專利名稱：人腫瘤壞死因子δ和ε的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明部分涉及新鑒定的多核苷酸和多肽，所述多核苷酸和多肽的變體和衍生物，制備所述多核苷酸和多肽及其變體和衍生物的方法，所述多肽的興奮劑和拮抗劑，以及所述多核苷酸、多肽、變體、衍生物、興奮劑和拮抗劑的應(yīng)用。具體地，在這些方面及其他方面，本發(fā)明涉及人腫瘤壞死因子δ和ε，以下有時(shí)稱作“TNFδ”和“TNFε”。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β(TNF-β或淋巴細(xì)胞毒素)是一大類多肽介體的相關(guān)成員，這些多肽介體包括干擾素、白介素和生長(zhǎng)因子，總稱為細(xì)胞因子(Beutler,B.And Cerami,A.,Annu.Rev.Immunol.,7:625-655,1989)。
最初腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)是由于其抗腫瘤活性而發(fā)現(xiàn)的。然而，現(xiàn)在它被看作是一個(gè)具有多種活性的多效性細(xì)胞因子，這些活性包括某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的細(xì)胞編程性死亡，細(xì)胞活化和增殖的介導(dǎo)以及在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中起重要作用。
至今，有9種已知的TNF配體超家族成員，TNF-α、TNF-β(淋巴細(xì)胞毒素α)、LT-β、OX40L、FASL、CD30L、CD27L、CD40L和4-1BBL。所述的TNF配體超家族的配體是酸性的類似TNF的分子，其在胞外功能域中約有20％序列同源性(范圍12％-36％)并主要以膜結(jié)合形式存在，生物學(xué)活性形式是三聚體/多聚體復(fù)合物。TNF配體超家族的可溶形式目前僅鑒定出TNF、LTα和FASL(綜述見(jiàn)Gruss,H.And Dower,S.K.,Blood,85(12):3378-3404(1995)，該文引入本文作參考)。
這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞增殖、活化和分化的調(diào)節(jié)，如通過(guò)細(xì)胞編程性死亡或細(xì)胞毒性控制細(xì)胞存活或死亡(Armitage,R.J.,Curr.Opin.Immunol.,6:407(1994)和Smith,C.A.,Cell,75:959,1994)。
TNF可由許多細(xì)胞類型、包括單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞(NK)并主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。已經(jīng)有人報(bào)道TNF-α在腫瘤的快速壞死、免疫刺激、自身免疫疾病、移植排斥、抵抗寄生蟲(chóng)、產(chǎn)生抗病毒應(yīng)答、敗血休克、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮效應(yīng)和代謝效應(yīng)中起作用。TNF-α還激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞分泌各種因子，包括PAI-1、IL-1、GM-CSF和IL-6來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，TNF-α正調(diào)節(jié)各種細(xì)胞粘附分子如E-選擇因子、ICAM-1和VCAM-1。
誘導(dǎo)由TNF配體超家族成員介導(dǎo)的各種細(xì)胞應(yīng)答的第一步是它們與特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合。TNF受體超家族含有10個(gè)目前已知的膜蛋白和編碼TNFR相關(guān)分子的幾個(gè)病毒開(kāi)放讀框。p75低親和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)受體是這一家族中第一個(gè)克隆到的受體(Johnson,D．等，細(xì)胞，47:545(1986))。后來(lái)克隆到兩個(gè)TNF特異性受體，顯示出它們與NGF受體相關(guān)(Loetscher,H．等，細(xì)胞，61:351(1990))。近幾年來(lái)已建立了一個(gè)新的Ⅰ型轉(zhuǎn)膜TNF受體超家族，這一家族包括p75神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體，p60TNFR-Ⅰ,p80TNFR-Ⅱ,TNFR-RP/TNFR-Ⅲ,CD27,CD30,CD40,4-1BB,OX40和FAS/APO-1。另外，已鑒定了幾種編碼可溶TNF受體的病毒開(kāi)放讀框，如兔纖維瘤病毒中的SFV-T2(Smith,C.A.等，生物化學(xué)生物物理研究通訊，176:335,1991)和痘苗病毒中的Va53或SaIF19R(Howard,S.T.，病毒學(xué)，180:633,1991)。這些受體的特征在于在胞外(氨基末端)功能域有多個(gè)富半胱氨酸功能域，它們參與配體結(jié)合。人家族成員間的富半胱氨酸胞外區(qū)的平均同源性為25-30％。
很明顯，目前需要調(diào)節(jié)正常和異常細(xì)胞的活化和分化的因子，因此也需要鑒定這種調(diào)節(jié)正常和病態(tài)細(xì)胞活化和分化的因子。特別是需要分離和鑒定控制轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的細(xì)胞編程性死亡、介導(dǎo)細(xì)胞活化和增殖并且作為免疫調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答的初級(jí)介導(dǎo)物起作用的、以及在預(yù)防、消滅或校正機(jī)能失調(diào)或疾病中起作用的與TNF配體超家族同族的其他TNF配體。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的多肽，稱為新的TNFδ和TNFε，根據(jù)

圖1和圖2的氨基酸序列與腫瘤壞死因子家族其他蛋白如人TNFα和TNFβ的已知氨基酸序列之間的同源性，本發(fā)明的多肽已被推斷鑒定為腫瘤壞死因子配體。
根據(jù)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的相似性，已經(jīng)鑒定本發(fā)明的多肽是TNF配體超家族的一個(gè)新成員。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼TNFδ和TNFε的多核苷酸，特別是編碼本文稱作TNFδ和TNFε的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明這一方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多核苷酸包括編碼圖1和圖2所示序列的人TNFδ和TNFε的區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了編碼人TNFδ的分離的核酸分子，包括mRNA,DNA,cDNA，基因組DNA及在本發(fā)明這一方面的另一些實(shí)施方案中的生物學(xué)、診斷學(xué)、臨床或治療上有用的變體、類似物或其衍生物，或其片段，包括變體、類似物和衍生物的片段。
在本發(fā)明的這一方面的特別優(yōu)選實(shí)施方案是人TNFδ和TNFε的天然存在的等位基因變體。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了編碼人的成熟TNF多肽和人的成熟TNFε多肽的分離的核酸分子，所述TNFδ多肽由1995年12月8日保藏的ATCC保藏號(hào)97377所含的人cDNA表達(dá)，所述TNFε多肽由1996年3月1日保藏的ATCC保藏號(hào)97457所含的人cDNA表達(dá)。
本發(fā)明的另一目的是提供能破壞某些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系、介導(dǎo)細(xì)胞活化和增殖并且作為免疫調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答的初級(jí)介導(dǎo)物起作用的TNFδ多肽，特別是人TNFδ和TNFε多肽。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了人源的新的多肽，本文稱作TNFδ和TNFε，及其生物學(xué)、診斷學(xué)或治療上有用的片段、變體和衍生物，所述片段的變體和衍生物以及前述物質(zhì)的類似物。
本發(fā)明的這一方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方案是由人TNFδ和TNFε基因的天然存在的等位基因編碼的人TNFδ和TNFε變體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)上述多肽、多肽片段、變體和衍生物、變體和衍生物的片段以及類似物的方法。在本發(fā)明這一方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了生產(chǎn)上述TNFδ和TNFε多肽的方法，包括在用于在宿主中表達(dá)人TNFδ和TNFε的條件下培養(yǎng)已以可表達(dá)方式摻入了外源衍生的編碼人TNFδ的多核苷酸和編碼TNFε的多核苷酸的宿主細(xì)胞，然后回收表達(dá)的多肽。
本發(fā)明的再一目的是使用上述多肽和多核苷酸用于研究、生物學(xué)、臨床學(xué)和治療目的的產(chǎn)物、組合物和方法。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了如下的產(chǎn)物、組合物和方法，所述的產(chǎn)物、組合物和方法用于通過(guò)測(cè)定TNFδ和TNFε多肽或編碼TNFδ或TNFε的mRNA而評(píng)估TNFδ和TNFε在細(xì)胞中的表達(dá)；分析TNFδ和TNFε基因中的遺傳變異和異常如缺陷；以及將TNFδ或TNFε多肽或多核苷酸給予生物體以增強(qiáng)TNFδ或TNFs功能或補(bǔ)償TNFδ或TNFε的功能時(shí)常。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了與人TNFδ或TNFε序列雜交的多核苷酸特別是探針。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了抗TNFδ或TNFε多肽的抗體，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是針對(duì)人TNFδ或TNFε高度選擇性的。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了TNFδ或TNFε興奮劑，優(yōu)選的興奮劑是模擬TNFδ或TNFε、與TNFδ結(jié)合分子或受體分子、或者TNFε結(jié)合分子或受體分子結(jié)合的、并激發(fā)或增強(qiáng)TNFδ誘導(dǎo)的或TNFε誘導(dǎo)的應(yīng)答的分子。優(yōu)選的興奮劑還包括與TNFδ和TNFε或TNFδ和TNFε多肽、或者TNFδ活性的其他調(diào)節(jié)物相互作用從而加強(qiáng)或增強(qiáng)TNFδ和TNFε的一種或一種以上作用的分子。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了TNFδ和TNFε拮抗劑。優(yōu)選的拮抗劑是那些模擬TNFδ和TNFε從而與TNFδ和TNFε受體或結(jié)合分子結(jié)合但不引發(fā)一種或一種以上TNFδ和TNFε誘導(dǎo)的應(yīng)答的分子。優(yōu)選的拮抗劑還包括與TNFδ和TNFε結(jié)合或相互作用從而抑制TNFδ和TNFε的一種或一種以上作用或阻止TNFδ和TNFε的表達(dá)的分子。
興奮劑和拮抗劑可以用于模擬、增強(qiáng)或抑制TNFδ和TNFε多肽的作用，例如它們可用于防止敗血休克、炎癥、腦瘧疾、HIV病毒的活化、移植宿主排斥、骨骼再吸附、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了用于體外給予細(xì)胞、來(lái)自體內(nèi)給予細(xì)胞及體內(nèi)給予細(xì)胞或給予多細(xì)胞生物體的包括TNFδ和TNFε多核苷酸或TNFδ和TNFε多肽的組合物。在本發(fā)明這一方面的某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括用于在宿主生物體中表達(dá)TNFδ和TNFε多肽以治療疾病的TNFδ和TNFε多核苷酸。這一點(diǎn)上特別優(yōu)選的是在人類患者中表達(dá)以治療與TNFδ和TNFε的異常內(nèi)源性活性相關(guān)的功能失調(diào)。
本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和方面經(jīng)如下描述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。然而應(yīng)理解的是以下描述和特異性實(shí)施例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，但僅僅是舉例給出。通過(guò)閱讀下面的描述及閱讀本文的其他部分，在所披露的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
附圖的簡(jiǎn)要描述下述附圖描述了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，它們僅僅是描述性的而非限制本文所披露的發(fā)明。
圖1示出了人TNFδ的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖2示出了人TNFε的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖3示出了TNFα、TNFβ、TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列之間的相似性區(qū)域(序列對(duì)比報(bào)告)。
圖4示出了由所示技術(shù)推導(dǎo)的TNFδ的結(jié)構(gòu)和功能特征，其是氨基酸序列的功能。
圖5示出了由所示技術(shù)推導(dǎo)的TNFε的結(jié)構(gòu)和功能特征，其是氨基酸序列的功能。
下述示意性解釋用于促進(jìn)對(duì)本文特別是實(shí)施例中常用的某些術(shù)語(yǔ)的理解，該解釋是為方便而提供并非對(duì)本發(fā)明的限制。
術(shù)語(yǔ)DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的某些序列的限制性內(nèi)切酶催化裂解DNA，本文所指的各種限制性內(nèi)切酶是可商購(gòu)的并且其反應(yīng)條件、輔因子和其他應(yīng)用需求是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且是常規(guī)的。
為進(jìn)行分析，典型地是用約2單位酶在約20微升反應(yīng)緩沖液中消化1微克質(zhì)?；駾NA片段。為分離DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，典型地用20-250單位酶在成比例放大的體積中消化5-50微克DNA。
用于特定限制性內(nèi)切酶的合適的緩沖液和底物量在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中有描述，例如見(jiàn)下述，它們也由供應(yīng)商提供。
通常使用在37℃1小時(shí)的保溫時(shí)間，但是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序、供應(yīng)商指導(dǎo)及反應(yīng)細(xì)節(jié)改變條件。消化后，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分析反應(yīng)并用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化片段。
術(shù)語(yǔ)“遺傳元件”通常指這樣一種多核苷酸，其包括編碼一種多肽的區(qū)域或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯或?qū)τ谠摱嚯脑谒拗骷?xì)胞中的表達(dá)很重要的其他過(guò)程的區(qū)域，或者這樣一種多核苷酸，其包括編碼多肽的區(qū)域和與其可操作連接的調(diào)節(jié)表達(dá)的區(qū)域。
遺傳元件可以包括在作為游離元件復(fù)制的載體中，即作為與宿主細(xì)胞基因組生理上獨(dú)立的分子。它們可以包含在微型染色體中，如那些當(dāng)用氨甲蝶呤在真核細(xì)胞中篩選進(jìn)行轉(zhuǎn)染DNA的擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)的微型染色體。遺傳元件也可包括在宿主細(xì)胞基因組中，但不是以其天然狀態(tài)而是在諸如分離、克隆和導(dǎo)入宿主細(xì)胞等操作后以純DNA形式或載體形式包括在宿主細(xì)胞基因組中。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指“經(jīng)人工”從其天然狀態(tài)而改變，即假如其在自然中發(fā)生，那么其已從其原始環(huán)境變化或脫離出，或者兩者都發(fā)生。例如，以天然狀態(tài)天然存在于活體動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)中分離出的相同多核苷酸或多肽是“分離的”。例如，對(duì)于多核苷酸來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)分離的是指其從其天然存在的染色體和細(xì)胞中分離出。
作為分離的一部分或在分離后，這種多核苷酸可與其它用于誘變的多核苷酸連接在一起形成融合蛋白，以及用于繁殖或在宿主中表達(dá)。分離的多核苷酸單獨(dú)或與其它多核苷酸如載體連接在一起可被導(dǎo)入培養(yǎng)的或整個(gè)生物體的宿主細(xì)胞中，導(dǎo)入后這種DNA仍然是分離的，因?yàn)樗鼈儾惶幱谄涮烊话l(fā)生的形式或環(huán)境。
類似地，多核苷酸和多肽可形成組合物，如作為培養(yǎng)基配制品、溶液以將多核苷酸或多肽導(dǎo)入細(xì)胞，以及作為化學(xué)或酶反應(yīng)的組合物或溶液(其不是天然發(fā)生的組合物)，在這些組合物中仍保持分離的多核苷酸或多肽。
術(shù)語(yǔ)“連接”是指在兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸之間、通常是雙鏈DNA之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。連接技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，連接方案在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和參考書(shū)中均有描述，例如參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)和Maniatis等，第146頁(yè)，見(jiàn)下述。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指相對(duì)較短的多核苷酸，通常該術(shù)語(yǔ)是指單鏈脫氧核糖核苷酸，但是其也可指單鏈或雙鏈核糖核苷酸，RNADNA雜合子和雙鏈DNA。
寡核苷酸如單鏈DNA探針寡核苷酸通常由化學(xué)方法合成，如那些手工或自動(dòng)寡核苷酸合成儀。然而也可用各種其它方法制備寡核苷酸，如體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)及在細(xì)胞和生物體內(nèi)表達(dá)DNA。
最初，典型的是得到無(wú)5’磷酸的化學(xué)合成的DNA。這種寡核苷酸的5’末端不是采用形成重組DNA分子的DNA連接酶的連接反應(yīng)形成磷酸二酯鍵的底物。當(dāng)需要連接這種寡核苷酸時(shí)，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如采用激酶和ATP加上磷酸。
化學(xué)合成的寡核苷酸的3’末端通常具有游離羥基，在連接酶如T4DNA連接酶存在下可以容易地與另一個(gè)多核苷酸如另一個(gè)寡核苷酸的5’磷酸形成磷酸二酯鍵。正如所公知的，當(dāng)需要時(shí)可通過(guò)在連接前除去另一個(gè)多核苷酸的5’磷酸而選擇性地防止這一反應(yīng)。
本文中的質(zhì)粒通常是根據(jù)本領(lǐng)域人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)命名原則以在前的小寫(xiě)p和/或接著的大寫(xiě)字母和/或數(shù)字命名。本文的起始質(zhì)粒是可商購(gòu)的，可由公眾不受限制地獲得的，或者可以根據(jù)公知的公布的程序從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。根據(jù)本發(fā)明可使用的許多質(zhì)粒和其它克隆和表達(dá)載體是本領(lǐng)域人員公知的和容易獲得的。另外，本領(lǐng)域人員可以容易地構(gòu)建出適用于本發(fā)明的其它質(zhì)粒。本發(fā)明中的這些質(zhì)粒和其它載體的性質(zhì)、構(gòu)建和應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域人員根據(jù)本文的披露是顯而易見(jiàn)的。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的RNA或DNA或是修飾的RNA或DNA。因此，例如，本文所用的多核苷酸是指單鏈和雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的RNA，包含DNA或RNA的雜合分子，所述的雜合分子可以是單鏈的或典型地是雙鏈的，或者是單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。另外，本文所用的多核苷酸也指包含RNA或DNA或者RNA和DNA的三鏈區(qū)，這種區(qū)域的鏈可以來(lái)自相同或不同的分子。這種區(qū)域可以包括一或多個(gè)這種分子的全部，但更典型地是僅涉及這種分子的一個(gè)區(qū)域。三螺旋區(qū)的分子通常是一種寡核苷酸。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)多核苷酸包括含有一或多個(gè)修飾堿基的如上所述的DNA或RNA。因此，具有為穩(wěn)定性或其它原因而修飾的骨架的DNA或RNA也是本文的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”所意在包括的。另外包含非通用堿基如肌苷或修飾的堿基如三苯甲基化堿基的DNA或RNA也屬于本文所定義的多核苷酸。
應(yīng)理解的是已對(duì)DNA和RNA作了許多修飾以滿足本領(lǐng)域公知的各種目的。本文所用術(shù)語(yǔ)多核苷酸包含這些多核苷酸的化學(xué)、酶學(xué)或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞包括簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞的特征性DNA和RNA的化學(xué)形式。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”包括下述所有多肽。多肽的基本結(jié)構(gòu)是公知的并已在無(wú)數(shù)教科書(shū)和現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中描述。根據(jù)這一點(diǎn)，本文所用的這一術(shù)語(yǔ)是指任何包括以肽鍵連接成線性鏈的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。如本文所用的，該術(shù)語(yǔ)指短鏈，例如通常在現(xiàn)有技術(shù)中稱為肽、寡肽和寡聚物，也指較長(zhǎng)的鏈，通常在現(xiàn)有技術(shù)中稱為蛋白質(zhì)，其有各種類型。
應(yīng)理解的是多肽通常含有不同于20個(gè)天然存在的氨基酸的氨基酸，并且在一給定多肽中許多氨基酸包括末端氨基酸均可被修飾，可通過(guò)天然過(guò)程修飾，如加工和其它翻譯后修飾，但也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。即使是在多肽中天然發(fā)生的通常修飾種類也太多而不能在此一一列出，但是在基本教科書(shū)、專著、各種研究文獻(xiàn)中均有描述，并且其是本領(lǐng)域人員公知的。在本發(fā)明多肽中可能存在的公知修飾中，舉例性地有乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)附著、血紅素基元共價(jià)附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂類或脂類衍生物的共價(jià)附著、磷酯酰肌醇的共價(jià)附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、共價(jià)交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；ⅵ?羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白裂解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒?；?、硫化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加如精氨?；捅樵诘鞍谆?br> 這種修飾對(duì)本領(lǐng)域人員來(lái)說(shuō)是公知的并在科學(xué)文獻(xiàn)中有詳述。例如，幾種特別通用的修飾如糖基化、脂類附著、硫化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化及ADP-核糖基化在最基本的教科書(shū)中有描述，例如參見(jiàn)蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子特性，第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company，紐約(1993)。關(guān)于這一主題的更詳細(xì)綜述例如參見(jiàn)Wold,F.，翻譯后蛋白修飾前景和展望，第1-12頁(yè)，蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾，B.C.Johnson編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1983),Seifter等，蛋白修飾分析和非蛋白輔因子，酶學(xué)方法182:626-646(1990),Rattan等，蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和成熟，Ann.N.Y.Acad.Sci.,663:48-62(1992)。
應(yīng)理解的是，正如公知的及如上所述，多肽并不總是完全線性的，例如多肽可由于遍在蛋白化而有分支，其也可以因翻譯后事件如天然加工事件以及非天然發(fā)生的由人工操作而導(dǎo)致的事件而環(huán)化，有或沒(méi)有分支。環(huán)化、分支以及分支環(huán)化多肽可通過(guò)非翻譯天然過(guò)程合成，也可通過(guò)完全合成方法合成。
修飾可發(fā)生在多肽中的任何地方，如肽骨架、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。事實(shí)上經(jīng)共價(jià)修飾而阻斷多肽中的氨基或羧基是天然和合成多肽中最普遍的，這種修飾也可存在于本發(fā)明的多肽中。例如，在蛋白裂解加工前在大腸桿菌中制備的多肽的氨基末端殘基幾乎均是N-甲酰甲硫氨酸。
發(fā)生在多肽中的修飾經(jīng)常是其制備的結(jié)果，例如對(duì)于在宿主中表達(dá)克隆基因而制備的多肽，修飾的性質(zhì)和程度很大程度上取決于宿主細(xì)胞翻譯后修飾能力及存在于多肽氨基酸序列中的修飾信號(hào)。例如，正如公知的，通常在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中不發(fā)生糖基化，因此當(dāng)需要糖基化時(shí)，應(yīng)在糖基化宿主，通常為真核細(xì)胞中表達(dá)多肽。昆蟲(chóng)細(xì)胞通常進(jìn)行與哺乳細(xì)胞相同的翻譯后糖基化作用，因此，已開(kāi)發(fā)了昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以有效表達(dá)具有天然形式的糖基化的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。類似的考慮也適用于其它修飾。應(yīng)理解的是在一給定的多肽中，在幾個(gè)位點(diǎn)可以存在相同或不同程度的同種修飾。另外，一種多肽可以含有多種修飾。通常，本文所用術(shù)語(yǔ)多肽包含所有修飾，特別是那些存在于由在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽而合成的多肽中的修飾。
術(shù)語(yǔ)多核苷酸或多肽的“變體”是指與參照多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。下面描述了這種意義上的變體，在本文它處有更詳細(xì)的描述。
多核苷酸變體是核苷酸序列與另一種參照多核苷酸不同的多核苷酸，通常這種不同是有限度的，參照多核苷酸和變體的核苷酸序列是整體上緊密相似的，并且在許多區(qū)域是相同的。如下所述，變體的核苷酸序列中的變化可能是沉默的，也就是說(shuō)它們不會(huì)改變由該多核苷酸編碼的氨基酸。當(dāng)改變僅限于這種沉默變化時(shí)，變體將編碼與參照相同氨基酸序列的多肽。另外還如下所述，變體核苷酸序列中的變化還可以改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列，這種核苷酸變化可導(dǎo)致由參照序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，見(jiàn)下述。
多肽變體是一種氨基酸序列與另一個(gè)參照多肽不同的多肽，通常這種不同是有限的，參照序列和變體序列在整體上是緊密相似的并且在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽氨基酸序列的不同可以是一或多個(gè)取代、添加、缺失、融合和截短，可以任何組合形式存在。
本文所用術(shù)語(yǔ)“受體分子”是指與本發(fā)明的TNFδ或TNFε多肽特異結(jié)合或相互作用的分子，不僅包括經(jīng)典的受體(其是優(yōu)選的)，也包括與本發(fā)明的多肽特異結(jié)合或相互作用的其它分子，其也稱作“結(jié)合分子”和“相互作用分子”，以及稱作“TNFδ結(jié)合分子”和“TNFδ相互作用分子”或“TNFε結(jié)合分子”和“TNFε相互作用分子”。本發(fā)明的多肽與這種分子如受體或結(jié)合或相互作用分子之間的結(jié)合對(duì)于本發(fā)明的多肽可以是唯一的(這是非常高度優(yōu)選的)，或者可以是高度特異于本發(fā)明多肽的(這是高度優(yōu)選的)，或者可以是高度特異于包括本發(fā)明的多肽的一組蛋白質(zhì)的(這是優(yōu)選的)，或者可以是特異于幾組蛋白質(zhì)的，其中至少一組包括本發(fā)明的多肽，本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及如下詳述的新的TNFδ和TNFε多肽和多核苷酸，本發(fā)明具體涉及由氨基酸序列同源性而與TNF配體超家族相關(guān)的多肽和多核苷酸。本發(fā)明特別涉及具有圖1所示核苷酸序列和氨基酸序列的TNFδ，以及ATCC保藏號(hào)97377中的人cDNA的TNF核苷酸序列和氨基酸序列。本發(fā)明還特別涉及具有圖2所示核苷酸序列和氨基酸序列的TNFε，以及ATCC保藏號(hào)97457中的人cDNA的TNFε核苷酸序列和氨基酸序列。以下稱保藏物為保藏克隆或“保藏克隆的cDNA”。應(yīng)理解的是圖1和圖2所示的核苷酸序列和氨基酸序列是通過(guò)測(cè)序保藏克隆的人cDNA而獲得。因此，當(dāng)兩者之間有偏差時(shí)，保藏克隆的序列是決定性的，并且引述圖1和圖2的序列包括引述保藏克隆的人cDNA的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼具有圖1和2推導(dǎo)的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽的分離的多核苷酸。
使用本文提供的信息如圖1所示的多核苷酸序列，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選程序獲得編碼人TNFδ多肽的本發(fā)明的多核苷酸，所述的程序例如那些用來(lái)自人組織細(xì)胞的mRNA作為起始材料克隆cDNA的程序。例如，圖1的多核苷酸在來(lái)源于人心臟組織細(xì)胞的cDNA的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。
如測(cè)序保藏克隆中的編碼人TNFδ的cDNA的結(jié)果所示，本發(fā)明的人TNFδ在結(jié)構(gòu)上與TNF配體超家族的其它蛋白相關(guān)，如此獲得的cDNA序列如圖1所示，其含有編碼約233個(gè)氨基酸殘基、推導(dǎo)分子量約25.871KDa的蛋白的開(kāi)放讀樞。在已知蛋白中該蛋白與TNFα具有最大同源性，圖1的TNFδ的完整氨基酸序列與TNFα的氨基酸序列約有38％相同性。
編碼人TNFε多肽的本發(fā)明的多核苷酸可以用標(biāo)準(zhǔn)克隆和篩選程序獲得，例如那些用來(lái)自人組織細(xì)胞的mRNA作為起始材料克隆cDNA的程序。舉例來(lái)說(shuō)，圖2的多核苷酸在來(lái)源于人心臟組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。
如測(cè)序保藏克隆中的編碼人TNFε的cDNA的結(jié)果所示，本發(fā)明的人TNFε在結(jié)構(gòu)上與TNF配體超家族的其它蛋白相關(guān)，如此獲得的cDNA序列如圖2所示。TNFε序列與圖1所示的TNFδ序列減去前50個(gè)氨基酸及TNFδ的第86-92位氨基酸區(qū)域后的序列基本相同。因此，TNFε是TNFδ的剪接變體。TNFε包含168個(gè)氨基酸殘基，圖2所示序列示出了不含N-末端疏水區(qū)的TNFε的成熟蛋白。該蛋白與TNFα有最大同源性，圖2的TNFε與TNFα的氨基酸序列有20％的相同性。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式如mRNA或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因組DNA，其通過(guò)克隆或由化學(xué)合成技術(shù)產(chǎn)生或由兩者結(jié)合產(chǎn)生。DNA可以是雙鏈或單鏈，單鏈DNA可以是編碼鏈(也稱為有義鏈)或非編碼鏈(反義鏈)。
編碼多肽的編碼序列可以相同于圖1和圖2顯示的多核苷酸的編碼序列或者可以是一個(gè)具有不同的編碼序列的多核苷酸，其中由于遺傳密碼的豐余或簡(jiǎn)并的結(jié)果，該不同的編碼序列編碼圖1和圖2的DNA編碼的多肽。
編碼圖1和圖2的多肽的本發(fā)明的多核苷酸包括，但不限于只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和附加編碼序列如編碼前導(dǎo)或分泌序列的序列，如前蛋白序列、蛋白原序列或前蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(包括或不包括前述附加編碼序列)和附加的非編碼序列，例如包括但不限于內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，如在轉(zhuǎn)錄、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷酸化信號(hào))、核糖體結(jié)合和mRNA的穩(wěn)定性等方面起重要作用的轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列；編碼如提供額外功能的附加的氨基酸的附加編碼序列。
因此，例如，多肽可以與促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記序列如一種肽融合。在本發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是六組氨酸肽，如由pQE載體(Qiager,Inc.)提供的標(biāo)記，這些均是可商購(gòu)的。如Gentz等，美國(guó)科學(xué)院院刊86:821-824(1989)所述，六組氨酸能方便地使融合蛋白純化。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于來(lái)源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一個(gè)表位，見(jiàn)Wilson等，細(xì)胞37:767(1984)所述。
如前所述，本文所用術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包含了包括編碼本發(fā)明的多肽、特別是具有圖1和圖2的氨基酸序列的人TNFδ和TNFε的序列的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了包括編碼多肽的單個(gè)連續(xù)區(qū)域或非連續(xù)區(qū)域(例如由內(nèi)含子間隔)及附加的也可含編碼和/或非編碼序列的區(qū)域的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上文中敘述的多核苷酸的變體，它編碼具有圖1和圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的片段，類似物和衍生物。多核苷酸的變體可以是天然存在的變體如天然存在的等位多核苷酸變體或多核苷酸的已知非天然存在的變體。多核苷酸的這種非天然存在的變體可以由誘變技術(shù)制備，如那些施加到多核苷酸、細(xì)胞或生物體上的誘變技術(shù)。
在這一點(diǎn)上變體是通過(guò)核苷酸取代、缺失或添加而與上述多核苷酸不同的變體，所述的取代、缺失或添加可以涉及一或多個(gè)核苷酸。變體可以在編碼區(qū)或非編碼區(qū)或兩個(gè)區(qū)域中發(fā)生改變。編碼區(qū)的改變可以產(chǎn)生保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。
關(guān)于這一點(diǎn)的本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼具有圖1和圖2的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，及其變體、類似物、衍生物和片段，以及變體、類似物和衍生物的片段。
在這一點(diǎn)上特別優(yōu)選的是這樣的多核苷酸，其編碼具有圖1和圖2的TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列的TNFδ和TNFε，其中有一些、幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、2或1個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失或添加，或者無(wú)氨基酸殘基被取代、缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變TNFδ和TNFε的性質(zhì)和活性的沉默取代、添加和缺失。在這一點(diǎn)上還特別優(yōu)選的是保守取代。最優(yōu)選的是編碼具有不含取代的圖1和圖2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是與編碼具有圖1和圖2的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽的多核苷酸具有至少70％相同性的多核苷酸以及與這種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸?；蛘?，最優(yōu)選的是包含與編碼TNFδ和TNFε多肽的多核苷酸至少有80％相同性的區(qū)域的多核苷酸以及與這種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在這一點(diǎn)上，特別優(yōu)選的是與其有至少90％相同性的多核苷酸，在這些特別優(yōu)選的多核苷酸中，具有至少95％相同性的多核苷酸是特別優(yōu)選的。另外，在95％相同性的多核苷酸中具有至少97％相同性的多核苷酸是高度優(yōu)選的，而這些當(dāng)中具有至少98％和至少99％相同性的多核苷酸是特別優(yōu)選的，而具有至少99％相同性的多核苷酸是更優(yōu)選的。
另外，在這一方面特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼基本保留了與圖1和圖2的cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能和活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及與本文上述序列雜交的多核苷酸，本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本文上述多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指當(dāng)序列間的堿基至少95％、優(yōu)選至少97％互補(bǔ)(例如G:C,A:T)時(shí)才發(fā)生雜交。
正如本文所討論的本發(fā)明的多核苷酸分析所示，例如，上述的本發(fā)明的多核苷酸可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針以分離編碼TNFδ和TNFε的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，以及分離與人TNFδ和TNFε基因具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因組克隆。這種探針通常包含至少15個(gè)堿基，優(yōu)選地，這種探針具有至少30個(gè)堿基，也可以具有至少50個(gè)堿基。
例如，TNFδ和TNFε基因的編碼區(qū)可以用已知DNA序列合成的寡核苷酸探針的篩選而分離。然后用與本發(fā)明的基因序列互補(bǔ)的標(biāo)記的寡核苷酸篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA的文庫(kù)以確定探針與文庫(kù)的哪些成員雜交。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作研究試劑和材料以發(fā)現(xiàn)人類疾病治療和診斷法，見(jiàn)如下關(guān)于多核苷酸分析的描述。
多核苷酸可以編碼這樣一種多肽，其是成熟蛋白加額外的氨基或羧基端氨基酸、或成熟多肽內(nèi)部的氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式具有一條以上多肽鏈時(shí))。這些序列可以在蛋白質(zhì)從前體加工至成熟形式中起作用，可以促進(jìn)蛋白運(yùn)輸，可以延長(zhǎng)或縮短蛋白質(zhì)半壽期或可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的操作以進(jìn)行分析或生產(chǎn)。通常是原位情形，額外的氨基酸可以通過(guò)細(xì)胞酶從成熟蛋白中加工去除。
多肽的成熟形式與一或多個(gè)原序列融合在一起的前體蛋白可以是多肽的非活性形式，當(dāng)原序列被除去時(shí)，這種未活化的前體通常被活化。在活化之前一些或全部原序列被除去。通常這種前體被稱為蛋白原。
總之，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，成熟蛋白加前導(dǎo)序列(其可被稱為前蛋白)，具有一或多個(gè)不是前蛋白的前導(dǎo)序列的原序列的成熟蛋白的前體，或者前蛋白原(其是蛋白原的前體，具有前導(dǎo)序列和一或多個(gè)原序列，其通常在加工步驟中被除去從而產(chǎn)生多肽的活性成熟形式)。
如上所述，含有人TNFδ和人TNFε cDNA的保藏物已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。另外還如上所述，所述的cDNA保藏物在本文被稱為“保藏克隆”或“保藏克隆的cDNA”。這些克隆分別于1995年12月8日和1996年3月1日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA，保藏號(hào)分別為ATCC 97377和97457。保藏材料是含有全長(zhǎng)TNFδ和TNFε人cDNA的pBluescript SK(-)質(zhì)粒(Stratagene,La Jolla,CA)。
保藏物是根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行保藏。在授予專利權(quán)后菌株將不受限制地向公眾發(fā)放。保藏物的提供僅是為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而非是對(duì)如根據(jù)35U.S.C.§112而為用于實(shí)施而索取保藏物的認(rèn)可。當(dāng)出現(xiàn)與本文描述的序列的任何沖突時(shí)，保藏材料中所含的多核苷酸的序列以及由其編碼的多肽的氨基酸序列是參照物。制造、使用或銷售保藏材料需經(jīng)許可，本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1和圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列的人TNFδ和TNFε多肽，本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中其是重組多肽。
本發(fā)明還涉及這些多肽的片段、類似物和衍生物。當(dāng)指圖1和圖2的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持這種多肽的相同生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括蛋白原，其可通過(guò)裂解除去蛋白原部分而活化產(chǎn)生活性成熟多肽。
圖1和圖2的多肽的片段、類似物和衍生物可以是(ⅰ)這樣的多肽，其中的一或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)取代，并且這種取代的氨基酸殘基可以是由遺傳密碼編碼的或不是由遺傳密碼編碼的；或(ⅱ)這樣的多肽，其中的一或多個(gè)氨基酸殘基包括一個(gè)取代基；或(ⅲ)這樣的多肽，其中的成熟多肽與另一種化合物融合，如增加多肽的半壽期的化合物(如聚乙二醇)；或(ⅳ)這樣的多肽，其中的成熟多肽融合有額外的氨基酸，如前導(dǎo)或分泌序列或用來(lái)純化成熟多肽的序列或蛋白原序列。這些片段、類似物和衍生物被認(rèn)為屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文教導(dǎo)而理解的范疇。
在這一點(diǎn)上本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是具有圖1和圖2的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽，及其變體、類似物、衍生物和片段，以及片段的變體、類似物和衍生物?；蛘撸谶@一點(diǎn)上本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是具有保藏克隆中人cDNA的TNFδ和TNFε的氨基酸序列的多肽，及其變體、類似物、衍生物和片段，以及片段的變體、類似物和衍生物。
優(yōu)選的變體是與參照序列有保守氨基酸取代的不同的變體，這種取代是用另一個(gè)相似特征的氨基酸取代多肽中的給定氨基酸的取代。典型視作保守取代的是在脂族(aliphatic)氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之間的一一置換；羥基殘基Ser和Thr的互換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gln之間的取代；堿性殘基Lys和Arg的交換；以及芳香殘基Phe,Tyr的置換。
在這一點(diǎn)上特別優(yōu)選的是這樣的變體、類似物、衍生物和片段以及片段的變體、類似物和衍生物，其具有圖1和圖2或保藏克隆中cDNA的TNFδ和TNFε多肽的氨基酸序列的TNFδ和TNFε，其中有一些、幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、2或1個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失或添加，或者無(wú)氨基酸殘基被取代、缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變TNFδ和TNFε的性質(zhì)和活性的沉默取代、添加和缺失。在這一點(diǎn)上還特別優(yōu)選的是保守取代。最優(yōu)選的是具有不含取代的圖1和圖2的氨基酸序列的多肽。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以分離形式提供，并優(yōu)選地純化到同質(zhì)。
本發(fā)明的TGFδ多肽包括SEQ ID NO:2的多肽(特別是成熟多肽)，以及與SEQ ID NO:2的多肽有至少70％相似性(優(yōu)選至少70％相同性)的多肽，更優(yōu)選與SEQ ID NO:2的多肽有至少90％相似性(更優(yōu)選至少90％相同性)的多肽，還更優(yōu)選與SEQ ID NO:2的多肽有至少95％相似性(還更優(yōu)選至少95％相同性)的多肽，并還包括這些多肽的一部分，這種多肽部分通常含有至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的TGFε多肽包括SEQ ID NO:4的多肽有至少70％相似性(優(yōu)選至少70％相同性)的多肽，更優(yōu)選與SEQ ID NO:4的多肽有至少90％相似性(更優(yōu)選至少90％相同性)的多肽，還更優(yōu)選與SEQ ID NO:4的多肽有至少95％相似性(還更優(yōu)選至少95％相同性)的多肽，并還包括這些多肽的一部分，這種多肽部分通常含有至少30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，兩個(gè)多肽間的“相似性”是通過(guò)將一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代與第二個(gè)多肽的序列相比而確定。
通過(guò)肽合成可用本發(fā)明的多肽的片段或部分產(chǎn)生相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽，因此，片段可用作中間體來(lái)產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽。本發(fā)明的多核苷酸的片段或部分可用于合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
片段是具有與上述TNFδ和TNFε多肽及其變體或衍生物部分而非全部氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。這種片段可以是“游離的”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或與其融合，或者片段也可包含在一個(gè)更大多肽之內(nèi)，它們形成一個(gè)部分或區(qū)域，當(dāng)包含在一個(gè)更大多肽之內(nèi)時(shí)，本文討論的片段最優(yōu)選地是形成單一的連續(xù)區(qū)域。然而，可有幾個(gè)片段包含在一個(gè)單個(gè)的更大的多肽之內(nèi)。例如某些優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含在一個(gè)設(shè)計(jì)用于在宿主中表達(dá)的前體多肽之內(nèi)的本發(fā)明的TNFδ和TNFε多肽的一個(gè)片段，在TNFδ和TNFε片段的氨基末端融合有異源的前多肽區(qū)和多肽原區(qū)，在片段的羧基末端融合有一個(gè)額外的區(qū)域。因此，在本文的含義的一個(gè)方面，片段是指從TNFδ和TNFε衍生的融合多肽或融合蛋白的一個(gè)部分或多個(gè)部分。
作為本發(fā)明的多肽片段的代表性例子，可以提及的是具有大約30-233個(gè)氨基酸的片段。在這一點(diǎn)上，“大約”包括所提及的特定范圍，以及比上限或下限或者上限和下限多或少一些、幾個(gè)、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的范圍。例如，大約100-233個(gè)氨基酸是指具有100加或減一些、幾個(gè)、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸至233加或減一些、幾個(gè)、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸殘基的多肽片段，即寬至100減一些氨基酸至233加一些氨基酸、窄至100加一些氨基酸至233減一些氨基酸的這樣一個(gè)范圍。
在這一點(diǎn)上高度優(yōu)選的是在上限或下限或者在上限和下限加上或減去多至5個(gè)氨基酸的所述范圍。特別高度優(yōu)選的是在上限或下限或在上限和下限加上或減去多至3個(gè)氨基酸的所述范圍。還特別高度優(yōu)選的是在上限或下限或者在上限和下限加上或減去1個(gè)氨基酸的范圍或者無(wú)添加或缺失的范圍。最高度優(yōu)選的是約15-233個(gè)氨基酸的片段。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的片段是TNFδ和TNFε的截短突變體。截短突變體包括具有圖1或圖2的氨基酸序列或其變體或衍生物的氨基酸序列的TNFδ和TNFε多肽，只是缺失了包括氨基末端在內(nèi)的一系列連續(xù)殘基(即連續(xù)的區(qū)域或部分)，或者缺失了包括羧基末端在內(nèi)的一系列連續(xù)殘基，或者如在雙截短突變體中那樣，缺失了兩段連續(xù)殘基，一段包括氨基末端，一段包括羧基末端。具有上述大小范圍的片段也是截短片段的優(yōu)選實(shí)施方案，通常其是片段中特別優(yōu)選的。
具有TNFδ和TNFε的結(jié)構(gòu)或功能特征的片段也是本發(fā)明這一方面優(yōu)選的。關(guān)于這一點(diǎn)的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括如下的片段，這些片段包含TNFδ和TNFε的α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)(“α-區(qū)”)，β-折疊和β-折疊形成區(qū)(“β-區(qū)”)，轉(zhuǎn)角及轉(zhuǎn)角形成區(qū)(“轉(zhuǎn)角區(qū)”)，卷曲和卷曲形成區(qū)(“卷曲區(qū)”)，親水區(qū)，疏水區(qū)，α-兩親區(qū)，β-兩親區(qū)，柔性區(qū)，表面形成區(qū)和高抗原指數(shù)區(qū)。
這些方面的某些優(yōu)選區(qū)域示于圖4(針對(duì)TNFδ)和圖5(針對(duì)TNFε)，其包括但不限于經(jīng)分析圖1和圖2的氨基酸序列而鑒定的上述類型的區(qū)域。如圖4和圖5所示，這種優(yōu)選的區(qū)域包括Gamier-Robsonα-區(qū)，β-區(qū)，轉(zhuǎn)角區(qū)和卷曲區(qū)，Chou-Fasmanα-區(qū)，β-區(qū)和轉(zhuǎn)角區(qū)，Kyte-Doolittle親水區(qū)和親水區(qū)，Eisenbergα和β-兩親區(qū)，Karplus-Schulz柔性區(qū)，Emini表面形成區(qū)和Jameson-Wolf高抗原指數(shù)區(qū)。
在這一點(diǎn)上高度優(yōu)選的片段是那些包括了結(jié)合有幾種結(jié)構(gòu)特征如上述幾種特征的TNFδ和TNFε區(qū)域的片段。特別優(yōu)選的區(qū)域是由圖1、2、4和5的信號(hào)肽區(qū)之后的殘基限定的區(qū)域，它們的特征均在于具有高度特征性的轉(zhuǎn)角區(qū)、親水區(qū)、柔性區(qū)、表面形成區(qū)和高抗原指數(shù)區(qū)的氨基酸組成。這種區(qū)域可以包含在一較大多肽之內(nèi)，或者其本身即可是本發(fā)明的優(yōu)選片段。應(yīng)理解的是這一段落中的術(shù)語(yǔ)“大約”與上述段落中關(guān)于片段中提到的含義相同。
進(jìn)一步優(yōu)選的區(qū)域是那些介導(dǎo)TNFδ和TNFε的活性的區(qū)域，關(guān)于這一點(diǎn)最優(yōu)選的是具有TNFδ和TNFε的化學(xué)、生物學(xué)或其它活性的片段，包括那些具有相似或改善的活性或不希望的活性降低的片段。這一點(diǎn)上高度優(yōu)選的是含有是相關(guān)多肽、如圖3所示相關(guān)多肽(包括人TNFα和β)的序列同系物或位置同系物或者序列及活性區(qū)同系物的區(qū)域的片段。特別優(yōu)選的片段是如上所述的截短突變體。
應(yīng)理解的是本發(fā)明還涉及編碼上述片段的多核苷酸，與編碼上述片段的多核苷酸雜交的多核苷酸，特別是那些在嚴(yán)格條件下雜交多核苷酸，以及用于擴(kuò)增編碼上述片段的多核苷酸的多核苷酸如PCR引物。優(yōu)選的多核苷酸是與上述優(yōu)選片段對(duì)應(yīng)的那些多核苷酸。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體進(jìn)行遺傳工程加工的宿主細(xì)胞和通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明多肽。
宿主細(xì)胞可經(jīng)基因工程化而摻入本發(fā)明的多核苷酸并表達(dá)本發(fā)明的多肽。例如，可用公知的技術(shù)如感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)載和轉(zhuǎn)化將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。多核苷酸可單獨(dú)導(dǎo)入或與其它多核苷酸一起導(dǎo)入，這種其它的多核苷酸可以獨(dú)立導(dǎo)入、共導(dǎo)入或與本發(fā)明的多核苷酸聯(lián)合導(dǎo)入。因此，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的共轉(zhuǎn)染技術(shù)并例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中篩選而可以將本發(fā)明的多核苷酸與另一種獨(dú)立的編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞。在這種情況下多核苷酸通常穩(wěn)定地?fù)饺氲剿拗骷?xì)胞基因組內(nèi)。
或者，多核苷酸可以與含選擇標(biāo)記的載體結(jié)合以在宿主中繁殖，可通過(guò)上述技術(shù)將載體構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞。通常質(zhì)粒載體是作為在沉淀物如磷酸鈣沉淀物的DNA導(dǎo)入或者與荷電脂類形成復(fù)合物而導(dǎo)入。也可使用電穿孔將多核苷酸導(dǎo)入宿主。如果載體是病毒，其可在體外包裝或?qū)氲桨b細(xì)胞中，包裝后的病毒可被轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明這一方面適用于制備多核苷酸并將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞的各種技術(shù)是本領(lǐng)域人員公知的和常規(guī)的。這類技術(shù)在上述Sambrook等中有詳細(xì)描述，其是詳述這些技術(shù)的許多實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中的一個(gè)代表。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，載體可以是例如質(zhì)粒載體、單鏈或雙鏈?zhǔn)删w載體、單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。這種載體可作為多核苷酸優(yōu)選DNA經(jīng)公知的將DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)載體是噬菌體和病毒載體時(shí)，其也可以并且優(yōu)選是作為包裝的或包囊化的病毒由公知的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)導(dǎo)入到細(xì)胞中。病毒可以是復(fù)制活性或復(fù)制缺陷的，在后一情況下病毒繁殖通常僅在互補(bǔ)宿主細(xì)胞中發(fā)生。
在某些方面優(yōu)選的載體是那些用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的載體。通常這種載體包括與待表達(dá)的多核苷酸可操作連接的用于在宿主中有效表達(dá)的順式作用控制區(qū)。合適的反式作用因子或者由宿主提供，或者由互補(bǔ)載體提供或由載體本身在導(dǎo)入宿主后提供。
在這一點(diǎn)的某些實(shí)施方案中，載體提供了特異表達(dá)，這種特異表達(dá)可以是可誘導(dǎo)表達(dá)或僅在某些類型細(xì)胞中表達(dá)，或者既是可誘導(dǎo)的又是細(xì)胞特異性的。特別優(yōu)選的可誘導(dǎo)載體是可由易于操作的環(huán)境因子如溫度和營(yíng)養(yǎng)添加劑誘導(dǎo)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并常規(guī)采用了各種適于本發(fā)明這一方面的載體，如用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞宿主的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)載體。
遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在為適合于激活啟動(dòng)子，篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增基因而修飾的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。先前用于宿主細(xì)胞表達(dá)篩選的培養(yǎng)條件，如溫度，PH諸如此類通常適于本發(fā)明多肽的表達(dá)，這是普通技術(shù)熟練人員顯而易見(jiàn)的。
可使用各種表達(dá)載體表達(dá)本發(fā)明的多肽，這些載體包括染色體的、附加型的和病毒衍生的載體，例如衍生自細(xì)胞質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、擬狂犬病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及由上述組合衍生的載體如那些衍生自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體如粘粒和噬菌粒，所有這些載體均可用于本發(fā)明這一方面的表達(dá)。通常，任何適合在宿主中保持、繁殖或表達(dá)多核苷酸以表達(dá)多肽的載體均可用于表達(dá)。
可通過(guò)各種已知和常規(guī)技術(shù)將合適的DNA插入到載體中，通常通過(guò)用一或多種限制性內(nèi)切酶裂解DNA序列和表達(dá)載體，然后用T4DNA連接酶將限制片段連接在一起?？捎糜诖四康牡南拗泼盖泻瓦B接的程序是常規(guī)公知的。Sambrook等的書(shū)中詳細(xì)描述了用于構(gòu)建表達(dá)載體的合適的程序。
表達(dá)載體中的DAN序列可操作地與合適的表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子連接以指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄，這類啟動(dòng)子的代表包括噬菌體λPL啟動(dòng)子，E.coli lac,trp和tac啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子以及反轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子，這些僅是熟知的啟動(dòng)子中的幾個(gè)。應(yīng)理解的是未提到的各種啟動(dòng)子均適用于本發(fā)明的這一方面，并且是本領(lǐng)域人員公知的，可以以本文實(shí)施例所述方式使用。
通常表達(dá)構(gòu)建物含有轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)，以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)中的用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由構(gòu)建物表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼區(qū)包括在開(kāi)頭處的翻譯起始AUG以及在待翻譯的多肽的末端合適處的終止密碼子。
另外，構(gòu)建體還可含有調(diào)控以及引起表達(dá)的調(diào)控區(qū)。通常，根據(jù)許多通用的程序，這種區(qū)域?qū)⑼ㄟ^(guò)控制轉(zhuǎn)錄如阻遏物結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子而操縱。
用于繁殖和表達(dá)的載體通常包括選擇標(biāo)記，這種標(biāo)記也可適用于擴(kuò)增，或者載體也可含有用于此目的的附加的標(biāo)記。表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的選擇標(biāo)記基因，優(yōu)選的標(biāo)記包括對(duì)于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli或其它細(xì)菌中為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。
含有本文其它處所述的合適的DNA序列以及合適的啟動(dòng)子和其它合適的調(diào)控序列的載體可以用各種公知的在宿主中表達(dá)所需多肽的技術(shù)導(dǎo)入合適的宿主。作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞。針對(duì)各種表達(dá)構(gòu)建體的宿主是公知的，根據(jù)本文的披露，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇宿主表達(dá)本發(fā)明的多肽。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體如表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，在該載體中以正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一點(diǎn)的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動(dòng)子，有許多可商購(gòu)的載體適用于本發(fā)明。
以下舉出載體的例子，優(yōu)選用于細(xì)菌的載體是pQE70,pQE60,pQE-9(來(lái)自Qiagen)，pBS載體，phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(來(lái)自Stratagene)；prtc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(來(lái)自Pharmacia)。優(yōu)選的真核載體是pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1,pSG(來(lái)自Stratagene),pSVK3,pBPV,pMSG,pSVL(來(lái)自Pharmacia)。這些載體僅是舉例示出了許多可商購(gòu)的公知的載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將這些載體用于本發(fā)明的這一方面。應(yīng)理解的是其它適于在宿主中導(dǎo)入、保持、繁殖或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或多肽的質(zhì)?；蜉d體也可用于本發(fā)明的這一方面。
利用如下的載體可從任何希望的基因中篩選啟動(dòng)子區(qū)，該載體含有缺少啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)道轉(zhuǎn)錄單位，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位位于用于導(dǎo)入候選啟動(dòng)子片段即可能含有啟動(dòng)子的片段的限制位點(diǎn)的下游。正如所公知的，在載體中cat基因上游的限制位點(diǎn)導(dǎo)入含啟動(dòng)子片段可產(chǎn)生CAT活性，該活性可用標(biāo)準(zhǔn)CAT分析檢測(cè)。適合此目的的載體是公知的并很容易獲得，兩個(gè)這種載體是pKK232-8和pCM7。所以，用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子不僅包括公知的很容易獲得的啟動(dòng)子，而且包括可用上述技術(shù)用報(bào)道基因很容易獲得的啟動(dòng)子。
適合表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的公知細(xì)菌啟動(dòng)子有大腸桿菌lacI和lacZ啟動(dòng)子，T3和T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，λPR,PL啟動(dòng)子，和trp啟動(dòng)子。公知真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，早期和晚期SV40啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子如Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子，和金屬硫蛋白啟動(dòng)子如鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。選擇適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中表達(dá)是公知程序，表達(dá)載體構(gòu)建、將載體導(dǎo)入宿主及在宿主中表達(dá)所需技術(shù)是在普通技術(shù)人員的水平中的。
本發(fā)明還涉及含有上面敘述的構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或者低等真核生物細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。
通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽(yáng)離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染或其它方法可將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，如Davis等，Basic Methods inMolecular Biology,(1986)中有述。宿主細(xì)胞中的這些構(gòu)建體可以常規(guī)方式用于生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘?，本發(fā)明的多肽可以通過(guò)常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)。
在合適的啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母，細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)。利用起源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用于生產(chǎn)這樣的蛋白質(zhì)。Sambrook etal.,分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)敘述了原核和真核宿主一起使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體。
一般來(lái)說(shuō)，重組表達(dá)載體包括復(fù)制源點(diǎn)，一個(gè)起源于高表達(dá)基因指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和一個(gè)在細(xì)胞與載體接觸后用于分離含載體的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。合適的啟動(dòng)子可以起源于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或熱休克蛋白等的基因的那些啟動(dòng)子。選擇標(biāo)記包括大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母trpl基因。
在載體中插入增強(qiáng)子序列可以提高高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常為10到300個(gè)bp，作用于特定宿主細(xì)胞中的啟動(dòng)子以增強(qiáng)它的轉(zhuǎn)錄活性。例子包括在復(fù)制源點(diǎn)晚期一側(cè)的bp100到270的SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制源點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。
編碼本發(fā)明的多肽的異源結(jié)構(gòu)序列的本發(fā)明的多核苷酸通常是利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)插入到載體中，從而其與啟動(dòng)子可操作連接以用于表達(dá)。多核苷酸的定位是使轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)大約位于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的5’。核糖體結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)和起始AUG之間沒(méi)有其它的起自起始密碼子(通常為AUG)的開(kāi)放讀框。另外，通常在多肽的末端有一翻譯終止密碼子，并且在轉(zhuǎn)錄區(qū)的3’末端的合適位置有聚腺苷化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
為了翻譯的蛋白能分泌進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì)空間或分泌到胞外環(huán)境，可將合適的分泌信號(hào)摻入進(jìn)表達(dá)的多肽。這些信號(hào)對(duì)于多肽可以是內(nèi)源的或可以是異源信號(hào)。
多肽可以以修飾的形式表達(dá)，如作為融合蛋白表達(dá)，并且不僅可以包括分泌信號(hào)，也可以包括附加的異源功能區(qū)。因此，例如可將附加的氨基酸，特別是帶電氨基酸組成的一個(gè)區(qū)域加到多肽的N一末端以增加在純化過(guò)程中或在隨后的處理和貯存過(guò)程中在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持續(xù)性。另外，也可向多肽加入促進(jìn)純化的區(qū)域，這種區(qū)域可在多肽的最終制備之前除去。向多肽添加促進(jìn)分泌、增加穩(wěn)定性和促進(jìn)純化的肽基序是本領(lǐng)域所熟悉的常規(guī)技術(shù)。
合適的用于本發(fā)明的多核苷酸和多肽的繁殖、保持或表達(dá)的原核生物宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌。假單胞菌屬，鏈霉菌屬，和葡萄球菌屬內(nèi)的各個(gè)種也是合適的宿主，當(dāng)然本領(lǐng)域人員已知的許多其它的宿主也可以選擇來(lái)使用。
作為一個(gè)代表性但非限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可以包含來(lái)源于包含已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商業(yè)途徑可獲得的質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制源點(diǎn)。這樣的商業(yè)載體包括例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEMI(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。這些Pbr322“骨架”部分與合適的啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
在合適宿主菌株轉(zhuǎn)化和宿主菌株生長(zhǎng)到合適的細(xì)胞密度之后，當(dāng)所選啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的時(shí)，通過(guò)合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子并且將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。通常通過(guò)離心收集細(xì)胞，通過(guò)物理或方法破碎細(xì)胞，并且保留得到的粗提取物以進(jìn)一步純化。可以通過(guò)任何常規(guī)的方法來(lái)破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，包括凍融循環(huán)，超聲波處理，機(jī)械破碎，或用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7系，如Gluzman，細(xì)胞，23:175(1981)所述。其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系包括，例如，C127,3T3,CHO,HeLa，人腎293和BHK細(xì)胞系。
哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制源點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，還有任何必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷化位點(diǎn)，拼接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和表達(dá)所需的5’側(cè)接非轉(zhuǎn)錄序列。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，來(lái)源于SV40拼接位點(diǎn)和聚腺苷化作用位點(diǎn)的DNA序列可以用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
通過(guò)多種方法可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。最優(yōu)選地，高效液相層析(HPLC)可以用于純化。當(dāng)在分離和/或純化過(guò)程中多肽被變性時(shí)，可采用公知的再折疊蛋白質(zhì)的步驟以再生活性構(gòu)象。
本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物，化學(xué)合成過(guò)程的產(chǎn)物，通過(guò)重組技術(shù)從原核生物或真核生物宿主(例如，細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生的產(chǎn)物。依據(jù)在重組生產(chǎn)過(guò)程中所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，在某些情況下由于宿主介導(dǎo)的過(guò)程本發(fā)明的多肽也可以包括一個(gè)起始的修飾的甲硫氨酸氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以有各種應(yīng)用，特別是用于那些利用TNFδ和TNFε的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的應(yīng)用中。這些應(yīng)用包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的細(xì)胞編程性死亡，細(xì)胞活化和增殖的介導(dǎo)，免疫調(diào)節(jié)的初級(jí)介體，對(duì)病原體的抗微生物性、抗病毒性和炎癥應(yīng)答易感性。其它的應(yīng)用涉及細(xì)胞、組織和生物體的失調(diào)的診斷和治療。本發(fā)明的這些方面將在以下討論中進(jìn)一步描述。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的多核苷酸用作例如診斷試劑以檢測(cè)互補(bǔ)多核苷酸。對(duì)與功能失調(diào)相關(guān)的本發(fā)明多肽的突變形式的檢測(cè)提供了一種診斷工具，其可以診斷或確定由本發(fā)明的多肽的表達(dá)不足、過(guò)量表達(dá)或變化表達(dá)產(chǎn)生的疾病或疾病的易感性，所述疾病例如為瘤形成如腫瘤。
通過(guò)各種技術(shù)可以在DNA水平檢測(cè)攜帶本發(fā)明基因中的突變的個(gè)體。為了診斷可以從病人的細(xì)胞，如血液，尿，唾液，組織活體檢查和尸體剖檢的材料得到核酸?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)或可以在分析之前利用PCR(Saiki et al,,Nature,324:163-166(1986))進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以用于同樣目的。作為一個(gè)例子，互補(bǔ)于編碼TNFδ和TNFε的核酸的PCR引物可以用于鑒定和分析TNFδ和TNFε表達(dá)和突變。例如，與正?；蛐拖啾葦U(kuò)增產(chǎn)物的大小的變化可以檢測(cè)缺失和插入。通過(guò)把擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記TNFδ和TNFεRNA或與放射標(biāo)記的TNFδ和TNFε反義DNA序列雜交可以鑒定點(diǎn)突變。通過(guò)RNase A消化或解鏈溫度的差異可以把錯(cuò)配雙螺旋與正確配對(duì)序列區(qū)別開(kāi)來(lái)。
參照基因與具有突變的基因之間的序列差異也可以通過(guò)直接DNA測(cè)序揭示。另外，可采用克隆的DNA區(qū)段作為探針以檢測(cè)特異的DNA區(qū)段。這種方法的靈敏性可通過(guò)合適應(yīng)用PCR或其它擴(kuò)增方法而大大增加。例如，測(cè)序引物可使用雙鏈PCR產(chǎn)物或由修改的PCR產(chǎn)生的單鏈模板。用放射性標(biāo)記的核苷酸經(jīng)常規(guī)程序測(cè)序，或用帶熒光標(biāo)記的自動(dòng)測(cè)序程序進(jìn)行測(cè)序。
通過(guò)在有或沒(méi)有變性劑時(shí)檢測(cè)凝膠上DNA片段的電泳遷移率的改變可以完成基于DNA序列差異的遺傳測(cè)試。通過(guò)高分辨凝膠電泳可以顯現(xiàn)小序列缺失和插入。在變性的甲酰胺梯度膠上可以區(qū)別不同序列的DNA片段，其中根據(jù)它們特有的解鏈或部分解鏈溫度，不同的DNA片段遷移停留在凝膠的不同位置(參見(jiàn)，例如Myers et al.,Science,230:1242(1985))。
通過(guò)核酸酶保護(hù)測(cè)定，如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)裂解方法也可以發(fā)現(xiàn)特定位置的序列變化(例如Cotton et al.,PNAS,USA,85:4397-440l(1985))。所以，通過(guò)如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)裂解，直接DNA序列分析或使用限制性酶(例如，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡分析方法可以完成特定DNA序列的檢測(cè)。除了較方便的凝膠電泳和DNA序列分析，還可以通過(guò)原位分析檢測(cè)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)于染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列可特異性地靶擊并與個(gè)體的人染色體的特定位置雜交。此外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前只有少數(shù)幾個(gè)根據(jù)實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明對(duì)染色體DNA的物理作圖是將這些序列與疾病相關(guān)的基因相聯(lián)的重要的第一步。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，用本文公開(kāi)的cDNA克隆本發(fā)明基因的基因組DNA，這可以使用各種公知的技術(shù)及可商購(gòu)的文庫(kù)完成。使用公知的技術(shù)將基因組DNA用于原位染色體作圖。典型地，根據(jù)常規(guī)的染色體作圖程序，需經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)才能鑒定出能給出好的原位雜交信號(hào)的基因組揮針。
另外，在某些情況下，通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)可以把序列定位于染色體上。該基因的3′未翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析被用于快速篩選引物，引物不應(yīng)跨越基因組DNA中一個(gè)以上外顯子的長(zhǎng)度從而使擴(kuò)增過(guò)程復(fù)雜化。然后這些引物用于PCR篩選含有單個(gè)人的染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有對(duì)應(yīng)于引物的人基因的雜交體將產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將特定DNA定位到特定染色體的快速方法。在本發(fā)明中利用同樣的寡核苷酸引物，以類似的方法由一組特異染色體片段組或大基因組克隆庫(kù)可以完成亞定位?？梢酝瑯佑糜趯?duì)它的染色體作圖的其它方法包括原位雜交，用標(biāo)記的流選染色體的預(yù)篩選和通過(guò)雜交的預(yù)選擇構(gòu)建染色體特異cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用于提供一步的精確染色體定位。這項(xiàng)技術(shù)可以與短至50或60堿基的cDNA一起使用?；仡欉@項(xiàng)技術(shù)可以見(jiàn)Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列定位于精確的染色體位置，序列在染色體上的物理位置就可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)。這樣的數(shù)據(jù)可以在例如McKusick，人類中的孟德?tīng)栠z傳(在線從約翰霍普金斯大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書(shū)館)中找到。然后通過(guò)連鎖分析(物理鄰接基因的共遺傳)鑒定基因和已定位于同一染色體區(qū)的疾病的關(guān)系。
接著，必須確定感染和未感染的個(gè)體之間cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部感染個(gè)體但不在任何正常個(gè)體中觀察到突變，那么這個(gè)突變很可能是引起疾病的原因。
根據(jù)目前物理圖譜的分辨率和遺傳圖譜分析技術(shù)，精確定位于與疾病相關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個(gè)潛在致病基因中的一種。(這假定1兆堿基作圖分辨率并且每20kb為一個(gè)基因)。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中本發(fā)明的蛋白的水平(包括確定正常水平和異常水平)的診斷分析法，如定量診斷分析法。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明用于檢測(cè)與正常對(duì)照組織樣品相比本發(fā)明的TNF蛋白的過(guò)量表達(dá)的診斷分析可以用來(lái)檢測(cè)瘤形成的存在。可以用于確定來(lái)自宿主的樣品中蛋白質(zhì)如本發(fā)明的蛋白的分析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的，這些分析方法包括放射免疫測(cè)定，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)試，Western印跡分析和ELISA測(cè)試，其中ELISA通常是優(yōu)選的。ELISA測(cè)試首先包括制備一個(gè)特異于本發(fā)明蛋白的抗體，優(yōu)選的是單克隆抗體。另外通常制備一個(gè)結(jié)合該單克隆抗體的報(bào)道抗體。附著于報(bào)道抗體是可檢測(cè)試劑如放射性，熒光或酶試劑，在這個(gè)例子中的辣根過(guò)氧化物酶。
為進(jìn)行ELISA分析，從宿主中取出樣品并在一個(gè)固體支持物，例如聚苯乙烯皿上溫育，皿與樣品中的蛋白質(zhì)結(jié)合。然后，通過(guò)與非特異蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白溫育而覆蓋任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接著，將單克隆抗體在皿中溫育，在這個(gè)過(guò)程中單克隆抗體附著于任何附著于聚苯乙烯皿上的本發(fā)明的蛋白。所有未結(jié)合的單克隆抗體用緩沖液洗去。將與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的報(bào)道抗體置于皿中，導(dǎo)致報(bào)道抗體與任何與本發(fā)明的蛋白結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合，然后洗去未附著的報(bào)道抗體。過(guò)氧化物酶活性試劑包括比色底物隨后加到皿中，通過(guò)一級(jí)和二級(jí)抗體與本發(fā)明的蛋白相連的固定化過(guò)氧化物酶產(chǎn)生顯色反應(yīng)產(chǎn)物。在給定時(shí)間的顯色量指示樣品中存在的本發(fā)明蛋白量。定量結(jié)果典型地通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而獲得。
可使用競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試，其中特異于本發(fā)明蛋白的抗體附著于一個(gè)固體支持物，標(biāo)記的本發(fā)明蛋白和來(lái)源于宿主的樣品通過(guò)固體支持物，并且檢測(cè)到的附著于固體支持物的標(biāo)記的量可以與樣品中本發(fā)明蛋白的量相關(guān)。
多肽，它們的片段或其它衍生物，或其類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可以用作免疫原以生產(chǎn)抗體。這些抗體可以例如是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合的，單鏈的和人源化的抗體，以及Fab片段，或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以用于這些抗體和片段的生產(chǎn)。
通過(guò)把多肽直接注射進(jìn)入動(dòng)物或給動(dòng)物(優(yōu)選的是非人類)施用該多肽，可以獲得針對(duì)相應(yīng)于本發(fā)明序列的多肽的抗體。這樣得到的抗體然后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，即使是僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可以用于產(chǎn)生結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后這樣的抗體可以用于從表達(dá)這一多肽的組織中分離多肽。
為了制備單克隆抗體，可以利用任何能通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein,1975，自然256:495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，今日免疫學(xué)4:72)，產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss,Inc.,pp88-96)。
可采用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因鼠或其它生物體如其它哺乳動(dòng)物可用來(lái)表達(dá)本發(fā)明免疫原多肽產(chǎn)物的人源化的抗體。
通過(guò)將上述抗體附著于固體支持物上經(jīng)親和層析分離和/純化，可以用所述抗體分離或鑒別表達(dá)多肽的克隆或純化本發(fā)明的多肽。
因此，本發(fā)明的多肽可以用于抑制瘤形成，如腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的多肽可能通過(guò)細(xì)胞編程性死亡和對(duì)某些細(xì)胞的毒性負(fù)責(zé)破壞腫瘤。本發(fā)明的多肽還誘導(dǎo)粘附細(xì)胞如LFA-1的正調(diào)節(jié)，因此可用于傷口愈合。本發(fā)明的多肽還可用于治療需要生長(zhǎng)促進(jìn)活性的疾病如再狹窄，因?yàn)楸景l(fā)明的多肽對(duì)內(nèi)皮起源的細(xì)胞具有增殖作用。本發(fā)明多肽因此還可用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育中的造血機(jī)能。
本發(fā)明的多肽還刺激T細(xì)胞的活化，因此可用于刺激對(duì)各種寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒感染的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的多肽還可用于消除自反應(yīng)性T細(xì)胞以治療和/或防止自身免疫疾病。自身免疫疾病的一個(gè)例子是Ⅰ型糖尿病。
本發(fā)明還提供了鑒別與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的分子如受體分子的方法，編碼與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)如受體蛋白的基因可用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行鑒別，例如配體淘選和FACS分選。這種方法在許多實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中有描述，例如Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)前方法1(2)第5章(1991)。
例如，可使用表達(dá)克隆法用于此目的，為此，從與本發(fā)明的蛋白質(zhì)反應(yīng)性的細(xì)胞制備聚腺苷化RNA，從此RNA制備cDNA文庫(kù)，將文庫(kù)分成各個(gè)庫(kù)，將各個(gè)庫(kù)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)不反應(yīng)的細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與標(biāo)記的本發(fā)明蛋白質(zhì)接觸，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用各種公知的技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記，如放射性碘化、包含進(jìn)位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識(shí)別位點(diǎn)。接觸后固定細(xì)胞并確定細(xì)胞松弛素的結(jié)合。這些程序可方便地在玻片上進(jìn)行。
鑒別庫(kù)中能產(chǎn)生TNFδ或TNFε結(jié)合細(xì)胞的cDNA，從這些陽(yáng)性庫(kù)中制備亞庫(kù)，轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞并如上所述篩選。使用重復(fù)的亞庫(kù)和再篩選方法，可以分離出一個(gè)或多個(gè)編碼推定的結(jié)合分子如受體分子的單個(gè)克隆。
或者，可以將標(biāo)記的配體與從表達(dá)結(jié)合分子如受體分子的細(xì)胞制備的細(xì)胞抽提物如細(xì)胞膜或膜抽提物光親和連接。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離交聯(lián)連接的材料并暴露于X-光膠片。含有配體-受體的標(biāo)記復(fù)合物可以被切下，分解成肽片段，并進(jìn)行蛋白質(zhì)微測(cè)序分析。微測(cè)序分析獲得的氨基酸序列可用于設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并寡核苷酸探針來(lái)篩選cDNA文庫(kù)，以便鑒定編碼推定的受體分子的基因。
本發(fā)明的多肽還可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞制備物中的TNFδ或TNFε結(jié)合分子如受體分子的TNFδ或TNFε結(jié)合能力。
本發(fā)明還提供了篩選化合物以鑒別能增強(qiáng)或阻斷TNFδ或TNFε對(duì)細(xì)胞的作用的那些化合物，所述的對(duì)細(xì)胞的作用例如TNFδ或TNFε與TNFδ或TNFε結(jié)合分子如受體分子的相互作用。興奮劑是增強(qiáng)本發(fā)明的多肽的天然生物學(xué)功能或以與本發(fā)明的多肽類似的方式起作用的化合物，而拮抗劑則降低或消除這種功能。
例如，可從表達(dá)與TNFδ或TNFε結(jié)合的分子的細(xì)胞制備細(xì)胞區(qū)室如膜或其制備物如膜制備物，所述的分子例如為信號(hào)分子或由TNFδ或TNFε調(diào)節(jié)的調(diào)控途徑的分子。在可能是TNFδ或TNFε的興奮劑或拮抗劑的候選分子的存在或不存在下，將制備物與標(biāo)記的TNFδ或TNFε保溫。候選分子與結(jié)合分子結(jié)合的能力反映在標(biāo)記配體結(jié)合的降低。無(wú)償結(jié)合即不誘導(dǎo)TNFδ或TNFε對(duì)結(jié)合TNFδ或TNFε結(jié)合分子的作用的分子最有可能是好的拮抗劑。結(jié)合良好并且激發(fā)與TNFδ或TNFε相同或緊密相關(guān)的作用的分子是興奮劑。
潛在的興奮劑和拮抗劑的類TNFδ或TNFε的作用可以通過(guò)例如測(cè)定候選分子與細(xì)胞和合適的細(xì)胞制備物的相互作用后的二級(jí)信使系統(tǒng)的活性，并將該作用與TNFδ或TNFε或激發(fā)與TNFδ或TNFε相同作用的分子的作用相比較而測(cè)定?？蓱?yīng)用的二級(jí)信使包括但不限于AMP鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌醇水解二級(jí)信使系統(tǒng)。
分析TNFδ或TNFε拮抗劑的另一個(gè)實(shí)施例是競(jìng)爭(zhēng)性分析，其是在適合競(jìng)爭(zhēng)抑制分析的條件下將TNFδ或TNFε和潛在的拮抗劑與膜結(jié)合的TNFδ或TNFε受體分子或重組TNFδ或TNFε受體分子合并?？梢詷?biāo)記TNFδ或TNFε，如用放射性標(biāo)記，從而可以精確測(cè)定與受體分子結(jié)合的TNFδ或TNFε分子的數(shù)量以評(píng)價(jià)潛在的拮抗劑的有效性。
潛在的拮抗劑包括與本發(fā)明的多肽結(jié)合從而抑制或消除其活性的小的有機(jī)分子、肽、多肽和抗體。潛在的拮抗劑還可以是這樣的小的有機(jī)分子、肽、多肽，如與結(jié)合分子如受體分子結(jié)合相同的位點(diǎn)的緊密相關(guān)的蛋白或抗體，但其不誘導(dǎo)TNFδ或TNFε誘導(dǎo)的活性，從而通過(guò)阻止本發(fā)明的多肽與其受體結(jié)合而防止其作用。
另一種潛在的拮抗劑是與TNFδ或TNFε結(jié)合而防止其與膜結(jié)合的TNFδ或TNFε受體相互作用的TNFδ或TNFε受體的可溶形式。以這種方式，受體不能被其配體刺激。
潛在的拮抗劑包括與本發(fā)明的多肽結(jié)合并占據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)從而防止其與細(xì)胞結(jié)合分子如受體分子的結(jié)合的小分子，由此防止了正常的生物學(xué)活性。小分子的例子包括但不限于小的有機(jī)分子、肽或非肽拮抗劑。
其它的潛在拮抗劑包括反義分子。通過(guò)反義DNA或RNA或通過(guò)三螺旋形成可用反義技術(shù)控制基因表達(dá)。反義技術(shù)例如在Okano,J.神經(jīng)生物化學(xué)56:560,1991；作為基因表達(dá)的反義抑制劑的寡脫氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton,FL(1988)中有討論。三螺旋形成的討論例見(jiàn)Lee等，核酸研究，6:3073(1979)；Cooney等，科學(xué)241；456(1988)；和Dervan等，科學(xué)251:1360(1991)。這些方法是基于多核苷酸與互補(bǔ)DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸的5’編碼部分可以用于設(shè)計(jì)長(zhǎng)約10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一種與參與轉(zhuǎn)錄的基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的DNA寡核苷酸從而防止轉(zhuǎn)錄及TNFδ或TNFε的產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，阻斷mRNA分子翻譯成TNFδ或TNFε多肽。上述寡核苷酸也可傳遞到細(xì)胞從而可在體內(nèi)表達(dá)反義RNA或DNA以抑制本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。
拮抗劑可以與藥物學(xué)可接受的載體一起用于組合物中，例如，如下所述。
例如拮抗劑可以用于治療惡病質(zhì)，其是由于脂蛋白脂酶系統(tǒng)性缺陷導(dǎo)致的脂類清除缺陷，由TNFδ或TNFε抑制。拮抗劑還可用于治療腦瘧疾，在該病中本發(fā)明的多肽似乎起病原作用。拮抗劑也可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子如滑液細(xì)胞中的IL1的TNFδ或TNFε誘導(dǎo)產(chǎn)生而治療。當(dāng)治療關(guān)節(jié)炎時(shí)，本發(fā)明的多肽優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)注射。
拮抗劑也可用于通過(guò)防止存在移植物時(shí)免疫系統(tǒng)的刺激而防止移植物一宿主排斥。
拮抗劑還可用于抑制骨再吸收，因此可治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松。
拮抗劑還可用作抗炎劑以治療內(nèi)毒性休克，這一嚴(yán)重癥狀是對(duì)細(xì)菌或其它類型感染的過(guò)激應(yīng)答所致。
本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸或多肽或興奮劑或拮抗劑的組合物。因此，本發(fā)明的多肽可與用于細(xì)胞，組織或生物體的一或多種有菌或無(wú)菌載體如適合給予患者的藥物學(xué)載體聯(lián)合應(yīng)用。這樣的組合物例如包括一種介質(zhì)添加劑或治療有效量的本發(fā)明的多肽和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其組合。配制的藥劑應(yīng)該適于給藥方式。
本發(fā)明還提供了藥物包或藥盒，它們含有一或多個(gè)裝填有上述本發(fā)明組合物的一種或多種成份的容器。附在這樣的容器中的是由控制藥物或生物學(xué)產(chǎn)品制造，使用或銷售的政府部門(mén)規(guī)定的通告。這樣的通知反映出制造，使用或銷售該產(chǎn)品供人使用得到政府部門(mén)同意。
本發(fā)明的多肽和其它化合物可以單獨(dú)使用或與其它化合物如治療用的化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以有效方便的方法如通過(guò)局部，口腔，肛門(mén)，陰道，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑給藥。
該藥物組合物通常以治療或預(yù)防特定疾病的有效量使用。一般來(lái)說(shuō)，它們以至少大約10μg/kg體重的量給藥，在大多數(shù)情況下，它們以每天不超過(guò)8mg/kg體重的量給藥。優(yōu)選地，大多數(shù)情況下，劑量大約是每天10μg/kg到1mg/kg體重。應(yīng)理解的是，考慮到癥狀、嚴(yán)重性、給藥途徑、并發(fā)癥等，可根據(jù)每種治療方式和癥狀用標(biāo)準(zhǔn)方法確定最佳劑量。
根據(jù)本發(fā)明通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)所述多肽將本發(fā)明的多核苷酸、多肽和屬于多肽的興奮劑和拮抗劑用于治療方式，這經(jīng)常被稱為“基因療法”。
所以，例如，可以在體外用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對(duì)來(lái)自病人的細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程處理，隨后將工程細(xì)胞提供給待用多肽治療的病人。例如，可以利用含有編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程處理。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且根據(jù)本文的教導(dǎo)顯而易見(jiàn)的。
類似地，為了在體內(nèi)表達(dá)多肽，可以用本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程化。例如，可如上所述對(duì)本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行工程化以在一種復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達(dá)。然后分離反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體并導(dǎo)入到包裝細(xì)胞中，用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，從而包裝細(xì)胞可產(chǎn)生含感興趣的基因的感染性病毒顆粒?？蓪⑦@些生產(chǎn)細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)工程化細(xì)胞并表達(dá)多肽。通過(guò)這種方法給予本發(fā)明多肽的這些和其它方法對(duì)本領(lǐng)域人員根據(jù)本文教導(dǎo)是顯而易見(jiàn)的。
衍生本文上述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿猩猩白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體衍生自Moloney鼠白血病病毒。
這種載體包括一或多個(gè)用于表達(dá)多肽的啟動(dòng)子，可采用的合適的啟動(dòng)子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR,SV40啟動(dòng)子，和人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，見(jiàn)Miller等，生物技術(shù)7:980-990(1989)所述，或者任何其它啟動(dòng)子(例如，細(xì)胞啟動(dòng)子如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、RNA聚合酶Ⅲ和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。可采用的其它病毒啟動(dòng)子包括不限于腺病毒啟動(dòng)子，胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子，B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域人員根據(jù)本文的教導(dǎo)是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列置于合適的啟動(dòng)子的控制之下，可采用的合適啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；異源啟動(dòng)子如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如MMT啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoI啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTR(包括本文上述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTR)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是控制編碼多肽基因的天然啟動(dòng)子。
用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系，可被轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501,PA317,Y-2,Y-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,YCRE,YCRIP,GP+E-86,GP+envAm12,DAN細(xì)胞系，見(jiàn)Miller,A.，人基因治療1:5-14(1990)所述。可通過(guò)本領(lǐng)域任何公知的方式將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)包裝細(xì)胞，這類方式包括但不限于電穿孔，使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)?？杀话疫M(jìn)脂質(zhì)體或與脂類偶聯(lián)，然后給予宿主。
生產(chǎn)細(xì)胞系將產(chǎn)生包括編碼多肽的核酸序列的感染性反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，然后可用這種反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚干細(xì)胞，胚癌細(xì)胞，以及造血干細(xì)胞，肝細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成骨髓細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步參照下述實(shí)施例加以描述，實(shí)施例僅是以特殊的實(shí)施方案為參照描述本發(fā)明，這些實(shí)施例盡管描述了本發(fā)明的某些特殊方面，但是其并非是限制本發(fā)明。
除非另有詳細(xì)描述，所有實(shí)施例均是用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。下述實(shí)施例的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)可以參照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行，如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，紐約(1989)，本文稱作“Sambrook”。
除非另有說(shuō)明，以下實(shí)施例中指出的所有份或量均指重量。除非另有說(shuō)明，實(shí)施例中的片段大小分離均用Sambrook和各種其它參考文獻(xiàn)如Goeddel等，核酸研究8:4057(1980)中的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行。除非另有描述，連接反應(yīng)是用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、保溫溫度和時(shí)間、約等摩爾量的待連接DNA片段和每0.5μg DNA約10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)來(lái)完成。
實(shí)施例1用細(xì)菌表達(dá)和純化人TNFδ和TNFε的可溶形式利用特異于人TNFδ或TNFε蛋白質(zhì)的氨基酸羧基端序列和基因3’的載體序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增保藏的多核苷酸中編碼λTNFδ和TNFε的DNA序列。將含有促進(jìn)克隆的限制位點(diǎn)的附加核苷酸各自加到5’和3’序列上。
5’寡核苷酸引物序列為5’-GCG GGA TCC CAG AGC CTCACC ACA G-3’，它含有一個(gè)下劃線的限制酶位點(diǎn)，接著跟著如圖所示編碼序列的開(kāi)始于ATG密碼子的第115位堿基的16個(gè)核苷酸。
3’引物序列為5‘-CGC AAG CTT ACA ATC ACA GTT TCACAA AC-3’，其含有下劃線的HindⅢ位點(diǎn)，并且后接20個(gè)互補(bǔ)于圖1和圖2所示的編碼序列的最后13個(gè)核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸。
限制位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于用于這些實(shí)施例的細(xì)菌表達(dá)的細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth,CA)。pQE-9編碼氨芐青霉素抗性(“Ampr”)并含有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制源點(diǎn)(“ori”)，一個(gè)IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(“RBS”)，一個(gè)6-His標(biāo)記和限制酶位點(diǎn)。
將擴(kuò)增的人TNFδDNA和載體pQE-9用BamHⅠ和HindⅢ消化，然后將消化的DNA連接在一起。TNFδDNA插入到pQE-9限制酶切載體是將TNFδ編碼區(qū)置于載體的IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游并與之可操作連接，并與起始AUG位于同一框內(nèi)，以便于TNFδ翻譯。
使用標(biāo)準(zhǔn)程序用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli細(xì)胞，這些程序如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，紐約(1989)所述。用大腸桿菌菌株M15/rep4進(jìn)行本文的所述的舉例性實(shí)施例，該菌株含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒表達(dá)lac阻遏物并賦予卡那霉素抗性(“Kanr”)。該菌株可購(gòu)自Qiagen，其僅是許多適于表達(dá)TNFδ的菌株中的一種。通過(guò)轉(zhuǎn)化子在含氨芐青霉素的LB平板上的生長(zhǎng)能力鑒別轉(zhuǎn)化子。從抗性菌落中分離質(zhì)粒DNA并經(jīng)限制分析證實(shí)克隆的DNA。
含有所需構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)充了氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜(O/N)。O/N培養(yǎng)物用于接種一個(gè)較大規(guī)模的培養(yǎng)物，比例約為1:100到1:250。細(xì)胞生長(zhǎng)到600nm處光密度(“OD600”)為0.4-0.6。然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至終濃度為1mM以使lacI阻遏物失活，誘導(dǎo)從lac阻遏物敏感型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞再生長(zhǎng)3-4小時(shí)，然后離心收獲細(xì)胞并用標(biāo)準(zhǔn)方法破碎。用常規(guī)收集技術(shù)從破碎的細(xì)胞中純化包涵體，將包涵體中的蛋白溶解在8M脲中。將含溶解蛋白的8M脲溶液在2X磷酸鹽緩沖液(PBS)中通過(guò)PD-10柱，由此除去脲，交換緩沖液并重折疊蛋白。再經(jīng)一層析步驟純化蛋白，除去內(nèi)毒素。然后無(wú)菌過(guò)濾，無(wú)菌過(guò)濾的蛋白制備物以95μg/ml的濃度在2XPBS中貯存。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)方法分析TNFδ制備物揭示出該制備物約含80％單體，預(yù)期分子量約為20.8Kda。
在使得含6-His標(biāo)記蛋白典型結(jié)合的條件下，在鎳螯合柱上層析純化蛋白，用6M鹽酸胍PH5.0從柱上洗脫蛋白，并復(fù)性。
實(shí)施例2利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)可溶的人TNFδ和TNFε利用對(duì)應(yīng)于所述基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物，擴(kuò)增了保藏克隆中的編碼全長(zhǎng)人TNFδ和TNFε蛋白質(zhì)的cDNA序列。
5’引物具有序列5’-GCG GGA TCC CCA GAG CCT CACCAC AG-3’，其含有下劃線的BamHⅠ限制酶位點(diǎn)，后面接著圖1和圖2的TNFδ和TNFε序列的16個(gè)堿基。如下所述插入表達(dá)載體后，編碼人TNFδ和TNFε的擴(kuò)增片段的5’端提供了一個(gè)有效的信號(hào)肽。如Kozak,M.,J.Mol.Biol.196:947-950(1987)所述的在真核細(xì)胞中起始翻譯的有效信號(hào)合適地位于構(gòu)建體的載體部分。
3’引物具有序列5’-CGC TCT AGA ACA ATC ACA GTTTCA CAA AC-3’，其含有下劃線的XbaⅠ限制位點(diǎn)，后接互補(bǔ)于圖1和圖2所示的TNFδ和TNFε編碼序列的最后13個(gè)核苷酸(包括終止密碼子)的核苷酸。
利用商購(gòu)試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla Ca.)從1％瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增的片段。然后用內(nèi)切酶BamHⅠ和Asp718消化該片段，然后再一次在1％的瓊脂糖膠上純化。這個(gè)片段被命名為F2。
用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如如Summers等，桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)程序的方法手冊(cè)，Texas農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站簡(jiǎn)報(bào)No.1555(1987)所述，在桿狀病表達(dá)系統(tǒng)中用載體pA2 GP表達(dá)TNFδ和TNFε蛋白質(zhì)。這一表達(dá)載體含苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體啟動(dòng)子，后面跟隨方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。包括N-末端甲硫氨酸的AcMNPV gp67的信號(hào)肽正位于BamHⅠ位點(diǎn)的上游。猿猴病毒40(“SV40”)的聚腺苷化位點(diǎn)被用于有效的聚腺苷化作用。為了容易地篩選重組病毒，來(lái)自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以同樣于多角體啟動(dòng)子的方向插入，后面接著多角體基因的聚腺苷化信號(hào)。為了進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的與野生型病毒DNA的同源重組，多角體序列兩側(cè)接著病毒序列以產(chǎn)生表達(dá)克隆的多核苷酸的活病毒。
許多其他桿狀病毒載體可以用于代替pA2-GP，如pAc373,pVL941和pAcIM1，如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，條件是構(gòu)建體提供了位置合適的用于轉(zhuǎn)錄、翻譯、運(yùn)輸?shù)鹊男盘?hào)，如所需的框內(nèi)AUG和信號(hào)肽。這類載體可參見(jiàn)Luckow等，病毒學(xué)，170:31-39。
用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒，然后用小牛腸磷酸酶及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序去磷酸化。然后利用商購(gòu)的試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)從1％瓊脂糖凝膠上分離該DNA。這一載體DNA被命名為“V2”。
用T4DNA連接酶連接片段F2和去磷酸化質(zhì)粒V2。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞。用BamHⅠ和XbaⅠ消化來(lái)自各個(gè)菌落的DNA，然后用凝膠電泳分析消化產(chǎn)物，由此鑒別含有攜帶人TNFδ和TNFε基因的質(zhì)粒的細(xì)菌。經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)克隆的片段的序列。該質(zhì)粒命名為pBac TNFδ。
利用脂轉(zhuǎn)染方法(如Felgner et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417(1987)所述)將1.0μg商購(gòu)的線性桿狀病毒DNA(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA.)與5μg質(zhì)粒pBac TNFδ一起共轉(zhuǎn)染。在含有50μl的無(wú)血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)的微滴板的無(wú)菌孔中將1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質(zhì)粒pBac TNFδ混合。之后將10μl Lipofectin和90μl Grace’s培養(yǎng)基加入，混合并在室溫下溫育15分鐘。然后，把轉(zhuǎn)染混合物滴加入種在具有1mlGrace’無(wú)血清培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)板中的Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(ATCCCRL1711)上。將平板前后輕搖，以便使新加入的溶液混合。然后平板在27℃溫育5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板中移去轉(zhuǎn)染溶液，加入補(bǔ)充了10％胎牛血清的1ml Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基。平板放回一個(gè)培養(yǎng)箱并在27℃繼續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，并如Summers和Smith(上述)所述進(jìn)行噬斑測(cè)定。使用具有“Blue Gal”(Life Technologies Ine.,Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠，以容易鑒別和分離產(chǎn)生染藍(lán)的噬斑的表達(dá)gal的克隆。(這種“噬斑測(cè)試”的詳細(xì)描述也可以參見(jiàn)Life Technolgies Inc.,Gaithesburg分發(fā)的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南，9-10頁(yè))。
連續(xù)稀釋四天后，將病毒加入細(xì)胞，適當(dāng)保溫后用一個(gè)Eppendorf吸管的管尖挑出染藍(lán)的噬斑。然后將含有重組病毒的瓊脂在一個(gè)含有200μl Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中重新懸浮。短時(shí)離心除去瓊脂，含有重組桿狀病毒的上清液用于感染播種于35mm皿中的Sf9細(xì)胞。四天后，收集這些培養(yǎng)皿中的上清液，然后貯存于4℃。經(jīng)包括限制酶譜和測(cè)序的DNA或TNFε分析鑒定含有合適插入的TNFδ或TNFε的克隆，此克隆命名為V-TNFδ。
Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)于補(bǔ)充了10％熱失活FBS的Gracs’s培養(yǎng)基中。用重組桿狀病毒V-TNFδ以感染復(fù)數(shù)(MOI)約為2(約1-3)感染細(xì)胞。六小時(shí)后除去培養(yǎng)基并用沒(méi)有甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培養(yǎng)基(購(gòu)自Life Technologise Inc.,Gaithersburg)替換。42小時(shí)后加入5μCi的35S-甲硫氨酸與5μCi的35S半胱氨酸(購(gòu)自Amersham)。細(xì)胞進(jìn)一步溫育16小時(shí)，然后離心收集，通過(guò)SDS-PAGE和放射自顯影可見(jiàn)裂解的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3 TNFδ表達(dá)在人組織中的分布使用如Sambrook等(上述)方法進(jìn)行Northern印跡分析來(lái)檢查T(mén)NFδ在人組織中的表達(dá)水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(BiotecxLaboratories Inc.,6023 South Loop East,Houston,TX 77033)分離總細(xì)胞RNA樣品。
從組織樣品中分離約10μg總RNA，在強(qiáng)變性條件下在1％凝膠上電泳大小分離RNA。將RNA從凝膠印跡到尼龍濾膜上，然后制備濾膜以用于與可檢測(cè)標(biāo)記的多核苷酸探針雜交。
作為檢測(cè)編碼TNFδ的mRNA的探針，標(biāo)記保藏克隆中cDNA插入物的編碼區(qū)的反義鏈至高比活性，用得自Stratagene的Prime-It試劑盒經(jīng)引物延伸標(biāo)記cDNA，根據(jù)廠商推薦的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)方案用50ngcDNA進(jìn)行反應(yīng)。用得自5-Prime-3-Prime公司，5603 Arapahoe Road,Boulder,CO80303的Select-G-50柱經(jīng)柱層析將標(biāo)記的多核苷酸從其它標(biāo)記的反應(yīng)成分中純化出來(lái)。
在小體積的7％SDS,0.5M NaPO4,PH7.4中以1,000,000cpm/ml的濃度將標(biāo)記的探針與濾膜在65℃雜交過(guò)夜。
之后，抽干探針溶液，用0.5×SSC,0.1％SDS在室溫和60℃各洗濾膜2次，然后干燥濾膜并用增感屏在-70℃曝光濾膜過(guò)夜。放射自顯影顯示在所有16種組織中均檢測(cè)到TNFδ的mRNA，其中心臟中有最高表達(dá)，其次是胎盤(pán)和腎。
實(shí)施例4人TNFδ或TNFε的基因治療表達(dá)從一個(gè)患者經(jīng)皮膚活檢獲得成纖維細(xì)胞，將得到的組織置于組織培養(yǎng)基中并分成小塊。將小塊組織置于組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，每瓶放置約10塊。將瓶頭朝下蓋緊并室溫過(guò)夜，室溫24小時(shí)后，倒轉(zhuǎn)瓶，組織塊仍固著在瓶的底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如Ham’sF12培養(yǎng)基，加10％FBS，青霉素和鏈霉素)。然后在37℃培養(yǎng)組織約1周，之后加入新鮮培養(yǎng)基并每隔幾天更換一次。再培養(yǎng)2周后出現(xiàn)了成纖維細(xì)胞單層，將單層胰酶化并量入大瓶中。
用限制酶消化用于基因治療的載體以克隆待表達(dá)的片段，用小牛腸磷酸酶處理消化的載體以防止自連。在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離去磷酸化的線性載體并純化。
分離能表達(dá)活性TNFδ或TNFε的cDNA，如果需要，修飾片段的末端以克隆進(jìn)載體。例如，可用DNA聚合酶處理5’突出以平末端化，3’突出可用S1核酸酶除去?？捎肨4 DNA連接酶將接頭連接至平末端。
將等量的Moloney鼠白血病病毒線性骨架和TNFδ或TNFε片段混合并用T4 DNA連接酶連接，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將細(xì)菌涂布含卡那霉素的瓊脂上。卡那霉素表型和限制分析證實(shí)載體中已正確插入了基因。
在含10％小牛血清(CS)，青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中將包裝細(xì)胞在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)至鋪滿密度。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將含TNFδ或TNFε基因的載體導(dǎo)入到包裝細(xì)胞中。從現(xiàn)稱為生產(chǎn)細(xì)胞的包裝細(xì)胞中收集含TNFδ或TNFε基因的感染性病毒顆粒。
向生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段合適時(shí)間后從鋪滿的生產(chǎn)細(xì)胞的平板收集培養(yǎng)基。將含感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基過(guò)濾通過(guò)Millipore濾膜以除去脫落的生產(chǎn)細(xì)胞，然后用過(guò)濾的培養(yǎng)基感染成纖維細(xì)胞。從成纖維的亞鋪滿板中除去培養(yǎng)基并迅速用過(guò)濾的培養(yǎng)基替換。可將Polybrene(Aldrich)包括進(jìn)培養(yǎng)基中以促進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。適當(dāng)保溫后，除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。如果病毒滴度高，則幾乎所有成纖維細(xì)胞均被感染而不需篩選。如果滴度低，則需要使用帶選擇標(biāo)記如neo或his的反轉(zhuǎn)錄病毒載體以選擇出轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用于擴(kuò)增。
然后工程化的成纖維細(xì)胞可以注射進(jìn)大鼠，單獨(dú)注射或在微載體珠如cytodex3株上生長(zhǎng)至鋪滿后注射。注射的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生TNFδ或TNFε產(chǎn)物，蛋白的生物學(xué)功能被給予宿主。
應(yīng)了解的是本發(fā)明可以以異于上述描述和實(shí)施例所述的方式進(jìn)行實(shí)施。根據(jù)上述教導(dǎo)可有各種改進(jìn)和變化，因此其均在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，包括與選自如下一組的成員具有至少70％相同性的多核苷酸，所述的組為(a)編碼包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)編碼包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)編碼包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽的多核苷酸；(d)與(a)、(b)或(c)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；以及(e)包含(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸的至少15個(gè)堿基的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO:2的氨基酸的多肽。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽。
7.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO:4的氨基酸的多肽。
8.權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼包括SEQ ID NO:4的第1-188位氨基酸的多肽。
9.一種分離的多核苷酸，包括與選自如下一組的成員具有至少70％相同性的多核苷酸，所述的組為(a)編碼具有由ATCC保藏號(hào)97377所含的人cDNA表達(dá)的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；(b)編碼具有由ATCC保藏號(hào)97457所含的人cDNA表達(dá)的氨基酸序列的成熟多肽的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸；以及(d)包含(a)、(b)或(c)的多核苷酸的至少15個(gè)堿基的多核苷酸。
10.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1的第447-1717位核苷酸。
11.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1的第332-1717位核苷酸。
12.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:3的第1-564位核苷酸。
13.一種包括權(quán)利要求2的DNA的載體。
14.一種包括權(quán)利要求13的載體的宿主細(xì)胞。
15.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述的DNA編碼的多肽。
16.一種用于生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求12的載體基因工程化所述的細(xì)胞，從而表達(dá)由載體中所含的人cDNA編碼的多肽。
17.一種多肽，包括選自如下一組的成員(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸的多肽；(c)包括SEQ ID N0:4的第1-188位氨基酸的多肽；以及(d)與(a)、(b)或(c)的多肽具有至少70％相同性的多肽。
18.權(quán)利要求17的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO:2的第1-233位氨基酸。
19.權(quán)利要求17的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO:2的第39-233位氨基酸。
20.權(quán)利要求17的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO:4的第1-188位氨基酸。
21.一種抑制權(quán)利要求17的多肽的活化的化合物。
22.一種治療需要TNFδ的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求17的多肽。
23.一種治療需要TNFε的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求17的多肽。
24.權(quán)利要求22的方法，其中治療有效量的多肽是通過(guò)向患者提供編碼所述多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而給予。
25.權(quán)利要求23的方法，其中治療有效量的多肽是通過(guò)向患者提供編碼所述多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所述多肽而給予。
26.一種治療需要抑制TNFδ多肽的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求21的化合物。
27.一種治療需要抑制TNFε多肽的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求21的化合物。
28.一種診斷與權(quán)利要求17的多肽的表達(dá)不足相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括確定在編碼所述多肽的核酸序列中的突變。
29.一種診斷方法，包括分析來(lái)自宿主的樣品中是否存在權(quán)利要求17的多肽。
30.一種鑒定與權(quán)利要求17的多肽結(jié)合并抑制該多肽的活化的化合物的方法，包括將在其表面表達(dá)所述多肽的受體的細(xì)胞與分析學(xué)可檢測(cè)的TNFδ多肽以及一種化合物在允許與受體結(jié)合的條件下接觸，所述的受體與能夠提供應(yīng)答化合物與所述受體結(jié)合的可檢測(cè)信號(hào)的第二種組分相連；以及通過(guò)檢測(cè)從TNFδ與受體的相互作用產(chǎn)生的信號(hào)的不存在而確定是否該化合物結(jié)合受體并抑制受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及人TNFδ和TNFε多肽,編碼所述多肽的多核苷酸,生產(chǎn)所述多肽的方法,特別是通過(guò)表達(dá)所述多核苷酸生產(chǎn)所述多肽的方法,以及所述多肽的興奮劑和拮抗劑。本發(fā)明還涉及在研究、診斷和臨床中使用這些多肽、多核苷酸、興奮劑和拮抗劑的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1214050SQ96180213
公開(kāi)日1999年4月14日 申請(qǐng)日期1996年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月14日
發(fā)明者倪健, 余國(guó)良, 萊納·L·根茨, 帕特里克·迪龍 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司