專利名稱：穩(wěn)定的外部指導序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的背景本申請涉及設計成以RNA酶P進行RNA靶裂解的方法和外部指導序列組合物。
I.核酶和外部指導序列分子核糖核酸(RNA)分子不僅可用作遺傳信息的載體，例如，基因組逆轉錄病毒RNA和信使RNA(mRNA)分子，和作為蛋白質合成所必需的結構，例如，轉移RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)分子，而且還可作為特異性地裂解核酸分子的酶。該催化性RNA分子稱為核酶。
于1989年獲得諾貝爾獎的Altman和Cech博士發(fā)現(xiàn)的催化性RNA在商業(yè)上的應用，特別是在治療上引起了極大的興趣(Altman，Prac.Ntl.Acad.Sci.USA 9010898-10900(1993)；Symons，Annu，Rev.Biochem.61641-671(1992)；Rossi等，Artisense Res.Dev.，1285-288(1991)；Cech，Annu Rev.Biochhem.59543-568，(1990))。已描述了催化性RNA(核酶)的一些類別，包括來自內含子核酶(WO88/04300，也見Cech.T.，Annu.Rev.Biochem.，59543-568，(1990))，錘頭狀核酶(WO89/05852和EP321021，GeneShears)，斧頭狀核酶(WO91/04319和WO91/04324，Innovir)。
RNA酶P另一類核酶包括酶的RNA部分，RNA酶P，它涉及轉移RNA(tRNA)，蛋白質合成機制中的一種常見的細胞成份的加工。細菌RNA酶P包括2種成份，蛋白質(C5)和RNA(M1)。Sidney Altman及其合作者證實了M1 RNA能象完整的酶一樣發(fā)揮功能，顯示了在大腸桿菌中，RNA是必需的催化成份(Guerrier-Takada等，Cell 35849-857(1983))。在隨后的工作中，Altman博士和同事經過使用一種外部指導序列(EGS)建立了用于將實際上任意RNA序列轉變成細菌RNA酶P的底物的方法，EGS在其5′端具有至少7個核苷酸互補于所要裂解的RNA3′至裂解位點的核苷酸，且在其5′端具有核苷酸NCCA(N是任意核苷酸)(WO 92/03566和Forster和Altman，Science 238407-409(1990))。使用相似的原理，建立了用于真核系統(tǒng)的EGS/RNA酶P介導的RNA裂解，(Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898006-8010(1992))。本文使用的“外部指導序列”和“EGS”指在靶RNA中形成RNA酶P活性裂解位點的任意寡核苷酸。
II.乙肝病毒(HBV)HBV，引起肝臟持久性非細胞致病性感染的一組含DNA的小病毒中的一個成員是在全世界發(fā)現(xiàn)的人感染原，它永久存在于慢性攜帶者的大型人類群體中。估計占地球人口大約6-7％受到了感染(3億攜帶者)。在全世界該感染的流行率不均勻。HBV的分布有一個地理梯度。在北美和西歐最低，在那里該病毒可檢測到占人口的0.1到0.5％，而在東南亞和近撒哈拉的非洲地區(qū)最高，那里感染率可占人口的5％到20％。這種傾斜的分布與肝細胞癌相平行，且提供了慢性HBV感染與這類惡性腫瘤之間相聯(lián)系的有力的流行病學證據。
乙型具有極大的醫(yī)學重要性，因為它可能是慢性肝臟疾病包括人類肝細胞癌的最常見的起因。感染的肝細胞不斷分泌在血液中高水平積累的病毒顆粒。這些顆粒有兩類(i)非感染性顆粒，由過剩的病毒衣殼蛋白(HBsAg)組成且不含核酸(濃度達到1013個顆粒/ml血液)，和(ii)感染性的，含DNA的顆粒(Dane顆粒)，由周圍裝配有含主要病毒衣殼蛋白，碳水化合物和類脂的27nm核衣殼核心(HBcAg)組成，以較低濃度存在(109個顆粒/ml血液)。人乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒家族的一個成員，與其親緣關系較近的包括土撥鼠肝炎病毒(WHV)，鴨肝炎病毒(DHV)，和松鼠肝炎病毒(GHV)(Robinson(1990))。與逆轉錄病毒一樣，嗜肝DNA病毒對其3.2kb DNA基因組進行逆轉錄(Pugh(1990))。乙肝病毒基因是環(huán)型且部分為單鏈，含有不完全的正鏈。不完全的正鏈與病毒顆粒中的DNA聚合酶復合，顯示出使用完全質鏈為模板延伸正鏈。這些形態(tài)學和結構特征使乙肝病毒區(qū)別于所有已知的含DNA病毒的類型。
乙肝病毒的復制循環(huán)也明顯區(qū)別于其它含DNA的病毒，且表明與含RNA的逆轉錄病毒有較近的親緣關系?；镜姆闯Ｌ卣魇鞘褂没蚪MRNA拷貝作為DNA基因組復制的中間體。感染性DNA基因組轉變成雙鏈形式，作為RNA轉錄的模板。多個RNA轉錄子從各感染的基因組合成，它具有信使功能或DNA復制功能。下文所稱的“基因組前體”是子代DNA基因組的前體，因為它們裝配成核衣殼核心并在從細胞中包被和輸出前逆轉錄成DNA。因此，各成熟的病毒粒子含有RNA基因組前體的DNA拷貝和DNA聚合酶。
待合成的第一DNA是負鏈極性并在病毒遺傳圖譜的單個位點起動。非常小的新生DNA負鏈(不超過30個核苷酸)共價連接到蛋白質上，并很可能作為負鏈DNA合成的引物。負鏈DNA的生長伴隨著前體基因組的協(xié)同降解，使該產物是全長的單鏈DNA，而不是RNADNA雜交體。正鏈DNA合成僅在負鏈完成后觀察到，且在與負鏈5′端相近的單個位點起始。正鏈的完全延長對核衣殼核心的包被和輸出是不需要的，因此，大多數細胞外病毒粒子在其基因組中含不完全的正鏈和較大的單鏈缺口。由于肝炎病毒基因組的復制是自主性的且不利用DNA到DNA的途經，其基因組的連續(xù)細胞內復制對于該病毒的維持是必需的。
組成病毒外殼的乙肝病毒表面抗原(HBsAgs)是由病毒S1前體，S2前體和S基因編碼的多肽。主要的蛋白質是來自2.1kb亞基因組信息的226氨基酸的S基因產物。
III.急性前髓細胞的白血病(APL)在成年人中大約10％的急性成骨髓細胞的白血病(AML)是急性前髓細胞白血病(APL，法美英分類(FAB)M3)，見Warrell等，New EnglandJ.Med.，329177-189(1993))。該疾病典型地以一種出血性素質存在，常由化療加劇，導致較高的早期死亡率，主要是死于顱內出血。這種出血性素質是由于存在惡性前髓細胞，它釋放前體凝血劑物質。然后，這些物質激活凝血級聯(lián)，排除纖維蛋白原，凝血因子和血小板。
盡管常規(guī)化療在大多數病人中可達到完全緩和，但5年存活率平均只有百分之35到45。這些數字不包括較高的早期死亡率(Warrell等，(1993))。
治療APL患者的第二條途徑涉及使用視黃酸，特別是全反式視黃酸(ATRA商標為tretioinTM，Hoffman La Roche，Nutley，NJ)。在一些公開的研究中，tretinoinTM能導致大約48％的所治療的病人緩解(Warrell等(1993))；Huang等，Blood，72567-572(1988)；Castaigne等Blood，761704-1709(1990)；Warrell等，New Engl.J.Med.，3241385-1393(1991)；Cheson，New England J.Med.，327422-424(1992))。然而，緩解的期限較短，平均3.5個月，隨后病人表現(xiàn)出對視黃酸的獲得性抗性。該抗性很可能解釋為從血液中清除藥物的能力增加，這是由于細胞色素P-450酶的誘導和細胞視黃酸結合蛋白的表達增強。目前極積進行視黃酸治療與常規(guī)化療的結合，早期的結果顯示60至70％的治愈率(Cheson，New England J.Med.，327422-424(1992))。
APL與非隨機的染色體異常密切相關，該異常的特征是在染色體15和17(t(15；17))的長臂之間的平衡的和相互的易位，這在超過90％的來自APL的病人細胞中發(fā)現(xiàn)(kakizuka等，Cell，66663-674，(1991)；de The等，Cell，66675-684(1991)；Pandolfi等，Oncogene，61285-1292(1991)；Chang等，Mol.Cell.Biol.，12800-810，(1992))。這種易位導致視黃酸受體基因(RARα)與一種推斷的轉錄因子PML的基因融合。融合產物PML-RARα與野生型RARα基因產物相比表現(xiàn)出改變的反式激活特征，該野生型產物在與視黃酸(RA)的反應中充當轉錄增強子(Kakizuka等，Cell，66663-674，(1991)；de The等，Cell.66675-684(1991)；Pandolfi等Oncogene，61285-1292(1991))。已顯示ATRA在體內(Warrell等，New England J.Med.，329177-189，(1991)和在培養(yǎng)細胞(Lanotte等，Blood，771080-1086，(1991))中誘導白血病細胞的成熟，這解釋了視黃酸的臨床效果。該視黃酸(RA)的敏感性與PML-RARα基因產物的存在緊密相聯(lián)(Lanotle等，Blood，771080-1086，(1991)；Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.892694-2698(1992))。從這些和其它發(fā)現(xiàn)(Grignani等，Cell，74423-431(1993))，假定PML-RARα以主要的陰性突變發(fā)揮功能，其產物抑制髓樣體分化。在APL病理形成中涉及PML-RARα蛋白質的證據是其在U937細胞中的表達，導致抑制分化，增強對RA的敏感性，并在培養(yǎng)基中存在有限血清時增強細胞存活率(Grignani等，Cell，74423-431(1993))。
幾乎所有的APL病人顯出具有前面所述t(15∶17)易位的未成熟的前髓細胞。該易位在分子水平的精確定位是重要的，因為在融合接頭中產生了不同的序列。對一系列的APL病人的研究顯示，在各種PML-RARα轉錄子之間有很大程度的不均一性(Miller等，Proc.Natll.Acad.Sci.USA，892694-2698(1992)；Pandolfi等，EMBO.J.，111397-1407(1992))。有3種來源的可變性(1)可選擇在mRNA的PML的側剪接，(2)可選擇在PML-RARα側(轉錄子3′端)的多聚腺苷化位點，(3)可變的融合點。對大量APL病例的研究表明，染色體17上的斷點通常位于RARα序列內含子2內部(Miller等Proc.Natl.Acad.Sci USA，892694-2698(1992)；Pandolfi等，EMBO J.，111397-1407(1992))。這導致相同的RARα序列存在于所有PML-RARα轉錄子變異體中。染色體15上的斷點在PML基因上代替在定義為bcrl，bcr2和bcr3的3個不同區(qū)域的群集(Pandolfi等，EMBO J.，111397-1407(1992))。bcr1區(qū)域跨越PML基因內含子6的全長，涉及該斷點的易位導致產生的成熟mRNA中，PML的外顯子6和RARα的的外顯子3一起剪接。bcr2區(qū)域橫跨包含PML小部分內含子4，外顯子5，內含子5和外顯子6的區(qū)域。涉及該斷點的易位基本上互不相同，且許多發(fā)生在PML外顯子內，引起融合序列的大量變化，偶爾產生異常的閱讀框，編碼畸變和截短的蛋白質。bcr3區(qū)域位于PML內含子3內，一律產生PML的外顯子3和RARα的外顯子3一起剪接的mRNA。融合接頭中的序列在所有bcr3的情況下是相同的。綜合起來，bcr1和bcr3型接頭占試驗APL病例的至少80％(Pandolfi等，EMBO J.，111397-1407(1992))，一個研究發(fā)現(xiàn)bcr1型接頭為bcr3型接頭出現(xiàn)率的2倍(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89694-2698(1992))。
其它易位癌癥在文獻中已報道許多其它的癌癥起因于或與染色體易位相關。其例子包括RBTN2和T細胞急性白血病中的t[11；14][p13；q11]，淋巴樣瘤中的紅細胞生成，translin，急性淋巴母細胞淋巴瘤中的T[5；14][q34；q11]，泡狀淋巴瘤中的T14；18染色體易位，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏疾??；在人滑膜肉瘤中的T18易位；Burkitt氏淋巴瘤；Ewing肉瘤中的t[11；22][q24；q12]易位；人小細胞肺癌中的t[3p；6p]和t[12q；19p]易位；傳播性縱隔瘤中的t[15；19]易位。在許多這類例子中，融合的轉錄產物或融合本身代表治療靶，如果治療劑能設計成選擇性地殺死或滅活具有該易位的那些細胞。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供治療病毒性疾病和涉及異常轉錄產物的疾病的治療劑及其使用方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供對核酸酶降解抗性增強的RNA酶P的修飾的外部指導序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供用RNA酶P的修飾的外部指導序列介導的裂解靶RNA分子的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供特異性地靶向肝炎的RNA酶P的外部指導序列，編碼該外部指導序列的載體及其使用方法。
本發(fā)明的概述真核RNA酶P的外部指導序列(EGS)分子改造成有效靶向且特異性地裂解靶RNA。設計并合成的構建的RNA分子含特異性的核苷酸序列，使RNA酶P的外部指導序列能優(yōu)選結合并促進RNA酶P介導的肝炎病毒RNA的裂解。具有修飾的核苷酸或核苷酸連接物的這些改造的RNA分子的修飾形式設計成增強其對核酸酶降解的抗性。特異性的區(qū)域修飾成達到增強穩(wěn)定性且維持RNA酶P的靶向活性。實施例證實了構建的RNA酶P的EGS分子結合并啟動肝炎病毒RNA的RNA酶P的裂解。還公開了用于篩選構建體的測定EGS活性的方法及使用并產生該RNA分子的方法。
附圖的簡要描述

圖1是具有核苷酸序列SEQ ID NO.4且在特異性區(qū)域具有化學修飾的EGS的結構圖。
圖2是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2的EGS和具有核苷酸序列SEQ ID NO.1的短橫型靶RNA的結構圖。兩個寡核苷酸的序列對比顯示堿基配對形成RNA酶P樣結構。RNA酶P裂解位點用箭頭表示。
圖3是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2(INNO-102，INNO-102，INNO-102，INNO-102和INNO-102)或SEQ ID NO.3(INNO-139)的EGS結構圖。含2′-O-甲基修飾的核苷酸用下面劃線表示。
圖4是圖3所示的EGS分子的裂解效率圖。
圖5是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2的各種EGS分子相對RNA酶P裂解效力(％)的圖示。試驗的所有EGS分子除INNO-102(wt)外，在兩個識別臂，可變環(huán)和T型主干上完全用2-O-甲基修飾。對各EGS的另外的修飾在相應的圖線段下面表示。2′-O-甲基修飾用下面劃線表示。具有5′-硫代磷酸基因的核苷酸說明書中概要表示。
圖6是具有核苷酸序列SEQ ID NO.3的各種EGS分子的相對RNA酶P裂解率(％)圖。對各EGS的修飾在相應的圖線段下以圖解表示。未修飾的區(qū)域在圖中以最細線表示。僅具有2′-O-甲基修飾的區(qū)域在圖中以第二粗線表示。僅具有5′-硫代磷酸基團的區(qū)域在圖中以第二粗線表示。具有2′-O-甲基修飾及5′-硫代磷酸基團的區(qū)域在圖中以最粗線表示。
圖7是在胎牛血清試驗中顯示修飾的EGS分子穩(wěn)定性的表。對于各EGS，顯示了相對裂解活性(％)和在試驗中的半衰期。對各EGS的修飾在相應的表條目下以圖示表明。未修飾的區(qū)域在圖中以最細線表示。僅具有2′-O-甲基修飾的區(qū)域在圖中以第二粗線表示。僅具有5′-硫代磷酸基團的區(qū)域在圖中以第二粗線表示。具有2′-O-甲基修飾和5′-硫代磷酸基團的區(qū)域在圖中以最粗線表示。
圖8是顯示用所有RNA和化學修飾的EGS分子對2.1kb HBV轉錄子進行RNA酶P介導的裂解試驗的圖示。對各EGS的修飾在相應的凝膠泳道下面以圖示表示。
圖9是具有核苷酸序列SEQ ID NO.5和在特定區(qū)域具有化學修飾的EGS結構的示意圖。
圖10是具有核苷酸序列SEQ ID NO.6和在特定區(qū)域具有化學修飾的EGS的結構示意圖。
圖11是具有核苷酸序列SEQ ID NO.4和在特定區(qū)域具有化學修飾的EGS的結構示意圖。
圖12是具有核苷酸序列SEQ ID NO.7和在特定區(qū)域具有化學修飾的EGS的結構示意圖。
圖13a，13b，13c和13d是靶向PML RAR融合接頭的外部指導序列的結構和序列。圖13a是EGS APL A20(靶APL RNA是SEQ IDNO.10的核苷酸7至24；EGS APLA 20是SEQ ID NO.11)；圖13b是無活性對照A20D(SEQ ID NO.11減去核苷酸22和23)；圖13c是EGSAPL 1009(靶APL RNA是SEQ ID NO.10的核苷酸6至22；EGS APL1009是SEQ ID NO.12)；圖13d是無活性對照APL 1017(SEQ ID NO.11減去核苷酸14，17，18，29)。
圖14a和14b是抑制細胞生長的MTT試驗的圖示，對于濃度為10μm(■)，9μm(□)，8μm(◆)，7μm(◇)，6μm(▲)，5μm(△)，4μm(●)，3μm(○)，2μm(×)，和1μm(※)的APL靶EGS A20(圖14a)和無活性對照EGS(圖14b)的光密度(即，細胞數量)對時間(天)的布點圖。
圖15a和15b是細胞生長抑制的MTT試驗的圖示，對于濃度為10μm(■)，9μm(□)，8μm(◆)，7μm(◇)，6μm(▲)，5μm(△)，4μm(●)，3μm(○)，2μm(×)，和1μm(※)的APL靶EGS 1009(圖15a)和無活性對照EGS(圖15b)的光密度(即，細胞數)對時間(天)的布點圖。
圖16是顯示在裂解試驗中EGS分子轉換率的圖示。圖中繪制了裂解的HBV底物百分數對培養(yǎng)時間的布點圖。
圖17是顯示名稱和核苷酸序列的表，包括針對HBV的EGS分子的化學修飾。在這些序列中，“A”，“C”，“G”和“V”指2′-O-甲基核糖核苷酸?！癆”，“C”，“G”和“V”指所示的核糖核苷酸。核苷酸之間的小寫“s”指核苷酸之間的硫代磷酸鍵。核苷酸之間的所有其它鍵是磷酸二酯鍵。在一些EGS序列末端的標記“ T(3′-3′)-5指經3′至3′鍵附著到胸腺嘧啶核苷酸上，從而在這些EGS上形成的一個第二5′端。EGS序列是從頭至尾，SEQ ID NO14，SEQID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ IDNO23，SEQ ID NO24，和SEQ ID NO25。
圖18是顯示靶向HBV的化學修飾的EGS的抗病毒活性的表。在欄顯示各EGS的名稱，中欄顯示對各EGS測定的μm下的EC50，右欄顯示各EGS靶向的HBV基因組的裂解位點。最后一排顯示潛在的抗HBV核苷類似物2′-3′-ddC的EC50。
圖19是顯示EGS分子EGS2和EGS2A與HBV RNA中其靶序列雜交的核苷酸序列和結構的示意圖。裂解位點的核苷酸用編號的箭頭表示。主干結構后的數字指在主干中水及的堿基對數目。
圖20是顯示與在HBV RNA中其靶序列雜交的EGS分子EGS 62和EGS 62A的核苷酸序列和結構的圖示。裂解位點的核苷酸用編號的箭頭表示。主干結構后的數字指主干中涉及的堿基對數。
圖21是顯示體內表達EGS分子的以pol III啟動子為基礎的載體的結構圖示。這一載體具有插入到以埃-巴二氏病毒(EBV)為基礎的載體中的有效連接到人U6 RNA(hU6P)pol IV啟動子上的編碼EGS分子的區(qū)域。
圖22是顯示與HBV RNA中其靶序列雜交的EGS分子EGS 62B的核苷酸序列和結構的圖示。在該裂解位點的核苷酸以編號的箭頭表示。主要結構后的數字指主干中涉及的堿基對的數目。
圖23是顯示用從pol III啟動子表達EGS的載體瞬時感染的HepG2、2、15細胞產生HBV的相對量的圖示。各線段頂部的百分數是相對于用不表達EGS的載體感染的細胞產生的量所產生的HBV百分數。
本發(fā)明的詳細描述構建了適于啟動靶RNA分子裂解的RNA分子。RNA分子是RNA酶P的外部指導序列(EGS)分子，它設計成特異性地結合并啟動靶RNA分子的RNA酶P介導的裂解及具有增強的核酸酶抗性。已構建了適用于治療乙肝病毒感染的RNA分子。
I.EGS分子的設計和合成EGS分子是合成的寡核苷酸，它與靶底物結合形成相似于前體tRNA的真核RNA酶P天然裂解位點的二級和三級結構。使用RNA酶P裂解肝炎RNA序列的體外活性試驗易于測定EGS分子靶向RNA酶P活性的能力，以下將作詳述。在具有修飾的核苷酸或核苷酸連接物的EGS分子的情況下，穩(wěn)定性試驗允許測定各種類型的修飾對核酸酶的抗性?；钚栽囼炘试S比較具有不同修飾的EGS分子介導的RNA酶P裂解效力。綜合起來，這些試驗用于優(yōu)化和平衡修飾的EGS分子的穩(wěn)定性和裂解效力。
已構建的示例性的EGS分子適用于治療病毒性疾病和癌癥。特異性的靶是乙肝病毒，更具體地說，是編碼乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的RNA。由于HBsAg在病毒超級結構和感染中起主要作用，以EGS為基礎的治療劑可用于通過裂解HBsAg mRNA減量調節(jié)肝炎。乙肝RNA或其它靶RNA內優(yōu)選的靶位點是在靶RNA的所有形式中都出現(xiàn)的保守序列區(qū)。在乙肝RNA的HBsAg編碼區(qū)已鑒定了2個這種優(yōu)選的位點并由具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸堿基序列的EGS分子靶向。
現(xiàn)在使用自動核酸合成生產或合成EGS分子和編碼具有已知序列的EGS分子的DNA序列的方法是常規(guī)的，例如，在由應用生物系統(tǒng)公司(Foster City，CA)或Pharmacia Oligo Pilot(Pharmacia，Piscataway，NJ)提供的DNA 392型合成儀上使用氰乙基亞磷酰胺的方法。也可利用合成核酸分子的其它方法(例如，見Ikuta等，Ann，Rev.Biochem.53323-356(1984)(磷酸三酯和亞磷酸三酯方法)；Narang等，MethodsEnzymol.65610-620(1980)(磷酸三酯方法))。作為選擇，可經過諸如用T7 RNA聚合酶轉錄DNA模板合成EGS分子(Mrlligan等，Nucl.Acids.Res.158783(1987))。也可以經過將編碼和表達EGS的載體放入細胞在細胞中合成EGS分子。
A.EGS分子的活性在不限量的RNA酶P存在的條件下，測量與各種量的構建EGS培養(yǎng)后剩余的底物RNA的百分數的體外裂解測定用作EGS/RNA酶P復合物的有效活性的指示劑。選擇表現(xiàn)出最高體外活性的EGS/RNA酶P復合物用于后來的試驗?？衫L制剩余RNA的百分數作為EGS濃度的函數的曲線。EGS/RNA酶P的催化效力可用Kcat/Km表達(其中，Kcat是裂解的速度常數，Km是Michaelis常數)，它是自由EGS與底物RNA分子反應的二級速率常數。按Heidenreich和Echstein的方法(J.Biol.Chem.，2671904-1909(1992))，使用下式測定Kcat/Km-ln F/t＝(Kcat/Km)[C]其中，F(xiàn)是底物剩余部分，t是反應時間，[C]是EGS濃度。
優(yōu)選的EGS構建體是那些結合并啟動肝炎底物RNA優(yōu)選進行RNA酶P裂解的構建體。優(yōu)選的構建體的選擇可使用實施例1所述的核酶裂解試驗并測定哪些構建體在介導肝炎底物RNA序列的特異性RNA酶P裂解中最有效，這可用上面所述的Kcat/Km值來測定。
B.EGS分子的構建經過改變前體tRNA分子(前體tRNATYr)的基本結構并加入底物識別序列可設計EGS分子，例如，如WO92/03566(本文引用以供參考)所述。例如，可用與靶序列互補的序列取代氨酰受體主干和D主干的序列。這些取代的序列稱為識別臂。與氨酰受體主干相應的識別臂稱為A識別臂，與D主干相應的識別臂稱作D識別臂。相應于tRNA序列和結構成份的剩余序列稱為裂解靶向序列。選擇識別臂的序列使具有與靶RNA緊靠所需裂解位點3′的序列特異性互補的區(qū)域。選擇識別臂的序列，使靶向序列的互補區(qū)域互相相鄰但以小的末配對區(qū)分開。這種關系的一個例子在圖2中表示。識別臂可以是產生功能性EGS分子的任意長度。一般來說，3′端識別臂應至少是7個核苷酸長且具有至少7個核苷酸長的與靶RNA分子互補的區(qū)域。
已發(fā)現(xiàn)除了識別臂外，功能性EGS分子僅需要相應于前體tRNA的T主干和環(huán)的結構。因此，功能性EGS分子僅需要T主干和環(huán)作為其裂解靶向序列。EGS分子的T主干和環(huán)可以是產生功能性EGS分子，即介導靶RNA分子的RNA酶P裂解的EGS分子的任意長度和序列。例如，可使用任意tRNA T環(huán)序列。具有6，7和8個核苷酸的環(huán)長的EGS分子是有功能的。具有有限序列的EGS分子T環(huán)中的變化超過在tRNA T環(huán)序列中所發(fā)現(xiàn)的變化，且保留EGS功能。T主干可具有形成主干結構的任意序列。具有4，5和6個堿基對的主干長度的EGS分子預期是具有功能的。優(yōu)選的T主干和環(huán)序列(SEQ ID NO.4的核苷酸7至23)在圖1中顯示。還發(fā)現(xiàn)在tRNA分子D主干和T主干之間出現(xiàn)的額外的或可變的環(huán)是EGS功能所不需要的。
因此，本文所述的EGS分子僅需要與靶序列互補的，附著于T主干和環(huán)5′和3′端的2個識別臂。EGS分子也可以含有與在tRNA前體分子中發(fā)現(xiàn)的那些相應的其它序列和結構，如D環(huán)或3′端NCCA序列。這些額外的序列和結構可認為是裂解靶向序列的一部分。EGS分子還可以在遠端的一側或兩側含有與靶向序列不互補且與tRNA結構不相關的序列。該序列不認為是識別序列或裂解靶向序列的一部分。
使用在Yuan等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，898006-8010(1992)中描述的試驗或上文描述的試驗易于篩選EGS分子啟動靶RNA的RNA酶P裂解的能力。
可偶聯(lián)EGS和RNA酶P的催化性RNA亞基以形成具有EGS靶向功能和RNA酶P催化性RNA裂解功能的單個寡核苷酸分子。在單個寡核苷酸分子中的這種結合稱為RNA酶P內部指導序列(RIGS)。RIGS可以與EGS相同的方式用于裂解靶RNA分子。
可經過以任意合適的方式連接指導序列和RNA酶P催化性序列形成RIGS。例如，EGS和RNA酶P催化性RNA可作為分離的分子進行制備，然后在體外共價偶聯(lián)?？蛇x擇地，可經過化學合成或經過體外或體內轉錄編碼連接的EGS和RNA酶P催化性序列的DNA分子作為單個分子來合成完整的RIGS。RIGS的EGS與RNA酶P功能區(qū)之間的連接可以是允許該功能區(qū)裂解靶RNA的任何形式。例如，兩個功能區(qū)可通過一個寡核苷酸連接子連接。優(yōu)選的是，連接子可以由以磷酸二酯鍵連接的普通核苷酸組成。EGS和RNA酶P催化性序列成份可以以任一順序相連，RNA酶P催化性序列可連接到EGS成份的3′端或5′端。構建和使用RIGS的方法在耶魯大學的PCT申請WO95/24489中描述。
EGS分子也可以是可調節(jié)的。可調節(jié)的EGS分子是上面所述的EGS序列連接到配體結合序列上，將EGS分子的活性置于該配體的控制下，需要該配體的存在來激活或滅活。構建的RNA分子一部分能結合配體，而另一部分是EGS序列。選擇結合配體的分子后，出現(xiàn)第二輪選擇過程，其中在存在和缺乏配體或“輔助藥品”的條件下測定配體結合分子的催化功能。以這種方式選擇可調節(jié)的EGS分子用于在配體存在的條件下裂解靶RNA，或在缺乏配體的條件下裂解靶RNA。
該方法和可調節(jié)的EGS分子在以控制的方式裂解靶RNA分子中有用。當靶RNA分子存在于細胞中，要使這些RNA分子完全失活而不需要殺死宿主細胞時特別有用?？烧{性EGS分子的形成，選擇和使用在PCT申請WO94/13791和WO94/13833(本文引用以供參考)中進行了充分的描述。
II.核酸酶抗性EGS分子A.修飾類型盡管未修飾的寡聚核糖核苷酸在無核酸酶環(huán)境中可作為有效的EGS發(fā)揮功能，但在血清中和在細胞內的短壽命減少了作為治療劑的有效性。可進行化學修飾以極大地增強EGS的核酸酶抗性而不損害共誘導RNA靶的RNA酶P介導的裂解的生物學功能。例如，可使用方便的核酸合成方法用2′甲氧核糖核苷酸，硫代磷酸脫氧核糖核苷酸或硫代磷酸核糖核苷酸取代EGS構建體的一個或多個堿基(例如，見Offensperger等，EMBO J.，121257-1262(1993)；Rosenberg等的WO93/01286(硫代硫酸寡核苷酸合成)，Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，857079-7083(1988)；Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857448-7794(1989)；Shaw等，Nacleic Acids Res，19747-750(1991)(含3′端亞磷氨酰修飾的3′核酸外切酶抗性的寡核苷酸的合成)，本文引用以供參考)。
目前的文獻已充分記載了寡核苷酸類似物的降解主要是由于3′-核酸外切酶。一些研究也證實了各種3′-修飾能極大地減小這些類似物的核酸酶敏感性。因此，減小對3′核酸外切酶的敏感性的另一方法是將一個自由氨基導入EGS分子的3′端羥基(例如，見Orson等Nucl.AcidsRes.，193435-3441(1991))。另一有用的3′端修飾是用3′至3′連接將胸腺嘧啶核苷酸偶聯(lián)到EGS的3′端。這種結構在本文中稱為3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸或T(3′-3′)。其它有用的修飾包括可能存在于序列中的胞嘧啶堿基的甲基化，插入劑如吖啶衍生物，共價連接到5′端磷酸上(例如，使用五亞甲基橋)以減小核酸分子對細胞內核酸酶的敏感性(例如，見Maher等Science，245725-730(1989)；Grigoriev等，J.Biol.Chem.，2673389-3395(1992))。
預期有用的另一類化學修飾是核苷酸核糖基團2′OH基的修飾，它顯示出對各種細胞內和細胞外核酸酶的活性是關鍵的。典型的2′修飾是合成2′-O-甲基寡核苷酸(Paolella等，EMBOJ.111913-1919，1992)和2′-氟和2′-氨基-寡核苷酸(Pieken，等，Science，253314-317(1991)；Heidenreich和Eckstain，J.Biol.Chem，2671904-1909(1992))。核酸酶抗性EGS構建體的例子在圖3和6中顯示。EGS分子的部分也可含有脫氧核糖核苷酸。該取代經過消除關鍵的2′-OH基增強了核酸酶抗性。
Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.的WO95/23225描述了增強核酶穩(wěn)定性的化學修飾，如在核苷或核苷酸糖的5′碳處導入烷基。該修飾也可用于EGS分子。烷基指飽和的脂肪族烴，包括直鏈，支鏈和環(huán)烷基。優(yōu)選的是該烷基具有1至12個碳原子。W95/23225還描述了可提供增強寡聚核苷酸穩(wěn)定性的2′-脫氧-2′烷基核苷酸。例如，在對功能非必需的核苷酸糖分子2′位具有烷基的寡核苷酸更穩(wěn)定。WO95/23225還描述了使用3′和/或5′二鹵代磷酸鹽取代的核苷酸，例如，3′和/或5′-CF2-磷酸酯取代的核苷酸。該核苷酸可用于EGS分子以增強其核酸酶抗性。
這類修飾影響使用該修飾的EGS分子啟動靶RNA核酶介導的裂解的效力的程度使用上面描述的裂解試驗易于測定。
B.嵌合EGS分子上述修飾可用于EGS分子的限定區(qū)域和/或組合產生修飾的EGS分子的嵌合體。由于需要合適的核苷酸相互作用以形成有活性的三維結構，EGS分子某些區(qū)域的修飾比其它區(qū)域更合理。例如，已發(fā)現(xiàn)插入2′-O-甲基修飾的核苷酸和硫代磷酸連接物可導入EGS的某些區(qū)域而不明顯減弱RNA酶P的靶向活性。還發(fā)現(xiàn)2′-O-甲基核糖核苷酸可取代與靶序列互補的序列和T主干中的任意核苷酸。在T環(huán)中只有部分核苷酸可用2′-O-甲基核苷酸取代而不明顯影響核酶裂解。為了使核酶裂解活性達到最大，優(yōu)選EGS分子T環(huán)部分的所有核苷酸包含未修飾的核糖核苷酸或具有硫代磷酸鍵的核糖核苷酸。實施例2，3和5說明了修飾的可能組合和修飾的核苷酸的優(yōu)選的排列。
修飾影響該修飾的EGS分子啟動靶RNA的RNA酶P介導的裂解效力的程度用上面描述的裂解試驗易于測定。根據當與未修飾的EGS(即具有與修飾的EGS具有相同的核苷酸序列但由未修飾的核糖核苷酸，未修飾的磷酸二酯鍵和未修飾的3′和5′端組成的EGS分子)介導的核酶裂解活性相比修飾的EGS介導的核酶裂解活性的水平可分類化學修飾的EGS分子。該比較提供了由修飾的EGS分子介導的相對核酶裂解活性，優(yōu)選以由未修飾的EGS分子介導的核酶裂解活性的百分數來表達。修飾的EGS分子可根據這些活性水平分類。以這種方式，例如可將修飾的EGS分子分成四類(1)修飾的EGS分子介導大于未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性的70％，(2)修飾的EGS分子介導50％至70％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性，(3)修飾的EGS分子介導25％至50％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性，和(4)修飾的EGS分子介導不足25％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性。優(yōu)選的修飾的EGS分子介導至少25％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性。更優(yōu)選的EGS分子介導至少50％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性。最優(yōu)選的EGS分子介導至少70％的未修飾的EGS所介導的核酶裂解活性。
III.克隆和表達載體將EGS分子導入哺乳動物細胞的優(yōu)選的載體包括病毒載體，如逆轉錄病毒，它將編碼EGS分子的DNA直接導入核中，然后在核中轉錄DNA以產生所編碼的EGS分子。
使用逆轉錄病毒載體進行基因治療的方法的例子在美國專利號4868116和4980286；PCT申請WO90/02806和WO89/07136，Mulligan，Science 260926-932(1993)中進行了描述，其教導本文引用以供參考。
可構建將其自身RNA序列以DNA的形式插入宿主染色體的缺陷型逆轉錄病毒載體以便將EGS插入宿主的細胞中，并在細胞中制備EGS的拷貝并釋放進細胞質中或滯留在核中與肝類RNA的靶核苷酸序列相互作用。
骨髓干細胞和造血細胞可相當容易地從人類取出和替代，提供了一種用于繁裂轉移的基因的自我再生性細胞群體。可用編碼EGS分子的以逆轉錄病毒為基礎的載體進行體內或體外轉染該細胞。當進行干細胞的體外轉染時，一旦轉染的細胞開始產生特定的EGS分子，可將該細胞植入病人并建立表達EGS的整個細胞克隆群體，從而抵抗病毒感染，轉化和其它疾病。
作為一個例子，用于克隆和表達編碼DNA序列的構建體的載體可以包括1.克隆位點，用于插入所要表達的編碼EGS分子的DNA序列。
2.哺乳動物復制起點(任選)，允許游離型(非整合型)復制，如來自Epstein-Barr病毒的復制起點。
3.在細菌細胞中有功能的復制起點，用于產生所需量的編碼EGS構建體的DNA，如來自pBR322質粒的復制起點。
4.啟動子，如來自Rous肉瘤病毒(RSV)，巨細胞病毒(CMV)的啟動子，或指導所要表達的編碼EGS構建體的插入的DNA序列在哺乳動物細胞中轉錄的哺乳動物U6基因啟動子(一種RNA聚合酶III啟動子)。
5.哺乳動物選擇標記(任選)，如新霉素或潮霉素抗性，它允許選擇用構建體轉染的哺乳動物細胞。
6.細菌抗生素抗性標記，如新霉素或氨芐青霉素抗性，它允許選擇用質粒載體轉化的細菌細胞。
體內傳遞和表達EGS分子的優(yōu)選的載體使用RNA聚合酶III(pol III)啟動子用于表達。圖21顯示了該載體的一個例子的結構。該啟動子可產生在結構上無細胞類型特異型表達的轉錄子。pol III啟動子也產生構建成保留于細胞核中許多，靶RNA分子位置的轉錄子。優(yōu)選的是，使用完整的pol III轉錄單位，包括pol III啟動子，終端信號和終止序列。pol III啟動子和其它pol III轉錄信號存在于tRNA基因，SS RNA基因，小核RNA基因和小胞質RNA基因中。優(yōu)選的用于EGS表達載體的polIII啟動子是人小核U6基因啟動子和tRNA基因啟動子。使用U6基因轉錄信號在體內產生矩RNA分子在Noonberg等，Nucleic Acids Res.222830-2836(1995)中有描述，使用tRNA轉錄信號由Thompson等，Nucleie Acids Res.，232259-2268(1995)描述，本文引用兩篇文獻以供參考。
許多pol III啟動子是內部的，即它們位于轉錄單位內。因此，這些pol III轉錄子包括啟動子序列。為了在表達EGS分子中有用，這些啟動子序列不應干擾EGS的結構或功能。由于EGS分子來自tRNA分子，因此tRNA基因啟動子序列易于插入EGS分子。tRNA基因的內部啟動子以兩個部分出現(xiàn)，一個A盒和一個B盒。在tRNA分子中，A盒序列一般存在于tRNA分子的D環(huán)和D主干的一半處，B盒序列一般存在于T環(huán)和T主干的鄰近核苷酸中。最小的EGS分子保留T主干和環(huán)結構，B盒序列可以它們插入tRNA分子T主干和環(huán)相同的方式插入EGS的該部分。由于最小的EGS不需要D環(huán)或主干，A盒序列不必存在于EGS分子的任意功能結構中。例如，A盒序列可連接于EGS的5′端，位于D識別臂后，以便維持A盒與B盒之間的合適的剪接。
U6基因啟動子不是內部的(Kunkel和Pederson，Nucleic Acids Res.187371-7379(1989)；Kunkel等。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838575-8579(1987)；Reddy等J.Biol.Chem.26275-81(1987))。對于表達EGS分子有用的合適的pol III啟動子系統(tǒng)在Hall等，Cell 293-5(1982)，Nielsen等，Nucleic Acids Res 213631-3636(1993)，F(xiàn)owlkes和Shenk，Cell 22405-413(1980)，Gupta和Reddy，NucleicAcids Res.192073-2075(1990)，Kickoefer等，J.Biol.Chem.2687868-7873(1993)，和Romero和Balckburn，Cell 67343-353(1991)中描述。表達核酶的pol III啟動子的使用也在Ribozyme Pharmaceuticals Inc的WO95/23225中描述。
IV.治療A.藥物組合物EGS分子可直接與藥學上可接受的載體結合使用以形成適于治療病人的藥物組合物。作為選擇，EGS可經過含有編碼和表達對特定RNA有特異性的EGS分子的序列的載體來傳遞。
直接傳遞涉及將預先合成的EGS分子插入靶細胞，通常借助于有利于穿過細胞膜的類脂復合物(脂質體)和其它分子，如抗體或其它小配體以增大靶向性。由于RNA對降解的敏感性，在許多情況下，直接傳遞的EGS分子可經化學修飾，使它們具有核酸酶抗性，如上所述。該傳遞方法允許更精確地監(jiān)控治療劑量。
載體介導的傳遞涉及用自我復制或非復制系統(tǒng)，如修飾的病毒載體或質粒感染靶細胞，產生大量由載體攜帶的序列編碼的EGS。細胞的靶向和進入的機制可由病毒提供，或者，如果使用質粒，可使用直接傳遞EGS分子所述相似兩方法。載體介導的傳遞產生持久不變量的EGS分子。與直接傳遞，如靜脈內注射EGS分子相比，它基本上更便宜和需要較少次的用藥。
在感染的急性關鍵期可使用直接傳遞方法。優(yōu)選的是，使用靜脈內或皮下注射直接傳遞EGS分子。有效量的寡核苷酸的傳遞以其到達目的靶位點前減小寡核苷酸的降解的形式是必需的。
最優(yōu)選的是，藥用載體特異性地將EGS傳遞給受影響的細胞。例如，肝炎B病毒影響肝細胞，因此，優(yōu)選的藥用載體將抗肝炎EGS分子傳遞給肝細胞。
B.EGS分子的傳遞可采用兩種傳遞方法，(1)合成EGS分子的傳遞，或(2)以瞬時方式傳遞表達EGS分子的載體。使用標準方法學，以基礎研究確定選擇的方法，也可能將它們結合使用。例如，經過使用陽離子脂質體制劑可有效地傳遞它們。
各種非載體方法也可用于將EGS分子傳遞給細胞。例如，一般來說，EGS分子或編碼EGS分子的DNA序列可摻入進或到微顆粒上。本文使用的微顆粒包括脂質體，病毒體，合成和/或天然聚合物形成的微球體和微囊體。制備微囊體和微球體的方法是本領域的技術人員已知的且包括溶劑蒸發(fā)，溶劑灌制，噴射干燥和溶劑延展?？蓳饺敫鞣N微粒的有用的聚合物的例子包括多糖、聚酐、聚原酸酯、聚羥基化物和蛋白質和肽。
可用標準方法生產脂質體，如Kim等，Biochem.Biophys.Acta.728339-348(1983)；Liu等，Biochim.Biophys.Acta.110495-101(1992)；和Lee等，Biochim.Biophys.Acta.，1103185-197(1992)；Wang等，Biochem.，289508-9514(1989))中所報道的方法，本文引用以供參考。EGS分子或編碼該分子的DNA當以微型顆粒制品提供時可包裝進脂質體。簡單地說，選擇類脂，溶于有機溶劑，混合并在真空中干燥到玻璃管底部。使用待包封的EGS分子，編碼EGS分子的DNA的水緩沖液重新水合脂膜，然后所得的水合脂載體或包裝有物質的脂質體可經離心洗滌并過濾，貯存于4℃。這一方法已用于將核酸分子傳遞進MOLT-3白血病細胞系細胞的核和胞質中(Thierry和Dritschilo，Nucl.Acids Res.，205691-5698(1992))。作為選擇，EGS分子或編碼該分子的DNA可經離子或共價方式摻入微顆粒內，或結合到微顆粒外。
陽離子脂質體或微囊體是在傳遞諸如核酸基的化合物的帶負電的化合物中特別有用的微顆粒，核酸基的化合物可經離子作用結合到這些脂質體帶正電的外表面上。以前已列出的許多陽離子脂質體在將核酸或核酸蛋白復合物傳遞給體外和體內的細胞中非常有效，如Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417(1987)；Felgner，Advanced Durg Delivery Reviews，5163-187(1990))；Clarenc等，Anti-Cancer Durg Design.881-94(1993)中所報道的，本文引用以供參考。使用包括一種或多種類脂的混合物可制備陽離子脂質體或微囊體，該脂類含有足夠數量的陽離子側基，使從該混合物形成的脂質體或微囊體具有凈正電荷，能以離子鍵結合帶負電荷的化合物?？捎糜谏a陽離子脂質體的帶正電的類脂的例子包括氨基脂，二油酰磷脂酰乙醇胺(PE)，它具有帶正電荷的伯胺頭部基團；磷脂酰膽堿(PC)，它具有不是伯胺的帶正電的頭部基團；和N[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三乙銨(“DOTMA”，見Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417(1987)；Felgner等，Nature，337387-388(1989)；Felgner，Advanced Drug Delivery Reviews，5163-187(1990))。
用于傳遞EGS分子的微顆粒的優(yōu)選形式是攜帶血紅素的微顆粒。在這些微顆粒中，血紅素插入或共價連接到微顆粒的外表面。攜帶血紅素的微顆粒的優(yōu)勢在于由于它們優(yōu)先結合并被表達血紅素受體的細胞，如肝細胞，吸收，為有效劑量所需的藥物或其它化合物的量明顯減少。這種靶向傳遞也可減小在非靶向傳遞方法中使用相當高藥物濃度引起的全身性副作用。用于形成攜帶血紅素的微顆粒的優(yōu)選的脂類是1，2-二油酰氧-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)和二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)。攜帶血紅素的微顆粒的生產和使用在Innovir的PCT申請WO95/27480中描述。
核酸也可經在陽離子脂質體包被或涂覆其上，經靜脈內注射入哺乳動物。該系統(tǒng)用于將DNA導入成年小鼠多組織的細胞中，包括內皮和骨髓，此處存在造血細胞(例如，見Zhu等，Science，261209-211(1993))。
含EGS分子或編碼這些分子的DNA的脂質體可用對于將抗肝炎EGS分子傳遞到靶向細胞有效的量經內吸性，例如，經靜脈內或腹膜內用藥進行給藥。當與合適的微型顆粒結合使用時，其它可能的途徑包括經過皮膚或口服。一般來說，施用給個體的與脂質體相聯(lián)的核酸的總量應小于為相同所需或試圖達到的效力所必須施用的未相聯(lián)的核酸的總量。
包括多種聚合體(如聚乳酸與聚乙醇酸共聚體，聚乙烯和聚原酸酯)和抗肝炎EGS分子或編碼該分子的DNA的組合物可經過使用插管或注射器局部傳遞給合適的細胞。將該組合物局部傳遞給細胞的其它方式包括使用輸注泵(例如，Alza公司，Palo Alto，California的產品)或將組合物摻入聚合植入體(例如，見Johnson和Lloyd-Jones.編輯，藥物傳遞系統(tǒng)(Chichester，EnglandEllis Horwood Ltd.，1987))。它可將治療性抗肝炎EGS組合物持久釋放到植入體鄰近區(qū)域而發(fā)揮效力。
下面提供的實施例用于說明目的及進一步的指示。
實施例實施例1寡核苷酸的合成，用于構建和分析EGS分子的質粒和轉錄反應。
寡核苷酸根據Ogilvie等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855764-5768(1988)的方法，采用5′-二甲氧基三苯甲基-2′-甲基硅-核糖核苷3′-CE-亞磷酰胺(Biosearch，MA，或ChemGenes Corp.，MA)制備寡聚核糖核苷酸(RNA)。使用Biosearch或Glen Research RNA合成方法合成2′-O-甲基寡聚核糖核苷酸(2′-O-甲基RNA)，亞酰胺購自Biosearch或Glen Research。合成在Millipore 8909 Experdite DNA/RNA合成儀上進行。可控孔度玻璃(CPG)用作固體支持基質。偶聯(lián)時間為大約13分鐘。為了合成含硫代磷酸鍵的類似物，用硫化代替氧化，使用Beaucage試劑進行10到15分鐘。以三苯甲基測量試驗的平均偶聯(lián)產率為96至98％。
按Scaring等，Nucleic Acids Research，185433-5441(1990)的描述進行以支持物上裂解，堿基和磷酸去保護，去掉2′-O-TBDMS基團。在TBAF溶液中的粗制寡核苷酸在使用15-20％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠進行標準電泳純化前在Sephadex G-25柱上脫鹽。產物帶以UV照射觀察，切下并從凝膠基質上洗脫下來。洗脫的寡聚體最后在C18Sep-Pak柱體上脫鹽并經OD260測量定量。純化的類似物的勻質性經5′端標記或分析性HPLC來檢查?？捎脡A基組成分析來進一步鑒定它們，如Seela和Kaiser，Nucleic Acids Res.，153113-3129(1987)所述，硫代酸鍵的含量以31P-NMR測定。經過從含氨基的修飾的CPG支持物上開始合成進行3′端的末端修飾。
質粒經過克隆跨越PML-RARα融合區(qū)的788核苷酸片段(SEQ IDNO.13的核苷酸1060至1848，相應于克隆B16的核苷酸1076至1739的PML序列和PML-RARα克隆B467的核苷酸1766至1890的RARα序列，de The等(Cell，66675-684(1991)進入載體PCR1000(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)構建質粒pAPL7-5。該片段從細胞系的總mRNA中進行PCR擴增，其斷點和序列與NB4細胞系相同(de The等，Lanotte等，Blood，771080-1086(1991))。融合區(qū)的序列證實與前面所報道的相同(de The等)。將該質粒的EcoRI/Hind III限制性片段克隆進載體pGEMTM-3Z(Promega，Madison，Wisconsin)以產生質粒pAPL-3Z3。
轉錄在含40mM Tris-HCl，pH7.5，18mM MgCl2，1mM亞精胺，5M同DTT，2000U/ml胎盤RNA酶抑制劑(Promega)，各3mM的ATP，UTP，CTP和GTP，50μCi的α-[32P]-rNTP(通常是CTP、New England Nuclear)和3000U/ml的T7 RNA聚合酶(New EnglandBiolabs)的100μl反應物中進行線型質粒(2.5μg)的失控轉錄。HindIII-線型化的pAPL-3Z3的轉錄產生含PML-RARα788個核苷酸和載體序列3′端大約60個核苷酸的轉錄子。使用基本上按Milligan等(Nucl.Acids Res.，158783-8798(1987))所述的標準方法，使用跨越啟動子區(qū)的完全編碼鏈和部分互補鏈進行從寡核苷酸的轉錄。所有轉錄在37℃下進行2到16小時并經過加入120μl終止混合液(甲酰胺，EDTA和痕量染料)終止反應。然后，反應混合物在90℃加熱3分鐘，在冰上冷卻，并在尿素/聚丙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳。
經過紫外光照射觀察轉錄產物，切下合適的帶并從聚丙烯酰胺凝膠中洗脫。純化的RNA重懸于水中并貯存于-20℃。
RNA酶P裂解試驗一般根據Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，898006-8010(1992)(本文引用以供參考)所述的方法進行裂解反應。簡單地說，短底物反應達到總體積31μ，其中含50mM Tris-HClpH7.4，10mM MgCl2，25mM KCl，0.1mM EDTA，EGS濃度為200nm，靶分子濃度為20nm或更少。反應物在37℃培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)后，反應溶液與上樣緩沖液(98％甲酰胺，100mMEDTA，0.025％溴酚蘭)混合。經過在含7M尿素的15％丙烯酰胺凝膠上電泳將裂解的底物和未裂解的分開。在分子動力學磷成像儀(Molecular DynamicsPhosphorimager)上將帶定量。
使用β顯示凝膠分析儀(Betagen)從干凝膠中計數相應于前體RNA底物和所得的2個裂解產物的帶。
基本上按Bartkiewicz等Genes Dev.3388-499(1989)(本文引用以供參考)的描述經DEAE Sepharose色譜和甘油密度梯度離心純化RNA酶P。
為了試驗具有較長靶RNA分子的裂解，使用不同的反應條件。在總體積為10μl的反應物中含40mM Tris-HCl(pH7.4)，10mMMgCl2，1mM亞精胺，10mM二硫蘇糖醇，0.05μgμl無核酸酶牛血清白蛋白，0.01％(v/v)Triton-X100，0.8單位/μl RNASIN，0.2mM ATP，0.2mM GTP，0.2mM UTP，0.2mM CTP，0.1μCi/μl[a32P]CTP.2mMm7G(5′)pppG，0.06μg/μl酵母RNA，25mM KCl，3單位的T7 RNA聚合酶，250nM EGS，1μl的人RNA酶P和3ng/μl線型化的質粒。經過加入線型化的質粒啟動反應，在37℃溫育30分鐘。經過加入10μl 80％的甲酰胺，10mM EDTA，0.1％溴酚蘭終止反應。在90℃加熱2分鐘后，樣品在5％變性的聚丙烯酰胺凝膠上48瓦電泳2小時。60℃真空干燥1小時后，經磷成像分析凝膠。
在各試驗中殘留的前體RNA底物的百分數以EGS濃度為函數繪圖，催化效力以Kcat/Km(其中Kcat是裂解的速度常數，Km是Michaelis常數)，自由EGS和底物反應的二級速度常數來表達。按照Heidenreich和Eckstein的方法(J.Biol.Chem.，2671904-1909(1992))，使用公式-ln F/t＝(Kcat/Km)[C]測定裂解反應的效力，其中F是RNA底物的剩余部分，t是反應時間，[C]是EGS濃度。
胎牛血清穩(wěn)定性試驗在胎牛血清(FCS)試驗中試驗修飾的EGS分子的核酸酶抗性。Shaw等Nucleic Acids Res，19747-750(1991)報道了10％FCS加熱滅活時，非常相似于人血清。試驗條件非常相似于以前Hoke等，Nucleic Acids Res.195743-5748(1991)所描述的。簡單地說，待測EGS類似物是用T4多核苷酸激酶和[γ-35S]ATP進行5′端標記(該方法可產生對去磷酸化有抗性的放射標記的寡核苷酸)。然后經過苯酚/氯仿提取，隨后用Sephadex G-25旋轉柱過濾純化標記的EGS。純化的EGS與冷EGS和10％加熱滅活的胎牛血清(FCS)混合，使EGS終濃度為大約5μm。處理EGS類似物超過24小時。在不同時間點從反應混合物提取等份試樣，與2X上樣染料混合，在90℃加熱滅活3分鐘，然后于-20℃貯存。在12％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠上分析結果。
實施例2構建介導HBsAg RNA的RNA酶P裂解的EGS分子設計人外部指導序列(EGS)分子以在編碼HBsAg的RNA中產生RNA酶P裂解。在靶存在的條件下，EGS分子形成tRNA樣結構，誘導RNA酶P的裂解。
靶向HBsAg的EGS構建體EGS序列HBV102(SEQ ID NO.2)，HBV#1(SEQ ID NO.5)和HBV#2(SEQ ID NO.6)設計成靶向編碼肝炎B表面抗原(HBsAg)的RNA的保守區(qū)。如圖2所示，HBV102識別臂的一個序列(A識別臂；SEQ ID NO.2的核苷酸25至31)與編碼HBsAg序列中的7個核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸13至19)互補。HBV102的另一識別臂的序列(D識別臂；SEQ ID NO.2的核苷酸1至4)與編碼HBsAg的序列中的4個核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸22至25)互補。因此，該靶序列含有與兩個未配對的核苷酸分開的EGS的2個識別臂互補的2個區(qū)域。
無可變環(huán)的EGSEGS構建體HBV140(SEQ ID NO.3)設計成靶向與HBV102編碼肝炎B表面抗原之RNA的保守區(qū)域。HBV140的識別臂具有與HBV102的識別臂相同的序列。具體地說，HBV140的A識別臂的序列(SEQ ID NO.3)的核苷酸22至28)與HBsAg編碼序列的7個核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸13至19)互補。HBV140的D識別臂的序列(SEQ ID NO.3的核苷酸1至4)與HBsAg編碼序列的4個核苷酸(SEQID NO.1的核苷酸22至25)。EGS HBV140僅28個核苷酸長。
含2′-O-甲基的EGS分子制備含一些2′-O-甲基核苷酸的以HBV102和HBV140為基礎的一些EGS分子。按以前的描述在自動寡核苷酸合成儀中制備寡核苷酸，除了核苷酸試劑中含2′-O-甲基。以三苯甲基測量分析平均偶聯(lián)產率范圍為96至98％。完成去保護后，經變性凝膠電泳純化完全去保護的寡核苷酸，經5′端標記，分析性HPLC，堿基組成分析和31P-NMR評價其純度。圖3顯示了構建的一些修飾的EGS分子。這一系列允許試驗EGS分子能被2′-O-甲基化且仍保留EGS功能的程度及由這些修飾提供的核酸酶抗性的程度。
2′-O-甲基/硫代磷酸嵌合的EGS分子制備含硫代磷酸核苷酸鍵及一些2′-O-甲基核苷酸的基于HBV102和HBV140的一些EGS分子。EGS分子的不同區(qū)域是未修飾的，2′-O-甲基化的，硫醇鹽化的，或兩者。所得的分子是修飾的嵌合體。按以前的描述在自動寡核苷酸合成儀中制備這些寡核苷酸，除了核苷酸試劑含有上面所述的2′-O-甲基基團。使用Beaucage試劑進行硫化10至15分鐘。圖3顯示了構建的一些修飾的EGS分子。這一系列允許試驗EGS分子能被2′-O-甲基化并仍保留EGS功能的程度及由這些修飾提供的核酸酶抗性的程度。
實施例3測量EGS的裂解活性使用實施例1中所述的RNA酶P裂解試驗以測定裂解反應的效力以分析實施例2所述的EGS構建體。圖1描述了使用短底物的模型系統(tǒng)，它用于評價修飾的EGS分子在誘導RNA酶P介導的靶裂解中的能力。短底物的序列(SEQ ID NO.1)來自全長基因組前體HBV RNA。該數據在圖4，5和6中提供。
2′-O-甲基取代2′-O-甲基-寡聚核糖核苷酸作為合理的修飾選擇具有一些優(yōu)選的特征。這些類似物的合成非常相似于DNA合成它們比DNA類似物對RNA靶具有更好的結合親和力且所得的雙螺旋具有RNA-RNA雙螺旋(A-形)和DNA-DNA雙螺旋(B-型)之間的結構。另外，證實它們對RNA-或DNA特異性的核酸酶的降解具有較好的抗性。圖3顯示了具有2′-O-甲基殘基的所有RNA EGS(INNO-102)的不同片段的系列順序取代。取代的核苷酸以在下面劃線來表示。如圖4所示，識別序列(INNO-108)的取代不影響RNA酶P介導的靶裂解相對于野生型EGS的效力。另一方面可變環(huán)(INNO-109)和T主干(INNO-110)的進一步取代導致活性進一步和額外的減小。然而，許多失去的活性可經過去掉可變環(huán)(INNO-139)而恢復。結果，全部RNA EGS識別序列和T主干被2′-O-甲基RNA殘基的取代為RNA酶P完全耐受。與此明顯相反，在T環(huán)(INNO-111)上7個核苷酸的取代導致修飾的EGS基本上無活性。這些結果表明T環(huán)中的一些或全部RNA殘基對于維持EGS的正確的三級結構和/或與RNA酶P的特異性相互作用是關鍵的。
T環(huán)修飾本系列修飾的目的是為了鑒定負責失去EGS活性的殘基從而建立產生核酸酶抗性EGS類似物的可供選擇的方案。最后，設計并試驗了7個類似物。每個類似物具有完全2′-O-甲基取代的識別序列，可變環(huán)和T主干。另外，T環(huán)7個殘基中的一個也用2′-O-甲基取代而剩下的6個位置保留為完整RNA(圖5)。裂解試驗的結果顯示第一個5′-U(INNO-124)和第3個5′-C(INNO-126)引起最顯著的裂解效力減小。隨后試驗了除這2個關鍵殘基外所有殘基都用2′-O-甲基RNA取代的類似物134。不幸的是，類似物134仍只有非常小的活性。這可能暗示T環(huán)可能采取相互協(xié)同的結構，在該區(qū)域2′-O-甲基殘基的聚集似乎明顯破壞了這一結構。對于T環(huán)中7個殘基中的3個被2′-O-甲基殘基取代的類似物141也碰到了活性不可忽視的減小。根據這些資料，采用了另一類修飾，即用硫代磷酸主鏈代替磷酸二酯鍵。這兩類修飾的結合產生了充分修飾的類似物143，其中T環(huán)區(qū)被硫代磷酸RNA取代，剩余的分子被2′-O-甲基殘基取代。經過裂解試驗評價，該嵌合EGS類似物仍保留野生型活性的大約70％。
主鏈修飾盡管2′-O-甲基取代可為未修飾的EGS提供明顯的核酸酶抗性，還研究了經過導入修飾的主鏈進一步增強穩(wěn)定性。例如，檢查了一系列2′-O-甲基硫代磷酸取代。以充分修飾的EGS143開始，硫代磷酸鍵選擇性地加到該分子的不同區(qū)域(圖6，INNO-151至INNO-154)。然而，這些類似物的體外裂解分析表明用這些雙倍修飾的殘基進行的取代引起相當明顯的和額外的活性損失。由于一些研究已顯示在寡核苷酸末端的簡單修飾可提供增強的核酸酶抗性，合成并試驗3四個末端磷酸二酯鍵(3′端2個和5′端2個)被硫代磷酸主鏈取代的類似物155。如圖6所示，末端封端的EGS類似物155當用純化的人RNA酶P制品試驗時仍能誘導有效的靶裂解。
末端修飾分析了兩類末端修飾。在一種情況下，3′和5′端都用2個2′-O-甲基硫代磷酸鍵加帽(INNO-155)；在另一種情況下，經過在修飾的CPG支持物上開始合成用氨基保護3′端(INNO-149)。如圖8所示，兩個類似物都能誘導2.1kb HBV RNA的RNA酶P介導的裂解，盡管類似物149似乎比類似物155更有效。
大型靶RNA的裂解含有HBV AYW株2.1kb RNA編碼序列的質粒pAYW2.1經過用Not I消化使之線型化，然后在[α32P]CTP存在的條件下用T7 RNA聚合酶轉錄。標記的轉錄子在各種EGS分子存在的條件下用RNA酶P在37℃保溫30分鐘。反應產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經磷成像分析。EGS介導的在2.1kb轉錄子靶位點的裂解產生大約1.7和0.4kb長的裂解產物，結果如圖8所示。
對于泳道1(CTRL)，轉錄子用CAT-9 EGS培養(yǎng)，描述見Yuan和Altman，Science，2631269-1273(1994)。CAT-9 EGS對HBV轉錄子無活性。與預期的一樣，檢測不到裂解。對于泳道2(EGS H62)，轉錄子與EGS H62保溫，它是一種全RNA EGS，具有SEQ ID NO.3的序列，經過T7 RNA聚合酶轉錄DNA寡核苷酸制備。觀察到2.1kb RNA的完全裂解。對于泳道3(EGS149)，轉錄子與INNO-149保溫，它是一種化學合成的RNA，具有SEQ ID NO.3的序列，其修飾為(1)在A識別臂，T主干和D識別臂的各各位置用2′-O-甲基修飾，(2)在T環(huán)各位置的硫代磷酸和(3)3′-氨基。觀察到2.1kb RNA大部分被該EGS裂解。對于泳道4(EGS 155)用INNO-155保溫轉錄子，它是一種化學合成的RNA，具有SEQ ID NO.3的序列，對其進行的修飾為(1)在A識別臂的后4個位置，D識別臂的前4個位置和T主干的各位置為2′-O-甲基修飾，(2)在T環(huán)各位置為硫代磷酸，和(3)在A識別臂的前3個位置和D識別臂的后3個位置為2′-O-甲基硫代磷酸。觀察到2.1kb被該EGS部分裂解。
使用實施例1所述的短底物試驗在濃度各為20nM的INNO-140和INNO-139(圖3所示)測量EGS介導的裂解的轉換率。靶分子濃度為400nM，超出20倍。在各時間點，取出2μl等份試樣并在10μl上樣緩沖液中終止反應。結果在圖16中所示。很明顯對識別臂和T環(huán)的2′-O-甲基修飾不明顯影響轉換率。
實施例4測量EGS的穩(wěn)定性為了評價不同修飾對修飾的EGS分子增加的核酸酶抗性的影響，使用實施例1中所述的胎牛血清試驗分析實施例2所述的EGS構建體。結果在圖7中概括。與預期的一樣，全RNA EGS(INNO-140)在10％FCS中具有非常短的半衰期(不超過10分鐘)。2′-O-甲基取代的INNO-139的半衰期大量增加但仍相對較短，很可能是由于存在未修飾的全RNA T環(huán)。用硫代磷酸RNA取代T環(huán)(INNO-143)將半衰期從2小時增加到接近10小時，增加2個2′-O-甲基硫代磷酸封(INNO-155)進一步將半衰期增加到超過18小時。
實施例5APL EGS效力的檢驗EGS的合成在應用生物系統(tǒng)的394 DNA/RNA合成儀上化學合成靶向于PML RNAα的融合接頭的2個EGS，APL A20(SEQ ID NO.11)和APL 1009(SEQ ID NO.12)。這些EGS的序列和其化學組成在圖13a和13c中顯示。在相應于EGS T環(huán)的序列中缺少2個核苷酸，此外相似于A20的EGS A20D在圖13b中顯示。在圖13d中顯示的EGS APL 1017在T環(huán)中缺少3個核苷酸，此外相似于APL 1009。對照EGS(A20D和APL1017)在RNA酶P存在的條件下不能誘導APL mRNA的裂解，但能與融合接頭雜交。EGS經反相HPLC純化，濃縮并懸浮于2M NaCl中以便將EGS轉變成鈉鹽形成，用水充分透析并凍干。EGS懸浮于水中用于試管裂解分析或懸浮于150mM NaCl中用于細胞培養(yǎng)試驗。
試管裂解分析用Hind III限制性酶線型化的pAPL-3Z3質粒3ng在32P-ATP存在下按實施例1所述轉錄30分鐘。在轉錄過程中向轉錄反應中加入0.25μM(終濃度)EGS和2μl來自HeLa細胞的RNA酶P的純化制品(Bartkiewicz等，Genes and Development，3488-499(1989))。反應產物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離并使用分子動子學磷成像儀觀察。
A20和APL1009都誘導APL RNA在融合接頭的裂解，而A20D和APL 1017不能誘導APL RNA的裂解。
細胞培養(yǎng)試驗NB4細胞，一種含從急性前髓細胞白血病病人分離出的t(15；17)易位標記的成熟誘導的細胞系(Lanotte等，(1991))用于試驗靶向PML-RNAα的EGS抗增生活性。這些細胞應答全反式視黃酸的成熟誘導效應。一個NB4細胞的亞克隆NB4/D5通常與視黃酸反應(Ahn等，(1995))，它用于細胞培養(yǎng)試驗。NB4細胞在含10％胎牛血清(Intergen，Purchase，NY)，100U/ml青霉素，200μg/ml鏈霉素，200mM谷氨酰胺的RPMI培養(yǎng)基中37℃，5％的pCO2下生長。
所有處理以一式三份進行，實驗重復超過一次。在對數生長期維持的NB4/D5細胞以1ml RPMI培養(yǎng)基中1×105個細胞的密度接種于24孔組織培養(yǎng)板上。向細胞中加入濃度不斷增加的EGS。每24小時去掉超過90％的培養(yǎng)基并用含相同濃度的EGS的新鮮培養(yǎng)基取代。每24小時取出細胞等份試樣并在這些細胞中進行MTT增生試驗(描述見Mosmann等，Journal of Immunological Methods，6555(1983))。
經MTT試驗測量，EGS A20(圖14a)和APL 1009(圖15a)都抑制細胞生長，而相應的無活性對照A20D(圖14b)和APL 1007(圖15b)對細胞生長無影響。用超過3μM濃度進行觀察，A20和APL 1009都顯示出對NB4細胞生長的劑量依賴性抑制。
實施例6EGS在表達HBV的細胞中的抗HBV的效力為了鑒定在HBV RNA中，在合適的EGS存在下易于被RNA酶P裂解的序列，經體外轉錄合成了靶向HBV RNA各保守區(qū)的80種EGS并在實施例3所述的試驗中使用HBV 2.1kb RNA轉錄子作底物試驗其體外裂解誘導活性。這些試驗揭示了RNA上在EGS存在下易于被RNA酶P裂解的一些位點。這些EGS的大多數限定于HBV RNA的2個明顯的區(qū)域，HBV 2.1kb RNA上從大約核苷酸350到大約核苷酸700，及從大約核苷酸1425至大約核苷酸1625。這表明在HBV RNA內可能存在大型非結構區(qū)。該靶選擇的方法也可應用于不同于HBV的靶RNA。
合成了12個顯示出誘導體外裂解的EGS的化學修飾的和核酸酶抗性的形式。這些EGS的序列和化學成份在圖17中顯示。所有EGS在HepG2.2.15細胞中試驗其對病毒復制的抑制，該細胞在組成上表面HBVRNA和完全裝配的HBV顆粒(Sell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，841005-100(91987))。一般按Korba和Gerin(Antiviral Res.1955-70(1992))所述進行該試驗。EGS以與血紅素脂顆粒，特別是與血紅素相連的1，2-二油酰氧-3-(三甲銨基)丙烷(DOTAP)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(稱為DDH)的復合物傳遞進細胞10天，使用點印跡試驗分析分泌進培養(yǎng)基的HBV顆粒的DNA基因組。
一般按下述制備血紅素脂顆粒。血紅素(作為Fe原卟啉IX氯化物，高鐵血紅素)溶于含8.3mM NaOH的乙醇中，在14krpm離心10分鐘沉淀不溶物。為了允許使用碳二亞胺進行有效的連接，經過加入少量體積的HCl而不沉淀血紅素來降低血紅素溶液的pH。在典型的反應中，200mg高鐵血紅素加入到10ml含8.3mM NaOH的乙醇中。將HCl加到上清血紅素溶液中使pH下降為1.7，加入血紅素溶液(含大約1.6mg血紅素)，760μl(10μmol)DOPE(10mg/ml)和500μl(10mg/ml)，在室溫下黑暗中允許進行連接過夜。向無菌玻璃試管的血紅素連接的DOPE中加入溶于氯仿的10微摩爾DOTAP并在真空中在渦流干燥器內50℃處理20分鐘使類脂干燥成薄膜。向類脂膜中加入1毫升無菌150mM NaCl并在Bransonic 1210水浴聲處理器中聲處理乳劑30分鐘，操作在20℃47kHz下進行以產生混濁溶液。使用Lipex Extruder(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)將脂顆粒擠出多聚碳酸膜。
經過將含EGS分子的溶液加入150mM NaCl中，向EGS溶液中加入DDH類脂顆粒(于150mM NaCl)至終濃度為0.2mg/ml來制備EGS/類脂組合物。室溫下培養(yǎng)15分鐘后，加入培養(yǎng)基，稀釋EGS/類脂混合物以獲得具有所需EGS終濃度的EGS組合物。等體積的150mM NaCl用作對照。
HepG2.2.15細胞的匯合培養(yǎng)物在96孔平底培養(yǎng)板上維持。每個EGS處理使用2份平板。每個平板上總共3份培養(yǎng)物用各個稀釋的EGS組合物處理。用10個連續(xù)日劑量的EGS組合物處理培養(yǎng)物。每天用新鮮的EGS組合物改變培養(yǎng)基。經過測量胞外HBV DNA水平監(jiān)測這些處理的效應。
這些EGS的抗病毒活性在圖18中顯示。圖18中中欄提供了列于左欄的EGS的EC50。EC50是相對于用對照組合物處理的細胞產生的HBV量減少50％時的化合物的濃度。作為對照，在相同試驗中測量了2′-3′ddC，一種已知有效的抗-HBV核苷類似物的抗病毒效力。EGS的EC50可比得上2′-3′-ddC，表明這些EGS具有明顯的抗HBV活性。
測量已接受EGS的細胞活性的酚紅試驗揭示的與施用EGS相關的毒性(定義為大于在未處理的細胞中觀察到的染料吸收水平50％的抑制)表明復制抑制與任意有效的毒性無關。
實施例7使用pol III啟動子啟動的表達載體表達抗HBVRNA的EGSEGS2和EGS62的克隆用XbaI和KpnI切割PREP9(Invitrogen，San Diego，CA)，一種以Epstein-Barr病毒為基礎的載體(Yates等，Nature，313812-815(1985)以去掉載體中的RSV LTR啟動子序列，將244核苷酸的人U6啟動子(hU6；從核苷酸+1至-244)克隆進該區(qū)域。在Applied Biosystems DNA合成儀上合成相應于EGS2和EGS62(分別見圖19和20)的cDNA，純化并克隆KpnI和BamHI之間的hU6啟動子下游。使用XbaI和BamHI切割EGS序列和hU6啟動子序列并在用BglII和NheI消化的pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)中亞克隆。
EGS 2A，EFS 62A和EGS 62B的克隆用Bgl II t Kpn I消化pCEP4質粒以去掉CMV啟動子，然后將包括U6基因5′封區(qū)的人U6啟動子(從核苷酸+25至-244)克隆進該位點。在Applied Biosystems DNA合成儀上合成相應于EGS 2A，EGS 62A和EGS 62B(分別見圖19，20和22)的cDNA，純化并克隆在KpnI和BamHI位點之間的5′封區(qū)下游。
在細胞中擴增所有的質粒，使用Qiagen(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)柱純化質粒DNA。然后使用實施例6中所述的DOTAP-DOPE-血紅素(DDH)脂質體將純化的質粒用于轉染HepG2.2.15。HepG2.2.15細胞以3×105細胞/孔接種于6孔平板上。細胞在含4％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞變成60-80％匯合時進行轉染。無EGS插入子的質粒載體也作為對照進行轉染。使用Chomczynski-Sacchi所述的方法(Anal.Biochem.162156-159(1987))在轉染后2天和6天時從細胞中提取總RNA。對總細胞RNA進行RNA酶保護試驗以確定EGS RNA，HBV RNA和GAPDH RNA的水平，該試驗根據Bordonaro等的方法(Biotechniques 3428-430(1994))使用相應的放射標記的反義RNA探針進行。在6％變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離保護的片段，使用分子動力學磷成像定量與保護帶相關的放射活性。GAPDH RNA的定量用于規(guī)范樣品。RNA酶保護試驗證實在用各EGS-質粒構建體雜的細胞中表達EGS RNA。不同EGS的表達與對照相比導致HBV RNA表達的抑制程度化范圍從29到53％(圖23)。EGS 2A顯示出HBV RNA表達的最大抑制，而對照質粒對HBV RNA水平無影響。
這些實驗清楚地證實了使用pol III啟動子表達抗HBV RNA的EGS導致HepG2.2.15細胞中HBV RNA水平的減小。
從上面的詳細描述，本發(fā)明的方法的修飾和變化對本領域的技術人員而言是顯而易見的。這些修飾和變化應落在所附權利要求的范圍內。
序列表(1)一般信息(i)申請人伊諾瓦研究室公司(ii)發(fā)明題目穩(wěn)定的外部指導序列(iii)序列數13(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Patrea L.Pabst(B)街道2800 One Atlantic Center1201 West Peachtree Street(C)城市亞特蘭大(D)街喬治亞(E)國家美國(F)郵編30309-3450(v)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)代理/代理人資料(A)姓名Pabst，Patrea L.
(B)登記號31，284(C)參考/文卷號ILI109CIP(ix)電信資料(A)電話(404)873-8794(B)電傳(404)873-8795(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度37個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO1序列描述GUCCUCCAAU UUGUCCUGGU UAUCGCUGGA UGUUGUC(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO2序列描述CGAUACGGAA GGUUCGAAUC CUUCCCAGGA C(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO3序列描述CGAUGAAGGU UCGAAUCCUU CCCAGGAC(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征
(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO4序列描述NNNNNNGAAG GUUCGAAUCC UUCNNNNNNN(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO5序列描述AGCGAUGAAG GUUCGAAUCC UUCCCAGGAC(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO6序列描述AUGAUAGAAG GUUCGAAUCC UUCACGCCGC(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO7序列描述NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無(xi)SEQ ID NO8序列描述NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNN(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(iii)假定無(iv)反義無
(xi)SEQ ID NO9序列描述NNNNGAAGGU UCGAAUCCUU CNNNNNNNNN N(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置1..50(D)其它信息/功能＝“APL RNA”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置11；12(D)其它信息/功能＝“融合接頭”(xi)SEQ ID NO10的序列描述CGGGGAGGCA GCCAUUGAGA CCCAGAGCAG CAGUUCUGAA GAGAUAGUGC(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置1..35(D)其它信息/功能＝“APL EGS A20”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征
(B)位置22…23(D)其它信息/功能＝“變異體(A20D)缺失位置22和23的U和U”(ix)特征(A)名稱/鍵mise_特征(B)位置17...23(D)其它信息/功能＝“17-23的序列是硫代磷酸RNA；分子剩余部分由2′-O-甲基RNA組成”(xi)SEQ ID NO11的序列描述GGGUCUCAGG CCCGGGUUCG AUUCCCGGUG GCUGC(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型RNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置1..31(D)其它信息/功能＝“APL EGS 1009”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置14；17；18；29(D)其它信息/功能＝“變異體(1017)在位置14，17，18和29(分別為U，A，A，和G)位缺失RNA”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置13.19(D)其它信息/功能＝“13-19的序列是硫代磷酸RNA，分子剩余部分由2′-O-甲基RNA組成”(xi)SEQ ID NO12的序列描述GUCUCAAGAA GGUUCGAAUC CUUCGGCUGC C(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長度3511個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(iii)假定無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(B)位置1..3511(D)其它信息/功能＝“PML-RARαDNA序列”(xi)SEQ ID NO13的序列描述CTCCCCTTCA GCTTCTCTTC ACGCACTCCA AGATCTAAAC CGAGAATCGA AACTAAGCTGGGGTCCATGG AGCCTGCACC CGCCCGATCT CCGAGGCCCC AGCAGGACCC CGCCCGGCCCCAGGAGCCCA CCATGCCTCC CCCCGAGACC CCCTCTGAAG GCCGCCAGCC CAGCCCCAGCCCCAGCCCTA CAGAGCGAGC CCCCGCTTCG GAGGAGGAGT TCCAGTTTCT GCGCTGCCAGCAATGCCAGG CGGAAGCCAA GTGCCCGAAG CTGCTGCCTT GTCTGCACAC GCTGTGCTCAGGATGCCTGG AGGCGTCGGG CATGCAGTGC CCCATCTGCC AGGCGCCCTG GCCCCTAGGTGCAGACACAC CCGCCCTGGA TAACGTCTTT TTCGAGAGTC TGCAGCGGCG CCTGTCGGTGTACCGGCAGA TTGTGGATGC GCAGGCTGTG TGCACCCGCT GCAAAGAGTC GGCCGACTTCTGGTGCTTTG AGTGCGAGCA GCTCCTCTGC GCCAAGTGCT TCGAGGCACA CCAGTGGTTCCTCAAGCACG AGGCCCGGCC CCTAGCAGAG CTGCGCAACC AGTCGGTGCG TGAGTTCCTGGACGGCACCC GCAAGACCAA CAACATCTTC TGCTCCAACC CCAACCACCG CACCCCTACGCTGACCAGCA TCTACTGCCG AGGATGTTCC AAGCCGCTGT GCTGCTCGTG CGCGCTCCTTGACAGCAGCC ACAGTGAGCT CAAGTGCGAC ATCAGCGCAG AGATCCAGCA GCGACAGGAGGAGCTGGACG CCATGACGCA GGCGCTGCAG GAGCAGGATA GTGCCTTTGG CGCGGTTCACGCGCAGATGC ACGCGGCCGT CGGCCAGCTG GGCCGCGCGC GTGCCGAGAC CGAGGAGCTGATCCGCGAGC GCGTGCGCCA GGTGGTAGCT CACGTGCGGG CTCAGGAGCG CGAGCTGCTGGAGGCTGTGG ACGCGCGGTA CCAGCGCGAC TACGAGGAGA TGGCCAGTCG GCTGGGCCGCCTGGATGCTG TGCTGCAGCG CATCCGCACG GGCAGCGCGC TGGTGCAGAG GATGAAGTGC 1080TACGCCTCGG ACCAGGAGGT GCTGGACATG CACGGTTTCC TGCGCCAGGC GCTCTGCCGC 1140CTGCGCCAGG AGGAGCCCCA GAGCCTGCAA GCTGGCGTGC GCACCGATGG CTTCGACGAG 1200TTCAAGGTGC GCCTGCAGGA CCTCAGCTCT TGCATCACCC AGGGGAAAGA TGCAGCTGTA 1260TCCAAGAAAG CCAGCCCAGA GGCTGCCAGC ACTCCCAGGG ACCCTATTGA CGTTGACCTG 1320CCCGAGGAGG CAGAGAGAGT GAAGGCCCAG GTTCAGGCCC TGGGGCTGGC TGAAGCCCAG 1380CCTATGGCTG TGGTACAGTC AGTGCCCGGG GCACACCCCG TGCCAGTGTA CGCCTTCTCC 1440ATCAAAGGCC CTTCCTATGG AGAGGATGTC TCCAATNACA ACGACAGCCC AGAAGAGGAA 1500GTGCAGCCAG ACCCAGTGCC CCAGGAAGGT CATCAAGATG GAGTCTGAGG AGGGGAAGGA 1560GGCAAGGTTG GCTCGGAGCT CCCCGGAGCA GCCCAGGCCC AGCACCTCCA AGGCAGTCTC 1620ACCACCCCAC CTGGATGGAC CGCCTAGCCC CAGGAGCCCC GTCATAGGAA GTGAGGTCTT 1680CCTGCCCAAC AGCAACCACG TGGCCAGTGG CGCCGGGGAG GCAGCCATTG AGACCCAGAG 1740CAGCAGTTCT GAAGAGATAG TGCCCAGCCC TCCCTCGCCA CCCCCTCTAC CCCGCATCTA 1800CAAGCCTTGC TTTGTCTGTC AGGACAAGTC CTCAGGCTAC CACTATGGGG TCAGCGCCTG 1860TGAGGGCTGC AAGGGCTTCT TCCGCCGCAG CATCCAGAAG AACATGGTGT ACACGTGTCA 1920CCGGGACAAG AACTGCATCA TCAACAAGGT GACCCGGAAC CGCTGCCAGT ACTGCCGACT 1980GCAGAAGTGC TTTGAAGTGG GCATGTCCAA GGAGTCTGTG AGAAACGACC GAAACAAGAA 2040GAAGAAGGAG GTGCCCAAGC CCGAGTGCTC TGAGAGCTAC ACGCTGACGC CGGAGGTGGG 2100GGAGCTCATT GAGAAGGTGC GCAAAGCGCA CCAGGAAACC TTCCCTGCCC TCTGCCAGCT 2160GGGCAAATAC ACTACGAACA ACAGCTCAGA ACAACGTGTC TCTCTGGACA TTGACCTCTG 2220GGACAAGTTC AGTGAACTCT CCACCAAGTG CATCATTAAG ACTCTGGAGT TCGCCAAGCA 2280GCTGCCCGGC TTCACCACCC TCACCATCGC CGACCAGATC ACCCTCCTCA AGGCTGCCTG 2340CCTGGACATC CTGATCCTGC GGATCTGCAC GCGGTACACG CCCGAGCAGG ACACCATGAC 2400CTTCTCGGAC GGGCTGACCC TGAACCGGAC CCAGATGCAC AACGCTGGCT TCGGCCCCCT 2460CACCGACCTG GTCTTTGCCT TCGCCAACCA GCTGCTGCCC CTGGAGATGG ATGATGCGGA 2520GACGGGGCTG CTCAGCGGCA TCTGCCTCAT CTGCGGAGAC CGCCAGGACC TGGAGCAGCC 2580GGACCGGGTG GACATGCTGC AGGAGCCGCT GCTGGAGGCG CTAAAGGTCT ACGTGCGGAA 2640GCGGAGGCCC AGCCGCCCCC ACATGTTCCC CAAGATGCTA ATGAAGATTA CTGACCTGCG 2700AAGCATCAGC GCCAAGGGGG CTGAGCGGGT GATCACGCTG AAGATGGAGA TCCCGGGCTC 2760CATGCCGCCT CTCATCCAGG AAATGTTGGA GAACTCAGAG GGCCTGGACA CTCTGAGCGG 2820ACAGCCGGGG GGTGGGGGGC GGGACGGGGG TGGCCTGGCC CCCCCGCCAG GCAGCTGTAG 2880CCCCAGCCTC AGCCCCAGCT CCAACAGAAG CAGCCCGGCC ACCCACTCCC CGTGACCGCC 2940CACGCCACAT GGACACAGCC CTCGCCCTCC GCCCCGGCTT TTCTCTGCCT TTCTACCGAC 3000CATGTCACCC CGCACCAGCC CTGCCCCCAC CTGCCCTCCC GGGCAGTACT GGGGACCTTC 3060CCTGGGGGAC GGGGAGGGAG GAGGCAGCGA CTCCTTGGAC AGAGGCCTGG GCCCTCAGTG 3120GACTGCCTGC TCCCACAGCC TGGGCTGACG TCAGAGGCCG AGGCCAGGAA CTGAGTGAGG 3180CCCCTGGTCC TGGGTCTCAG GATGGGTCCT GGGGGCCTCG TGTTCATCAA GACACCCCTC 3240TGCCCAGCTC ACCACATCTT CATCACCAGC AAACGCCAGG ACTTGGCTCC CCCATCCTCA 3300CAACTCACAA GCCATTGCTC CCCAGCTGGG GAACCTCAAC CTCCCCCCTG CCTCGGTTGG 3360TGACAGAGGG GGTGGGACAG GGGCGGGGGG TTCCCCCTGT ACATACCCTG CCATACCAAC 3420CCCAGGTATT AATTCTCGCT GGTTTTGTTT TTATTTTAAT TTTTTTGTTT TGATTTTTTT 3480AATAAGAATT TTCATTTTAA GCAAAAAAAA A 351權利要求
1.包含分離的寡核苷酸分子的外部指導序列，包含RNA酶P裂解靶向序列，和與靶RNA分子上的靶向序列互補的識別序列，其中，外部指導序列促進RNA酶P介導的靶RNA分子的裂解，且其中，在外部指導序列中至少一個核苷酸選自修飾的核苷酸的未修飾的脫氧核糖核苷酸。
2.權利要求1的外部指導序列，其中識別序列包含A識別臂和D識別臂，其中A識別臂位于外部指導序列的3′端，D識別臂位于外部指導序列的5′端。
3.外部指導序列，包含的核苷酸堿基序列選自SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ IDNO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，和SEQ ID NO25。
4.權利要求1的外部指導序列，其中靶RNA分子是乙肝RNA分子。
5.一種用于促進靶RNA分子裂解的組合物，其中該組合物包含存在于藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)中的權利要求1的外部指導序列。
6.權利要求5的組合物，其中藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)選自脂質體，病毒體，微球體和微囊體。
7.權利要求2的外部指導序列，具有結構
其中，R代表3′-OH，3′-OPO(O)CH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，Z代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，V代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸或具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸，M代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，X代表具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，其中n大于0，m大于0，n和m的和大于3。
8.權利要求2的外部指導序列，具有結構
其中R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，Y代表具有5′-磷酸(酯)或5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，J代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，L代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，S代表具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，其中，n大于0，m大于0，n和m之和大于3。
9.權利要求2的外部指導序列，具有結構
其中R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，Y代表具有5′-磷酸(酯)或5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，其中，n大于0，m大于0，n和m之和大于3。
10.權利要求2的外部指導序列，具有結構
其中，R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
11.權利要求2的外部指導序列，具有結構
其中，R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NE2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
12.權利要求7的外部指導序列，其中靶RNA分了是乙肝RNA分子。
13.一種用于裂解靶RNA分子的方法，包括在促進RNA酶P裂解的條件下，將RNA酶P，靶RNA分子和外部指導序列接觸，該外部指導序列包含含有下列結構的分離和寡核苷酸分子RNA酶P裂解靶向序列，和與靶RNA分子上的靶向序列互補的識別序列，其中外部指導序列促進RNA酶P介導的靶RNA分子的裂解，以及其中在外部指導序列中至少一個核苷酸選自修飾的核苷酸和未修飾的脫氧核糖核苷酸。
14.權利要求13的方法，其中靶RNA分子是乙肝RNA分子，其中接觸步驟經過給病人或來自病人的細胞施用外部指導序列來實現(xiàn)，其中外部指導序列存在于藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)中。
15.權利要求14的方法，其中的藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)選自脂質體，病毒體，微球體和微囊體。
16.一種抑制乙肝病毒的方法，包含給病人和來自病人的細胞施用編碼外部指導序列的構建的表達載體，該外部指導序列包括RNA酶P裂解靶向序列，與乙肝RNA分子上的靶向序列互補的識別序列，其中外部指導序列促進乙肝RNA分子RNA酶P介導的裂解。
17.權利要求16的方法，其中構建的表達載體存在于藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)中。
18.權利要求17的組合物，其中藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)選自脂質體，病毒體，微球體和微囊體。
19.權利要求18的方法，其中藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)是脂質體。
20.權利要求16的方法，其中載體是選自逆轉錄病毒載體，腺伴隨病毒載體和Epstein-Barr病毒載體的病毒載體。
21.權利要求1的外部指導序列，包含RNA酶P裂解靶向序列，與靶RNA綜上的靶向序列互補的識別序列，和與配體結合的RNA序列，其中外部指導序列至少一個核苷酸選自修飾的核苷酸和未修飾的脫氧核糖核苷酸，其中外部指導序列僅當與配體結合時促進RNA酶P對靶RNA分子的裂解。
22.權利要求1的外部指導序列，包含RNA酶P裂解靶向序列，與靶RNA分子上的靶向序列互補的識別序列，和結合配體的RNA序列，其中，外部指導序列上的至少一個核苷酸選自修飾的核苷酸和未修飾的脫氧核糖核苷酸，其中外部指導序列僅當不與配體結合時促進RNA酶P對靶RNA分子的裂解。
23.權利要求1的外部指導序列，其中核糖核苷酸的一個或多個2′-羥基被選自氫，O-烷基，氨基和氟的化學基團取代，其中一個或多個磷酸(酯)連接基團用選自甲基磷酸(酯)的和硫代磷酸(酯)的連接基團取代，且其中所述修飾增強了外部指導序列對核酸酶的抗性。
24.權利要求23的外部指導序列，其中核糖核苷酸的一個或多個2′-羥基基團被氫或甲基取代，且其中一個或多個磷酸(酯)的連接基團用硫代磷酸(酯)取代。
25.權利要求23的外部指導序列，其中3′-端用3′-3′-連接的胸腺嘧啶苷酸封端。
26.一種構建的編碼外部指導序列的表達載體，包含下列結構的分離的寡核苷酸分子RNA酶P裂解靶向序列，和與乙肝RNA分子上靶向序列互補的識別序列，其中外部指導序列促進乙肝RNA分子的RNA酶P介導的裂解。
27.一種用于促進乙肝RNA分子裂解的組合物，其中該組合物包含在于藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)中的權利要求25的構建的表達載體。
28.權利要求27的組合物，其中藥學上可接受的傳遞系統(tǒng)選自脂質體，病毒體，微球體和微囊體。
29.一種外部指導序列，包含下列結構的分離的寡核苷酸分子RNA酶P裂解靶向序列，與乙肝RNA分子靶向序列互補的識別序列，其中外部指導序列促進乙肝RNA分子的RNA酶P介導的裂解。
全文摘要
構建了介導特異性靶RNA裂解的修飾的外部指導序列(EGS)分子。該修飾的分子是RNA酶P的外部指導序列分子,設計成特異性地結合并啟動RNA酶P介導的靶RNA分子裂解并增強了核酸酶抗性。特異性的區(qū)域修飾成達到穩(wěn)定性增強且維持RNA酶P活性。構建了適用于治療乙肝病毒感染的修飾的外部指導序列分子。
文檔編號A61P1/16GK1177378SQ96192325
公開日1998年3月25日 申請日期1996年1月16日 優(yōu)先權日1995年1月13日
發(fā)明者沙吉·T·喬治, 邁克爾·馬, 馬丁納·維爾納, 翁貝托·佩斯, 阿倫·R·戈爾德貝格 申請人:伊諾瓦研究室公司