專(zhuān)利名稱(chēng)：制備用作細(xì)胞種植框架和植入體的生物細(xì)胞外基質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人或動(dòng)物組織所得到的組織制備生物細(xì)胞外基質(zhì)的方法。
器官或組織的損傷或缺失是人類(lèi)健康中最經(jīng)常發(fā)生、最具災(zāi)難性且花費(fèi)最昂貴的問(wèn)題之一。因此，組織工程學(xué)作為一個(gè)新的領(lǐng)域便應(yīng)運(yùn)而生，其是利用生物學(xué)和工程學(xué)原理來(lái)開(kāi)發(fā)損傷組織的功能替代物。
組織工程是一個(gè)應(yīng)用工程和生命科學(xué)原理研究正常和病理狀態(tài)哺乳組織間結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系并進(jìn)而研制能恢復(fù)，保持或改善組織功能的領(lǐng)域。它包括將活細(xì)胞與天然或人工的細(xì)胞外基質(zhì)一起用于研制用于恢復(fù)或替代組織功能的移植體。
對(duì)于制備新的組織替代物所采取的三種基本構(gòu)思之一是將細(xì)胞置于基質(zhì)上或之中。該基質(zhì)來(lái)自天然材料或合成的生物降解的聚合物纖維框架，其被作為ECM。
盡管已開(kāi)發(fā)出許多人工或合成的移植物，但這些組織替代物仍不能恰當(dāng)?shù)厝〈烊桓叨葟?fù)雜的結(jié)構(gòu)。今天在組織移植中所面臨的挑戰(zhàn)是克服機(jī)體的免疫系統(tǒng)并盡力改善移植物的功能。盡管在本領(lǐng)域已取得了很大進(jìn)展，但目前的組織移植仍存有許多問(wèn)題，這包括炎癥，降解，瘢痕，感染，鈣化，咬合和排斥。因此，目前廣泛深入的醫(yī)學(xué)生物材料研究是面向改善移植組織移植物的工程，但理想的人工移植物還未研制出來(lái)。
美國(guó)專(zhuān)利4,801,299記載了一種通過(guò)用洗滌劑除去組織中細(xì)胞成份從而得到供移植用的細(xì)胞外基質(zhì)的方法。但如該組織預(yù)先用固定劑固定的話，則該洗滌劑不能用于該組織的制備。
本發(fā)明人在研究中出人意料地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將來(lái)自人或動(dòng)物供體的組織先用固定液固定，然后用作為消化液的堿性溶液除去固定組織中細(xì)胞得到細(xì)胞外基質(zhì)，該細(xì)胞外基質(zhì)具有優(yōu)良的組織完整性和作為移植物所需具備的其它性質(zhì)，并使供體的來(lái)源更廣，從而為供體提供了廣泛來(lái)源。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明的目的是提供一種加工來(lái)自人或動(dòng)物的生物組織的方法，其是通過(guò)化學(xué)處理來(lái)制備脫細(xì)胞化的以膠原蛋白為主的ECM，所得到的生物組織用于人類(lèi)或動(dòng)物的移植。本發(fā)明提供了制備改進(jìn)的ECM的有效方法，該ECM一般具有該組織的原有形狀且同時(shí)保留了所需要的生物結(jié)構(gòu)。該組織可由已知方法得到，該組織可是宿主的或從尸體或供體得到的。該組織在固定后進(jìn)行脫細(xì)胞。
得到該組織后，對(duì)其進(jìn)行固定，然后進(jìn)行脫細(xì)胞，其中脫細(xì)胞用的消化液選自堿金屬氫氧化物或其碳酸鹽或碳酸氫鹽，氫氧化銨，堿金屬醇化物，有機(jī)胺或它們的混合物?？刹捎醚鯕溲趸c或氫氧化鉀溶液。然后將所得到的ECM洗滌，孵育并保存。
在移植前，作為細(xì)胞框架的ECM可用來(lái)自宿主(自身細(xì)胞)或其它人的細(xì)胞種植。該機(jī)體組織的ECM也可作為基質(zhì)材料用于組織替代。
本發(fā)明包括通過(guò)固定處理，除去細(xì)胞，滅菌和細(xì)胞重建步驟獲得生物組織，從而提供用于移植的生物替代組織。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所獲得的組織優(yōu)選是與隨后進(jìn)行植入的移植物相同的組織。例如皮膚用于代替皮膚，血管用于代替血管，軟骨用于代替軟骨等。
用人的尸體或動(dòng)物供體得到的生物組織具有1cm3體積或更大，其獲取后馬上置于帶有固定劑的固定液中，如戊二醛或甲醛。該固定液可包含于緩沖液如磷酸鈉緩沖液中(PBS)的2％甲醛和1.5％戊二醛。該組織在固定液中最少保留時(shí)間約2小時(shí)，或直到該組織完全被固定。組織固定后，用適宜材料對(duì)其洗滌幾次，如用蒸餾水。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該組織然后被放在NaOH或KOH溶液或任何其它堿性溶液中以進(jìn)行該組織的孵育，從而除去固定組織中細(xì)胞。該組織于室溫在該溶液中的保留時(shí)間為約12小時(shí)-5天。溶液優(yōu)選含1.5-2.0N NaOH或KOH的堿性溶液。濃度范圍為0.1N-5N，溫度范圍為約4℃-60℃，這取決于所加工供體組織的類(lèi)型和獲得該脫細(xì)胞化ECM所需的時(shí)間長(zhǎng)度。更高濃度，更高的溫度或更長(zhǎng)的消化將損害該結(jié)果。實(shí)踐中，在室溫用NaOH或KOH處理更長(zhǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致彈性纖維的消化。所得ECM可通過(guò)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察到。
組織脫細(xì)胞化后，進(jìn)行組織的洗滌。洗滌組織的溶液可以是蒸餾水和緩沖液，如磷酸鈉。
在該步中，可變化洗滌溶液，優(yōu)選為約每30分鐘，且持續(xù)洗滌直到ECM呈半透明狀。洗滌ECM后，將ECM于氨基酸如天門(mén)冬氨酸，谷氨酸或甘氨酸溶液中孵育以消除殘余的游離固定劑并降低pH。具體的氨基酸可是0.5％天門(mén)冬氨酸或0.1M甘氨酸溶液。緩沖液中ECM孵育最好將洗滌液pH帶到約7.4。加工后，可以在移植前不損害ECM結(jié)構(gòu)的任何方式放置并貯存該脫細(xì)胞的ECM。
該ECM結(jié)構(gòu)提供了用于細(xì)胞粘著，生長(zhǎng)和分化的適宜有效的生物底物。該ECM可在移植前通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在其上種植活細(xì)胞作為細(xì)胞框架而成為替代組織，或通過(guò)各種醫(yī)學(xué)步驟直接作為體內(nèi)或體外植入的模板。
本發(fā)明提供了一種組織產(chǎn)品，其包括良好防腐的ECM。該ECM調(diào)節(jié)與其接觸的細(xì)胞行為上起著活性的并且綜合的作用。
本發(fā)明就是制備一個(gè)完好保留的細(xì)胞外基質(zhì)，目前大量的研究已經(jīng)證明了細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)與其相接觸的細(xì)胞的各種行為起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，圍繞在細(xì)胞外的基質(zhì)是一種相對(duì)很穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，但是只認(rèn)為圍繞在細(xì)胞外的基質(zhì)對(duì)于細(xì)胞僅僅起著惰性的支持和框架的作用，這種看法已成為了過(guò)去，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的每一種成份對(duì)于與它相接觸的細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化都有著特殊的功能，由它們結(jié)合而構(gòu)成的具有三維立體空間的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝、調(diào)節(jié)都起著不可替代的作用，反過(guò)來(lái)由于這些細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞所產(chǎn)生，所以細(xì)胞對(duì)于圍繞在其周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)的形成起著這樣或那樣的作用和影響，在細(xì)胞的表面有著與ECM相連結(jié)的特殊的受體，這樣細(xì)胞基質(zhì)的組成成份和空間結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞的代謝、形態(tài)生長(zhǎng)分化有著密切相關(guān)的作用。
因此，對(duì)于通過(guò)該技術(shù)特殊處理過(guò)的組織，由于所有能夠被宿主識(shí)別出對(duì)宿主表達(dá)組織免疫抗原性的細(xì)胞物質(zhì)被去除，而完整保留下來(lái)的ECM其形態(tài)，組織結(jié)構(gòu)，超微結(jié)構(gòu)，定位和耐受性等都與原有組織的基質(zhì)一樣。
當(dāng)與目前市場(chǎng)的移植物比較時(shí)，本發(fā)明所制備的ECM具有難以模仿的天然生物構(gòu)造并在應(yīng)用中具有優(yōu)越性能。該ECM與由ECM成份如膠原或纖維蛋白涂覆的化學(xué)聚合物底物組成的移植體比較，其絕對(duì)無(wú)毒，不會(huì)引起不良過(guò)敏活性且可促進(jìn)細(xì)胞繁殖。當(dāng)本發(fā)明與美國(guó)專(zhuān)利4,801,299的ECM和方法比較時(shí)，本發(fā)明通過(guò)更簡(jiǎn)易，低花費(fèi)的方法在更短的時(shí)間內(nèi)制備ECM，同時(shí)保留了所需的天然結(jié)構(gòu)，且供體的來(lái)源更廣泛，方便。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)去除了細(xì)胞成份，保留細(xì)胞外基質(zhì)而制備生物移植體的方法，其包括以下步驟a.獲得組織b.將所得的組織用固定劑固定，c.將選自堿金屬氫氧化物或其碳酸鹽或碳酸氫鹽，氫氧化銨，堿金屬醇化物，有機(jī)胺或它們的混合物的堿性溶液用于所述組織。
2.權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)去除細(xì)胞成份，保留細(xì)胞外基質(zhì)，制備生物移植體的方法，其還包括用緩沖液對(duì)組織進(jìn)行洗滌的步驟。
3.權(quán)利要求2所述的一種制備生物移植體的方法，其進(jìn)一步包含了將所獲得的細(xì)胞外基質(zhì)在孵育溶液中進(jìn)行孵育的步驟以便消除殘留的固定液成份并降低細(xì)胞外基質(zhì)的pH值。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中的孵育液是天門(mén)冬氨酸。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中的孵育液是谷氨酸。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中孵育液是甘氨酸。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中的堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
9.權(quán)利要求3所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
10.權(quán)利要求4所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
11.權(quán)利要求5所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
12.權(quán)利要求6所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鈉溶液。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中的堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
14.權(quán)利要求2所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
15.權(quán)利要求3所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
16.權(quán)利要求4所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
17.權(quán)利要求5所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
18.權(quán)利要求6所述的方法，其中堿性溶液是氫氧化鉀溶液。
19.權(quán)利要求1-6任一所要求的方法，其中所制備的ECM可作為移植用的模板直接用于人或動(dòng)物的移植。
20.權(quán)利要求1-6任一所要求的方法，其中所制備的ECM可被種植上來(lái)自宿主或其它人或動(dòng)物的活細(xì)胞而用作人或動(dòng)物移植的移植體。
21.權(quán)利要求1所要求的方法，其中所述的動(dòng)物可以是豬、牛、羊。
全文摘要
由人類(lèi)或動(dòng)物供體得到的組織。該組織可通過(guò)固定方法來(lái)固定?？梢鹋懦獾募?xì)胞成分可通過(guò)化學(xué)處理從組織中除去，從而使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)保留了它們?cè)械男螤?，生物結(jié)構(gòu)，超微結(jié)構(gòu)，定位和耐久性。將活細(xì)胞種植在作為細(xì)胞框架的所得ECM上，形成用于移植或同種異體移植的有生命的移植物。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1160480SQ96104550
公開(kāi)日1997年10月1日 申請(qǐng)日期1996年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月1日
發(fā)明者胡杰 申請(qǐng)人:胡杰