專利名稱：能夠針對(duì)人胃癌誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的肽和含該肽的預(yù)防或治療人胃癌的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肽以及編碼此肽的DNA，其中該肽能在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)針對(duì)人胃癌細(xì)胞的CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；參見(jiàn)MedicalImmunology，修訂第三版，Kikuchi kokichi編)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種肽以及編碼此肽的DNA，其中該肽通過(guò)結(jié)合至HLA-A31抗原(人白細(xì)胞抗原；參見(jiàn)Modern Immunology，第二版，yamamura yuichi和Tomio編)能使CTL呈遞于人胃細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種預(yù)防或治療人胃癌的藥劑，該藥劑含有能在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)針對(duì)人胃癌細(xì)胞的CTL的肽，本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療人胃癌的疫苗，該疫苗包含具有編碼此肽DNA的重組病毒或重組細(xì)菌。
惡性腫瘤的藥物療法，使用過(guò)直接損害腫瘤細(xì)胞的化學(xué)治療劑，或使用免疫治療劑，通過(guò)非特異激活宿主的免疫力及增強(qiáng)宿主生物保護(hù)功能進(jìn)行免疫治療?？墒牵壳皼](méi)有藥劑能夠完全治愈惡性腫瘤尤其是消化道腫瘤。
近年來(lái)，使用動(dòng)物腫瘤，主要是小鼠，進(jìn)行的研究表明通過(guò)對(duì)存在于各種腫瘤細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異抗原增強(qiáng)抗原特異免疫應(yīng)答，能夠完全治愈腫瘤。臨床上，已通過(guò)增強(qiáng)對(duì)這些腫瘤特異抗原的抗原特異免疫應(yīng)答實(shí)施過(guò)這種治療。
關(guān)于通過(guò)增強(qiáng)腫瘤抗原特異免疫應(yīng)答治療腫瘤的藥劑或方法，曾報(bào)道使用過(guò)針對(duì)一種抗原的單克隆抗體，該抗原在腫瘤細(xì)胞中被表達(dá)，主要由B細(xì)胞識(shí)別，還曾報(bào)道腫瘤特異免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是通過(guò)給病人服用他們自身的腫瘤細(xì)胞或其溶解碎片，這些做為疫苗已用射線或藥物去活，并且為了增加腫瘤細(xì)胞免疫原性，將病毒或各種細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，如此處理的腫瘤細(xì)胞給病人自己服用，由此誘導(dǎo)腫瘤特異免疫應(yīng)答。
但是，人們正在清楚地認(rèn)識(shí)到包括CTL的T細(xì)胞在體內(nèi)主要作用于腫瘤排斥。目前已證實(shí)使用抗B細(xì)胞識(shí)別抗原的抗體進(jìn)行治療受到限制。
而且，已證實(shí)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答要么強(qiáng)烈要么抑制地作用在T細(xì)胞中的兩個(gè)功能亞群(Th1和Th2亞集團(tuán))被激活的階段，還證實(shí)包含多抗原的腫瘤細(xì)胞自身的免疫有時(shí)更會(huì)抑制對(duì)該腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
更進(jìn)一步地說(shuō)，關(guān)于滅活腫瘤細(xì)胞的接種，通過(guò)體內(nèi)再激活而使腫瘤再生長(zhǎng)的可能性不可完全被否定。于是，存在安全問(wèn)題。
為了避免上述問(wèn)題，考慮這樣的方法用來(lái)激活被認(rèn)為在腫瘤排斥中起重要作用的CTL的抗原蛋白被鑒別出來(lái)，并使用此抗原蛋白激活CTL。
通過(guò)近年來(lái)研究進(jìn)展證實(shí)，CTL被誘導(dǎo)，在細(xì)胞中由蛋白水解酶分解并由抗原蛋白衍生的8至12個(gè)氨基酸組成的肽通過(guò)被結(jié)合至HLA抗原做為對(duì)CTL的抗原呈遞分子。
因此，關(guān)于癌抗原肽，認(rèn)為如果能發(fā)現(xiàn)為誘導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL而被結(jié)合至HLA分子上的肽，則此肽能用做預(yù)防或治療癌癥的藥劑。
在這些想法的基礎(chǔ)上，曾研究過(guò)能誘導(dǎo)CTL的癌抗原肽?？墒牵挥幸环N從蛋白質(zhì)衍生的肽即MAGE family，mart-1，Thyrosinase，gp100，它是出現(xiàn)在黑素瘤中的癌抗原，現(xiàn)已被弄清。關(guān)于包括胃癌的消化系統(tǒng)癌，能夠誘導(dǎo)CTL的癌抗原肽的存在和該癌抗原肽的結(jié)構(gòu)目前仍是未知的。
本發(fā)明提供1)能夠?qū)θ宋赴┱T發(fā)免疫應(yīng)答的肽，2)編碼此肽的DNA，3)預(yù)防或治療人胃癌的藥劑，該藥劑含有上述肽，4)預(yù)防或治療人胃癌的疫苗，該疫苗含有具備編碼上述肽的DNA的重組病毒或重組細(xì)菌。
本發(fā)明人注意到下列事實(shí)識(shí)別腫瘤抗原的CTL做為對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物防御機(jī)制，起重要作用。即他們?cè)诳紤]下列事實(shí)之時(shí)進(jìn)行了研究用能做為疫苗一部分的肽或用包含有編碼該肽的DNA的轉(zhuǎn)化體對(duì)CTL進(jìn)行的有效誘導(dǎo)，在預(yù)防或治療癌癥中是有效的。
我們知道HLA抗原被結(jié)合至癌抗原肽并做為對(duì)CTL的抗原呈遞分子，由此CTL被誘導(dǎo)。因此，如果發(fā)現(xiàn)了能激活CTL與胃癌細(xì)胞作用的肽，則使用同樣的肽作為預(yù)防或治療胃癌的藥劑是可能的。
本發(fā)明人成功地建立了CTL細(xì)胞株(Tc-HST-2)，該CTL細(xì)胞株與限制于HLA-A31的胃癌細(xì)胞特異地反應(yīng)，它來(lái)自患胃癌的病人，本發(fā)明人又成功地建立了該CTL作用的胃癌細(xì)胞株(HST-2)，此株也來(lái)自相同的病人(J.I.Meth.154，235-243，1992和Cancer 75，1484-1489，1995)。
但是，該CTL是否識(shí)別腫瘤抗原以及該CTL識(shí)別什么抗原仍是不清楚的。另外，特異地存在于消化系統(tǒng)癌癥包括胃癌中的并且能誘導(dǎo)CTL的癌抗原肽根本還沒(méi)有弄清楚，其實(shí)質(zhì)就更不清楚了。
因此，本發(fā)明者提純了存在于胃癌細(xì)胞HST-2細(xì)胞表面上的結(jié)合HLA的肽，并且鑒別了激活CTL細(xì)胞株Tc-HST-2的肽。而且，他們以常規(guī)手段用化學(xué)方法合成了此被鑒別的肽。于是，第一次證實(shí)此肽確實(shí)能激活CTL細(xì)胞株Tc-HST-2。還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)此肽被HST-2以外的胃癌細(xì)胞表達(dá)。
從這些結(jié)果證實(shí)，上述肽能被很好地用作預(yù)防或治療胃癌的藥劑。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
即本發(fā)明涉及1)一種肽，該肽是存在于人胃癌細(xì)胞的胃癌抗原蛋白的片斷，該片斷結(jié)合至HLA分子并能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，2)預(yù)防或治療人胃癌的藥劑，該藥劑含上述肽，3)編碼上述肽的DNA，以及4)預(yù)防或治療人胃癌的疫苗，該疫苗包括含此DNA的重組病毒或重組細(xì)菌。
本發(fā)明將在下面詳細(xì)描述。
為了鑒別一種肽，該肽是存在于人胃癌細(xì)胞的胃癌抗原蛋白的片斷，該片斷結(jié)合至HLA分子能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，建立下列各項(xiàng)是必要的(1)能在體外大量生長(zhǎng)的已發(fā)現(xiàn)的HLA-型人癌細(xì)胞株，(2)CTL細(xì)胞株，它與上述癌細(xì)胞株反應(yīng)以抑制HLA分子和T細(xì)胞受體，表現(xiàn)細(xì)胞毒性，且能在體外大量生長(zhǎng)。
做為已發(fā)現(xiàn)的能在體外大量生長(zhǎng)的HLA-型人胃癌細(xì)胞株，例如由本發(fā)明者建立的HST-2細(xì)胞[J.Immunol.Meth.，Vol.154，pp.235-243(1992)；和Jpn.J.Cancer Res.，Vol.84，pp.906-913(1993)]可被使用。此細(xì)胞株是胃癌病人癌腹水中形成的胃印記環(huán)細(xì)胞癌株。
而且，做為一種CTL細(xì)胞株，它與上述癌細(xì)胞株反應(yīng)抑制HLA分子和T細(xì)胞受體，表現(xiàn)細(xì)胞毒性并能在體外大量生長(zhǎng)，由本發(fā)明者建立的Tc-HST-2細(xì)胞[J.Immunol.Meth.，Vol.154，pp.235-243(1992)；和Jpn.J.CancerRes.，Vol.84，pp.906-913(1993)]可被使用。
在Cancer，Vol.75，pp.1484-1489(1995)中描述過(guò)此CTL細(xì)胞株能特異地與HST-2細(xì)胞反應(yīng)并同時(shí)識(shí)別HST-2抗原和HLA-A31抗原。
能夠使用HST-2細(xì)胞以獲得含胃癌抗原肽的結(jié)合HLA的肽，該肽能夠誘導(dǎo)Tc-HST-2細(xì)胞株的CTL活性。即HST-2細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，例如在含胎牛血清RP MI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌培養(yǎng)物。此后，用0.1％三氟乙酸(TFA)溶液有效地提取存在于細(xì)胞表面的與HLA分子結(jié)合的肽。在ScienceVol.249，pp.283-287(1990)中描述了使用TFA提取HLA-結(jié)合肽。
能誘導(dǎo)Tc-HST-2細(xì)胞的CTL活性的胃癌抗原肽能通過(guò)反相色譜從上述HLA-結(jié)合肽提純。此胃癌抗原肽的提純將在以后的實(shí)施例詳細(xì)描述。
在通過(guò)反相色譜被分離的HLA-結(jié)合肽級(jí)分中的Tc-HST-2-反應(yīng)性的胃癌抗原肽，能根據(jù)如在Science vol.249，pp.283-287(1990)中所描述的相同方式，通過(guò)測(cè)定每一級(jí)份的CTL誘導(dǎo)性來(lái)鑒別。
即HLA-A31-陽(yáng)性HST-2或KG-1細(xì)胞用含51Cr的鉻酸鈉進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后與通過(guò)反相色譜分離的HLA結(jié)合肽混合。混合物于37℃溫育3小時(shí)，然后，Tc-HST-2加入其中。得到的混合物進(jìn)一步溫育12小時(shí)。通過(guò)測(cè)定上清液中51Cr釋放的放射性活性可檢測(cè)CTL的誘導(dǎo)性。
關(guān)于能夠誘導(dǎo)Tc-HST-2細(xì)胞的CTL活性的用反相色譜分離出的胃癌抗原肽，它的氨基酸序列能以通常的方式用固相技術(shù)蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定。例如，由序列表中序列1代表的肽即是具有CTL誘導(dǎo)性的肽。
無(wú)需說(shuō)明，具有序列表中序列1所代表的氨基酸序列的肽能用于本發(fā)明。而且，通過(guò)對(duì)序列表中序列1所代表的氨基酸序列的一部分進(jìn)行修飾而得到的氨基酸序列的肽，也能用于本發(fā)明，此片斷被結(jié)合至HLA分子上并能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
通過(guò)對(duì)本發(fā)明序列表中序列1所代表的氨基酸序列的一部分進(jìn)行修飾而得到的氨基酸序列的肽，具體例子包括(1)用另一個(gè)氨基酸代替由序列表序列1所代表的氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸，而得到的氨基酸序列，(2)從具有序列表序列1所代表的氨基酸序列的肽N-末端或C-末端中去除至少一個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，以及(3)在整個(gè)氨基酸序列的一部分中含有序列表序列1所代表的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明的肽涉及范圍為由幾個(gè)氨基酸結(jié)合形成的肽至由許多氨基酸結(jié)合形成的肽。
如果一個(gè)肽不能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，即使它具有序列表序列1所代表的氨基酸序列的一部分經(jīng)修飾而得到的氨基酸序列，也不能用于本發(fā)明。
例如具有序列表序列2所代表的氨基酸序列的肽能用在本發(fā)明中，但具有序列表序列3或4代表的氨基酸序列的肽不能被使用，因?yàn)樗鼪](méi)有CTL誘導(dǎo)性(參考后面描述的實(shí)施例)。
生產(chǎn)上述肽的方法沒(méi)有具體限制?？墒褂霉滔嚯暮铣杉夹g(shù)或重組DNA技術(shù)生產(chǎn)肽。
尤其可用通常的固相肽合成技術(shù)合成由序列表序列1或2所代表的以胃癌細(xì)胞為靶的能誘導(dǎo)CTL的肽。也可通過(guò)將編碼構(gòu)成此肽的氨基酸的DNA摻入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，并且培養(yǎng)如此轉(zhuǎn)化的BCG細(xì)菌或?qū)儆诖竽c桿菌屬的細(xì)菌。
從氨基酸序列能推斷出編碼具有序列表序列1或2代表的氨基酸序列的肽的DNA。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，與每一個(gè)氨基酸序列相應(yīng)的密碼子是熟知的。
本發(fā)明中所有的肽由反相HPLC純化，通過(guò)反相HPLC鑒定這些均是單組分。于是這些肽用質(zhì)譜得到鑒定，并用于CTL分析中。
本發(fā)明的肽能夠誘導(dǎo)對(duì)胃細(xì)胞特異的CTL株Tc-HST-2的CTL活性。CTL誘導(dǎo)性能通過(guò)上述鉻釋放法或通過(guò)Immunogenetics，vol.35，p.145(1992)所描述的TNF釋放法測(cè)得。
即在TNF釋放法中，HLA-A31-陽(yáng)性的HST-2或KG-1細(xì)胞與本發(fā)明的肽混合，混合物在37℃溫育3小時(shí)。然后，Tc-HST-2加入其中，得到的混和物進(jìn)一步溫育12小時(shí)。測(cè)定上清液中釋放的TNF的活性以檢測(cè)CTL的誘導(dǎo)性。
TNF活性能由Immunogenetics，vol 35，p.145(1992)所描述的方法測(cè)得。
即TNF-敏感的Wehi 164細(xì)胞與試驗(yàn)樣品混合，將混合物溫育24小時(shí)。然后將MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(鎓)溴化物]溶液加入到培養(yǎng)物中，得到的混和物進(jìn)一步溫育3小時(shí)。在線粒體內(nèi)被轉(zhuǎn)換的甲溶解在酸性丙醇后，測(cè)得的量以O(shè)D 570處表示，以檢查TNF活性。
本發(fā)明的肽，例如具有序列表序列1所代表的氨基酸序列的肽，可做為T細(xì)胞表位誘導(dǎo)對(duì)胃癌細(xì)胞特異的CTL。因此，它更多地被希望做為預(yù)防或治療人胃癌的藥劑。
在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明的肽能夠以下列方式給藥1)直接給藥本發(fā)明的肽2)與藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑一起服用，或3)進(jìn)一步與下面所要求的助劑一起服用，可使用注射管或用噴霧從粘膜經(jīng)皮下吸收等方式。載體指人血清白蛋白等，稀釋劑指PBS，蒸餾水等。
本發(fā)明中，預(yù)防或治愈人胃癌的藥劑含有重量比0.01至100％的肽，優(yōu)選重量比0.1至95％。該肽是存在人胃癌細(xì)胞中的胃癌抗原蛋白片斷，該片斷結(jié)合至HLA分子之上，具體地是HLA-A31分子，能夠誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
此藥劑按本發(fā)明的肽量一次給藥在0.01mg至100mg之間，給成年人服用。但，該范圍只是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，它不是至關(guān)重要的。
制劑配方?jīng)]有特別限制。含有賦形劑如糖類的凍干劑或顆粒劑也是可用的。
此制劑在上述給藥中沒(méi)有嚴(yán)重的急性毒性。
為增加CTL誘導(dǎo)性而加入到本發(fā)明藥劑中的助劑包括微生物如BCG、描述于Nature，vol.344，p.873(1990)中的ISCOM，描述于J.Immunol.，vol.148，p.1438(1992)皂角苷-類QS-21，脂質(zhì)體和氫氧化鋁。
而且，免疫活化劑能用做助劑。它的例子包括磨菇多糖，裂裥菌素和picibanil。促進(jìn)T細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、IL-1、IL-6和TNF也能用作助劑。
在上述文獻(xiàn)和Science，vol.255，p.333(1992)中描述過(guò)CTL等的免疫應(yīng)答可由上述方法在體內(nèi)被誘導(dǎo)。
而且，這是可能的為呈遞抗原，將上述抗原肽在體外加入到集自病人的細(xì)胞中或有相同HLA單元型的細(xì)胞中，之后，這些細(xì)胞注射到病人的血管中以在病人體內(nèi)有效地誘導(dǎo)CTL。進(jìn)一步說(shuō)，這是可能的將上述肽加入到病人的外周血淋巴細(xì)胞中，含肽的淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)以在體外誘導(dǎo)CTL，之后，得到的淋巴細(xì)胞再被轉(zhuǎn)移至病人的血管。通過(guò)這種細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)行的治療已經(jīng)做為癌癥治療方法被實(shí)踐，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。
編碼本發(fā)明所證實(shí)的胃癌抗原肽的DNA被插入到合適的載體中；含有此重組DNA的病毒如牛痘病毒或細(xì)菌如BCG能有效地用作活疫苗以預(yù)防或治療人胃癌。
即，(1)編碼具有序列表序列1所代表的氨基酸序列的肽的DNA或(2)編碼具有一種氨基酸序列的肽的DNA，該氨基酸序列通過(guò)修飾序列表序列1所代表的氨基酸序列的一部分而得，(例如具有序列表序列2所代表的氨基酸序列的肽)，當(dāng)上述DNA插入到被重組病毒或重組細(xì)菌表達(dá)的抗原蛋白基因中時(shí)，此肽序列便做為抗原蛋白的一部分被表達(dá)，然后在細(xì)胞中被加工，并被呈遞至HLA抗原，使誘導(dǎo)能識(shí)別相同細(xì)胞的CTL成為可能。
藥劑的劑量和給藥方法與通常的BCG疫苗的接種或給藥方法相同。
本發(fā)明參考下面的實(shí)施例進(jìn)行更具體地描述。但是，本發(fā)明并不限于這些。實(shí)施例1來(lái)自HST-2的Tc-HST-2應(yīng)答肽的提純和它們的鑒定將HST-2細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞/ml)接種于50ml含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(含2-mM谷氨酰胺，5×10-5M2ME，100單位/ml的青霉素，100μg/ml的鏈霉素和16mMNaHCO3)中，在175cm2塑料培養(yǎng)箱(產(chǎn)品目錄號(hào)No.3028由Falcon制造)中進(jìn)行接種，在37℃ 5％ CO2空氣存在下溫育4天。
溫育完成之后，棄去形成的上清液，殘余物用PBS(-)洗滌。然后將20ml的0.1％TFA溶液加于其中，混合物于4℃培養(yǎng)30分鐘。與HLA結(jié)合的肽從HLA分子中釋放。被釋放的與HLA結(jié)合的肽以10000g離心15分鐘以分離出其中的細(xì)胞殘余物。
20毫升由培養(yǎng)上述HST-2得到的與HLA結(jié)合的肽溶液被凍干，并溶解在5ml 0.1％TFA溶液中。將一毫升這種與HLA結(jié)合的肽溶液用反相HPLC柱(μBONDS HERE；5μC18-300A，19mm×150mm)處理。反相HPLC柱提前用含0.1％TFA蒸餾水平衡，然后目的物質(zhì)用0.1％TFA中的濃度從0至80％呈線性增加的乙腈進(jìn)行洗脫。以1ml/min的流速進(jìn)行該過(guò)程。每次以1ml的量收集洗脫液。
上述程序共重復(fù)10次。收集具有相同保留時(shí)間的級(jí)分，凍干。在上述方法中HPLC洗脫圖形中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。在

圖1示出HPLC的洗脫圖形。
如下方法測(cè)定抗Tc-HST-2細(xì)胞的HPLC洗脫級(jí)分的CTL誘導(dǎo)性。即表達(dá)HLA-A31抗原的1×106↑HST-2或KG-1細(xì)胞做為靶細(xì)胞被懸浮在10％含F(xiàn)CS的RPIM培養(yǎng)基中，細(xì)胞數(shù)達(dá)1×107個(gè)細(xì)胞/ml。100μl含51Cr的鉻酸鈉和PBS混合物被加入至該懸浮液中，得到的混合物于37℃在5％CO2的存在下溫育3小時(shí)用于51Cr標(biāo)記。51Cr標(biāo)記的細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞)懸浮在100μl溶液中。將含HPLC分離的與HLA結(jié)合的肽的3微升溶液加入其中，混合物進(jìn)一步在相同的條件下溫育3小時(shí)，由此與HLA結(jié)合的肽結(jié)合至HLA分子上。
接著，Tc-HST-2細(xì)胞(2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml)以100μl的量加入其中，混合物在相同條件下溫育12小時(shí)，12小時(shí)溫育之后，收集形成的100μl的上清液，使用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定在此上清液中釋放的51Cr的放射活性，以測(cè)定CTL活性。
使用下式計(jì)算特異性細(xì)胞毒性。
特異性毒性＝(每孔測(cè)定值-最小釋放值)/
(最大釋放值-最小釋放值)×100其中最小釋放值指每孔單獨(dú)充滿靶細(xì)胞的測(cè)定值和從靶細(xì)胞自然釋放的51Cr值最大釋放值指當(dāng)將表面活性劑1％TritonX-100加入到靶細(xì)胞中，細(xì)胞被破壞時(shí)的釋放值。
結(jié)果示于圖2。如圖2清楚所示，在從HPLC洗脫的第12個(gè)級(jí)分中觀察到CTL誘導(dǎo)性。
Tc-HST-2的CTL誘導(dǎo)性被測(cè)出的第12個(gè)級(jí)分進(jìn)一步用反相HPLC柱(μBONDS HERE，5μC18-300A，19mm×150mm)處理。反相HPLC柱提前用含0.1％TFA的蒸餾水平衡。然后目標(biāo)物質(zhì)以0.1％TFA中濃度從0至40％線性增加的乙腈洗脫劑洗脫。以1ml/min流速進(jìn)行此過(guò)程。以每次1ml的量收集洗脫液。
上述方法總共重復(fù)10次。顯示相同保留時(shí)間的級(jí)分被收集并凍干。在上述方法HPLC的洗脫圖形中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異的區(qū)別。圖3示出HPLC的洗脫圖形。
用上述方法測(cè)定HPLC洗脫級(jí)分中Tc-HST-2的CTL誘導(dǎo)性。圖4顯示出結(jié)果。從圖4清楚得知，CTL誘導(dǎo)性在從HPLC洗脫的第17個(gè)級(jí)分被測(cè)出。CTL誘導(dǎo)性被測(cè)出的第17個(gè)級(jí)分用反相HPLC柱分離，用于分析(ZORBAX，ODS柱，4mm×250mm)。反相HPLC柱提前用含0.1％TFA的蒸餾水平衡，然后目標(biāo)物質(zhì)通過(guò)0.1％TFA中濃度為0至60％線性增加的乙腈來(lái)洗脫，以1ml/min的流速進(jìn)行該過(guò)程，以得到一主峰。
此峰被取出，并被輸入至蛋白質(zhì)序列儀(477A，由ABI制造)。氨基酸序列由Edman降解法測(cè)定。從N-末端開(kāi)始的氨基酸序列由序列表序列1代表。實(shí)施例2胃腫瘤抗原肽的合成和CTL誘導(dǎo)性的測(cè)定。
具有序列表序列1所代表的相同氨基酸序列的合成肽1和從合成肽1N-末端起含9個(gè)至7個(gè)氨基酸的三種類型的肽，即，肽1-9(具有序列表序列2代表的氨基酸序列的肽)，肽1-8(具有序列表序列3代表的氨基酸序列的肽)，肽1-7(具有序列表序列4代表的氨基酸序列的肽)用自動(dòng)肽合成儀(477A，由ABI制造)根據(jù)相同機(jī)器手冊(cè)中的說(shuō)明被合成。
這些合成肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，用TFA與無(wú)水乙醚的混合物再沉淀。用反相HPLC鑒定為單一組分，并用質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定。接著，用釋放TNF的方法對(duì)它們進(jìn)行CTL分析。
表達(dá)HLA-A31抗原的1×104HST-2細(xì)胞做為靶細(xì)胞懸浮在100μl溶液中，將上述四種肽每種5μl加入其中以至終濃度達(dá)10μM，1μM或0.1μM?；旌衔镞M(jìn)一步在相同的條件下溫育3小時(shí)，以便將與HLA結(jié)合的肽結(jié)合至HLA分子。然后，Tc-HST-2細(xì)胞(1×106細(xì)胞數(shù)/ml)以100μl的量被加入其中，得到的混合物在相同條件下被進(jìn)一步溫育12小時(shí)。
12小時(shí)溫育之后，收集形成的30μl上清液，測(cè)定上清液釋放的TNF活性以檢測(cè)CTL誘導(dǎo)性。TNF活性用下面的方法測(cè)得。
對(duì)TNF敏感的7×104Wehi 164細(xì)胞懸浮在120μl溶液中，并加入30μl上述上清液，將混合物溫育24小時(shí)。溫育完成之后，每孔加入10μl 5mg/ml的MTT，混合物進(jìn)一步溫育3小時(shí)。接著，將含0.01％鹽酸的150μl丙醇加入其中以溶解在溫育過(guò)程中形成的甲。然后，在570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度以測(cè)定TNF活性。
結(jié)果顯示在圖5。如圖5清楚所示，在合成肽1和1-9中鑒定Tc-HST-2的CTL誘導(dǎo)性。實(shí)施例3人MKN 28胃癌細(xì)胞株中胃癌抗原肽的表達(dá)為了鑒定由Tc-HST-2識(shí)別的胃癌抗原肽在除HSF2外的胃癌細(xì)胞株中是否被表達(dá)，通過(guò)51Cr釋放法檢測(cè)由Tc-HST-2所給的對(duì)MKN28的細(xì)胞毒性，MKN 28是HLA-A31-陰性的人胃癌細(xì)胞株。用51Cr釋放法進(jìn)行的CTL活性檢測(cè)如實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行。結(jié)果顯示在圖6。Tc-HST-2對(duì)不表達(dá)HLA-A31的MKN 28細(xì)胞沒(méi)有顯出細(xì)胞毒性。另一方面，Tc-HST-2對(duì)MKN 28 A31(+)C1-2和MKN 28A31(+)C1-5表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性，它們是通過(guò)電穿孔法由轉(zhuǎn)染含HLA-A31基因的PBJ-A31質(zhì)粒至MKN28中，以表達(dá)HLA-A31而形成的MNK28亞系，如圖6所示。
從上述結(jié)果中可鑒定出，Tc-HST-2識(shí)別的胃癌抗原肽也可在MKN28中表達(dá)，此肽結(jié)合至HLA-A31分子上并由Tc-HST-2識(shí)別。
本發(fā)明的肽能在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)對(duì)人胃癌細(xì)胞的CTL，并且此肽本身和含此肽的藥劑能被期望做為預(yù)防或治療人胃癌的藥劑。而且，含具有編碼該肽DNA的重組體的病毒或細(xì)菌做為預(yù)防或治療人胃癌的疫苗，顯示出非常滿意的藥效，其中肽能在體內(nèi)或體外誘導(dǎo)針對(duì)人胃癌細(xì)胞的CTL。序列表序列1序列長(zhǎng)度10序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性序列類型肽來(lái)源人序列Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ser Cys Trp Ile1 5 10序列2序列長(zhǎng)度9序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性序列類型肽來(lái)源人序列Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ser Cys Trp1 5序列3序列長(zhǎng)度8序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性序列類型肽來(lái)源人序列Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ser Cys1 5序列4序列長(zhǎng)度7序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性序列類型肽來(lái)源人序列Tyr Ser Trp Met Asp Ile Ser1 5
圖1是來(lái)自HST-2胃癌細(xì)胞的與HLA結(jié)合的肽在反相HPLC柱中的洗脫曲線。圖1中，直線表示乙腈濃度，曲線表示每個(gè)濃度在OD210的吸光度。
圖2表示使用來(lái)自HST-2的與HLA結(jié)合的肽時(shí)，Tc-HST-2的特異性細(xì)胞毒性的曲線圖。
○指當(dāng)用HST-2時(shí)的特異性細(xì)胞毒性。
◆指當(dāng)用HLA-A31-陽(yáng)性KG-1細(xì)胞做為靶細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞毒性。進(jìn)行所有的試驗(yàn)以使靶細(xì)胞與CTL的比例是1∶100。
圖3是圖2中顯示CTL誘導(dǎo)性的第12個(gè)級(jí)分反相HPLC洗脫曲線。圖3中，直線指乙腈濃度，曲線指在OD210的每個(gè)濃度的吸光度。
圖4是顯示當(dāng)使用來(lái)自HST-2的與HLA結(jié)合的肽時(shí)，Tc-HST-2的特異性細(xì)胞毒性曲線。
□指當(dāng)使用HST-2做為靶細(xì)胞時(shí)特異性細(xì)胞毒性?！糁府?dāng)使用HLAA31陽(yáng)性CCRF-CEM細(xì)胞做為靶細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞毒性。進(jìn)行所有的試驗(yàn)，靶細(xì)胞對(duì)CTL的比例是1∶100。
圖5是顯示當(dāng)使用肽1(由序列表序列1代表的肽)、肽1-9(序列表序列2代表的肽)、肽1-8(序列表序列3代表的肽)和肽1-7(序列表序列4代表的肽)時(shí)，由TNF釋放法測(cè)定的Tc-HST-2的CTL誘導(dǎo)性的曲線圖。
對(duì)TNF敏感的Wehi細(xì)胞通過(guò)TNF釋放而被損傷，通過(guò)殘留細(xì)胞進(jìn)行的MTT的摻入量減少。肽濃度是10mM，1mM和0.1mM。在所有試驗(yàn)中，HST-2用做靶細(xì)胞，靶細(xì)胞對(duì)CTL的比例是1∶100。
■指當(dāng)加入肽1時(shí)的細(xì)胞毒性，□指當(dāng)加入肽1-9時(shí)的細(xì)胞毒性，△指當(dāng)加入肽1-8的細(xì)胞毒性?！鹬府?dāng)加入肽1-7時(shí)的細(xì)胞毒性。虛線指當(dāng)沒(méi)加入肽時(shí)的細(xì)胞毒性。
圖6是顯示當(dāng)使用MKN28A31(+)c1-2細(xì)胞和MKN28A31(+)c1-5細(xì)胞時(shí)的Tc-HST-2的細(xì)胞毒性圖，其中MKN28A31(+)c1-2和MKN28A31(+)c1-5是通過(guò)人工表達(dá)HLA-A31和親代MKN28的胃癌細(xì)胞而得的亞系。進(jìn)行所有的試驗(yàn)，靶標(biāo)細(xì)胞與CTL的比例是1∶100。
權(quán)利要求
1 一種肽，它是存在于人胃癌細(xì)胞中的胃癌抗原蛋白片斷，所述片斷被結(jié)合至HLA分子上并能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
2 權(quán)利要求1的肽，其中HLA分子是HLA-A31。
3 權(quán)利要求1的肽，其中所述的肽具有序列表序列1代表的氨基酸序列。
4 權(quán)利要求1的肽，它具有的氨基酸序列是通過(guò)修飾序列表序列1代表的氨基酸序列的一部分而得到的，以使所述肽能夠誘導(dǎo)更有效的以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
5 權(quán)利要求4的肽，它具有序列表序列2代表的氨基酸序列。
6 一種預(yù)防或治療人胃癌的藥劑，所述藥劑含有一種肽，該肽是存在于人胃癌細(xì)胞的胃癌細(xì)胞抗原蛋白質(zhì)片斷，所述片斷被結(jié)合至HLA分子上并能誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
7 權(quán)利要求6的藥劑，其中HLA分子是，HLA-A31。
8 權(quán)利要求6的藥劑，其中所述的肽具有序列表序列1或2代表的氨基酸序列。
9 一種編碼權(quán)利要求1或4的肽的DNA。
10 一種編碼權(quán)利要求3或5的肽的DNA。
11 一種預(yù)防或治療人胃癌的疫苗，所述疫苗包含具有權(quán)利要求9或10的DNA的重組病毒或重組細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對(duì)人胃癌誘導(dǎo)有效CTL的肽。具有特定氨基酸序列的肽誘導(dǎo)以胃癌細(xì)胞為靶的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因此，此肽被期望做為預(yù)防或治療胃癌的藥劑。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1158856SQ9612119
公開(kāi)日1997年9月10日 申請(qǐng)日期1996年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月29日
發(fā)明者菊地浩吉, 佐藤升志, 佐原弘益, 八十島孝博, 和田好正, 鈴木學(xué), 羽室淳爾 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社, 菊地浩吉