專利名稱：人類趨化因子β－8,趨化因子β－1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白－4的制作方法
此申請(qǐng)是未決申請(qǐng)08/446,881(1995年5月5日在美國(guó)專利和商標(biāo)局申請(qǐng))的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及新近鑒定的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的產(chǎn)生。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽已被推定性地鑒定為人類趨化因子β-8(Ckβ-8)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-4(MIP-4)和趨化因子β-1(Ckβ-1)。本發(fā)明也涉及抑制這些多肽的作用的方法。
趨化因子，也稱為intercrine細(xì)胞因子，是結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的細(xì)胞因子的亞家族。這些分子的大小為8-10kd。一般來(lái)說(shuō)，趨化因子在氨基酸水平上顯示出20％至75％的同源性，以形成兩個(gè)二硫鍵的四個(gè)保守的半胱氨酸殘基為特征。以前兩個(gè)半胱氨酸殘基的排列為基礎(chǔ)，將趨化因子分成兩個(gè)亞家族，α和β。在α亞家族中，前兩個(gè)半胱氨酸由一個(gè)氨基酸分開，因此稱為″C-X-C″亞家族。在β亞家族中，這兩個(gè)半胱氨酸在鄰近的位置上，因此稱為″C-C″亞家族。至此，在人類中已經(jīng)鑒定了這個(gè)家族的至少8個(gè)不同的成員。
intercrine細(xì)胞因子顯示出各種功能。一個(gè)標(biāo)志特征是它們引起不同細(xì)胞類型(包括單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的趨化遷移的能力。許多趨化因子具有促炎活性并且與炎性反應(yīng)的多個(gè)步驟有關(guān)。這些活性包括組胺釋放、溶酶體酶和白細(xì)胞三烯釋放的刺激作用，增加靶免疫細(xì)胞吸附到內(nèi)皮細(xì)胞上，增強(qiáng)補(bǔ)體蛋白的結(jié)合，誘導(dǎo)粒細(xì)胞吸附分子和補(bǔ)體受體的表達(dá)及突發(fā)性呼吸。除了和炎癥有關(guān)外，已表明某些趨化因子顯示出其它活性。例如，巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1)能夠抑制造血干細(xì)胞的增殖，血小板因子-4(PF-4)是有力的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制物，白介素-8(IL-8)促進(jìn)角化細(xì)胞的增殖，而GRO是黑素瘤細(xì)胞的自分泌生長(zhǎng)因子。
根據(jù)多樣化的生物活性，趨化因子和很多生理和疾病狀態(tài)(包括淋巴細(xì)胞運(yùn)輸、創(chuàng)傷愈合、造血調(diào)節(jié)和免疫紊亂(如變態(tài)反應(yīng)、氣喘和關(guān)節(jié)炎))有關(guān)，這一點(diǎn)并不奇怪。造血譜系調(diào)節(jié)物的例子是MIP-1。原來(lái)將MIP-1鑒定為巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子。后來(lái)的研究表明MIP-1由兩種不同的，但是相關(guān)的蛋白質(zhì)MIP-1α和MIP-1β組成。MIP-1α和MIP-1β都是巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的化學(xué)引誘物。有趣的是，多潛能干細(xì)胞抑制物(SCI)的生物化學(xué)純化和接下來(lái)的序列分析表明SCI和MIP-1α相同。并且，已表明MIP-1β能抵消MIP-1α抑制造血干細(xì)胞增殖的能力。此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了這樣一個(gè)假說(shuō)，即MIP-1的主要生理作用是調(diào)節(jié)骨髓的造血，而所提出的炎性功能是次要的。MIP-1α作為干細(xì)胞抑制物的作用方式與其在G1/S核分裂間期阻斷細(xì)胞周期的能力有關(guān)。并且，MIP-1α的抑制作用似乎受未成熟的祖先細(xì)胞限制，而其在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSP)存在的情況下對(duì)晚期的祖先具有真正的刺激作用。已經(jīng)克隆了幾組趨化因子，它們可能是MIP-1α和MIP-1β的人類同系物。在所有的情況下，從針對(duì)激活的T細(xì)胞RNA制備的文庫(kù)中分離cDNA?？梢栽谠缙诘膭?chuàng)傷炎癥細(xì)胞中檢測(cè)MIP-1蛋白，已表明MIP-1蛋白誘導(dǎo)創(chuàng)傷成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和IL-6。此外，當(dāng)或者皮下注射到小鼠的腳墊(footpad)上，或者腦池內(nèi)注射到兔的腦脊髓液中時(shí)，天然的純化MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起急性炎癥(Wolpe和Cerami，1989，F(xiàn)ASEB J.32565-73)。除了MIP-1的這些直接或間接的促炎性質(zhì)外，在使用無(wú)菌傷口室的實(shí)驗(yàn)小鼠模型中，在傷口愈合的早期炎性階段，重新獲得MIP-1(Fahey，等，1990，細(xì)胞因子，292)。例如，PCT申請(qǐng)WO92/05198(由Chiron公司申請(qǐng))公開了一種在酵母中作為產(chǎn)生哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIPS)模板的活性DNA分子。
鼠MIP-1α和MIP-1β是不同的但十分相關(guān)的細(xì)胞因子。這兩種蛋白質(zhì)的部分純化混合物影響嗜中性功能并引起局部的炎癥和發(fā)熱。已在酵母細(xì)胞中表達(dá)了MIP-1α并將其純化成同質(zhì)性。結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)了MIP-1α與PF-4和IL-8具有相似的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與它們共有限定的序列同源性。也證明了MIP-1α在體內(nèi)是活性的，保護(hù)小鼠的干細(xì)胞，防止后來(lái)其在體外由氚化的胸苷殺死。也表明MIP-1α促進(jìn)更多的定型祖先粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞在響應(yīng)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的增殖(Clemens.J.M.等，細(xì)胞因子，476-82(1992))。
原來(lái)在母專利申請(qǐng)中稱為MIP-1γ的本發(fā)明的多肽(Ckβ-1)，基于氨基酸序列的同源性其為β趨化因子家族的新成員。原來(lái)在母專利申請(qǐng)中稱為MIP-3的Ckβ-8多肽，基于氨基酸序列的同源性也是β趨化因子家族的新成員。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供了新的成熟多肽，它們是人類Ckβ-8、人類MIP-4和人類Ckβ-1以及它們的具有生物學(xué)活性并且診斷或治療上有用的片段、類似物及衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了編碼這些多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及它們具有生物學(xué)活性的和診斷或治療上有用的片段、類似物及衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法，這一方法包括在促進(jìn)所說(shuō)的蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含核酸序列的重組原核生物和/或真核生物的宿主細(xì)胞，并回收所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸用于治療目的的方法，例如保護(hù)骨髓干細(xì)胞防止其在化療期間受到化學(xué)治療試劑的損害，除去白血病細(xì)胞，刺激免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)造血和淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸，治療牛皮癬、固體腫瘤，促進(jìn)宿主針對(duì)有抵抗力的慢性和急性感染的防御，和刺激創(chuàng)傷愈合。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了抗這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了這些多肽的拮抗劑，它們可用于抑制這些多肽的作用，例如抑制IL-1和TNF-α的產(chǎn)生，治療再生障礙性貧血、脊髓發(fā)育不良綜合征、哮喘、關(guān)節(jié)炎。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了包含足夠長(zhǎng)度的核酸分子的核酸探針，以便特異性地和Ckβ-8、Ckβ-1和MIP-4核酸序列雜交。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了檢測(cè)與這些多肽表達(dá)不足和過(guò)量表達(dá)有關(guān)的疾病以及檢測(cè)編碼這些多肽的核酸序列的突變的診斷測(cè)定方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供了為了開發(fā)用于治療人類疾病的治療劑和診斷劑這一目的，將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸作為與科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體制造有關(guān)的體外研究試劑的方法。
通過(guò)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
下列附圖用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，而無(wú)意于用來(lái)限制權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。


圖1是編碼Ckβ-8的cDNA序列和相應(yīng)的推定的氨基酸序列。開始的21個(gè)氨基酸代表推定的前導(dǎo)序列。所有的信號(hào)序列通過(guò)桿狀病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)的N末端肽測(cè)序而確定。
圖2是編碼Ckβ-1的cDNA序列和相應(yīng)的推定的氨基酸序列。開始的19個(gè)氨基酸代表前導(dǎo)序列。
圖3是編碼MIP-4的cDNA序列和相應(yīng)的推定的氨基酸序列。開始的20個(gè)氨基酸代表前導(dǎo)序列。
圖4顯示了Ckβ-8(上面)和人類MIP-1α(下面)的氨基酸同源性。顯示了所有趨化因子的四個(gè)半胱氨酸特征。
圖5是兩個(gè)氨基酸序列，其中上面的序列是人類MIP-4氨基酸序列，下面的序列是人類MIP-1α(人類扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白前體)。
圖6顯示了Ckβ-1(上面)和人類MIP-1α(下面)的氨基酸序列對(duì)比。
圖7是凝膠照片，HA標(biāo)記的Ckβ-1在COS細(xì)胞中表達(dá)后，將Ckβ-1在其上進(jìn)行電泳。
圖8是Ckβ-1在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化后的SDS-PAGE凝膠照片。
圖9是Ckβ-8在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和三步純化后的SDS-PAGE凝膠照片。
圖10.使用48孔的微室裝置(Neuro Probe公司)通過(guò)趨藥性測(cè)定確定了Ckβ-8的化學(xué)引誘物活性。實(shí)驗(yàn)方法如制造商手冊(cè)所描述。對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)的Ckβ-8濃度，在5個(gè)高倍視野(field)中檢驗(yàn)了遷移。所得的結(jié)果表示兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。顯示了對(duì)THP-1細(xì)胞(A)和PBMCs(B)的化學(xué)引誘物活性。
圖11.使用Hitachi F-2000熒光分光光度計(jì)測(cè)定了響應(yīng)Ckβ-8的胞內(nèi)鈣濃度的變化。將細(xì)菌表達(dá)的Ckβ-8加入到Indo-1荷載的THP-1細(xì)胞中至最終濃度為50nM，并監(jiān)測(cè)鈣濃度的胞內(nèi)水平。
圖12.以LPS(0.1-10ng/ml)或者Ckβ-8(至50ng/ml)處理單核細(xì)胞系THP-116個(gè)小時(shí)。把組織培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行ELISA分析以定量TNF-α的分泌。
圖13.以用量不斷增加的Ckβ-8(由桿狀病毒產(chǎn)生)處理通過(guò)淘析法純化的人類外周血單核細(xì)胞。將組織培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行ELISA分析以定量TNF-α、IL-6、IL-1、GM-CSF和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的分泌。
圖14.將低密度的小鼠骨髓細(xì)胞群體接種(1,500個(gè)細(xì)胞/平皿)在含有瓊脂，含有或不含有指示趨化因子(100ng/ml)，但含有IL-3(5ng/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)和M-CSF(5ng/ml)的培養(yǎng)基中。所示的數(shù)據(jù)表示從兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所獲得的平均值(每一個(gè)實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行重復(fù))。在接種后的14天計(jì)數(shù)集落。含有趨化因子時(shí)產(chǎn)生的集落數(shù)表示為不含有任何加入的趨化因子時(shí)產(chǎn)生的集落數(shù)的平均百分?jǐn)?shù)。
圖15說(shuō)明了Ckβ-8和Ckβ-1對(duì)小鼠骨髓集落經(jīng)HPP-CFC(A)和LPP-CFC(B)形成的作用。
圖16說(shuō)明了桿狀病毒表達(dá)的Ckβ-1和Ckβ-8對(duì)M-CFS和SCF刺激的新分離的骨髓細(xì)胞集落形成的作用。
圖17說(shuō)明了Ckβ-8和Ckβ-1對(duì)IL-3和SCF刺激的骨髓細(xì)胞的lin群體的增值和分化的作用。
圖18.Ckβ-8和Ckβ-1對(duì)骨髓細(xì)胞的lin群體的GR-1和Mac-1(表面標(biāo)記)陽(yáng)性細(xì)胞群體產(chǎn)生的作用。將lin細(xì)胞在添加了IL-3(5ng/ml)和SCF(100ng/ml)(單獨(dú)(a))及Ckβ-8(50ng/ml)(b)或Ckβ-1(50ng/ml)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后將細(xì)胞用抗骨髓分化GR.1、Mac-1、Sca-1和CD45R表面抗原的單克隆抗體染色，并通過(guò)FACScan分析。所示的數(shù)據(jù)為陽(yáng)性細(xì)胞占大(A)和小(B)細(xì)胞群體的百分?jǐn)?shù)。
圖19說(shuō)明了Ckβ-8(+)的存在抑制了骨髓細(xì)胞響應(yīng)IL-3、M-CSF和GM-CSF的集落形成。
圖20.劑量反應(yīng)的Ckβ-8抑制骨髓細(xì)胞集落的形成。如圖19分離和處理細(xì)胞。在基于瓊脂集落形成測(cè)定中將處理的細(xì)胞以1,000個(gè)細(xì)胞/平皿的密度，在IL-3、GM-CSF或M-CSF(5ng/ml)存在及有或沒(méi)有Ckβ-8(1，10，50和100ng/ml)的情況下接種。所示的數(shù)據(jù)以特定因子單獨(dú)存在時(shí)形成的集落數(shù)的百分比表示集落的形成。所說(shuō)的數(shù)據(jù)是各重復(fù)平皿的平均值，誤差條表明標(biāo)準(zhǔn)差。
圖21.在造血生長(zhǎng)因子存在或不存在的情況下，Ckβ-8和Ckβ-1對(duì)編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。從股骨和脛骨中沖洗(flush)小鼠骨髓細(xì)胞，以ficol密度梯度分離小鼠骨髓細(xì)胞，通過(guò)塑料吸附除去單核細(xì)胞。將所得的細(xì)胞群體在以MEM為基礎(chǔ)的添加了IL-3(5ng/ml)、GM-CSF(5ng/ml)、M-CSF(10ng/ml)和G-CSF(10ng/ml)，另外加入或不加入Ckβ-8(50ng/ml)或Ckβ-1(250ng/ml)的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。此外，在單獨(dú)含有或不含有Ckβ-8和Ckβ-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，使用boehringermannheim細(xì)胞死亡ELISA試劑盒誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。數(shù)據(jù)表示在背景基礎(chǔ)上增加的百分比，所考慮的背景是在每一種生長(zhǎng)因子存在的情況下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中編程性細(xì)胞死亡發(fā)生的量。
圖22.人類單核細(xì)胞中編碼Ckβ-8的RNA的表達(dá)。從新淘析的單核細(xì)胞中分離總RNA，并經(jīng)100U/ml hu rIFN-g或者100ng/ml LPS或者兩者處理。在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分離每一個(gè)處理的RNA(8μg)，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。通過(guò)經(jīng)32P標(biāo)記的cDNA的探測(cè)定量Ckβ-8 mRNA，通過(guò)光密度計(jì)在得到的放射自顯影照片上定量所說(shuō)的帶。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供了分離的核酸(多核苷酸)，這些核酸編碼具有圖1，2和3推定的氨基酸序列的成熟多肽(分別為SEQ ID NO.2，4和6)，或者編碼由以ATCC 75676(1994年2月9日保藏)保藏的克隆的cDNA編碼的Ckβ-8多肽，和編碼由以ATCC 75675(1994年2月9日保藏)保藏的克隆的cDNA編碼的成熟MIP-4多肽，和編碼由以ATCC 75572(1993年10月13日保藏)保藏的克隆的cDNA編碼的Ckβ-1多肽。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸結(jié)構(gòu)上與屬于細(xì)胞因子或趨化因子家族的促炎超基因“intercrine”有關(guān)。Ckβ-8和MIP-4是MIP-1的同系物，并且對(duì)MIP-1α比對(duì)MIP-1β更同源。編碼Ckβ-8的多核苷酸來(lái)源于主動(dòng)脈內(nèi)皮的cDNA文庫(kù)，并含有一個(gè)編碼120個(gè)氨基酸殘基多肽的開放讀框，這種多肽對(duì)許多趨化因子顯示出明顯的同源性。頂端匹配是對(duì)人類巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α的匹配，顯示出36％等同性和66％相似性(圖4)。
編碼MIP-4的多核苷酸來(lái)源于人類成熟的肺臟cDNA文庫(kù)，并含有一個(gè)編碼89個(gè)氨基酸殘基多肽的開放讀框，這種多肽對(duì)許多趨化因子顯示出明顯的同源性。頂端匹配是對(duì)人類扁桃體淋巴細(xì)胞LD78β蛋白的匹配，顯示出60％等同性和89％相似性(圖5)。并且，在所有的趨化因子中以特征基元存在的四個(gè)半胱氨酸殘基在兩個(gè)克隆中都是保守的。在此基因中，前兩個(gè)半胱氨酸殘基在相鄰位置上的事實(shí)將它們分為趨化因子的″C-C″或者β亞家族。在其它的亞家族(″CXC″或α亞家族)中，前兩個(gè)半胱氨酸殘基由一個(gè)氨基酸殘基分開。
編碼Ckβ-1的多核苷酸含有編碼93個(gè)氨基酸多肽的開放讀框，此多肽的前19個(gè)氨基酸是前導(dǎo)序列，這樣所說(shuō)的成熟多肽含有74個(gè)氨基酸殘基。Ckβ-1對(duì)人類巨噬細(xì)胞炎性蛋白α顯示出明顯的同源性，在80個(gè)氨基酸的一段序列中，具有48％的等同性和72％的相似性。并且，包含特征基元的四個(gè)半胱氨酸殘基是保守的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1，2和3所示的(SEQ ID NO.1、3和5)或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其能和圖1，2和3的DNA(SEQ ID NO.1、3和5)或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1，2和3(SEQ ID NO.2，4和6)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導(dǎo)或分泌序列或前蛋白序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和有或無(wú)附加的編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或編碼成熟多肽的編碼序列的5′和/或3′端的非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術(shù)語(yǔ)包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1，2和3(SEQ ID NO.2，4和6)的推定的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸的等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、類似物和衍生物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，這種多核苷酸可以具有圖1、2和3(SEQ ID NO.1、3和5)中所示的或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體的編碼序列。在本領(lǐng)域大家都知道等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其中多核苷酸序列可以具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，這不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變編碼多肽的功能。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中所說(shuō)的編碼成熟多肽的序列可以在相同的閱讀框架中融合進(jìn)多核苷酸序列，這種多核苷酸序列有助于宿主細(xì)胞中多肽的表達(dá)和分泌，比如說(shuō)具有分泌序列功能的前導(dǎo)序列控制細(xì)胞中多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白(preprotein)，宿主細(xì)胞切除這種前導(dǎo)序列形成成熟的多肽形式。這種多核苷酸也編碼原蛋白(proprotein)，這種原蛋白是5′端有附加的氨基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是原蛋白，是一種無(wú)活性的蛋白形式。切除原序列，留下的是有活性的成熟蛋白。
這樣，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一種成熟蛋白或有原序列的蛋白或既有原序列又有前序列(presequence)(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有讀框中融合進(jìn)標(biāo)記序列的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多肽。在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其使得融合進(jìn)標(biāo)記的成熟多肽可以純化，或者例如當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)。所說(shuō)的血細(xì)胞凝集標(biāo)記相應(yīng)于源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(如果兩個(gè)序列之間具有至少50％，優(yōu)選的具有70％的等同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)″嚴(yán)格條件″指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選的具有97％的同源性時(shí)雜交才可以發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實(shí)質(zhì)上與由圖1、2和3(SEQ ID NO.1、3和5)的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽保持了相同的生物學(xué)功能或活性。
另外，所說(shuō)的多核苷酸可以是具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選的是30個(gè)堿基，更優(yōu)選的是至少50個(gè)堿基，這些多核苷酸和本發(fā)明的多核苷酸雜交，如上文所述它們與本發(fā)明的多核苷酸具有等同性，但沒(méi)有活性。例如，這些多核苷酸可以作為SEQ ID NOS1、3和5的多核苷酸的探針，用于回收所說(shuō)的多核苷酸，或者作為診斷探針或作為PCR引物。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保存。這些保藏物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35 U.S.Cζ112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的多肽的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對(duì)保藏材料的任何制造，使用或者銷售需要經(jīng)過(guò)許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的推定的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1多肽，以及這些多肽的片段，類似物和衍生物。
術(shù)語(yǔ)″片段″，″衍生物″和″類似物″，當(dāng)提到圖1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，指實(shí)質(zhì)上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括原蛋白，這種蛋白通過(guò)切除原蛋白部分，產(chǎn)生有活性的成熟多肽而激活。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說(shuō)的圖1、2和3(SEQ ID NO.2、4和6)的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或者(ii)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基，或者(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)這樣一種，其中附加氨基酸融合進(jìn)成熟多肽，如前導(dǎo)或分泌序列，或者用來(lái)純化成熟多肽的序列，或者原蛋白序列。通過(guò)本文的闡述，這樣的片段、衍生物以及類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地是以分離的形式提供本發(fā)明的多肽，并且優(yōu)選地是把多肽純化至均質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)″基因″或者″順?lè)醋印逯负彤a(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA片段；其包括編碼區(qū)前面和后面的序列(前導(dǎo)區(qū)和尾隨序列)以及在各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語(yǔ)″分離的″意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動(dòng)物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或DNA或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因?yàn)檫@種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所說(shuō)的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。所說(shuō)的工程宿主細(xì)胞可以在改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基改良得適于激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因。培養(yǎng)條件，例如pH值和溫度等，是以前用于選擇表達(dá)宿主細(xì)胞的那些，對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來(lái)經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種表達(dá)載體的任何一種中，特別是表達(dá)多肽的載體或質(zhì)粒。這樣的載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和存活。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來(lái)說(shuō)，用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在表達(dá)載體中的所說(shuō)的DNA序列可有效連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)上，以指導(dǎo)mRNA合成。這樣的啟動(dòng)子的代表性例子可以提到的是LTR或猿猴病毒40啟動(dòng)子，大腸桿菌、lac或trp、噬菌體λPL啟動(dòng)子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。所說(shuō)的表達(dá)載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該載體也可以包含供擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或者控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅屬(Drosophila)S2和Sf9；腺病毒；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。通過(guò)本文的闡述，對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，其中已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包括可有效連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動(dòng)子。大量適合的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體。細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)粒或載體，只要它們?cè)谒拗髦锌蓮?fù)制和存活，都可以使用。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或者其它帶有選擇性際記的載體從任何所需的基因選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩種合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動(dòng)子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對(duì)適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說(shuō)的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？梢杂闪姿徕}轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來(lái)以常規(guī)方式產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。
成熟蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母，細(xì)菌，或適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的控制之下的其它細(xì)胞中表達(dá)。采用得自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來(lái)產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達(dá)載體。
插入到載體中的增強(qiáng)子序列增強(qiáng)了高等真核生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動(dòng)子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)100至270bp的猿猴病毒40增強(qiáng)子，細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)上的多形瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。
一般地，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌和釀酒酵母TRP1基因的氨芐青霉素抗性基因)以及源于高表達(dá)基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以是來(lái)自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列在適當(dāng)?shù)碾A段與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定化或簡(jiǎn)單的純化。
通過(guò)與具有功能性啟動(dòng)子的可操作閱讀相(operable reading phase)中的合適的翻譯起始和終止信號(hào)一起插入編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。所說(shuō)載體包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以保證載體的保持和在合適時(shí)在宿主內(nèi)提供擴(kuò)增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，和假單胞菌屬，鏈霉菌屬，葡萄球菌屬的各個(gè)種，雖然其它的也可以選擇來(lái)使用。
作為一個(gè)代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322″骨架″部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保持所形成的粗提取物用于進(jìn)一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍結(jié)-解凍循環(huán)，聲處理，機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組體蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5′側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位點(diǎn)可以用來(lái)提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和性色譜、羥基磷灰石色譜和植物凝集素色譜。需要時(shí)在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相色譜(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌，酵母，高等植物，培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生的。依據(jù)重組產(chǎn)生方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是由哺乳動(dòng)物或其它真核細(xì)胞的碳水化合物糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發(fā)明的多肽可以用于各種免疫調(diào)節(jié)和炎癥功能，也可以用于各種疾病中。Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1屬于趨化因子家族，因此它們是白細(xì)胞(如單核細(xì)胞，嗜中性細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞等)的化學(xué)引誘物。
Northern印跡分析表明Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1優(yōu)選在造血器官的組織中表達(dá)。
Ckβ-8在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥方面起重要作用。圖22表明脂多糖誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞表達(dá)Ckβ-8。因此，作為響應(yīng)內(nèi)毒素的存在，單核細(xì)胞表達(dá)Ckβ-8，所以Ckβ-8的使用可用于調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。
如圖10所示，在THP-1細(xì)胞(A)和PBMCs(B)中化學(xué)引誘物的活性是明顯的。Ckβ-8在THP-1細(xì)胞中誘導(dǎo)明顯的鈣運(yùn)動(dòng)(圖11)，這表明Ckβ-8對(duì)單核細(xì)胞具有生物作用。并且，Ckβ-8在人類單核細(xì)胞中產(chǎn)生依賴劑量的趨化性和鈣運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。
因此，使用Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1有利于通過(guò)控制靶免疫細(xì)胞向傷口區(qū)的滲透促進(jìn)傷口愈合。以類似的方式，本發(fā)明的多肽能提高宿主通過(guò)它們對(duì)殺微生物的白細(xì)胞的吸引和激活而防御慢性感染(例如，分枝桿菌感染)。
因?yàn)橛凶C據(jù)表明將表達(dá)趨化因子的細(xì)胞注入到腫瘤中，能造成腫瘤的退化(例如，在Karposi肉瘤治療中)，所以本發(fā)明的多肽還可以用于腫瘤的治療中。圖12和13的分析表明Ckβ-8誘導(dǎo)TPH-1細(xì)胞分泌TNF-α，TNF-α是已知用于消退腫瘤的試劑。250ng/ml的Ckβ-8誘導(dǎo)1200微微克/毫升TNF-α的產(chǎn)生和分泌。Ckβ-8也明顯地誘導(dǎo)人類單核細(xì)胞分泌其它腫瘤和癌癥抑制劑，如IL-6、IL-1和G-CSF。另外，Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通過(guò)它們的趨化性活性刺激宿主防御(破壞腫瘤細(xì)胞的)細(xì)胞(如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的侵入和激活，并以此方式也可用于治療固體癌癥。
所說(shuō)的多肽也可用于抑制生血細(xì)胞的增殖和分化，因此可用于保護(hù)骨髓干細(xì)胞，防治其在化療期間遭受化療試劑的傷害。圖14和15表明Ckβ-8和Ckβ-1抑制低增殖潛力集落形成細(xì)胞的集落形成，并且表明Ckβ-8是LPP-CFC集落生長(zhǎng)的有力的和特異性的抑制物。圖16表明Ckβ-1特異性地抑制M-CSF刺激的集落形成，而Ckβ-8則不能。然而，也表明Ckβ-8和Ckβ-1明顯地抑制骨髓細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化。這種抗增殖作用允許更廣泛地暴露在化療試劑中，因此化療更有效。
可以在治療上使用Ckβ-1和Ckβ-8多肽在定型祖先細(xì)胞的亞群(例如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞)中的抑制作用以抑制白血病細(xì)胞的增殖。
在圖17、18和19中，除去所用的細(xì)胞譜系的定型細(xì)胞，使得到的細(xì)胞群體和Ckβ-1和Ckβ-8接觸。Ckβ-1在Mac-1陽(yáng)性細(xì)胞群體中引起接近50％的降低，此結(jié)果和圖16表明的Ckβ-1誘導(dǎo)對(duì)響應(yīng)M-CSF的集落形成細(xì)胞的抑制作用的結(jié)果一致。如圖19所示，Ckβ-8抑制定型祖先細(xì)胞響應(yīng)IL-3、GM-CSF和M-CSF的形成集落的能力。并且，如圖20所示，表明了Ckβ-8抑制集落形成的劑量反應(yīng)。這一抑制作用可能是由于這些因子介導(dǎo)的分化信號(hào)的特異封阻，或者是由于祖先細(xì)胞中細(xì)胞毒素的作用。
所說(shuō)的多肽的另一個(gè)作用是，例如在自身免疫疾病和淋巴細(xì)胞的白血病中，通過(guò)抑制IL-2的生物合成而抑制T細(xì)胞的增殖。
因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)皮膚中的朗格罕氏細(xì)胞產(chǎn)生MIP-1α，所以可以使用Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1抑制牛皮癬的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖(角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖)。
可以使用Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通過(guò)募集切除碎片及促進(jìn)結(jié)締組織的炎性細(xì)胞和通過(guò)控制過(guò)量TGFβ介導(dǎo)的纖維變性而防止傷痕的出現(xiàn)。此外，因?yàn)镃kβ-8、MIP-4和Ckβ-1增加血管的滲透性，所以可以使用這些多肽治療中風(fēng)、血小板增多、肺栓塞和骨髓增殖紊亂。
Ckβ-8可以通過(guò)誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡而用于治療白血病和不正常增殖的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。如圖21所示，Ckβ-8在造血祖先細(xì)胞群體中誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸可以用作與科學(xué)研究有關(guān)的體外研究試劑、DNA合成和DNA載體的產(chǎn)生，并可用于發(fā)展治療學(xué)和診斷學(xué)，目的是治療人類疾病。例如，Ckβ-1和Ckβ-8可以通過(guò)暫時(shí)地防止未成熟的造血祖先細(xì)胞(如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)的分化而用于擴(kuò)展它們。這些骨髓細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)。
可以使用全長(zhǎng)的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1基因片段作為cDNA文庫(kù)的雜交探針，以便分離此全長(zhǎng)的基因和分離與此基因具有高度序列相似性或相似生物學(xué)活性的其它基因。然而，優(yōu)選的是此探針具有至少30個(gè)堿基，例如可以含有50或更多的堿基。所說(shuō)的探針也可以用于鑒別相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆、基因組克隆或包含調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子在內(nèi)的完整基因克隆。篩選的實(shí)施例包括利用已知DNA序列分離此基因的編碼區(qū)，以合成寡核苷酸探針。具有與本發(fā)明的基因序列互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸可以用來(lái)篩選人類cDNA文庫(kù)、基因組DNA或mRNA，以確定探針和哪些文庫(kù)成員雜交。
本發(fā)明也涉及Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因作為部分診斷劑的用途，檢測(cè)與所說(shuō)的核酸序列突變的存在有關(guān)的疾病和對(duì)此疾病的易感性。這些疾病和趨化因子多肽的表達(dá)不足有關(guān)。
可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)具有Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1基因突變的個(gè)體?？梢詮幕颊叩募?xì)胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸。基因組DNA可以直接用于檢測(cè)，或者在分析前用PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作為一個(gè)例子，可以用和編碼Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1的核酸互補(bǔ)的PCR引物鑒別和分析Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1突變。例如，可以通過(guò)與正常遺傳型比較擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化檢測(cè)缺失或者插入。點(diǎn)突變可以經(jīng)擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1 RNA或者放射性標(biāo)記的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1反義DNA序列雜交鑒別。經(jīng)核糖核酸酶A消化，或者從熔點(diǎn)溫度的不同辨別完美配對(duì)的序列和錯(cuò)配雙螺旋。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過(guò)檢測(cè)在有或沒(méi)有變性劑時(shí)凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點(diǎn)或部分融化溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見(jiàn)，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護(hù)測(cè)定法揭示特定位置上的序列變化，所述測(cè)定法如核糖核酸酶保護(hù)和S1保護(hù)或化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國(guó)，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測(cè)特定DNA序列，所述方法例如雜交，核糖核酸酶保護(hù)，化學(xué)裂解，直接DNA測(cè)序，或使用限制酶(例如，限制片段長(zhǎng)度多形性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
除較常規(guī)的凝膠-電泳和DNA測(cè)序法之外，也可用原位分析檢測(cè)突變。
因?yàn)橄鄬?duì)于正常對(duì)照組織樣品所說(shuō)的蛋白質(zhì)的過(guò)量表達(dá)能檢測(cè)某種疾病(例如，腫瘤)的存在或?qū)δ撤N疾病的易感性，因此，本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白的變化的水平的診斷分析方法。用于檢測(cè)來(lái)自宿主的樣品中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白水平的分析方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，所說(shuō)的方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、ELISA測(cè)定和“夾層”測(cè)定。ELISA測(cè)定(Coligan等，免疫學(xué)最新草案，1(2)，第6章，(1991))最初包括制備Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白之抗原的特異性抗體，優(yōu)選的是單克隆抗體。此外，制備單克隆抗體的受體抗體。將可檢測(cè)的試劑和受體抗體結(jié)合，所說(shuō)的試劑如放射性、熒光或者在這個(gè)實(shí)施例中是辣根過(guò)氧化物酶。由宿主中獲得樣品，并將其在和樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)上培養(yǎng)。通過(guò)和非特異性蛋白質(zhì)(如BSA)一起培養(yǎng)，將覆蓋皿中任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接下來(lái)，在單克隆抗體和結(jié)合到聚苯乙烯皿上的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白結(jié)合期間，將單克隆抗體在皿中培養(yǎng)。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉?，F(xiàn)在，將和辣根過(guò)氧化物酶連接的受體抗體放入皿中，結(jié)果導(dǎo)致受體抗體和任何結(jié)合到Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白上的單克隆抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。然后向皿中加入過(guò)氧化物酶底物，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1蛋白的量。
可以使用競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其中對(duì)Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1特異的抗體吸附在固體支持物上，標(biāo)記的Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1和衍生于宿主的樣品通過(guò)固體支持物，例如通過(guò)液體閃爍色譜檢測(cè)的標(biāo)記的量和樣品中蛋白的量有關(guān)。
“夾層”測(cè)定類似于ELISA測(cè)定。在“夾層”測(cè)定中Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1通過(guò)固體支持物，并與吸附在固體支持物上的抗體結(jié)合。然后，第二個(gè)抗體結(jié)合到Ckβ-8、MIP-4和Ckβ-1上。然后標(biāo)記的且對(duì)第二個(gè)抗體特異的第三個(gè)抗體通過(guò)固體支持物并與第二個(gè)抗體結(jié)合，然后進(jìn)行定量。
本發(fā)明提供了用于鑒別趨化因子多肽的受體的方法?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來(lái)鑒別編碼所說(shuō)受體的基因，如配體淘選和FACS分類法(Coligan等免疫學(xué)最新草案，1(2)，第5章，(1991))。優(yōu)選使用的是表達(dá)克隆，其中的聚腺苷酸RNA由對(duì)所說(shuō)的多肽響應(yīng)的細(xì)胞制備，把由所說(shuō)的RNA建立的cDNA文庫(kù)劃分成不同的庫(kù)，用來(lái)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或?qū)λf(shuō)的多肽不響應(yīng)的其它細(xì)胞。生長(zhǎng)在載玻片上的轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露在所說(shuō)的標(biāo)記的多肽中。所說(shuō)的多肽可以用包括位點(diǎn)特異性蛋白激酶識(shí)別部位碘化或其包含體在內(nèi)的各種手段標(biāo)記。固定和培養(yǎng)后，將載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別陽(yáng)性庫(kù)，同時(shí)利用重復(fù)子庫(kù)集(iterative sub-pooling)和再篩選(rescreen)方法制備和再轉(zhuǎn)染子庫(kù)，最終產(chǎn)生編碼推定受體的單克隆。
作為另一種受體鑒別方法，標(biāo)記的多肽可以是光親和性的，可以和能表達(dá)受體分子的細(xì)胞膜或提取物制劑連接。用PAGE分辨交叉連接的物質(zhì)并把其暴光在X光膠片上?？梢园寻f(shuō)的多肽的受體的標(biāo)記復(fù)合物切斷、分解成蛋白質(zhì)片段并進(jìn)行蛋白微測(cè)序。從微測(cè)序中獲得的氨基酸序列可以用來(lái)設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并寡核苷酸探針以篩選用來(lái)鑒別編碼推定的受體基因的cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明也涉及篩選化合物以鑒別本發(fā)明趨化因子多肽的興奮劑和拮抗劑的方法。興奮劑是含有所說(shuō)的多肽相似生物功能的化合物，而拮抗劑則阻斷這些功能?？梢酝ㄟ^(guò)在帶有孔的過(guò)濾器(所說(shuō)的孔具有足夠的直徑(大約5μm)，允許細(xì)胞通過(guò))的頂部放置細(xì)胞而測(cè)定趨化性，所說(shuō)的細(xì)胞受任何一種本發(fā)明的多肽的趨化。將潛在的興奮劑溶液放置在室的底部，上面的隔室中是合適的對(duì)照培養(yǎng)基，這樣，經(jīng)計(jì)數(shù)隨時(shí)間遷入到或通過(guò)孔膜的細(xì)胞而測(cè)定興奮劑的濃度梯度。
當(dāng)測(cè)定拮抗劑時(shí)，將本發(fā)明的趨化因子多肽放置在下面的室中，加入潛在的拮抗劑以確定所說(shuō)細(xì)胞的趨化性是否受到阻止。
另外，在這一化合物存在的情況下，將表達(dá)所說(shuō)的多肽受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制劑與標(biāo)記的趨化因子多肽(如放射活性)一道培養(yǎng)。然后，可以測(cè)定此化合物阻止這一相互作用的能力。當(dāng)以這種方式測(cè)定興奮劑時(shí)，不加入趨化因子，測(cè)定興奮劑本身和所說(shuō)的受體的相互作用的能力。
潛在的Ckβ-8，MIP-4和Ckβ-1拮抗劑的例子包括抗體，或在某些情況下為和這種多肽結(jié)合的寡核苷酸。潛在的拮抗劑的另一個(gè)例子是所說(shuō)的多肽的負(fù)顯性突變體。負(fù)顯性突變體是與所說(shuō)的野生型多肽的受體結(jié)合的多肽，但沒(méi)有保持生物學(xué)活性。
采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體也是潛在的拮抗劑。反義技術(shù)可以通過(guò)三螺旋形成或反義DNA或者RNA來(lái)控制基因的表達(dá)，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5′編碼部分可以用來(lái)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一種與轉(zhuǎn)錄所涉及的基因區(qū)互補(bǔ)的DNA寡核苷酸(三螺旋-參見(jiàn)Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，進(jìn)而阻止趨化因子多肽的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸體內(nèi)雜交到mRNA上，并阻斷mRNA分子翻譯成為所說(shuō)的多肽(反義-Okano，J. Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細(xì)胞中，以便可以體內(nèi)表達(dá)反義RNA或DNA，來(lái)抑制趨化因子多肽的產(chǎn)生。
另一種潛在的趨化因子的拮抗劑是所說(shuō)的多肽的肽衍生物，這種肽通過(guò)天然或合成的方式修飾成所說(shuō)的多肽的類似物，其已經(jīng)失去了生物學(xué)活性，但仍能識(shí)別并結(jié)合所說(shuō)的多肽的受體，因此有效地抑制受體。多肽衍生物的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
可以使用這些拮抗劑治療MIP誘導(dǎo)的或促進(jìn)的紊亂，例如自身免疫、慢性炎癥和傳染性疾病。自身免疫疾病的例子包括多發(fā)性硬化和胰島素依賴性糖尿病。
這些拮抗劑也可以用于通過(guò)阻止單核噬細(xì)胞的募集和激活而治療傳染病，所說(shuō)的傳染病包括矽肺、內(nèi)樣瘤病、自發(fā)的肺部纖維變性。通過(guò)阻止嗜曙紅細(xì)胞的產(chǎn)生和遷移，這些化合物也可用于治療自發(fā)的過(guò)多嗜曙紅綜合癥。這些拮抗劑也可以通過(guò)阻止巨噬細(xì)胞的遷移和產(chǎn)生本發(fā)明的趨化因子多肽而治療內(nèi)毒素休克。
通過(guò)阻止動(dòng)脈壁中單核細(xì)胞的滲透，這些拮抗劑也可用于治療動(dòng)脈粥樣硬化。
通過(guò)抑制趨化因子誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿的脫粒及組胺的釋放，這些拮抗劑也可用于治療組胺介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)和免疫紊亂(包括晚期過(guò)敏反應(yīng)、慢性蕁麻疹特應(yīng)性皮炎)。也可以治療IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，如過(guò)敏性哮喘、鼻炎和濕疹。
通過(guò)阻止傷口區(qū)對(duì)單核細(xì)胞的吸引，這些拮抗劑也可用于治療慢性和急性炎癥。因?yàn)槁院图毙缘难装Y性肺部疾病和肺部單核噬細(xì)胞的匯集有關(guān)，所以這些拮抗劑可用于調(diào)節(jié)正常的肺部巨噬細(xì)胞群體。
通過(guò)阻止患者關(guān)節(jié)中的滑液對(duì)單核細(xì)胞的吸引，拮抗劑也可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。單核細(xì)胞的流入和激活在退化和炎性關(guān)節(jié)病的致病中起重要的作用。
這些拮抗劑也可用于干擾重要源于IL-1和TNF的有害的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。以這種方式，拮抗劑可用于阻止炎癥。拮抗劑也可用于抑制趨化因子誘導(dǎo)的依賴前列腺素的發(fā)熱。
這些拮抗劑也可用于治療骨髓的無(wú)能，如再生障礙性貧血和脊髓發(fā)育不良綜合癥。
通過(guò)阻止肺部中嗜曙紅細(xì)胞的積累，這些拮抗劑也可用于治療哮喘和變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)。這些拮抗劑也可用于治療上皮下的基底膜纖維變性，其是哮喘肺的顯著特征。
拮抗劑可用來(lái)與藥學(xué)上可接受的載體一起組合成組合物，例如，下文描述的。
所說(shuō)的趨化因子多肽、興奮劑和拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包含治療有效量的所說(shuō)的多肽和藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。
這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它們的組合物。其配方應(yīng)該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個(gè)或多個(gè)填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。與這種容器相關(guān)聯(lián)的可以是管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品的政府機(jī)構(gòu)的準(zhǔn)許。此外，所說(shuō)的多肽、興奮劑和拮抗劑可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說(shuō)的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來(lái)說(shuō)，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過(guò)每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
趨化因子多肽和多肽形式的興奮劑或拮抗劑，可以依據(jù)本發(fā)明通過(guò)體內(nèi)表達(dá)這樣的多肽而使用，這常被稱作″基因治療″。
這樣，例如，可以對(duì)患者細(xì)胞用體外編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進(jìn)行基因工程操作，然后向欲用此多肽治療的患者提供所說(shuō)的工程細(xì)胞。這樣的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可以經(jīng)本領(lǐng)域公知的方法用包括編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
同樣地，可以通過(guò)例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作，以便體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域已知的，可以將產(chǎn)生包括編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞施用給患者，以便體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程處理和體內(nèi)表達(dá)多肽。通過(guò)本發(fā)明的闡述，由這種方式經(jīng)施用本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。例如，工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如，在與合適的運(yùn)送載體結(jié)合后，腺病毒可以用于體內(nèi)工程化細(xì)胞。
逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以是來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒，這些病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠肉瘤病毒、莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞氏肉瘤病毒和Harvey肉瘤病毒。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(pMV-7)的兩側(cè)是莫洛尼氏鼠肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)，并包含皰疹單純性病毒(HSV)胸苷激酶(tk)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的可選擇的藥物抗性基因neo。唯一的EcoRI和HindIII位點(diǎn)有利于編碼序列的引入(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))。
所說(shuō)的載體包含一種或多種合適的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；猿猴病毒40啟動(dòng)子；和Miller等(生物技術(shù)，vol.7，No.9，980-990(1989))描述的人類細(xì)胞肥大病毒(CMV)啟動(dòng)子或其它的啟動(dòng)子，例如如真核細(xì)胞啟動(dòng)子的細(xì)胞啟動(dòng)子(這樣的啟動(dòng)子包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。通過(guò)本文的闡述，合適的啟動(dòng)子的選擇對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動(dòng)子控制之下，這些啟動(dòng)子包括但不限于病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，如皰疹單純性胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和控制編碼所說(shuō)多肽的基因的天然啟動(dòng)子。
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)者細(xì)胞系?？梢赞D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501、PA317和GP+am12。所說(shuō)的載體可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)這些包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔法、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。
生產(chǎn)者細(xì)胞系產(chǎn)生包含編碼所說(shuō)的多肽的核酸序列的傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒?？梢允褂眠@些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所說(shuō)的多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒別也有價(jià)值。所說(shuō)的序列特異性地導(dǎo)向單個(gè)人染色體的特定位置，并與之雜交。此外，當(dāng)前也需要鑒別染色體上的特定位點(diǎn)。極少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多形性)的染色體標(biāo)記試劑現(xiàn)在可用來(lái)標(biāo)記染色體位置。在關(guān)聯(lián)與疾病有關(guān)基因的那些序列中，按照本發(fā)明的染色體的DNA作圖是重要的第一步。
簡(jiǎn)言之，可以通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)對(duì)序列作圖到染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析迅速選擇引物，該引物不跨越一個(gè)以上的基因組DNA中的外顯子，這樣使擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后，這些引物用于PCR篩選包含單獨(dú)的人染色體的體細(xì)胞雜種。僅包含相應(yīng)于引物的人基因的那些雜種產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜種的PCR作圖是指定特定DNA到特定染色體的快速方法。利用本發(fā)明及相同的寡核苷酸引物，可以由一組特定染色體的片段或一組大的基因組克隆以類似的方式獲得亞定位。可以以類似的方式使用其它用于對(duì)染色體作圖的作圖策略，所述策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選染色體預(yù)篩選和經(jīng)雜交預(yù)選擇構(gòu)建染色體特異性-cDNA文庫(kù)。
在一個(gè)步驟中，中期染色體擴(kuò)散的cDNA克隆的熒光原位雜交(FISH)可以用來(lái)提供精確的染色體位置。這一技術(shù)可以與短至500或600堿基的cDNA一起使用。這一技術(shù)的綜述，參見(jiàn)Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列對(duì)精確的染色體位置作圖，染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，在人中的孟德?tīng)柺竭z傳(可聯(lián)機(jī)到Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫(kù)上使用)中找到。然后，基因和已作圖到相同的染色體區(qū)的疾病之間的相互關(guān)系經(jīng)連鎖分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑒別。
接著，有必要確定感染和未感染個(gè)體之間cDNA或者基因組序列中的不同。如果在某些或全部感染個(gè)體中觀察到突變，但在任何正常個(gè)體中觀察不到，則所述的突變很可能是疾病的病因。
采用現(xiàn)有分辨率的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)，精確定位到與疾病相關(guān)的染色體區(qū)上的cDNA是50和500之間的潛在致病性基因的一個(gè)(這假定1兆堿基作圖分辨率，每20kb一個(gè)基因)。
所說(shuō)的多肽，其片段或其它衍生物或其類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可以用作免疫原由此產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈和人化的抗體以及Fab片段，或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域中已知的各種方法可以用于產(chǎn)生這樣的抗體和片段。
可以通過(guò)對(duì)動(dòng)物直接注射所說(shuō)的多肽或者對(duì)動(dòng)物(優(yōu)選的是非人動(dòng)物)施用這種多肽獲得產(chǎn)生來(lái)抗相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽的抗體。然后如此獲得的抗體結(jié)合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可以用于產(chǎn)生結(jié)合全部天然多肽的的抗體。用這種抗體從表達(dá)多肽的組織中分離多肽。
對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供由傳代細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當(dāng)今免疫學(xué)，472)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
有關(guān)產(chǎn)生單鏈抗體描述的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可以采用來(lái)產(chǎn)生抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可以利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人化的抗體。
將參照以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。然而應(yīng)該清楚本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。除非特別指明，所有份數(shù)或數(shù)量均指重量。
為了有利于理解下列實(shí)施例，以下描述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)?！庇汕懊娴男憄和/或后續(xù)的大寫字母和/或數(shù)字標(biāo)示。本文的起始質(zhì)粒是市售的、無(wú)限制的公眾可獲得的或者是可以按已出版的方法從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。此外，所描述的質(zhì)粒的等同質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
DNA的″消化″指以限制性內(nèi)切酶催化切割DNA，這種限制性內(nèi)切酶僅作用在DNA一定的序列上。本文所用的各種限制酶是市售的，使用它們的反應(yīng)條件，輔助因子和其它需要是作為普通技術(shù)人員應(yīng)了解的知識(shí)。為了分析的目的，一般地是在約20微升緩沖液中使用1微克質(zhì)?；駾NA片段以及約2單位的酶。為了分離DNA片段進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建的目的，一般地是在較大體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的緩沖液和底物的量由制造者規(guī)定。通常使用37℃約1小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間，但可以按照供應(yīng)者的說(shuō)明變化。在消化之后，反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，84057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行切割片段的大小分離。
″寡核苷酸″指單鏈多脫氧核苷酸或兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學(xué)合成的。這樣合成的寡核苷酸沒(méi)有5′磷酸基，同時(shí)在激酶存在下不添加帶有ATP的磷酸鹽時(shí)，其不連接另一個(gè)寡核苷酸。合成的寡核苷酸將連接沒(méi)有去磷酸化的片段。
″連接″指在兩個(gè)雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程(Maniatis，T.，等，Id.，p.146)。除非提供其它方式，可以采用已知緩沖液和條件用每0.5微克大約等摩爾量的待連接的DNA片段10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)進(jìn)行連接。
除非有其它說(shuō)明，按Graham，F(xiàn).和van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)的描述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1Ckβ-8的細(xì)菌表達(dá)和純化用相應(yīng)于加工過(guò)的Ckβ-8蛋白質(zhì)(減去信號(hào)肽序列)的5′和3′末端序列的PCR寡核苷酸引物和Ckβ-8基因3′載體序列起始擴(kuò)增編碼Ckβ-8的DNA序列，ATCC#75676。把相應(yīng)于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分別加入到5′和3′的序列中。具有5′TCAGGATCCGTCACAAAAGATGCAGA 3′(SEQ ID NO.7)序列的5′寡核苷酸引物包含一個(gè)BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其后是從假定加工過(guò)的蛋白質(zhì)的末端氨基酸密碼子起的Ckβ-8編碼序列的18個(gè)核苷酸。3′端的序列5′CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT3′(SEQ ID NO.8)包含與XbaI位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。所說(shuō)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相當(dāng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen公司，Chat sworth，CA)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-調(diào)節(jié)啟動(dòng)子操縱子(P/0)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用BamHI和Xba I消化pQE-9。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9上，并插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記和RBS之序列的框架中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(可從Qiagen得到)。M15/rep4包含多拷貝的質(zhì)粒pREP4，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI抑制子并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒別這種轉(zhuǎn)化體同時(shí)選擇抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質(zhì)粒DNA，并且通過(guò)限制分析確認(rèn)。在補(bǔ)充Amp(100 ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)中過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)包含所需構(gòu)建體的克隆。所說(shuō)的O/N培養(yǎng)物用來(lái)以1∶100到1∶250的比率接種大量培養(yǎng)物。使細(xì)胞生長(zhǎng)至0.4和0.6之間的光密度600(0.D.600)。添加IPTG(異丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至終濃度1mM。IPTG通過(guò)滅活lacI抑制子，清除導(dǎo)致增加的基因表達(dá)的P/O誘導(dǎo)。將細(xì)胞另外培養(yǎng)3至4小時(shí)。然后由離心收獲細(xì)胞。在離液劑(6摩爾的鹽酸胍)中溶解得到的細(xì)胞沉淀。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下從此溶液中經(jīng)鎳螯合物柱層析純化溶解的Ckβ-8(Hochuli，E.等，層析雜志411177-184(1984))。從此柱中以6摩爾的鹽酸胍(pH5.0)洗脫Ckβ-8(95％純度)，為了變性將洗脫液調(diào)至3摩爾的鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾的谷胱甘肽(還原型的)和2毫摩爾的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中溫育12小時(shí)后，用10毫摩爾的磷酸鈉透析所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2MIP-4的細(xì)菌表達(dá)和純化用相應(yīng)于加工過(guò)的MIP-4蛋白質(zhì)(減去信號(hào)肽序列)的5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物起始擴(kuò)增編碼MIP-4的DNA序列，ATCC#75675。把相應(yīng)于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分別加入到5′和3′末端序列中。具有5′TCAGGATCCTGTGCACAAGTTGGTACC 3′(SEQ ID NO.9)序列的5′寡核苷酸引物包含一個(gè)BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其后是從假定加工過(guò)的蛋白質(zhì)的末端氨基酸密碼子起的MIP-4編碼序列的18個(gè)核苷酸；3′端的序列5′CGCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT 3′(SEQ ID NO.10)包含與Xba I位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。所說(shuō)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相當(dāng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen公司，Chat sworth，CA)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-調(diào)節(jié)啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。用BamHI和Xba I消化pQE-9，將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9上，并插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記和RBS之序列的框架中。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株(可從Qiagen得到)。M15/rep4包含多拷貝的質(zhì)粒pREP4，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI抑制子并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒別這種轉(zhuǎn)化體同時(shí)選擇抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質(zhì)粒DNA，并且通過(guò)限制分析確認(rèn)。在補(bǔ)充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)中過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)包含所需構(gòu)建體的克隆。所說(shuō)的O/N培養(yǎng)物用來(lái)以1∶100到1∶250的比率接種大量培養(yǎng)物。使細(xì)胞生長(zhǎng)至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(異丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至終濃度1mM。IPTG通過(guò)滅活lacI抑制子，清除導(dǎo)致增加的基因表達(dá)的P/O誘導(dǎo)。將細(xì)胞另外培養(yǎng)3至4小時(shí)。然后由離心收獲細(xì)胞。在離液劑(6摩爾的鹽酸胍)中溶解得到的細(xì)胞沉淀。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下從此溶液中經(jīng)鎳螯合物柱層析純化溶解的MIP-4(Hochuli，E.等，層析雜志411177-184(1984))。從此柱中以6摩爾的鹽酸胍(pH5.0)洗脫MIP-4(95％純度)，為了變性將洗脫液調(diào)至3摩爾的鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾的谷胱甘肽(還原型的)和2毫摩爾的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中溫育12小時(shí)后，用10毫摩爾的磷酸鈉透析所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3Ckβ-1的細(xì)菌表達(dá)和純化用相應(yīng)于加工過(guò)的Ckβ-1蛋白質(zhì)(減去信號(hào)肽序列)的5′和3′末端序列的PCR寡核苷酸引物起始擴(kuò)增編碼Ckβ-1的DNA序列，ATCC#75572，并把相應(yīng)于Bam HI和XbaI的附加核苷酸分別加入到5′和3′的序列中。具有5′GCCCGCGGATCCTCCTCACGGGGACCTTAC3′(SEQ ID NO.11)序列的5′寡核苷酸引物包含一個(gè)BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其后是從假定加工過(guò)的蛋白質(zhì)的末端氨基酸密碼子起的Ckβ-1編碼序列的15個(gè)核苷酸；3′端的序列5′GCCTGCTCTAGATCAAAGCAGGGAAGCTCCAG 3′(SEQ ID NO.1 2)包含與Xba I位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，翻譯終止密碼子和Ckβ-1編碼序列的最后20個(gè)核苷酸。所說(shuō)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相當(dāng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-調(diào)節(jié)啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用BamHI和XbaI消化pQE-9，將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9上，并插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記和RBS之序列的框架中。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株(可從Qiagen的M15/rep 4商標(biāo)中得到)。M15/rep4包含多拷貝的質(zhì)粒pREP4，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI抑制子并賦予卡那霉素抗性(Kanr)。由其在LB平板上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒別轉(zhuǎn)化體同時(shí)選擇抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質(zhì)粒DNA，并且通過(guò)限制分析確認(rèn)。在補(bǔ)充Amp(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)中過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)包含所需構(gòu)建體的克隆。所說(shuō)的O/N培養(yǎng)物用來(lái)以1∶100到1∶250的比率接種大量培養(yǎng)物。使細(xì)胞生長(zhǎng)至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(異丙基-B-D-硫葡萄糖吡喃糖苷)至終濃度1mM。IPTG通過(guò)滅活lacI抑制子，清除導(dǎo)致增加的基因表達(dá)的P/O誘導(dǎo)。將細(xì)胞另外培養(yǎng)3至4小時(shí)。然后由離心收獲細(xì)胞。在離液劑(6摩爾的鹽酸胍)中溶解得到的細(xì)胞沉淀。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下從此溶液中經(jīng)鎳螯合物柱層析純化溶解的Ckβ-1(Hochuli，E.等，層析雜志411177-184(1984))。從此柱中以6摩爾的鹽酸胍(pH5.0)洗脫Ckβ-1(95％純度)，為了變性將洗脫液調(diào)至3摩爾的鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10毫摩爾的谷胱甘肽(還原型的)和2毫摩爾的谷胱甘肽(氧化型的)。在此溶液中溫育12小時(shí)后，用10毫摩爾的磷酸鈉透析所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4重組Ckβ-8在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒CMV-Ckβ-8 HA的表達(dá)來(lái)源于載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含1)猿猴病毒40的復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)、猿猴病毒40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼全長(zhǎng)Ckβ-8前體的DNA片段和融合到其3′末端框架中的HA標(biāo)記克隆到所說(shuō)的載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子控制之下。HA標(biāo)記相當(dāng)于來(lái)自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(guò)(I.Wilson，等，細(xì)胞37767(1984))。HA標(biāo)記向靶細(xì)胞蛋白的灌輸，使帶有抗體(其識(shí)別HA表位)的重組蛋白質(zhì)很容易測(cè)定。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下經(jīng)PCR使用兩個(gè)引物構(gòu)建編碼Ckβ-8的DNA序列(ATCC#75676)，所說(shuō)的引物5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGGTCTCCGTGGCT3′(SEQ ID NO13)包含HindIII位點(diǎn)，之后是由起始密碼子開始的Ckβ-8編碼序列的18個(gè)核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATTCTTCCTGGTCTTGATCC3′(SEQ ID NO14)包含Xba I位點(diǎn)的互補(bǔ)序列、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和Ckβ-8編碼序列的最后20個(gè)核苷酸(不包含終止密碼子)。因此，PCR產(chǎn)物包含HindIII位點(diǎn)，Ckβ-8編碼序列，之后是融合在框架中的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后是翻譯終止密碼子和Xba I位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化和連接PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組體Ckβ-8，通過(guò)DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。通過(guò)放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)Ckβ-8-HA蛋白質(zhì)的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用去垢劑裂解細(xì)胞(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基。在15％的SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5重組MIP-4在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒CMV-MIP-4 HA的表達(dá)來(lái)源于載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含1)猿猴病毒40的復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)、猿猴病毒40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼全長(zhǎng)MIP-4前體的DNA片段和在讀框中融合進(jìn)其3′末端的HA標(biāo)記克隆到所說(shuō)的載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子控制之下。HA標(biāo)記相當(dāng)于來(lái)自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(guò)(I.Wilson，等，細(xì)胞37767(1984))。HA標(biāo)記向靶細(xì)胞蛋白的灌輸，使帶有抗體(其識(shí)別HA表位)的重組蛋白質(zhì)很容易測(cè)定。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下經(jīng)PCR使用兩個(gè)引物構(gòu)建編碼MIP-4的DNA序列(ATCC#75675)，所說(shuō)的引物5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGGGCCTTGCAGCTGCC3′(SEQ ID NO15)包含HindIII位點(diǎn)，之后是由起始密碼子開始的MIP-4編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAABCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCATTCAGCTTCAGGTC3′(SEQ ID NO16)包含Xba I位點(diǎn)的互補(bǔ)序列、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和MIP-4編碼序列的最后19個(gè)核苷酸(不包含終止密碼子)。因此，PCR產(chǎn)物包含HindIII位點(diǎn)，MIP-4編碼序列，之后是融合在框架中的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后是翻譯終止密碼子和XbaI位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化和連接PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組體MIP-4，通過(guò)DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。通過(guò)放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)MIP-4-HA蛋白質(zhì)的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用去垢劑裂解細(xì)胞(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基。在15％的SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6重組Ckβ-1在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒CMV-Ckβ-1 HA的表達(dá)來(lái)源于載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，其包含1)猿猴病毒40的復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)、猿猴病毒40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼全長(zhǎng)Ckβ-1前體的DNA片段和融合到其3′末端框架中的HA標(biāo)記克隆到所說(shuō)的載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子控制之下。HA標(biāo)記相當(dāng)于來(lái)自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(guò)(I.Wilson，等，細(xì)胞37767(1984))。HA標(biāo)記向靶細(xì)胞蛋白的灌輸，使帶有抗體(其識(shí)別HA表位)的重組蛋白質(zhì)很容易測(cè)定。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下經(jīng)PCR使用兩個(gè)引物構(gòu)建編碼Ckβ-1的DNA序列(ATCC#75572)，所說(shuō)的引物5′引物5′GGAAAGCTTATGAAGATTCCGTGGCTGC3′(SEQ ID NO17)包含HindIII位點(diǎn)，之后是由起始密碼子開始的Ckβ-1編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′序列5′CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTTCTCCTTCATGTCCTTG3′(SEQ ID NO18)包含Xba I位點(diǎn)的互補(bǔ)序列、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和Ckβ-1編碼序列的最后19個(gè)核苷酸(不包含終止密碼子)。因此，PCR產(chǎn)物包含HindIII位點(diǎn)，Ckβ-8編碼序列，之后是融合在框架中的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記后是翻譯終止密碼子和XbaI位點(diǎn)。用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶消化和連接PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE中(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組體Ckβ-1，通過(guò)DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。通過(guò)放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)Ckβ-8-HA蛋白質(zhì)的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基并用去垢劑裂解細(xì)胞(RIPA緩沖液(150 mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基。在15％的SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例7Ckβ-8在人類組織中的表達(dá)模式進(jìn)行Northern印跡分析以檢測(cè)Ckβ-8在人類組織中的表達(dá)水平。使用RNAzolTMB系統(tǒng)分離總細(xì)胞RNA樣品(Biotecx實(shí)驗(yàn)室，公司，Houston，TX77033)。將從每一種特定的人類組織中分離的大約10μg的總RNA在1％的瓊脂糖凝膠上分離并在印跡尼龍濾器上(Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。根據(jù)帶有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It試劑盒進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。以Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射標(biāo)記的全長(zhǎng)Ckβ-8基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下過(guò)夜雜交所說(shuō)的濾器。用O.5×SSC和0.1％SDS在室溫下洗滌兩次，在60℃下洗滌兩次，然后在-70℃下，將此濾器過(guò)夜露置在增強(qiáng)屏上。
實(shí)施例8MIP-4在人類細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行Northern印跡分析以檢測(cè)MIP-4在人類細(xì)胞中的表達(dá)水平。使用RNAzolTMB系統(tǒng)分離總細(xì)胞RNA樣品(Biotecx實(shí)驗(yàn)室，公司，Houstonl TX77033)。將從每一種特定的人類組織中分離的大約10μg的總RNA在1％的瓊脂糖凝膠上分離并印跡在尼龍濾器上(Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。根據(jù)帶有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It試劑盒進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。以Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射標(biāo)記的全長(zhǎng)MIP-4基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下過(guò)夜雜交所說(shuō)的濾器。用0.5×SSC和0.1％SDS在室溫下洗滌兩次，在60℃下洗滌兩次，然后在-70℃下，將此濾器過(guò)夜露置在增強(qiáng)屏上。
實(shí)施例9Ckβ-1在人類組織中的表達(dá)模式進(jìn)行Northern印跡分析以檢測(cè)Ckβ-8在人類組織中的表達(dá)水平。使用RNAzolTMB系統(tǒng)分離總細(xì)胞RNA樣品(Biotecx實(shí)驗(yàn)室，公司，Houstonl TX77033)。將從每一種特定的人類組織中分離的大約10μg的總RNA在1％的瓊脂糖凝膠上分離并印跡在尼龍濾器上(Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))。根據(jù)帶有50ng DNA片段的Stratagene Prime-It試劑盒進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。以Select-G-50柱純化標(biāo)記的DNA。(5 Prime-3 Prime，公司Boulder，CO)。然后用放射標(biāo)記的全長(zhǎng)Ckβ-8基因以1,000,000 cpm/ml在0.5 M NaPO4，pH 7.4和7％SDS及65℃下過(guò)夜雜交所說(shuō)的濾器。用0.5×SSC和0.1％SDS在室溫下洗滌兩次，在60℃下洗滌兩次，然后在-70℃下，將此濾器過(guò)夜露置在增強(qiáng)屏上。脾中存在豐富的Ckβ-1的信使RNA。
實(shí)施例10使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化趨化因子Ckβ-8使用重組桿狀病毒(設(shè)計(jì)這種病毒是為了表達(dá)Ckβ-8 cDNA)感染SF9細(xì)胞。以2個(gè)MOT感染細(xì)胞，并在28℃下培養(yǎng)72-96小時(shí)。通過(guò)低速離心從感染的培養(yǎng)物中除去細(xì)胞碎片。向上清液中加入蛋白酶抑制物混合物，最終濃度為20μg/ml Pefabloc SC，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/mlE-64和1mM乙二胺四乙酸。通過(guò)只將20-30μl的上清液加樣到15％SDS-PAGE凝膠上監(jiān)測(cè)上清液中的Ckβ-8水平。檢測(cè)Ckβ-8，其可見(jiàn)的9Kd的帶相當(dāng)于每升幾毫克的表達(dá)水平。另外通過(guò)三步純化方法純化Ckβ-8肝素結(jié)合親和層析。將桿狀病毒培養(yǎng)物的上清液和1/3體積的含有100mMHEPES/MES/NaOAc(pH6)的緩沖液混合，并通過(guò)0.22μm的膜過(guò)濾。然后將此樣品加樣到肝素結(jié)合柱上(HE1 poros 20，生物感知系統(tǒng)公司)。在大約300 mM NaCl中以50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的50至500 mM NaCl溶液的線性梯度洗脫Ckβ-08；陽(yáng)離子交換色譜。將從肝素層析中富集的Ckβ-8用含有50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的緩沖液稀釋5倍。將得到的混合物加樣到陽(yáng)離子交換柱中(S/M poros 20，生物感知系統(tǒng)公司)。在250 mM NaCl中以50 mM HEPES/MES/NaOAc(pH 6)的25至300 mM NaCl溶液的線性梯度洗脫Ckβ-8；篩析色譜。在陽(yáng)離子交換層析后，通過(guò)將Ckβ-8加樣到篩析柱(HW50，TOSO HAAS，1.4×45cm)上進(jìn)一步純化Ckβ-8。在靠近分子量為13.7Kd標(biāo)準(zhǔn)物(Rnase A)的位置上分級(jí)分離的Ckβ-8，相當(dāng)于所說(shuō)的蛋白的二聚物形式。
在以上描述的三步純化后，通過(guò)SDS-PAGE凝膠的考馬斯藍(lán)染色而判定得到的Ckβ-8的純度是否超過(guò)90％(圖9)。
也檢驗(yàn)了純化的Ckβ-8的內(nèi)毒素/LPS的污染。按照LAL測(cè)定，LPS的含量少于0.1ng/ml(BioWhittaker)。
實(shí)施例11桿狀病毒表達(dá)的Ckβ-1和Ckβ-8對(duì)M-CSF和SCF刺激的新分離的骨髓細(xì)胞的集落形成的作用在37℃下，將小鼠骨髓細(xì)胞的低密度群體培養(yǎng)在處理的組織培養(yǎng)盤中1小時(shí)以除去單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它吸附在塑料表面的細(xì)胞。然后在圖16所示的因子存在或不存在的情況下，將沒(méi)有吸附的細(xì)胞群體接種(10,000個(gè)細(xì)胞/盤)在含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂中。在37℃下將這些培養(yǎng)物培養(yǎng)10天(88％N2，5％CO2和7％O2)，并在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)。以平均數(shù)表示集落數(shù)，并由進(jìn)行的三次重復(fù)測(cè)定獲得。
實(shí)施例12Ckβ-8和Ckβ-1對(duì)IL-3和SCF刺激的骨髓細(xì)胞lin群體的增值和分化的作用使用陰性選擇方法獲得富含在原始造血祖先中的小鼠骨髓細(xì)胞群，其中使用一組單克隆抗體(抗cd11b，CD4，CD8，CD45R和Gr-1抗原)和磁性的小珠除去大部分此譜系中已定型的細(xì)胞。在指示趨化因子(50 ng/ml)存在或不存在的情況下，將得到的細(xì)胞群(lin細(xì)胞)接種(5×104細(xì)胞/ml)在添加了IL-3(50 ng/ml)+SCF(100 ng/ml)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。37℃下在潮濕的保溫箱(5％CO2，7％O2，和88％N2環(huán)境)中培養(yǎng)7天后，收獲細(xì)胞并測(cè)定HPP-CFC和未成熟的祖先。另外，通過(guò)FACScan分析細(xì)胞的某些分化抗原的表達(dá)。以平均數(shù)+/-SD表示集落數(shù)，并由對(duì)每群細(xì)胞進(jìn)行的6個(gè)盤的實(shí)驗(yàn)獲得集落數(shù)據(jù)(圖17)。
實(shí)施例13Ckβ-8抑制響應(yīng)IL-3，M-CSF和GM-CSF的集落的形成從股骨和脛骨中沖洗小鼠骨髓細(xì)胞，在ficol密度梯度上分離，并通過(guò)塑料吸附除去單核細(xì)胞。將得到的細(xì)胞群體在以MEM為基礎(chǔ)的添加了IL-3(5ng/ml)，GM-CSF(5ng/ml)，M-CSF(10ng/ml)和G-CSF(10ng/ml)的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。在IL-3(5ng/ml)，GM-CSF(5ng/ml)或M-CSF(5ng/ml)及有或沒(méi)有Ckβ-8(50ng/ml)存在的情況下，將這些細(xì)胞以1,000個(gè)細(xì)胞/盤的密度接種在以瓊脂為基礎(chǔ)的集落形成測(cè)定培養(yǎng)基中。表示集落形成的數(shù)據(jù)為特定因子單獨(dú)存在時(shí)形成的集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)。以如各重復(fù)盤的平均數(shù)所描述的數(shù)據(jù)表示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，誤差條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差(圖19)。
實(shí)施例14經(jīng)基因治療的表達(dá)從患者中經(jīng)皮膚活組織檢查獲得成纖維細(xì)胞。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基中并將其分成小塊。將小組織塊放置在濕組織培養(yǎng)瓶的表面，每瓶放置大約10塊。將瓶倒轉(zhuǎn)，緊密靠近，在室溫下過(guò)夜。在室溫下放置24小時(shí)后，將瓶旋轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，組織塊仍然固著在瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(如Ham′s F12培養(yǎng)基，其中含有10％FBS、青霉素和鏈霉素)。然后，在37℃下培養(yǎng)大約1周。此時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基，以后每隔幾天換一次培養(yǎng)基。又培養(yǎng)2周之后，出現(xiàn)單層的成纖維細(xì)胞。將單層細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并按重量均等地分裝到更大的瓶中。
將pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))(其兩側(cè)是Moloney鼠肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū))用EcoRI和HindIII消化，之后用牛犢腸磷酸酶處理。在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離線性載體，并用玻璃珠純化。
利用PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明的多肽的cDNA，所說(shuō)的引物分別相當(dāng)于5′和3′末端序列。包含EcoRI位點(diǎn)和3′引物的5′引物還包含HindIII位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在的情況下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒線性主鏈和EcoRI和HindIII片段一起加入。在適于這兩種片段連接的條件下，保存得到的反應(yīng)混合物。用連接混合物轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將細(xì)菌HB101接種在包含卡那霉素的瓊脂中，以確認(rèn)載體中是否含有正確插入的興趣基因。
將兼嗜性pA317或者GP+am12包裝細(xì)胞在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)，至其在Dulbecco改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)(含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素)中為鋪滿密度。然后將含有所說(shuō)的基因的載體加入到培養(yǎng)基中，并用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。此時(shí)，包裝細(xì)胞產(chǎn)生含有所說(shuō)的基因的傳染性病毒顆粒(此時(shí)，包裝細(xì)胞稱為生產(chǎn)者細(xì)胞)。
將新鮮培養(yǎng)基加入到轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)者細(xì)胞中，隨后，在鋪滿生產(chǎn)者細(xì)胞的10cm平板上收獲培養(yǎng)基。將含有傳染性病毒顆粒的用過(guò)的培養(yǎng)基通過(guò)微孔濾器過(guò)濾，以除去分離的生產(chǎn)者細(xì)胞，然后用這種培養(yǎng)基感染成纖維細(xì)胞。從未鋪滿成纖維細(xì)胞的平板中除去培養(yǎng)基，并迅速地用生產(chǎn)者細(xì)胞的培養(yǎng)基替換。將此培養(yǎng)基除去，代替以新鮮培養(yǎng)基。如果病毒的滴度很高，事實(shí)上所有的成纖維細(xì)胞都將被感染，則不需要選擇。如果病毒的滴度很低，有必要利用具有可選擇性的標(biāo)記(如neo或者h(yuǎn)is)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射到宿主中，或者單獨(dú)或者在cytodex 3微載體珠上生長(zhǎng)至鋪滿。此時(shí)，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生所說(shuō)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
按照上文的描述本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化是可能的，因此，在附屬的權(quán)利要求范圍內(nèi)，可以另外非如上文的特定描述實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人LI等(ii)發(fā)明名稱人類趨化因子β-8，趨化因子β-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-4(iii)序列數(shù)18(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州NEW JERSEY(E)國(guó)家美國(guó)(F)ZIP07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(c)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(Vi)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(Vii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/173,209(B)申請(qǐng)日1993年12月22日(Viii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/208,339(B)申請(qǐng)日1994年3月8日(ix)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)
(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US94/07256(B)申請(qǐng)日1994年6月28日(ix)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號(hào)36，134(c)證書/文檔號(hào)325800-289(x)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度363個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTG TTACTGCCCT TGGATCCCAG 60GCCCGGGTCA CAAAAGATGC AGAGACAGAG TTCATGATGT CAAAGCTTCC ATTGGAAAAT 120CCAGTACTTC TGGACAGATT CCATGCTACT AGTGCTGACT GCTGCATCTC CTACACCCCA 180CGAAGCATCC CGTGTTCACT CCTGGAGAGT TACTTTGAAA CGAACAGCGA GTGCTCCAAG 240CCGGGTGTCA TCTTCCTCAC CAAGAAGGGG CGACGTTTCT GTGCCAACCC CAGTGATAAG 300CAAGTTCAGG TTTGCATGAG AATGCTGAAG CTGGACACAC GGATCAAGAC CAGGAAGAAT 360TGA 363(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Lys Val Thr-20 -15 -10Ala Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu-5 15Phe Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp10 15 20Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro25 30 35Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn40 45 50Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly55 60 65Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys70 75 80Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn85 90 95(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度282個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGAAGATCT CCGTGGCTGC AATTCCCTTC TTCCTCCTCA TCACCATCGC CCTAGGGACC 60AAGACTGAAT CCTCCTCACG GGGACCTTAC CACCCCTCAG AGTGCTGCTT CACCTACACT 120ACCTACAAGA TCCCGCGTCA GCGGATTATG GATTACTATG AGACCAACAG CCAGTGCTCC 180AAGCCCGGAA TTGTCTTCAT CACCAAAAGG GGCCATTCCG TCTGTACCAA CCCCAGTGAC 240AAGTGGGTCC AGGACTATAT CAAGGACATG AAGGAGAACT GA 282(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度93個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr-15 -10 -5Ile Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr1 5 10His Pro Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro15 20 25Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser30 35 40Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys45 50 55Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met60 65 70Lys Glu Asn(3)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度270個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGAAGGGCC TTGCAGCTGC CCTCCTTGTC CTCGTCTGCA CCATGGCCCT CTGCTCCTGT 60GCACAAGTTG GTACCAACAA AGAGCTCTGC TGCCTCGTCT ATACCTCCTG GCAGATTCCA 120CAAAAGTTCA TAGTTGACTA TTCTGAAACC AGCCCCCAGT GCCCCAAGCC AGGTGTCATC 180CTCCTAACCA AGAGAGGCCG GCAGATCTGT GCTGACCCCA ATAAGAAGTG GGTCCAGAAA 240TACATCAGCG ACCTGAAGCT GAATGCCTGA 270(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度89個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met-20 -15 -10Ala Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys-51 5 10Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val15 20 25Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile30 35 40Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys45 50 55Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala60 65(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7TCAGGATCCG TCACAAAAGA TGCAGA 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGT 26(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9TCAGGATCCT GTGCACAAGT TGGTACC27(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10CGCTCTAGAG TAAAACGACG GCCAGT 26(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11GCCCGCGGAT CCTCCTCACG GGGACCTTAC 30(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO12GCCTGCTCTA GATCAAAGCA GGGAAGCTCC AG 32(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO13GGAAAGCTTA TGAAGGTCTC CGTGGCT27(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度59個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO14CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAA TTCTTCCTGG TCTTGATCC 59(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO15GGAAAGCTTA TGAAGGGCCT TGCAGCTGCC30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度57個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO16CGCTCTAGAT CAABCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG GCATTCAGCT TCAGGTC 57(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO17GGAAAGCTTA TGAAGATTCC GTGGCTGC 28(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度58個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO18CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTAG TTCTCCTTCA TGTCCTTG 58
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包含選自由下列物質(zhì)組成的組的成員(a)一種編碼包含SEQ ID NO.2的氨基酸-21至氨基酸99之多肽的多核苷酸；(b)一種編碼包含SEQ ID NO.2的氨基酸1至氨基酸99之多肽的多核苷酸；(c)一種能夠和(a)或(b)的多核苷酸雜交且與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸；和(d)一種(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，這種多核苷酸編碼包含SEQ ID NO.2的氨基酸-21至氨基酸99的多肽。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，這種多核苷酸編碼包含SEQ ID NO.2的氨基酸1至氨基酸99的多肽。
7.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包含選自由下列物質(zhì)組成的組的成員(a)一種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有由包含在ATCC 75676號(hào)保藏物中的DNA表達(dá)的氨基酸序列；(b)一種能夠和(a)的多核苷酸雜交且與(a)的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸；(c)一種(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸，這種多核苷酸包含如在SEQ ID NO.1中所示核苷酸1至核苷酸363的序列。
9.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
10.一種用權(quán)利要求9的載體經(jīng)基因工程操作獲得的宿主細(xì)胞。
11.一種產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說(shuō)的DNA編碼的多肽。
12.一種產(chǎn)生能夠表達(dá)多肽之細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求9的載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
13.一種選自由下列成員組成的組的多肽(i)一種具有SEQ ID NO.2推定的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；和(ii)一種由ATCC75676號(hào)保藏物的cDNA編碼的多肽和所說(shuō)多肽的片段、類似物及衍生物。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中所說(shuō)的多肽具有SEQ ID NO.2推定的氨基酸序列。
15.一種權(quán)利要求13之多肽的興奮劑。
16.一種抗權(quán)利要求13之多肽的拮抗劑。
17.一種用于治療需要Ckβ-8的患者的方法，該方法包括對(duì)所說(shuō)的患者施用治療有效量的權(quán)利要求13的多肽。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的治療有效量的多肽是通過(guò)向患者提供編碼所說(shuō)的多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)的多肽來(lái)施用的。
19.一種治療需更抑制Ckβ-8多肽的患者的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求16的拮抗劑。
20.一種診斷與權(quán)利要求13的多肽的表達(dá)不足有關(guān)的疾病或?qū)Υ思膊〉囊赘行缘姆椒ǎ摲椒òù_定編碼所說(shuō)的多肽的核酸序列的突變。
21.一種診斷方法，該方法包括分析在來(lái)源于宿主的樣品中是否存在權(quán)利要求13的多肽。
22.一種鑒定抗權(quán)利要求13的多肽的拮抗劑和興奮劑的方法，該方法包括將細(xì)胞、待篩選的化合物和所說(shuō)的多肽組合在一起，其中所說(shuō)的細(xì)胞通過(guò)多孔濾器與所說(shuō)的多肽分開；和確定這些細(xì)胞的遷移程度，以確定所說(shuō)的化合物是否是有效的拮抗劑或興奮劑。
全文摘要
本文公開了人類Ckβ－8、MIP－4、Ckβ－1和編碼這些趨化因子多肽的DNA(RNA)以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法。本文也公開了將這些趨化因子多肽用于治療白血病、腫瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纖維變性障礙、創(chuàng)傷愈合和牛皮癬的方法。本文也公開了抗這些趨化因子多肽的拮抗劑和它們作為治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫、慢性及急性炎癥、傳染性疾病、過(guò)敏反應(yīng)、不依賴于前列腺素的發(fā)熱和骨髓失去功能的治療劑的用途。本文還公開了檢測(cè)與核酸序列突變有關(guān)的疾病和檢測(cè)所說(shuō)的多肽變化的濃度的診斷測(cè)定方法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1186501SQ95197892
公開日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1995年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月5日
發(fā)明者C·A·羅森, S·M·盧本, 李浩東, M·D·艾德姆斯 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司