100U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI中。如下所述，在有或無相應(yīng)劑量IL-6(Interpharm實(shí)驗(yàn)室提供的CHO-衍生的人IL-6)存在下進(jìn)行以上細(xì)胞系的培養(yǎng)。實(shí)施例3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和螢光素酶及β半乳糖苷酶測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(AusubelR.等，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology.)GreenePublishingAssociates和WileyInterscience，紐約)在hepes緩沖液中利用磷酸鈣沉淀法進(jìn)行HepG2人肝癌細(xì)胞和T47D人乳腺癌細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Ausubel同上)利用DEAE-葡聚糖進(jìn)行鼠M1骨髓白血病細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。為了檢測螢光素酶和β-半乳糖苷酶的活性，通過在室溫下用1ml/106細(xì)胞的抽提緩沖液(25mMTRIS-磷酸鹽，pH7.8、2mMDTT、2mMEDTA、10％甘油、1％TritonX-100)孵育15分鐘后當(dāng)場抽提細(xì)胞。為了測定螢光素酶活性，用100μl螢光素酶測定緩沖液(20mMTricien、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2-5H2O、2.67mMMgSO4、0.1mMEDTA、33.3mMDTT、0.27mM輔酶A、0.47mM螢光素、0.53mMATP)直接測定20μl細(xì)胞提取物。為了測定β半乳糖苷酶的活性，10μ1細(xì)胞提取物用100μlLumigal底物(Lumigen提供)在37℃孵育1小時(shí)。用BertholdAutolumatLB953發(fā)光計(jì)進(jìn)行Lumigal和螢光素酶讀數(shù)，對螢光素酶進(jìn)行輸出數(shù)據(jù)即計(jì)數(shù)/秒(cps)的30秒積分，對β-半乳糖苷酶進(jìn)行15秒的積分。報(bào)道質(zhì)粒pM8SVL被證明能夠在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后賦予細(xì)胞IL-6應(yīng)答性，即將螢光素酶活性的表達(dá)提高至50-100倍(SerlupiCrescenzi等，第12屆歐洲免疫會(huì)議公報(bào)(Posteratthe12thEuropeanImmunol.Meeting，)Barcelona，1994年6月14-17日)。還在T47D人乳腺癌細(xì)胞和鼠M1骨髓白血病細(xì)胞中對該質(zhì)粒進(jìn)行了測試。用DEAE/葡聚糖，以0.5μgDNA/106細(xì)胞轉(zhuǎn)染M1細(xì)胞，用2.5μgDNA/105細(xì)胞磷酸鈣法轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞。除了它們對IL-6都具有應(yīng)答外，兩細(xì)胞系只有非常少的共有特征。結(jié)果(圖3)顯示，在IL-6處理后，pM8SVL質(zhì)粒中的M8DNA分子在兩種細(xì)胞系中都非?；钴S。如圖3所示，用報(bào)道基因質(zhì)粒pM8TKL在M1細(xì)胞中也觀察到了明顯的IL-6應(yīng)答，該質(zhì)粒中在M8分子兩側(cè)的是胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子而不是pM8SVL中的SV40啟動(dòng)子。在用IL-6處理(1ng/m1)后檢測了轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞的螢光素酶受誘導(dǎo)性的時(shí)間進(jìn)程。質(zhì)粒pM8SVL被用作陽性報(bào)道基因質(zhì)粒(0.2μgDNA/105細(xì)胞)。通宵轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分離后用IL-6處理。圖4記錄了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，用IL-6處理2小時(shí)后，幾乎可以獲得對IL-6的完全應(yīng)答。實(shí)施例4抑制劑質(zhì)粒pM8的測試。在用對IL-6應(yīng)答的i)pM8SVL報(bào)道基因質(zhì)粒和ii)插入在pM8抑制劑質(zhì)粒中的M8分子共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，測定M8DNA對IL-6活性的抑制作用。后一種質(zhì)粒包含M8序列但沒有提供對IL-6應(yīng)答性的能力。在不同劑量IL-6存在下，用多至2.5μgDNA/105細(xì)胞的對IL-6應(yīng)答的報(bào)道質(zhì)粒pM8SVL(含有M8和螢光素酶基因)和10或50倍摩爾過量的pM8轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。在用載體質(zhì)粒pC轉(zhuǎn)染時(shí)保持每次轉(zhuǎn)染的DNA總量相等，該質(zhì)粒與pM8相同但是沒有其中特定的165bp長的M8DNA片段。如圖5所示，在4次實(shí)驗(yàn)中，即使pM8抑制劑質(zhì)粒摩爾數(shù)過量50倍，抑制劑質(zhì)粒都沒有顯示對IL-6活性明顯且具有重現(xiàn)性的特異抑制作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，IL-6應(yīng)答性報(bào)道基因質(zhì)粒pM8SVL按0.1μgDNA/105細(xì)胞的劑量使用，恒定的用于轉(zhuǎn)染的DNA總量為5μgDNA/105細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)中使用的最適度下的IL-6劑量是1ng/ml。如圖5所示，由于不同的轉(zhuǎn)染本身具有不可避免的可變性，所以以上實(shí)驗(yàn)情況的變化是可以接受的。圖5抑制劑質(zhì)粒pM8SV的測試。圖5中的結(jié)果有些出乎意料，因?yàn)橐种苿┵|(zhì)粒pM8的活性M8抑制劑DNA序列與pM8SVL報(bào)道基因質(zhì)粒中的活性序列相同。所以，可以預(yù)計(jì)到在共轉(zhuǎn)染后不同質(zhì)粒中的這兩種相同M8序列之間有競爭，由此造成報(bào)道基因測定中對IL-6活性的抑制作用。而且，由于數(shù)據(jù)是在有限量IL-6存在下獲得的，所以不能用存在過量的沒有被M8抑制劑DNA分子充分中和的活化的IL-6特異性轉(zhuǎn)錄因子解釋以上結(jié)果。此外，利用已知轉(zhuǎn)錄因子(26-30)的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)也與圖5中的結(jié)果不同。對圖5結(jié)果的另一種解釋可能是報(bào)道基因質(zhì)粒中除M8之外的其它序列造成了IL-6特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。pM8抑制劑質(zhì)粒中一定沒有這種序列，但是它們一定存在于陽性報(bào)道基因質(zhì)粒pM8SVL中(例如能夠結(jié)合通用轉(zhuǎn)錄因子的SV40早期基因啟動(dòng)子序列)。所以，pM8質(zhì)粒在與報(bào)道基因質(zhì)粒pM8SVL競爭時(shí)失效。為了驗(yàn)證這一假設(shè)而構(gòu)建了同時(shí)包含作為IL-6抑制劑DNA的M8序列和SV40啟動(dòng)子序列(參見圖1)。用HepG2細(xì)胞在IL-6報(bào)道基因測定中測試該抑制劑質(zhì)粒。分別進(jìn)行了4次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)染。用0.1μg報(bào)道質(zhì)粒DNA和摩爾數(shù)過量的圖6所示抑制劑質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在用載體質(zhì)粒時(shí)，保持被轉(zhuǎn)染DNA總量一致。用1ng/ml的IL-6對轉(zhuǎn)染細(xì)胞測試18小時(shí)。圖6中的結(jié)果顯示pM8SV抑制劑質(zhì)粒產(chǎn)生明顯的劑量依賴性IL-6活性抑制作用。表1記錄了圖6中的原始數(shù)據(jù)。在每次實(shí)驗(yàn)中，每一劑量的抑制劑質(zhì)粒進(jìn)行三次重復(fù)轉(zhuǎn)染。對于每次實(shí)驗(yàn)，在一單列中表示的誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)值來自相同的轉(zhuǎn)染過程。記錄的光發(fā)射值是cps的30秒積分值。如表1所示，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果略有變化，特別是在較低的抑制劑質(zhì)粒劑量時(shí)，但是重復(fù)轉(zhuǎn)染的CV通常低于20％。為了否定pM8SV抑制劑質(zhì)粒產(chǎn)生的IL-6活性抑制完全來自SV40啟動(dòng)子DNA而不是M8與SV40的組合，于是構(gòu)建了另一種質(zhì)粒并在報(bào)道基因測定中進(jìn)行了測試。該質(zhì)粒只包含作為IL-6活性抑制劑的SV40DNA序列，既沒有M8抑制劑序列，也沒有螢光素酶基因。用0.1μg報(bào)道質(zhì)粒DNA和摩爾數(shù)過量的圖7所示抑制劑質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在用載體質(zhì)粒時(shí)，保持被轉(zhuǎn)染DNA總量一致。用1ng/ml的IL-6對轉(zhuǎn)染細(xì)胞測試18小時(shí)。圖7中的結(jié)果顯示，該抑制劑質(zhì)粒(pSV)只表現(xiàn)出對IL-6活性的部分抑制作用，從不超過40％，而且不是劑量依賴性的。由此可以認(rèn)定，單有SV40DNA序列是不足以有效抑制IL-6活性的。另一方面，螢光素酶報(bào)道質(zhì)粒pGL2-pv包含SV40啟動(dòng)子序列而沒有M8序列，由此產(chǎn)生不為IL-6進(jìn)一步誘導(dǎo)的基線水平的螢光素酶表達(dá)。在該質(zhì)粒中，螢光素酶的基線水平表達(dá)并不被pM8SV抑制劑質(zhì)粒所抑制，由此證明pM8SV質(zhì)粒并沒有有效的去除只特異性結(jié)合pGL2-pv的SV40啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)際上，在后一種抑制劑質(zhì)粒存在下，報(bào)道質(zhì)粒pGL2-pv的螢光素酶活性甚至比該抑制劑質(zhì)粒不存在時(shí)更高(沒有顯示)。實(shí)施例6pM8SV對由報(bào)道基因質(zhì)粒pHPSVL引起的IL-6活性的抑制。然后，我們試圖在另一報(bào)道基因測定中測定IL-6的抑制劑質(zhì)粒pM8SV，其中報(bào)道基因質(zhì)粒中介導(dǎo)IL-6信號的靶DNA序列并不與M8抑制劑序列完全匹配。所以，用質(zhì)粒pHPSVL轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，該質(zhì)粒包含位于SV40啟動(dòng)子和螢光素酶基因之間的841堿基對的人觸珠蛋白啟動(dòng)子序列。該質(zhì)粒中包含一個(gè)來自人觸珠蛋白啟動(dòng)子序列APRE位點(diǎn)(Maeda等，生物化學(xué)，260(11)，pp.6698-709，1995年6月10日)。在此之前我們已經(jīng)證明該質(zhì)粒的確對IL-6有應(yīng)答，即將螢光素酶的表達(dá)提高6至8倍(SerlupiCrescenzi等，第12屆歐洲免疫會(huì)議公報(bào)(Posteratthe12thEuropeanImmunol.Meeting，)Barcelona，1994年6月14-17日)。圖8顯示了三次重復(fù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在以報(bào)道基因質(zhì)粒pHPSVL和50倍摩爾數(shù)過量的載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，IL-6造成的可誘導(dǎo)性使得螢光素酶的表達(dá)高出基線水平約4倍。相反，與50倍摩爾數(shù)過量的pM8SV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染則完全消除了IL-6引起的可誘導(dǎo)性。所以，在用不同于pM8SVL的IL-6應(yīng)答報(bào)道基因質(zhì)粒(例如，pHPSVL)進(jìn)行測試時(shí)，pM8SV抑制劑質(zhì)粒仍然能夠抑制IL-6活性。實(shí)施例7抑制劑質(zhì)粒pM8SV在T47D細(xì)胞中的測試。還在使用T47D人乳腺癌細(xì)胞的pM8SVL報(bào)道基因測定中測試了pM8SV抑制劑質(zhì)粒，IL-6信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)在該細(xì)胞中不同于肝癌細(xì)胞。如前所述，利用pM8SVL報(bào)道基因質(zhì)粒的IL-6報(bào)道基因測定對該細(xì)胞系有效但不是最好的。由于T47D細(xì)胞的敏感性較低，所以用較高的質(zhì)粒DNA水平即1μg陽性報(bào)道基因質(zhì)粒/105細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所以，在過量載體或抑制劑質(zhì)粒的存在下可以觀察到非特異性抑制，由此造成IL-6特異性抑制作用較高的可變性。結(jié)果顯示于表2。顯示了兩次進(jìn)行三次重復(fù)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)的平均值(AVG)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。由每次轉(zhuǎn)染的原始數(shù)據(jù)計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)的平均值。在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2中每105個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別使用1和0.5μg報(bào)道基因質(zhì)粒。在這些實(shí)驗(yàn)中分別用載體質(zhì)粒和抑制劑質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，兩種質(zhì)粒都使用與報(bào)道質(zhì)粒相同的過量摩爾數(shù)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后用1ng/ml的IL-6誘導(dǎo)18小時(shí)。記錄的光發(fā)射值是cps的30秒積分值。通過比較過量抑制劑質(zhì)粒存在下和相應(yīng)劑量載體質(zhì)粒存在下的誘導(dǎo)作用來評價(jià)IL-6特異性抑制作用。而且，由于非特異性抑制，螢光素酶表達(dá)的基線水平接近于測定的定量極限值。表2中的結(jié)果(見實(shí)施例1)顯示，重復(fù)轉(zhuǎn)染三次后，在抑制劑質(zhì)粒pM8SV過量20倍時(shí)觀察到了對IL-6活性相關(guān)的特異性抑制，但是在摩爾數(shù)過量10倍時(shí)沒有。在本實(shí)驗(yàn)中不能測試摩爾數(shù)過量50倍的抑制劑質(zhì)粒，因?yàn)榇藭r(shí)的非特異性抑制作用過高。在使用0.5μgDNA/105細(xì)胞的另一實(shí)驗(yàn)中，以上結(jié)果無法重現(xiàn)(表2，見實(shí)驗(yàn)2)。缺乏重現(xiàn)性可以被認(rèn)為是因?yàn)門47D報(bào)道基因測定的高可變性和低敏感性。或者，靶細(xì)胞的差異選擇性可以解釋以上結(jié)果。實(shí)施例8最小DNA抑制序列的定義。為了確定保留抑制與IL-6誘導(dǎo)性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力的最小DNA序列，可以使用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)實(shí)驗(yàn)法(參照Ausubel)?？梢岳脤?shí)施例3和以下實(shí)施例中所述的報(bào)道基因測定法來測試該最小序列引起的功能性抑制。在報(bào)道基因測定中，我們已證明能夠功能性抑制IL-6活性的最小DNA序列是抑制劑質(zhì)粒pM8SV內(nèi)包含8倍重復(fù)的APREDNA序列和SV40早期啟動(dòng)子序列的350bp的BamHI-HindIII片段。已知后一種序列具有通用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，例如AP-1樣位點(diǎn)(Zenke等，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志，5(2)，pp.387-97，1986)和Sp-1位點(diǎn)(Dynan等，細(xì)胞(Cell)，35，pp.79-87，1983)的6倍重復(fù)。該BamHI-HindIII片段可以利用PCR或核酸酶處理之類的常規(guī)手段(參照Ausubel)在其5’端和/或3’端進(jìn)行缺失，以包含兩個(gè)APRE序列和僅僅一個(gè)或數(shù)個(gè)來自SV40早期啟動(dòng)子的特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。由此形成的DNA序列可以用于HepG2細(xì)胞中以pSVM8L為基礎(chǔ)的報(bào)道基因測定法抑制性測試。此外，通過末端標(biāo)記或Klenow補(bǔ)平反應(yīng)之類的常規(guī)手段用32P標(biāo)記該DNA，可將保留了全部功能性抑制IL-6信號能力的最小DNA片段用于EMSA?？梢栽谟肐L-6處理后，將標(biāo)記過的DNA片段與HepG2細(xì)胞的核提取物一起孵育。還可以與用量逐漸增加的競爭劑DNA序列一起孵育，例如由上述BamHI-HindIII抑制劑DNA片段缺失產(chǎn)生的非標(biāo)記DNA片段。孵育后，可進(jìn)行混合物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。相對于非結(jié)合標(biāo)記DNA的凝膠遷移率變動(dòng)(滯后)表明相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與被測標(biāo)記DNA片段發(fā)生結(jié)合。特定變動(dòng)凝膠條帶的消失表明在未標(biāo)記競爭劑DNA存在下對這種結(jié)合的抑制。表1HepG2的IL-6報(bào)道基因測定。pSM8抑制劑質(zhì)粒對pSVM8L報(bào)道基因質(zhì)粒的測試。</tables>表2IL-6的T47D報(bào)道基因測定</tables>序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS股份公司(B)街道6JOHNGORSIRAWEG(C)城市CURACAO(E)國家荷蘭(F)郵編無(ii)發(fā)明名稱IL-6活性抑制劑(iii)序列數(shù)量6(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度356堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO1CCCAGGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG60ATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTT120CTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAG180TCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGC240CCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGC300TATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT356(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO2GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG38(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO3CGCGGCCGCCTCGAGG16(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO4GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC24(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO5CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT29(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQIDNO6CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC28權(quán)利要求1.能夠抑制IL-6活性的核苷酸序列，它包含i)至少一段通式為ZXMYKGKAA的APRE元件核苷酸序列，其中的Z代表T或G，也可以缺失，X代表T或者缺失，M代表C或A，Y代表C或T，K代表T或G；該序列連接于ii)至少一段作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)但不是APRE元件的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其中的(i)是核苷酸序列TTCTGGGAA。3.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的核苷酸序列，其中的(ii)選自TATA框和以下轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)AP-1、AP-2、HNF-1、SP-1、NF-KB、Oct-1、E-2和SRF。4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的核苷酸序列，其中的APRE元件(i)被至少重復(fù)兩次。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其中的APRE元件被重復(fù)3至10次。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列，其中的APRE元件被重復(fù)8次。7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的核苷酸序列，其中的序列(i)包含至少兩種不同的APRE元件。8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的核苷酸序列，其中的序列(ii)包含至少兩種不同的作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核苷酸序列，其中的序列(ii)是SV40早期啟動(dòng)子。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，該序列如SEQIDNO1所述。11.包含根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的核苷酸序列的質(zhì)粒載體。12.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列在抑制IL-6作用的治療方法中的用途。13.一種藥物組合物，它包含根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的載體和/或賦形劑。14.一種藥物組合物，它包含根據(jù)權(quán)利要求11所述的質(zhì)粒和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的載體和/或賦形劑。全文摘要本發(fā)明涉及能夠抑制IL－6活性的核苷酸序列、其用途以及包含該核苷酸的藥物組合物。具體地說,本發(fā)明涉及這樣一段核苷酸,它包含:i)至少一段通式為ZXMYKGKAA的APRE元件核苷酸序列,其中的Z代表T或G,也可以缺失,X代表T或者缺失,M代表C或A,Y代表C或T,K代表T或G;該序列連接于ii)至少一段作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)但不是APRE元件的核苷酸序列,例如啟動(dòng)子區(qū)域中的序列。文檔編號A61K48/00GK1183801SQ95197849公開日1998年6月3日申請日期1995年5月11日優(yōu)先權(quán)日1995年5月11日發(fā)明者O·塞盧皮－克雷申奇,A·佩佐蒂申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司