專利名稱：具有免疫調(diào)節(jié)作用的新肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無抗原特異性的免疫調(diào)節(jié)，包括免疫抑制和免疫興奮。具體地說，本發(fā)明涉及能夠在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)肽及其治療作用和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)機(jī)能正常時，免疫系統(tǒng)保護(hù)個體免于感染和癌細(xì)胞生長。要發(fā)揮這些功能，免疫系統(tǒng)必須能夠識別并反擊侵入機(jī)體的外來抗原(包括癌特異性抗原)，但對機(jī)體正常細(xì)胞所帶的自身抗原不發(fā)生作用。
刺激免疫系統(tǒng)有可能提高其防護(hù)水平。疫苗，包括象白喉類毒素這樣的單蛋白抗原，被廣泛用于對某種特異性抗原及其疾病產(chǎn)生免疫性。免疫系統(tǒng)的一般性刺激有時可用象佐劑、白細(xì)胞介素、干擾素和集落刺激因子這類非特異性抗原來產(chǎn)生。
有時，免疫系統(tǒng)失去了區(qū)別自身和異己這種重要能力。由此而導(dǎo)致的對于個體自身組織的免疫攻擊會形成自身免疫病例如，紅斑狼瘡、I型糖尿病，或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在這種情況下，或當(dāng)個體是組織或器官移植地受體時，人們希望的是免疫抑制而非免疫興奮。
通常用皮質(zhì)類固醇、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素、他利莫司(FK506)、雷帕霉素或麥考酚酸嗎啉乙酯治療可引起免疫應(yīng)答的非特異性抑制。一些免疫球蛋白，包括單克隆抗體OKT3，也可用于這個目的。對一種特異性抗原的免疫抑制，又稱“耐受誘導(dǎo)”，也是有可能發(fā)生的。已有許多方法用于誘導(dǎo)對于某一特定抗原的耐受，其中包括靜脈內(nèi)或重復(fù)性局部施用稀釋的抗原、極高劑量抗原治療法和口服抗原法。
EP635621描述了一種口服給藥系統(tǒng)，它特別依賴于一種表面有一層正電性多糖薄膜的可膠凝的水狀膠體，膠體內(nèi)可摻入一種藥物(肽)。
WO94/20136描述了一種在糊精復(fù)合物中引入藥物活性肽的方法。該肽可作為受體激活劑、受體拮抗劑及疫苗。該方法表明，長度在3～20個氨基酸的肽大多數(shù)都不穩(wěn)定，易喪失其生物活性。這些肽并未指明含有半胱氨酸殘基。該方法指出糊精的應(yīng)用提高了這些肽的穩(wěn)定性。
EP566135描述了一種系統(tǒng)，以口服給藥的方式，使與胞苷核苷酸衍生物相連接的肽作用于粘膜系。EP566135指出，當(dāng)口服且沒有某些保護(hù)或穩(wěn)定性物質(zhì)時，肽或蛋白會失去活性，同時還引述了許多專利申請，這些申請聲稱對于肽的口服的穩(wěn)定問題提供了不同的解決方法。
患者的不適與采用注射法施用肽或蛋白有關(guān)，除此以外，實際使用的肽或蛋白的總量還可引起毒副作用。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些肽具有免疫調(diào)節(jié)劑的活性。一個與免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)的令人驚訝的性質(zhì)是，該活性具有免疫抑制或免疫興奮作用，在此和其它實驗基礎(chǔ)上，免疫調(diào)節(jié)活性已顯示出對某些疾病具有治療效果，例如癌癥和關(guān)節(jié)炎。此外，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過口服作用于上皮細(xì)胞時，肽的作用與腫瘤生長的調(diào)節(jié)有關(guān)。一個更令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，口服本發(fā)明的“裸”肽無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑。因此，本發(fā)明的肽不需要與傳送載體(例如提高向內(nèi)臟粘膜上皮細(xì)胞傳送能力的泡狀載運體系)這類轉(zhuǎn)運藥劑聯(lián)合施用。另外還發(fā)現(xiàn)，要達(dá)到同樣的療效，口施用藥的肽量要顯著低于全身給藥方式，例如腸胃外注射。
本發(fā)明的目的之一是提供一種用免疫調(diào)節(jié)肽治療疾病的有效方法。
本發(fā)明的另一目的是提供可用于治療疾病的免疫調(diào)節(jié)肽。
本發(fā)明的其他一些目的可從下列的描述和實施例中體現(xiàn)。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種純化的具有生理活性的肽，其至少包含兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔離，該肽可被哺乳動物上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。
這些肽由分別具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基組成脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈。本發(fā)明的肽必須具有生理活性，即它們必須能夠誘導(dǎo)一種免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。適宜的氨基酸可獨立地選自天然和非天然的氨基酸。天然氨基酸殘基的實例包括Ile、Leu、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Met、Val和His。因此，本發(fā)明的肽可包含附加的半胱氨酸殘基，其既可相鄰又可遠(yuǎn)離上文所提及的至少兩個半胱氨酸殘基。技術(shù)人員知道，天然氨基酸殘基就是指那些存在于活體組織的肽和/或蛋白質(zhì)中的氨基酸。技術(shù)人員也知道，這些天然氨基酸殘基可以化學(xué)修飾的形式出現(xiàn)于本發(fā)明的肽中，這些化學(xué)修飾包括加入諸如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基、叔丁基等在內(nèi)的保護(hù)基團(tuán)。技術(shù)人員應(yīng)該知道，任何出現(xiàn)于本發(fā)明的肽中的保護(hù)性基團(tuán)基本上不會干擾其免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，因而對其治療效果無礙。
本發(fā)明的純化肽可人工合成，如通過化學(xué)方法，或用DNA重組技術(shù)獲得?；蛘撸景l(fā)明的肽可從多肽或蛋白質(zhì)等分離。
本發(fā)明的肽由兩個相同或不同的肽單體通過二硫鍵結(jié)合成二聚體，第一肽與第二肽單體都包含至少兩個半胱氨酸殘基，第一肽單體的至少一個半胱氨酸殘基通過二硫鍵與第二肽單體的至少一個半胱氨酸殘基連接。一方面，這些肽通過二硫鍵彼此連接，即第一肽單體的至少兩個半胱氨酸殘基通過二硫鍵與第二肽單體的至少兩個半胱氨酸殘基連接。本發(fā)明的二聚體可為平行形式，這兩個肽單體彼此平行排列，使得兩肽都可從一個方向讀出，例如從N-末端到C-末端。形成二聚體的肽單體長度可相同或不同。優(yōu)選方案為，兩肽長度相同，且一種單體的N-和C-末端氨基酸殘基相鄰于第二條肽單體的N-和C-末端氨基酸殘基。或者，本發(fā)明的二聚體可反平行排列。也就是說，自N-末端到C-末端閱讀的第一單體與自C-末端到N-末端閱讀的第二單體對應(yīng)排列，即第二單體為第一肽單體的反方向；按上述描述，本發(fā)明的平行或反平行二聚體是通過二硫鍵將兩個肽單體的半胱氨酸殘基相連接。當(dāng)形成本發(fā)明的肽二聚體的兩個肽單體彼此不同時，該二聚體被稱為異二聚體。異二聚體可以是平行或反平行形式。因此，異二聚體可以由兩個同樣長度的肽單體組成，例如，兩肽可因L-型氨基酸殘基被D-型氨基酸殘基替換而不同。另外，構(gòu)成二聚體的肽單體可以有不同的長度。優(yōu)選地，形成本發(fā)明二聚體的第一肽和第二肽應(yīng)完全相同。
本發(fā)明的肽也包括這樣的單體，其中至少兩個連續(xù)或間隔排列的必需半胱氨酸殘基通過二硫橋連接。這些單體可為鏈狀或環(huán)狀。優(yōu)選地，單體應(yīng)為鏈狀。
此處的實施例表明，施用本發(fā)明的肽，例如口服，氣管內(nèi)、鼻腔或腸胃外給藥，會產(chǎn)生明顯的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答。
“上皮細(xì)胞層”定義為覆蓋于機(jī)體內(nèi)表面和外表面(包括管系和其他小腔)的細(xì)胞層及其相關(guān)細(xì)胞。對于本發(fā)明而言，上皮細(xì)胞為至少一層和至多層細(xì)胞層?！吧掀ぜ?xì)胞層”這一范疇還包括特化的淋巴組織和其他細(xì)胞，即那些位于上皮細(xì)胞層中或與之相關(guān)的、對免疫應(yīng)答有影響的細(xì)胞，例如T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、腸細(xì)胞、NK-細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞和包含與粘膜相關(guān)的淋巴組織(MALT)在內(nèi)的細(xì)胞，如集合淋巴結(jié)等。因此技術(shù)人員知道，所謂的游移細(xì)胞。如屬于上述的上皮細(xì)胞層中的I-淋巴細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞這樣的短暫停留細(xì)胞，也屬于上皮細(xì)胞的范疇。本發(fā)明的肽可被上皮細(xì)胞層主動或被動吸收。例如，肽可被細(xì)胞表面吸收，或被位于上皮細(xì)胞層內(nèi)表面的的細(xì)胞主動或被動吸收，還可從上皮細(xì)胞內(nèi)表面的細(xì)胞間穿過而被位于上皮細(xì)胞層更深處的細(xì)胞吸收，如T-淋巴細(xì)胞或集合淋巴結(jié)。技術(shù)人員知道，此處所指的“吸收”包括這樣的情況，即本發(fā)明肽無需物理性穿透上皮細(xì)胞，其通過與膜內(nèi)或膜上的細(xì)胞表面受體作用而引發(fā)免疫應(yīng)答，這些細(xì)胞為位于上皮細(xì)胞內(nèi)的某些特化細(xì)胞，如腸細(xì)胞和內(nèi)皮淋巴細(xì)胞。因此，可以理解，本發(fā)明的肽可以作用于上皮細(xì)胞層，結(jié)合于上皮細(xì)胞層，通過或穿透上皮細(xì)胞層。
本發(fā)明肽的優(yōu)選施用法為以口服劑、鼻用藥劑或氣管內(nèi)制劑方式進(jìn)行口腔、鼻腔或氣管內(nèi)給藥。已發(fā)現(xiàn)，要達(dá)到某一療效，口腔給藥時本發(fā)明肽的用藥量明顯低于其他的用藥方式，如腸胃外給藥。
一方面，本發(fā)明提供了一種包含一種免疫調(diào)節(jié)肽的口服劑，該肽包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔離，并被哺乳動物消化道上皮細(xì)胞層吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。該肽可以是單體或二聚體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一種免疫調(diào)節(jié)肽的口服劑，這些肽都包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔離，且這些肽中至少一種被哺乳動物消化道上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效，其中，要在某一哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生一同樣顯著的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答，至少一種口服肽的用量低于腸胃外給藥時該藥的至少一種肽的用量。
另一方面，本發(fā)明提供了一種鼻用藥劑形式的免疫調(diào)節(jié)肽，它包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，并被哺乳動物鼻腔通道上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一種免疫調(diào)節(jié)肽的鼻用藥劑，這些肽都包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，且這些肽中至少一種被哺乳動物鼻腔通道上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效，其中，要在某一哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生一同樣顯著的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答，至少一種鼻用藥劑肽的施用量低于腸胃外給藥時該藥的至少一種肽的施用量。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含一種免疫調(diào)節(jié)肽的氣管內(nèi)制劑，該肽包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，并被哺乳動物肺部上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包含至少一種免疫調(diào)節(jié)肽的氣管內(nèi)制劑，這些肽都包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，且這些肽中至少一種被哺乳動物肺部上皮細(xì)胞吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效，其中，要在某一哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生一同樣顯著的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答所需的至少一種氣管內(nèi)制劑的肽的用量低于腸胃外給藥時該藥的至少一種肽的用量。
本發(fā)明的肽可為任意長度，只要它們能夠誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答并具治療效果。通常，本發(fā)明的肽為4～30個氨基酸殘基的短肽。優(yōu)選地，肽的長度應(yīng)為4～約20個氨基酸殘基。更優(yōu)選地，本發(fā)明的肽為4～15個氨基酸殘基長度(例如4～10或4～9)，而4～7個氨基酸長度為最優(yōu)選。例如，肽可為4、5、6、7或8個氨基酸長度，具有或不具保護(hù)性基團(tuán)。
本發(fā)明的肽可以與此處所指的轉(zhuǎn)運藥劑結(jié)合，也可不結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽是以“裸露”形態(tài)施用，即無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑。附加的轉(zhuǎn)運藥劑是指這樣一類物質(zhì)，即在施用前、施用時或施用后，可與本發(fā)明的肽有意識地接觸或結(jié)合，從而促進(jìn)肽的吸收和/或增加肽的穩(wěn)定性。
因此，更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種純化的無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑的生理活性肽，該肽長度為4～15個氨基酸殘基，包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，該肽被哺乳動物上皮細(xì)胞層吸收而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。該肽可為單體，或由相同或不同的肽組成的二聚體。
本發(fā)明的適宜的肽將以下列通式描述
通式(I)
(A)n-X-Cys-Cys-Y-(B)m(I)
其中
每個A獨立地選自H，一個保護(hù)基團(tuán)如乙基、三苯甲基(Trt)，烯丙基和叔丁基，或至少一個氨基酸殘基，它獨立地選自具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈；
n是一個選自1～11的整數(shù)；
X選自NH和具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈和脂肪族側(cè)鏈。優(yōu)選地，X應(yīng)選自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala或NH。
Y選自NH和具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基仲氨基基團(tuán)、脂肪族側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈、芳香側(cè)鏈和酰胺側(cè)鏈。優(yōu)選地，Y應(yīng)選自Pro、Gly、Leu、Glu、Val、Ile、Ser、Phe、Tyr、Thr、Asp、Gln或NH；
每個B獨立地選自包括H，OH，NH2，一個保護(hù)基團(tuán)如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一個氨基酸殘基，它獨立地選自具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈；
m是一個選自1～11的整數(shù)；
條件是當(dāng)A不是至少一個氨基酸殘基時n為1，當(dāng)B不是至少一個氨基酸殘基時m為1；整個肽鏈包含不超過15個氨基酸殘基。
當(dāng)A和/或B代表一個氨基酸殘基或一個氨基酸殘基序列時，此氨基酸殘基或殘基序列可包含天然氨基酸殘基，例如上述的氨基酸殘基或其類似物，也可包含非天然氨基酸殘基，如人工合成的氨基酸殘基和其類似物，亦可同時包含天然氨基酸殘基和/或其類似物與非天然氨基酸殘基和/或其類似物。
技術(shù)人員知道，屬于通式(I)范疇中的肽，其分子間的二硫橋出現(xiàn)于兩半胱氨酸殘基之間。這種肽代表了通式(I)肽的氧化形式。顯然，通式(I)的肽可為平行或反平行排列的同二聚體或異二聚體。這些同二聚體或異二聚體由通式(I)中的單體肽構(gòu)成，并通過半胱氨酸殘基由二硫鍵連接。
亦屬于本發(fā)明范疇的是通式(I)肽的藥用鹽或其生理功能衍生物，以及其藥用載體。
依照通式(I)，本發(fā)明的優(yōu)選肽如下
X是Gly，Y是Gly；
X是Pro，Y是Pro；
X是Pro，Y是Val；
X是Ile，Y是Leu；
X是Pro，Y是Glu；
X是Glu，Y是Tyr；
X是Pro，Y是Phe；
X是Glu，Y是Phe；
X是Ala，Y是Val；
X是Val，Y是Ile；
X是Gln，Y是Ser；
X是Ile，Y是Thr；
X是Leu，Y是Asp；
X是Asp，Y是Ile；
X是Leu，Y是Gln；
X是Gly，Y是Asn；
X是Gly，Y是Pro；或
X是Ala，Y是Gly；
其中A和B按上述定義。
依據(jù)本發(fā)明的通式(I)，其它的更優(yōu)選肽為
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro；
Ac Ala Pro Cys Cys Val Pro；
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala；
Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr；
Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；
Ala Pro Cys Cys Glu Ser；
Pro Ala Cys Cys Gly Pro；
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
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Pro Gly Cys Cys Gly Pro
依據(jù)本發(fā)明的通式(I)，其它的更優(yōu)選肽為
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Arg Cys Ser Cys Cys Asn；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Pro Ala Cys Cys Gly Pro；
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
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Pro Gly Cys Cys Gly Pro
應(yīng)當(dāng)理解，上述肽中分別位于C-末端和N-末端的氨基酸殘基不包含修飾。
通式(II)
(A)n-X-Cys-Z-Cys-Y-(B)m(II)
其中
每個A獨立地選自H，一個保護(hù)基團(tuán)如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一個氨基酸殘基，它獨立地選自具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的L-型或D-型氨基酸殘基脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈；
n是一個選自1～10的整數(shù)；
X選自NH和具有以下側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基脂肪族側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酸性側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈，酰胺側(cè)鏈。優(yōu)選地，X應(yīng)選自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala、Lys或NH；
Z選自具有脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈的氨基酸殘基。優(yōu)選地，Z選自Ile、Gly、Thr、Ala和Lys。
Y選自具有以下側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基酰胺側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，脂肪族側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈和仲氨基基團(tuán)。優(yōu)選地，Y選自Pro、Gly、Glu、Val、Gln和Arg；
B獨立地選自包括H、OH、NH2，一個保護(hù)基團(tuán)如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一個具有下列側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈，芳香側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈；
m是一個選自1～10的整數(shù)；
條件是當(dāng)A不是至少一個氨基酸殘基時n為1，當(dāng)B不是至少一個氨基酸殘基時m為1；每條肽鏈包含不超過15個氨基酸殘基。
對于通式(I)，顯然，當(dāng)A和/或B代表一個氨基酸殘基或一個氨基酸殘基序列時，此氨基酸殘基或殘基序列可包含天然氨基酸殘基，例如上述的氨基酸殘基或其類似物，也可包含非天然氨基酸殘基，如人工合成的氨基酸殘基和其類似物，亦可同時包含天然氨基酸殘基和/或其類似物與非天然氨基酸殘基和/或其類似物。
技術(shù)人員知道，屬于通式(II)范疇中的肽，其分子間的二硫橋出現(xiàn)于兩個連續(xù)排列或隔開開的半胱氨酸殘基之間。這種肽代表了通式(II)肽的氧化形式。
技術(shù)人員同樣知道，通式(II)的二聚體可為平行或反平行排列，也可包含異二聚體，通過二硫鍵與兩單體的半胱氨酸殘基連接。亦屬于本發(fā)明范疇的是，通式(II)肽的藥用鹽或其生理功能衍生物，及其藥用載體。
依照通式(II)，本發(fā)明的優(yōu)選肽如下
Val Cys Ile Cys Gln；
Val Cys Gly Cys Arg；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Phe Cys Ile Cys Lys；
Ala Cys Lys Cys Gln；
Lys Cys Arg Cys Lys；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Leu Cys Ala Cys Val；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
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Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly；
Val Cys Gly Cys Arg
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Val Cys Gly Cys Arg.
本發(fā)明的肽可與轉(zhuǎn)運藥劑一起使用，或不需轉(zhuǎn)運藥劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可以無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑而由口腔、氣管內(nèi)、鼻腔、或機(jī)體施用。更優(yōu)選地，本發(fā)明的肽應(yīng)由氣管內(nèi)、鼻腔、或口腔施用。最優(yōu)選地，本發(fā)明的肽應(yīng)口腔施用?！稗D(zhuǎn)運藥劑”包括傳送的附加手段，如泡狀傳送、微粒、脂質(zhì)體等系統(tǒng)，這些方法用于將藥物(例如肽)運送到上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)運藥劑”也包括化學(xué)藥劑或附加的肽段，它們與藥物肽發(fā)生耦聯(lián)、融合或與之混合，并有助于維持本發(fā)明肽段的生理學(xué)活性，例如以預(yù)前肽或前肽形式提供肽、將肽與載運蛋白(如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)融合、或與化學(xué)藥劑如環(huán)狀糊精等混合。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽以自由肽形式與常規(guī)佐藥、賦形劑和藥物制劑中常用的稀釋劑一起施用。因此，本發(fā)明的肽可以以簡單的口腔或全身制劑形式由口腔或全身給藥，這些制劑包含口腔和全身藥劑通常采用的佐劑、稀釋藥和賦形劑。優(yōu)選地，該肽以口服劑形式施用，無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑。
已發(fā)現(xiàn)粘膜相關(guān)的淋巴組織(MALT)也存在于消化道的上皮細(xì)胞，即食道、胃、十二指腸、回腸和結(jié)腸；肺部的支氣管系；和鼻腔通道的表層。雖然理論上尚未證實，但具認(rèn)為本發(fā)明的肽可與MALT作用并導(dǎo)致一系列免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答從而對某些疾病起治療作用。
免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答在功效上可以是免疫抑制或免疫興奮。已有跡象顯示免疫應(yīng)答可用于治療癌癥。現(xiàn)已表明，在對起源于間充質(zhì)的癌癥如肉瘤的治療中，具有免疫調(diào)節(jié)作用的本發(fā)明肽有優(yōu)勢，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤或脊椎肉瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤或間皮肉瘤；白血病和淋巴瘤如粒細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病、淋巴細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀組織細(xì)胞肉瘤或何杰金氏?。蝗饬鋈缙交∪饬龌驒M紋肌肉瘤、上皮細(xì)胞腫瘤如鱗狀上皮癌、基底細(xì)胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭狀腺癌、乳頭狀腺瘤、囊腺癌、髓樣癌、未分化癌、支氣管癌、黑素瘤，腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、膽管腺癌、乳頭狀癌、轉(zhuǎn)移細(xì)胞癌、絨毛膜癌、semonoma或胚胎瘤；及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤或室管膜瘤。本發(fā)明肽依其活性可用于治療惡性腫瘤如黑素瘤、乳癌、胃腸道癌如結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、頭頸部鱗狀上皮癌。而且，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的上述肽可治療與自身免疫疾病相關(guān)的急性和/或慢性感染，如無肥胖的糖尿病、全身性紅斑狼瘡、韌帶硬化、斯耶格倫綜合癥、皮肌炎或多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈硬化，和牛皮蘚、哮喘、鼻炎、纖維化、慢性支氣管炎、肝炎、感染后無反應(yīng)癥、獲得性免疫缺損癥如AIDS、以及創(chuàng)傷后免疫無反應(yīng)癥。
此外，依據(jù)本發(fā)明，這些具有免疫調(diào)節(jié)作用的肽作為佐劑非常有益，可應(yīng)用于各種疫苗制劑和抑制移植器官排異的制劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，該方法包括將純化的具有生理活性和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物肽作用于哺乳動物上皮細(xì)胞層，這種肽包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，并能夠誘導(dǎo)上述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。
再一方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，其包括1)確定需要調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答的一種哺乳動物，2)將純化的具有生理活性的藥物肽作用于哺乳動物至少一種上皮細(xì)胞，該肽無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑，具有4～15個氨基酸殘基，并包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，并能夠誘導(dǎo)上述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。優(yōu)選地，消化道上皮細(xì)胞層為肽的作用對象。最優(yōu)選地，肽應(yīng)作用于MALT。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，此方法包括將通式(I)的具有生理活性劑量的肽作用于哺乳動物MALT，該肽無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑，并能夠誘導(dǎo)上述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。該肽可以是單體或二聚體。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，此方法包括將通式(II)的具有生理活性劑量的肽作用于哺乳動物MALT，該肽無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑，并能夠誘導(dǎo)上述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答進(jìn)而產(chǎn)生抗病療效。該肽可以是單體或二聚體。
進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了長度為4～15個氨基酸殘基的生理活性肽在藥劑制備中的應(yīng)用，該肽包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，且無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑。本發(fā)明肽可用于治療以上例舉的一些特殊形式的癌癥。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了通式(I)具有生理活性且無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑的肽在藥劑制備中的應(yīng)用，特別是對癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。同樣，本發(fā)明提供了通式(II)具有生理活性且無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑的肽在藥劑制備中的應(yīng)用，特別是對癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的另一實施方案中提供了通過化學(xué)過程生產(chǎn)本發(fā)明肽的方法，在此法中單個氨基酸殘基或本發(fā)明的肽段通過肽鍵連接，并在此過程的開始和/或結(jié)束時加入保護(hù)性基團(tuán)。
本發(fā)明的另一實施方案中，作為本發(fā)明的可選方面，提供了可用于治療的無需附加的轉(zhuǎn)運藥劑的生理活性肽，該肽長度為4～15個氨基酸殘基，包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔開，該肽可治療如癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。更者，本發(fā)明提供了可用于治療例如癌癥或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的通式(I)或通式(II)的肽。
在治療癌癥或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過程中，通式(I)或通式(II)的肽的施用量顯然會不同，這一點醫(yī)生或獸醫(yī)應(yīng)始終慎重考慮。要考慮的因素包括要治療的疾病狀況、用藥途徑、藥劑性質(zhì)、體重、表面積、年齡、一般條件和所施用的特殊肽。本發(fā)明肽的適宜的有效劑量按體重一般約為0.0001μmol/kg至1000μmol/kg，優(yōu)選地，按體重約為0.003μmol/kg至300μmol/kg，例如在約0.001μmol/kg至100μmol/kg范圍內(nèi)，例如，0.03μmol/kg至3.0μmol/kg?？倓┝靠梢允且淮位蚨啻斡盟幜浚缑刻?～6次。例如，對于一個75公斤的哺乳動物(如人)，用藥量約2.25μmol/kg/天至225μmol/kg/天，通常肽的劑量為100μmol。如果是多次施用，本發(fā)明肽的服法通常為每天至多4次，每次25μmol。本發(fā)明肽也可隔天施用或每周一至兩次。當(dāng)然，合適的施用方法應(yīng)在醫(yī)生或獸醫(yī)的指導(dǎo)下進(jìn)行。
雖然活性肽可以單獨施用，但將其制成藥劑則更好。本發(fā)明的制劑包含通式(I)或通式(II)的肽或其鹽，和一種或數(shù)種合適的藥用載體，以及其它一些任選的治療成分。這些載體應(yīng)是藥物學(xué)可接受的，即與制劑的其它成分相容并基本上對患者無害。顯然，上述肽的游離酸加成鹽(如鹵酸鹽)及堿鹽都屬于本發(fā)明范疇。最優(yōu)選地，這些鹽是藥物學(xué)可接受的。
適合的酸性附加鹽由下列物質(zhì)形成鹽酸、氫溴酸、硝酸、高氯酸、磺酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、苯甲酸、谷氨酸、草酸、天門冬氨酸、丙酮酸、醋酸、琥珀酸、延胡索酸、草酸、羥乙基磺酸、硬脂酸、酞酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸、乳糖酸和葡萄糖醛酸。合適的堿鹽包括無機(jī)堿鹽如堿金屬(如鈉和鉀)鹽和堿土金屬(如鈣)鹽；有機(jī)堿鹽如苯基乙基芐胺、二芐基乙二胺、乙醇胺和雙乙醇胺鹽；和氨基酸鹽如賴氨酸和精氨酸鹽。最優(yōu)選地，這些鹽是藥物學(xué)可接受的。
因而，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥劑，其包含通式(I)或通式(II)的肽及合適的藥用載體。
自然，任何包含通式(I)肽的藥學(xué)制劑可以包含不止一種通式(I)的肽。因此，一種藥學(xué)制劑可以包含至少兩種通式(I)或(II)的肽，或一種通式(I)或(II)的肽的混合物。換言之，該藥劑可包含至少兩種肽，其中至少一種選自通式(I)并且至少一種選自通式(II)，并可包含選自通式(I)或(II)的肽的混合物。
本發(fā)明還提供了一種藥劑的制備方法，其包括將本發(fā)明的肽，例如至少一種通式(I)的肽和/或至少一種通式(II)的肽或它們的生理功能衍生物，與一種合適的藥學(xué)載體耦聯(lián)。
本發(fā)明的肽及其生理功能衍生物在合適的治療條件下可以通過任何途徑施用，這些途徑包括口腔、氣管內(nèi)、直腸、鼻腔、局部(包括頸部和舌下)、陰道和腸外(包括皮下、肌肉、靜脈、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)和硬膜外)。應(yīng)注意，用藥途徑會因例如病人的狀況而變化。優(yōu)選制劑為適于口腔、鼻腔或氣管內(nèi)施用的制劑。最優(yōu)選劑型為適于口腔施用的制劑。
在口腔局部施用的制劑包括糖錠，其包含處于通常為蔗糖、金合歡膠和黃蓍膠一類的香味基質(zhì)中的肽；錠劑，其包含處于諸如明膠和甘油、或蔗糖和金合歡膠一類惰性基質(zhì)中的活性成分；漱口藥，其包含肽及合適的液體載體。
適于口服的本發(fā)明制劑可為分立單位，如膠囊、扁形膠囊劑，片劑、含有肽和通常為蔗糖、金合歡膠和黃蓍膠一類香味基質(zhì)的糖錠；含活性成分及諸如明膠和甘油、或蔗糖和金合歡膠一類惰性基質(zhì)的錠劑；含有活性成分及合適液體載體的漱口藥。每種制劑一般包含確定劑量的活性肽，以粉末或顆粒、水性或非水性的溶液或懸液如糖漿、配劑、乳劑或飲劑等形式存在。
片劑可由壓擠或鑄模生產(chǎn)，并可任選一種或多種輔助成分。壓制的片劑可用適當(dāng)?shù)臋C(jī)器將非流質(zhì)形態(tài)(如粉末或顆粒)的活性肽壓擠而成，并可任意與下列物質(zhì)混合結(jié)合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙甲基纖維素)，潤滑劑、惰性稀釋劑、保存劑、分散劑(例如淀粉、羥乙酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、羥甲基纖維素鈉)，表面活性或彌散劑。鑄模的片劑可用適當(dāng)?shù)臋C(jī)器將惰性液體稀釋劑調(diào)配的肽鑄模而成。該片劑可任選涂層或刻痕，這樣可使藥物在使用過程中緩慢或可控釋放其活性成分，例如，羥丙甲基纖維素以不同的比例釋放所要求的劑量。
糖漿可由活性肽加入濃縮的糖的水溶液而制成，例如蔗糖，也可加入其它的必需成分。這類必需成分可包含香料，防止糖結(jié)晶的藥劑或能促進(jìn)其它成分溶解的藥劑，例如象甘油或山梨醇一類的多羥基醇。
除了上述的成分外，本發(fā)明的制劑還可包含一種至數(shù)種下列成分稀釋劑、緩沖劑、香料、結(jié)合劑、表面活性劑、增稠劑、潤滑劑、保存劑(包括抗氧化劑)等。
對本發(fā)明制劑適用的乳化劑和乳液穩(wěn)定劑包括吐溫60、斯潘80、鯨十八烷?；?、單硬脂酸、甘油酯和月桂磺酸鈉。
選擇適于本制劑的油或脂應(yīng)基于要獲得的治療性質(zhì)，因為對于大多數(shù)藥物乳劑常用的油，活性化合物的溶解度很低。因此脂油最好應(yīng)為無油膩、無污染和可洗的物質(zhì)，具有適當(dāng)?shù)膹姸纫苑乐箯墓軤罨蚱渌萜髦行孤??？捎玫臑橹辨溁蚓哂蟹种ф湹摹嘻}或二鹽烷基酯如二異己二酸酯、異十六烷硬脂酸酯、可可酸乙二醇丙烯酯、異丙基肉豆蔻酯、癸基油酸酯、棕櫚酸丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕櫚酸酯或一種被稱為CrodamolCAP具有支鏈的酯的混合物，后三種為優(yōu)選酯。根據(jù)所需性質(zhì)，它們可單獨或混合使用。另外，高熔點脂如白凡士林和/或液狀石蠟或其它礦物油也可使用。
直腸施用的制劑可制成任何適宜的形式，例如具有合適基質(zhì)的栓劑，其包含本發(fā)明肽與中性脂基(如可可油)的混合物，或者與水楊酸鹽的混合物；或者制成溶液或懸液的形式。另外，膠狀直腸膠囊制劑包含本發(fā)明的活性肽與植物油或石蠟油之混合物。
適合鼻腔給藥、載體為固體的制劑包括粗粉末，例如顆粒大小為20～500微米范圍。當(dāng)顆粒大小從根本上取決于顆粒狀的活性物質(zhì)時，顆粒大小應(yīng)在2～500微米之間。粗粉末制劑施用法為，將裝有粉末的藥瓶靠近鼻子并快速吸入呼吸道。載體為液體的制劑，如適于鼻腔噴霧或鼻腔點滴的制劑，包括該活性成分的水性或油性溶液。因此，本發(fā)明肽可制成加壓的定量的吸入劑或干粉吸入劑，用于口腔或鼻腔攝入，或制成液劑用于噴霧?；钚噪谋晃⒓?xì)化或處理成顆粒，其大小要適合于吸入治療(總平均直徑＜10μm)。
作為加壓的定量的吸入劑，微細(xì)化的肽可懸浮于一種液體噴射劑或液體噴射劑的混合物。這種噴射劑也可作為溶劑，但并非必須。另外，微細(xì)化的肽還可裝入具有如一定規(guī)格的瓶中。
合適的噴射劑包括那些在此領(lǐng)域常用的如氫氟烷烴(HFA)。HFA噴射劑可制成任何適于將本發(fā)明肽送至MALT的混合物。用于本發(fā)明的合適的HFA實例包括四氟乙烷(如噴射劑134a(Hoechst))和七氟丙烷(如噴射劑227(Hoechst))。自然，很明顯這類制劑還可包含適當(dāng)濃度的表面活性劑，例如三油酸脫水山梨糖醇、卵磷脂、油酸等，表面活性劑的使用可增加肽制劑的物理穩(wěn)定性。該制劑也可含有溶劑如乙醇，以提高肽在所選噴射劑中的溶解度。
本發(fā)明的活性肽可通過適于干粉吸入的呼吸設(shè)備吸入，如便攜式呼吸器等。在這些干粉制劑中，本發(fā)明的活性肽可單獨使用，或與諸如乳糖、甘露醇或葡萄糖之類的載體結(jié)合使用。載體的選擇不是很嚴(yán)格，只要其基本無損于本發(fā)明肽的生理作用。粉劑還可包括其它一些添加劑，以例如保持穩(wěn)定性等。再者，這些添加劑應(yīng)基本不與本發(fā)明肽的生理及治療作用相抵觸。呼吸設(shè)備可為現(xiàn)有的任何一種形式，如具有確定劑量的單劑量吸入器或多劑量吸入器，其劑量可通過測量刻度來計算或由確定劑量的包裝決定。
適于腸胃外施用的制劑適宜地包含活性混合物的無菌水制劑，它應(yīng)優(yōu)選地與受者的血液等滲。這類制劑適合包含一種本發(fā)明肽的藥物學(xué)和藥理學(xué)可接受的酸加成鹽溶液，并與受者血液等滲。
適用的制劑包括含有本發(fā)明肽的濃縮溶液或固體，用合適的溶劑稀釋可制成上述適于腸胃外施用的溶液。
本發(fā)明將通過下列非限制性實施例給以闡述。
1.肽的合成
需明確的是，在此處的本發(fā)明肽當(dāng)未指明其N-和C-末端基團(tuán)時，N-末端為氨基形式(NH2)，C-末端為羧基形式(-COOH)。
下列實施例中的肽采用與表1相同的編號方式，表1顯示了實施例43的結(jié)果。
實施例1Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
用于本合成過程的是Fmoc-嘌呤，其連接于一種由具有聚乙二醇支鏈的交叉連接的聚苯乙烯主鏈組成的樹脂(1.11g，0.18mmol/g，0.20mmol)，并與Rapp Polymer公司的連接物p-羧基-三苯甲烷聯(lián)合使用(Sheppard，R.C.，Williams，B.J.用于固相肽合成的對酸不穩(wěn)定的樹脂連接劑，國際肽、蛋白研究雜志，1982，20，451-454)。Nα-Fmoc-保護(hù)的L-氨基酸五氟苯購自Bachem公司和Millipore公司，Cys由一個三苯甲烷(Mrt)基團(tuán)保護(hù)。肽藥劑品質(zhì)的DMF和20％哌啶/DMF購自Millipore。連接劑1-酚三唑(HOBT)來自Fluka公司。合成過程在Millipore公司的9050+型肽合成器中進(jìn)行。
C-末端氨基酸、掛于樹膠的Tentagel S trt-Pro-Fmoc(1.11g，0.18mmol/g，0.20mmol)(來自Rapp Polymer公司)在DMF中浸泡30分鐘，然后向合成器中加入漿料。合成器不斷工作于解封閉、清洗和耦聯(lián)過程，每一循環(huán)8分鐘，在每個Fmoc-解封閉過程加入20％哌啶/DMF，并用HOBT(0.9mmol)活化Nc-Fmoc-保護(hù)的L-氨基酸五氟苯酯(0.8mmol)。將活化的氨基酸加入合成室并每次循環(huán)30分鐘。合成器中止合成過程時，對N-末端的Fmoc-基團(tuán)解封閉并用DMF進(jìn)行最終清洗。合成于樹脂上的肽被轉(zhuǎn)移至燒結(jié)的玻璃漏斗中，用MeOH(2×10ml)清洗兩次，并用CH2Cl2(3×10ml)清洗三次。樹脂于真空中干燥過夜，然后肽鏈側(cè)鏈去保護(hù)，并用二硫基乙烷/TFA 5/95(20ml)于室溫處理3小時將其從樹脂上分開。濾去樹脂并用3×10ml的醋酸沖洗。將與酸結(jié)合的部分蒸發(fā)，殘渣與醚研磨三次。
粗品肽溶于1/1的H2O/CH3CN并冰凍干燥。獲得的物質(zhì)經(jīng)HPLC純化，采用Gilson 305和306 HPLC裝置，其具有Kromasil 100-5C1825cm×22mm內(nèi)徑的留相體積(A＝0.1％TFA/H2O-B＝0.1％TFA/CH3CN5-80％/25min；10ml/min，220nm)。HPLC的結(jié)合部分經(jīng)冰凍干燥獲得84mg的本化合物。MH+(m/z)＝533
實施例2Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met的合成
按實施例1的相似方案制備Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met(39.6mg，54.7μmol)。將Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met溶于5％的醋酸水溶液(80ml)，用碳酸銨將此溶液調(diào)至pH6。
加入二甲基亞砜(60ml)，在室溫下將此混合物攪拌24小時。之后，將此反應(yīng)混合物在真空中濃縮至8ml。此溶液通過半制備HPLC純化(APEX Prep Sil ODS，8μm，25cm×20mm內(nèi)徑，線性梯度洗脫為CH3CN，5-60％，0.1％TFA水溶液，50分鐘，流量10ml/min，220nm紫外監(jiān)測)，然后通過冰凍干燥得到本肽(19.7mg，50％為白色粉末)。按C28H51N8O8S3計算的HRMS(FAB+)嚴(yán)格質(zhì)量為723.299；實際獲得為723.302。
實施例3分子間氧化的平行二聚體的合成
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro (平行二聚體)
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Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro
要制備平行同質(zhì)二聚體，按實施例1的相似過程合成一種單肽鏈(Pro-Gly-Cys-Cys(Acm)-Gly-Pro)，其一個半胱氨酸帶有Acm(甲基乙酰胺)保護(hù)基團(tuán)而另一個半胱氨酸不帶保護(hù)基團(tuán)。按實施例2的相似過程，單體肽通過自由半胱氨酸的氧化而形成二聚體。第二個二硫橋采用Ruiz-Gayo法獲得(Ruiz-Gayo et al，1988，Tetrahedron Letters，29，3845-3848)，此法中單氧化的二聚體肽(100mg，83μmol)溶于MeOH(16ml)。加入新制備的0.2MI2/CH3OH(8.2ml，1.64mmol)，將此混合物于室溫攪拌2小時。向混合物中加入H2O(20ml)，然后緩慢加入0.5M抗壞血酸(aq)直至碘的顏色消失。在室溫下讓此混合物緩慢蒸發(fā)至原體積的一半。此粗品經(jīng)過冰凍干燥，然后用HPLC純化。
實施例4反平行二聚體的合成
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro(反平行二聚體)
×
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro
制備反平行同質(zhì)二聚體采用常規(guī)的Ruiz-Gayo法(Ruiz-Gayo et al，1988，Tetrahedron Letters，29，3845-3848)。按實施例1的相似方案合成兩種單肽鏈(Pro-Gly-Cys(Acm)-Cys-Gly-Pro和Pro-Gly-Cys-Cys(Acm)-Gly-Pro)，其各有一個半胱氨酸帶有Acm(甲基乙酰胺)保護(hù)基團(tuán)而另一個半胱氨酸不帶保護(hù)基團(tuán)。其中的一種單體肽中的未加保護(hù)的半胱氨酸用二硫吡啶活化，即將單體肽(62μmol)溶于異丙醇/2M醋酸(50/50，20ml)，并加入2，2’-二硫吡啶(205μmol溶于15ml異丙醇/2M醋酸(50/50))?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜。將混合物蒸發(fā)，然后加入CH3CN(25ml)并再次蒸發(fā)。殘留的粗品與醚(4×25ml)研磨，獲得的硫吡啶衍化物Pro-Gly-Cys(SPyr)-Cys(Acm)-Gly-Pro無需進(jìn)一步純化就可直接使用。將活化的肽鏈溶于0.01M醋酸銨溶液(50ml，pH＝6.5)，加入另一種肽鏈(溶于17ml 0.01M醋酸銨(aq))并攪拌30分鐘，使此活化衍生物與第二條肽鏈(62μmol)反應(yīng)。反應(yīng)混合物經(jīng)冰凍干燥，粗品經(jīng)HPLC純化得到單二硫橋二聚體。第二個二硫橋可按實施例3的相同方案獲得，其中CH3OH中的碘，經(jīng)過HPLC純化后，可促使終產(chǎn)物的形成。
實施例5Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例6Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例7Phe-Cys-Ile-Cys-Lys的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例8Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例9Arg-Cys-Ser-Gly-Cys-Cys-Asn的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例10分子內(nèi)氧化的Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例11分子內(nèi)氧化的Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例12分子內(nèi)氧化的Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例13分子內(nèi)氧化的Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例14分子內(nèi)氧化的Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例15分子內(nèi)氧化的Lys-Cys-Arg-Cys-Lys的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例16分子間氧化的反平行二聚體的合成
Val-Cys-Gly-Cys-Arg(反平行二聚體)
×
Val-Cys-Gly-Cys-Arg
合成按實施例4的相似方案進(jìn)行。
實施例17分子內(nèi)氧化的Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例18分子內(nèi)氧化的Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例19分子內(nèi)氧化的Leu-Leu-Phe-Gly-Pro-Cys-Cys-NH2的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例20分子內(nèi)氧化的Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例21Pro-Val-Cys-Cys-Ile-Gly的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例22分子內(nèi)氧化的Pro-Val-Cys-Cys-Ile-Gly的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例23分子內(nèi)氧化的Ser-Gln-Cys-Cys-Ser-Leu的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例24分子內(nèi)氧化的Ser-Ile-Cys-Cys-Thr-Lys的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例25Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例26Leu-Ala-Cys-Cys-Val-Val的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例27Pro-Gly-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例28Ac-Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行，在Millipore公司的9050+型肽合成器中，于合成過程的最后增加一個甲基化步驟，即在DMF中向樹脂增加0.3M N-乙酰咪唑，并使溶液在合成管中循環(huán)2小時，然后用DMF清洗。
實施例29Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例30Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例31Ala-Pro-Cys-Cys-Glu-Ser的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例32Pro-Ala-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例33Val-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例34Gly-Pro-Cys-Ile-Cys-Pro-Gly的合成
| |
Gly-Pro-Cys-Ile-Cys-Pro-Gly
合成按實施例3的相似方案進(jìn)行。
實施例35Val-Cys-Gly-Cys-Arg的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例36Val-Cys-Gly-Cys-Arg的合成
| |
Val-Cys-Gly-Cys-Arg
合成按實施例3的相似方案進(jìn)行。
實施例37Ile-Cys-Thr-Cys-Glu的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例38Ile-Cys-Thr-Cys-Glu的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例39Leu-Cys-Ala-Cys-Cal的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例40Asp-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例41Asp-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按實施例2的相似方案進(jìn)行。
實施例42Ala-Cys-Lys-Cys-Gln的合成
合成按實施例1的相似方案進(jìn)行。
實施例43延遲型過敏性(DTH)試驗
依據(jù)本發(fā)明，肽調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力可通過其在小鼠DTH試驗中的作用予以闡明。DTH試驗用于闡明免疫調(diào)節(jié)，例如下面引入作為參考的文獻(xiàn)就描述了這一方法，Carlsten H.，et al(1986)國際變態(tài)反應(yīng)應(yīng)用進(jìn)展，81322。肽按一或多種下列劑量試驗0.0003μmol/kg，0.003μmol/kg，0.03μmol/kg，0.3μmol/kg，3.0μmol/kg。
雄性和雌性的Balb/c小鼠取自Bomholtsgaard(丹麥)，每只體重為18～20克。DTH試驗用的抗原為4-乙氧亞甲基-2-苯基噁唑啉-5-one(OXA)(Sigma化學(xué)藥劑公司)。
在第0天，于小鼠去毛的腹部epicutaneous施加150μl含有3％OXA的乙醇-丙酮(3∶1)純?nèi)芤阂允蛊渲旅?。致敏后立即開始喂養(yǎng)處理，每天(上午)一次直至第6天，處理采用包括1～41號肽或媒介物(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，包含63％∶37％比例混合的緩沖液A和緩沖液B的混合物(緩沖液ANa2HPO4 0.89g/100ml，EDTA 0.05g/100ml；緩沖液BNaH2PO40.69g/100ml，EDTA 0.05g/100ml))。七天后，在所有小鼠雙耳的兩側(cè)用20μl溶于花生油的1％OXA進(jìn)行表面敷用來激發(fā)免疫應(yīng)答。在激發(fā)前24或48小時和激發(fā)后24或48小時，用Oditest彈簧測徑器測量耳的厚度。敷用和測量在輕度戊巴比妥麻醉下進(jìn)行。
依據(jù)van Loveren H.等(1984)免疫方法雜志67311所描述的方法對DTH反應(yīng)的強度進(jìn)行測量，并由公式表述為Tt24/48-Tt0μm單位，在各個測試(T)中的t0、t24和t48分別代表0時刻、敷用后+24小時或+48小時耳的厚度。結(jié)果表述為平均值+/-S.E.M.。由Student’s雙尾t檢測方法獲得各組平均值之間的顯著水平。與對照組(磷酸鹽緩沖液)相比，耳厚增減的顯著偏差反應(yīng)了肽的免疫調(diào)節(jié)作用。
表1給出了DTH試驗中用的1～41號肽的結(jié)構(gòu)。與對照組相比，在至少一種測試過的劑量下，這些肽在免疫興奮和免疫抑制作用方面顯示了明顯的差異。
表1在DTH試驗中引起免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的1～41號肽
1.Gly Pro Cys Cys Pro Gly
2.Gly Pro Cys Cys Pro Gly
3.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
4.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
5.Trp Pro Cys Cys Pro Trp
6.Leu Leu Phe Gly Pro Cys Cys NH2
7.Ala Pro Cys Cys Val Pro
8. Val Ile Cys Cys Leu Phr
9. Thr Pro Cys Cys Phe Ala
10.Glu Glu Cys Cys Phe Tyr
11.Pro Val Cys Cys Ile Gly
12.Pro Val Cys Cys Ile Gly
13.Val Cys Ile Cys Gln
14.Leu Ala Cys Cys Val Val
15.Val Cys Gly Cys Arg
16.Ser Gln Cys Cys Ser Leu
17.Lys Pro Cys Cys Glu Arg
18.Lys Cys Arg Cys Lys
19.Lys Glu Cys Cys Tyr Val
20.Ser Ile Cys Cys Thr Lys
21.Lys Leu Cys Cys Asp Ile
22.Pro Asp Cys Cys Ile Pro
23.Lys Glu Cys Cys Tyr Val
24.Asp Cys Ile Cys Gln
25.Ile Cys Thr Cys Glu
26.Ile Cys Thr Cys Glu
27.Leu Cys Ala Cys Val
28.Lys Leu Cys Cys Gln Met
29.Phe Cys Ile Cys Lys
30.Asp Cys Ile Cys Gln
31.Lys Leu Cys Cys Gln Met
32.Ac Ala Pro Cys Cys Val Pro
33.Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn
34.Ala Cys Lys Cys Gln
35.Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
| |
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
36.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
| |
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
38.Val Cys Gly Cys Arg
||
Val Cys Gly Cys Arg
39.Pro Gly Cys Cys Pro Gly
40.Ala Pro Cys Cys Glu Ser
41.Pro Ala Cys Cys Gly Pro
實施例44以不同途徑給藥時肽的免疫調(diào)節(jié)作用之比較
按照實施例43，用0.0003μmol/每公斤體重至3.0μmol/每公斤體重的劑量，給小鼠(10只組)口服和腸胃外注射(靜脈和皮下注射)肽(4號肽—衍生于SEQ ID NO.2)。按實施例43對這些動物進(jìn)行檢查；發(fā)現(xiàn)耳的厚度有變化。記錄每組小鼠(每組10只)的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以口服方式給肽比其它腸胃外方式給肽所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答更顯著。
實施例45以不同途徑給藥時肽二聚體(36號肽—衍生于SEQ IDNO.2)的免疫調(diào)節(jié)作用之比較
用0.03μmol/每公斤體重和3.0μmol/每公斤體重的劑量，給小鼠(10組)施用肽(36號肽)。按實施例43對這些動物進(jìn)行檢查；發(fā)現(xiàn)耳的厚度有變化。計算每組小鼠(每組10只)的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DTH試驗中肽二聚體產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答比對照組顯著，并發(fā)現(xiàn)以口服給藥比其它腸胃外方式給以相同劑量的肽所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答更強。
實施例46肽(1，2，7和4號肽；及8號肽)對腫瘤生長的作用
培養(yǎng)于等滲鹽溶液和5％同質(zhì)大鼠血清中的104個自發(fā)主長的大鼠乳房癌細(xì)胞皮下接種于Wistar大鼠的右后腿(每組8只)。腫瘤大小可通過觸診估計，也可用測徑器測量其第一直徑(a)即最大直徑和一個與之垂直的直徑(b)。腫瘤的體積用下面的公式計算
V＝0.4ab2
腫瘤的體積以mm3為單位，為每組大鼠的平均值(每組8只)。
藥物和對照(等滲鹽溶液)以管飼法(喂食管)給藥，在4～8和11～15天期間每天(上午)一次，投放下列肽
i)Gly Pro Cys Cys Pro Gly(1號肽(SEQ ID NO1 )3μmol/kg/day)；
ii)Ala Pro Cys Cys Val Pro(7號肽(SEQ ID NO5)0.03，0.3μmol/kg/day)；
iii)Val Ile Cys Cys Leu Thr(8號肽(SEQ ID NO6)0.03，0.3
μmol/kg/day)；和
iv)Pro Gly Cys Cys Gly Pro(4號肽(衍生于SEQ ID NO2)0.03，0.3
μmol/kg/day)；并在6-9天和13-20天，每天加入下肽
Gly Pro Cys Cys Pro Gly(2號肽(衍生于SEQ ID NO1)0.003，0.03，0.3，3.0μmol/kg/day)。
與對照在所有測藥劑量水平上相比，1、2和4肽的結(jié)果顯示，腫瘤的體積顯著減小。
序列表(1)一般信息 (i)申請人
(A)姓名ASTRA AB
(B)街道Vaestra Maelarehamnen 9
(C)城市Soedertaelje
(E)國別瑞典
(F)郵編S-151 85
(G)電話+46-8-553 260 00
(H)傳真+46-8-553 288 20
(I)電傳19237 astras (ii)發(fā)明名稱免疫調(diào)節(jié)肽 (iii)序列數(shù)目30 (iV)計算機(jī)可讀形式
(A)介質(zhì)類型軟盤
(B)計算機(jī)IBM PC兼容型
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ii)分子類型肽 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)定位1..6 (xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Pro Cys Cys Pro Gly 1 5(2)SEQ ID NO2的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)定位1..6 (xi)序列描述SEQ ID NO2
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
1 5(2)SEQ ID NO3的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)定位1..6 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO3
Trp Pro Cys Cys Pro Trp
1 5(2)SEQ ID NO4的資料 (i)序列特征
(A)長度7個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)定位1..7 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點
(B)定位7
(D)其它信息/產(chǎn)品＝”O(jiān)THER”/符號＝”Cys-NH2” (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位6..7 (xi)序列描述SEQ ID NO4
Leu Leu Phe Gly Pro Cys Xaa
1 5(2)SEQ ID NO5的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO5
Ala Pro Cys Cys Val Pro
1 5(2)SEQ ID NO6的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO6
Val Ile Cys Cys Leu Thr
1 5(2)SEQ ID NO7的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO7
Thr Pro Cys Cys Phe Ala
1 5(2)SEQ ID NO8的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO8
Glu Glu Cys Cys Phe Tyr
1 5(2)SEQ ID NO9的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO9
Pro Val Cys Cys Ile Gly
1 5(2)SEQ ID NO10的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO10
Val Cys Ile Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO11的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO11
Leu Ala Cys Cys Val Val
1 5(2)SEQ ID NO12的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO12
Val Cys Gly Cys Arg
1 5(2)SEQ ID NO13的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO13
Ser Gln Cys Cys Ser Leu
1 5(2)SEQ ID NO14的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO14
Lys Pro Cys Cys Glu Arg
1 5(2)SEQ ID NO15的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位2..4 (xi)序列描述SEQ ID NO15
Lys Cys Arg Cys Lys
1 5(2)SEQ ID NO16的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO16
Lys Glu Cys Cys Tyr Val
1 5(2)SEQ ID NO17的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO17
Ser Ile Cys Cys Thr Lys
1 5(2)SEQ ID NO18的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO18
Lys Leu Cys Cys Asp Ile
1 5(2)SEQ ID NO19的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO19
Pro Asp Cys Cys Ile Pro
1 5(2)SEQ ID NO20的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO20
Asp Cys Ile Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO21的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO21
Ile Cys Thr Cys Glu
1 5(2)SEQ ID NO22的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位2..4 (xi)序列描述SEQ ID NO22
Leu Cys Ala Cys Val
1 5(2)SEQ ID NO23的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO23
Lys Leu Cys Cys Gln Met
1 5(2)SEQ ID NO24的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO24
Phe Cys Ile Cys Lys
1 5(2)SEQ ID NO25的資料 (i)序列特征
(A)長度7個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO25
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn
1 5(2)SEQ ID NO26的資料 (i)序列特征
(A)長度5個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO26
Ala Cys Lys Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO27的資料 (i)序列特征
(A)長度7個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (xi)序列描述SEQ ID NO27
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
1 5(2)SEQ ID NO28的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO28
Pro Gly Cys Cys Pro Gly
1 5(2)SEQ ID NO29的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO29
Ala Pro Cys Cys Glu Ser
1 5(2)SEQ ID NO30的資料 (i)序列特征
(A)長度6個氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO30
Pro Ala Cys Cys Gly Pro
1 權(quán)利要求
1.一種純化的具有生理活性的肽，其包含至少兩個半胱氨酸殘基，這兩個殘基直接相連或被不多于一個氨基酸殘基隔離，該肽可被哺乳動物上皮細(xì)胞層吸收而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答并由此產(chǎn)生抗病療效。
2.權(quán)利要求1的肽，其為二聚體形式，二聚體中的第二肽通過第一肽的至少兩個半胱氨酸殘基和第二肽的至少兩個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵與第一肽相連。
3.權(quán)利要求2的肽，其中二聚體選自平行二聚體、反平行二聚體和混合二聚體。
4.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)項的肽，其長度為4至約30個氨基酸。
5.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)項的肽，其長度為4至約20個氨基酸。
6.權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項的肽，其長度為4至15個氨基酸。
7.權(quán)利要求1至6中任一權(quán)項的肽，其包含天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸。
8.權(quán)利要求1至7中任一權(quán)項的肽，組成此肽的氨基酸殘基獨立地選自Ile、Leu、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Met、His和Val。
9.通式(I)所示的權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的肽
(A)n-X-Cys-Cys-Y-(B)m (I)
其中
每個A獨立地選自H、一個保護(hù)基團(tuán)、或至少一個氨基酸殘基，該氨基酸殘基獨立地選自L-型或D-型氨基酸殘基，這些殘基具有選自脂肪側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈、堿性側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、仲氨基基團(tuán)、酰胺側(cè)鏈、芳香側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈的基團(tuán)；
n是一個選自1～11的整數(shù)；
X選自NH和具有選自脂肪族側(cè)鏈、仲氨基基團(tuán)、酰胺側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈和脂肪族側(cè)鏈的基團(tuán)的氨基酸殘基。
Y選自NH和具有選自仲氨基基團(tuán)、脂肪族側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈、芳香側(cè)鏈和酰胺側(cè)鏈的基團(tuán)的氨基酸殘基；
每個B獨立地選自H、OH、NH、一個保護(hù)基團(tuán)或至少一個氨基酸殘基，該氨基酸殘基具有選自脂肪族側(cè)鏈，脂肪羥基側(cè)鏈，堿性側(cè)鏈，酸性側(cè)鏈，仲氨基基團(tuán)，酰胺側(cè)鏈，芳香族側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈的基團(tuán)；
m是一個選自1～11的整數(shù)；
條件是當(dāng)A不是至少一個氨基酸殘基時n為1，當(dāng)B不是至少一個氨基酸殘基時m為1；每個肽序列包含不超過15個氨基酸殘基。
10.權(quán)利要求9的肽，其中
X選自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala和NH；
Y選自Pro、Gly、Leu、Glu、Val、Ile、Ser、Phe、Tyr、Thr、Asp、Gln和NH。
11.權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的肽，其中
X是Gly且Y是Gly；
X是Pro且Y是Pro；
X是Pro且Y是Val；
X是Ile且Y是Leu；
X是Pro且Y是Glu；
X是Glu且Y是Tyr；
X是Pro且Y是Phe；
X是Glu且Y是Phe；
X是Ala且Y是Val；
X是Val且Y是Ile；
X是Gln且Y是Ser；
X是Ile且Y是Thr；
X是Leu且Y是Asp；
X是Asp且Y是Ile；
X是Leu且Y是Gln；
X是Gly且Y是Asn；
X是Gly且Y是Pro；或
X是Ala且Y是Gly；
12.權(quán)利要求9至11中任一權(quán)項的肽，其為兩種肽序列形成的二聚體形式，其中第二肽的兩個半胱氨酸殘基與第一肽的兩個半胱氨酸殘基以二硫鍵連接。
13.權(quán)利要求12的二聚體形式的肽，它由兩種相同肽序列組成。
14.權(quán)利要求11的肽，其選自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro；和
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn。
15.權(quán)利要求11的肽，其選自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala；
Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr；
Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；和
Pro Ala Cys Cys Gly Pro。
16.下列肽
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
| |
Pro Gly Cys Cys Gly Pro。
17.權(quán)利要求14的肽，其選自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；和
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn。
18.權(quán)利要求15的肽，其選自
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；和
Pro Ala Cys Cys Gly Pro。
19.如通式(II)所示的權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的肽
(A)n-X-Cys-Z-Cys-Y-(B)m (II)
其中
每個A獨立地選自H、一個保護(hù)基團(tuán)、或一個氨基酸殘基，該氨基酸殘基為L-型或D-型，并具有選自脂肪族側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈、堿性側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、仲氨基基團(tuán)、酰胺側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈的基團(tuán)；
n是一個選自1～1O的整數(shù)；
X選自NH和具有選自脂肪族側(cè)鏈、仲氨基基團(tuán)、芳香側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈和酰胺側(cè)鏈的基團(tuán)的氨基酸殘基。
Z選自具有選自脂肪族側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈和堿性側(cè)鏈的基團(tuán)的氨基酸殘基；
Y選自具有選自酰胺側(cè)鏈、堿性側(cè)鏈、脂肪族側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈和仲氨基基團(tuán)的基團(tuán)的氨基酸殘基；
每個B獨立地選自H、OH、NH、一個保護(hù)基團(tuán)或一個氨基酸殘基，此氨基酸殘基具有選自脂肪族側(cè)鏈、脂肪羥基側(cè)鏈、堿性側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、仲氨基基團(tuán)、酰胺側(cè)鏈和含硫側(cè)鏈的基團(tuán)；
m是一個選自1～10的整數(shù)；
條件是當(dāng)A不是至少一個氨基酸殘基時n為1，當(dāng)B不是至少一個氨基酸殘基時m為1；并且每個肽序列包含不超過15個氨基酸殘基。
20.權(quán)利要求19的肽，其中
X選自Gly、Pro、Gln、Ile、Phe、Val、Asp、Leu、Glu、Ala、Lys或NH；
Y選自Pro、Gly、Glu、Val、Lys、Gln和Arg
Z選自Ile、Arg、Gly、Thr、Ala和Lys。
21.權(quán)利要求19或20的肽，其為兩種肽序列形成的二聚體形式，其中第二肽的兩個半胱氨酸殘基與第一肽的兩個半胱氨酸殘基以二硫鍵連接。
22.權(quán)利要求21的二聚體形式的肽，其由兩種相同肽序列組成。
23.權(quán)利要求19或20的肽，它選自
Val Cys Ile Cys Gln；
Val Cys Gly Cys Arg；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Phe Cys Ile Cys Lys；和
Ala Cys Lys Cys Gln。
24.一種肽，它選自
Ile Cys Thr Cys Glu；
Lys Cys Arg Cys Lys；
Leu Cys Ala Cys Val；和
Asp Cys Ile Cys Gln。
25.一種肽，它選自
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
| |
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly；
Val Cys Gly Cys Arg
| |
Val Cys Gly Cys Arg。
26.權(quán)利要求1至25中任一權(quán)項的肽，其不含附加的轉(zhuǎn)運藥劑。
27.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)利的肽的酸加成鹽。
28.權(quán)利要求27的酸加成鹽，其選自下列酸的酸加成鹽鹽酸、氫溴酸、硝酸、高氯酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、苯甲酸、谷氨酸、草酸、天門冬氨酸、丙酮酸、醋酸、琥珀酸、延胡索酸、順丁烯二酸、草酰乙酸、烴乙基磺酸、硬脂酸、苯二甲酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、乳糖酸和葡萄糖醛酸。
29.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽的堿鹽。
30.權(quán)利要求29的堿鹽，其選自堿金屬和堿土金屬鹽、有機(jī)堿鹽和氨基酸鹽。
31.包含權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的免疫調(diào)節(jié)肽的口服劑型。
32.權(quán)利要求31的口服劑型，其中口服給藥時能夠在哺乳動物體內(nèi)引起顯著免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)肽的劑量，少于注射給藥時在該哺乳動物體內(nèi)引起相同水平免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的相同免疫調(diào)節(jié)肽的劑量。
33.權(quán)利要求32的口服劑型，其不含附加的轉(zhuǎn)運藥劑。
34.包含權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的免疫調(diào)節(jié)肽的氣管內(nèi)劑型。
35.權(quán)利要求34的氣管內(nèi)劑型，其中氣管內(nèi)給藥時能夠在哺乳動物體內(nèi)引起顯著免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)肽的劑量，少于注射給藥時在該哺乳動物體內(nèi)引起相同水平免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的相同免疫調(diào)節(jié)肽的劑量。
36.權(quán)利要求35的氣管內(nèi)劑型，其不含附加的轉(zhuǎn)運藥劑。
37.包含權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的免疫調(diào)節(jié)肽的鼻用劑型。
38.權(quán)利要求37的鼻用劑型，其中鼻腔給藥時能夠在哺乳動物體內(nèi)引起顯著免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)肽的劑量，少于注射給藥時在該哺乳動物體內(nèi)引起相同水平免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的相同免疫調(diào)節(jié)肽的劑量。
39.權(quán)利要求38的鼻用劑型，其不含附加的轉(zhuǎn)運藥劑。
40.包含至少一種權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽的藥物制劑，其還含有藥用載體。
41.權(quán)利要求40的藥物制劑，其中藥物制劑是用于口服的。
42.權(quán)利要求40或權(quán)利要求41的藥物制劑，其包含至少一種通式(I)的肽或其生理衍生物以及一種藥用載體。
43.權(quán)利要求40至42中任一權(quán)項的藥物制劑，其包含至少一種通式(I)的肽或其鹽和至少一種通式(II)的肽或其鹽以及一種藥物載體。
44.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其以口服劑型用于治療。
45.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其以口服劑型用于癌癥治療。
46.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其以口服劑型用于自身免疫疾病治療。
47.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其用于治療。
48.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其用于癌癥治療。
49.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽或其鹽，其用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療。
50.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的生理活性肽或其鹽在制備適于治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
51.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的生理活性肽及其鹽在制備適于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
52.權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的生理活性肽及其鹽在制備適于治療自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用。
53.不含附加的轉(zhuǎn)運藥劑的權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的生理活性肽及其鹽在制備適于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
54.一種藥物制劑的制備方法，其包括將權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的至少一種肽或其至少一種鹽與藥用載體結(jié)合。
55.權(quán)利要求54的方法，其包括將至少一種通式(I)的肽和/或至少一種通式(II)的肽或其鹽與藥用載體結(jié)合。
56.一種在哺乳動物體內(nèi)引起免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，其包括確定需要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的哺乳動物，和向哺乳動物上皮細(xì)胞層施用一定劑量的權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的生理活性肽或其鹽，該劑量足以引起所述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答并由此產(chǎn)生治療效果。
57.權(quán)利要求56的方法，其包括向哺乳動物MALT施用一定劑量的通式(I)的生理活性肽或其鹽，該劑量足以引起所述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答并由此產(chǎn)生治療效果。
58.權(quán)利要求56或權(quán)利要求57的方法，其包括向哺乳動物MALT施用一定劑量的通式(II)的生理活性肽或其鹽，該劑量足以引起所述免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答并由此產(chǎn)生治療效果。
59.一種通過化學(xué)方法制備權(quán)利要求1至26中任一權(quán)項的肽的方法，其包括將單個氨基酸殘基或本發(fā)明的肽段連接而形成肽鍵，并在此過程開始和/或結(jié)束時加入保護(hù)基團(tuán)。
全文摘要
可被哺乳動物上皮細(xì)胞層吸收，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答，并由此對疾病產(chǎn)生療效的肽，包含該肽的制劑及其應(yīng)用。
文檔編號A61K38/08GK1154704SQ9619054
公開日1997年7月16日 申請日期1996年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月22日
發(fā)明者H·貝里斯特蘭德, T·埃里克松, M·林德瓦爾, B·澤爾施特蘭德 申請人:阿斯特拉公司