專利名稱：：溶菌酶二聚體的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到溶菌酶二聚體的新用法和含有這種二聚體的組合物。這種新用法是以對免疫系統(tǒng)的非特異性刺激這一共同原則為基礎(chǔ)的，特別應(yīng)用于人和動物體內(nèi)與自然防御系統(tǒng)和再生系統(tǒng)功能損傷相關(guān)癥候或疾病的預(yù)防和/或治療。
背景技術(shù)：
：八十年代后期，人們發(fā)現(xiàn)某些酶的二聚體盡管基本上保留有相應(yīng)單體的有益特性，但比單體的毒性小得多，并且在某些情況下以治療量劑應(yīng)用也根本不顯示消極的副作用。WO89/11294中已描述了包括以溶菌酶二聚體或包括其它二聚化酶作為活性成分的抗病素和抗菌性組合物。這里的報導(dǎo)是當(dāng)溶菌酶二聚體在培養(yǎng)物中的濃度為1.25-20mg/ml時，它可抑制多種從病人取得的標(biāo)本中所培養(yǎng)菌株的增殖。當(dāng)二聚體以1-2mg/kg體重的劑量，每天口服2次應(yīng)用時，也可對尤細小病毒(cpV)感染的治療有效。后來，又發(fā)現(xiàn)了溶菌酶二聚體的又一些誘人的特性并且開發(fā)了藥物，另外的治療性應(yīng)用，尤其用于如WO94/01127中說的細菌和病毒感染的治療。WO94/01127中出現(xiàn)的模型理論可幫助理解用溶菌酶二聚體觀察到的不同效果。盡管溶菌酶二聚體的全部作用方式還不完全明了，但似乎存在由相應(yīng)單體的溶菌活性所不能解釋的其它治療能力。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)二聚體溶菌酶的某些免疫刺激作用，尤其關(guān)系到細胞因子水平的調(diào)節(jié)。此外，他們據(jù)自己的實驗推斷，溶菌酶二聚體能阻止病毒穿透細菌的細胞，可能是通過封閉細胞膜外的某些區(qū)域，其中可能包括病毒的受體蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)公開了另外的用溶菌酶二聚體在體外獲得的結(jié)果。尤其是Bartholeyns和Zenebergh(歐洲癌癥雜志，15卷85-91，1979)檢測了二聚體溶菌酶體外對肝癌細胞(HCT)的抑制細胞生長的活性。他們發(fā)現(xiàn)對細胞培養(yǎng)中癌細胞倍增的抑制率為73％±15％(同上，89頁，表2)。奇怪的是，除WO94/01127外到目前為止沒有用溶菌酶二聚體的體內(nèi)實驗的報導(dǎo)。這很奇怪，令人驚異，現(xiàn)在等待解釋，為何Bartholeyns和Zenebergh或其它的研究者不繼續(xù)對此物進行研究，以開發(fā)另外對癌癥有希望的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)Sorrentino等歐洲生化雜志124，183-189(1982)的方法制備的純化溶菌酶二聚體與本發(fā)明中優(yōu)選應(yīng)用的溶菌酶二聚體所進行的比較(圖1)至少揭示了一種可能的原因在依照Sorrentin等制備的制劑中含有高濃度的副產(chǎn)品，如溶菌酶單體、三聚體和四聚體，而本發(fā)明中所優(yōu)選應(yīng)用的產(chǎn)品是高純度的，也就是說含有需聚溶菌酶二聚體的量達制劑中所有溶菌酶流分重量的90％。WO91/10731中已描述了制備這樣高純度溶菌酶二聚體的方法。因為本領(lǐng)域中15年前就已經(jīng)知道，盡管溶菌酶單體有好的抗菌作用，但它有相當(dāng)?shù)亩拘钥梢鹧装Y和嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至引起中毒性休克癥狀，所以現(xiàn)有技術(shù)溶菌酶二聚體的純化在體內(nèi)實驗和應(yīng)用中只是不夠好，這就很好地支持了這種必然。在這種情況下可很好地理解為什么包括Bartholeyns和Zenebergh在內(nèi)的權(quán)威人士—盡管推薦把溶菌酶二聚體作為有希望的候選物進行進一步研究—在以后的10到15年中沒有進行另外的實驗開發(fā)溶菌酶二聚體的體內(nèi)應(yīng)用。盡管科學(xué)界可能由于對體內(nèi)應(yīng)用溶菌酶二聚體所持有的偏見而對此缺乏研究動機，本發(fā)明仍進行了進一步的研究和開發(fā)工作，以改進二聚體溶菌酶生產(chǎn)和純化的方法，發(fā)現(xiàn)人和動物體內(nèi)應(yīng)用可起到如WO91/01127中所示具有抗病毒和抗菌作用的產(chǎn)品。此外，本發(fā)明人知道二聚體的溶菌酶與單體相比毒性低并且可得到新的、高純度的溶菌酶二聚體，在此基礎(chǔ)上他們試圖并開始用溶菌酶二聚體制劑在體內(nèi)做抗腫瘤(癌癥)實驗，盡管現(xiàn)有技術(shù)并沒有建議它用于治療細菌或病毒感染之外的疾病。本發(fā)明的最大優(yōu)勢之一是為藥物組合物的生產(chǎn)提供了高純度溶菌酶二聚體的應(yīng)用以補充或替代傳統(tǒng)的化療中通常應(yīng)用的毒性極高的抗癌藥物。附圖簡述圖1示按照2種不同的現(xiàn)有工藝所制備的溶菌酶二聚體的純度的比較。發(fā)明詳述本發(fā)明中所指的高純度溶菌酶二聚體由于其毒性單體的量小可用于制備直接用于人和動物治療的藥物組合物。如上面所指出的，純化溶菌酶二聚體含有大約10％重量或更少的不需要的副產(chǎn)品，可通過任何來源的溶菌酶單體的二聚體化而獲得，例如從人、動物、卵、植物、微生物而來的溶菌酶單體，這些單體可以天然狀態(tài)進行自然分離或通過化學(xué)或基因工程的方法生產(chǎn)，以制備出化學(xué)和生物特性與天然品相同或基本相同的溶菌酶單體。本發(fā)明的發(fā)明人用體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?，?yōu)選小鼠和大鼠的實驗?zāi)Ｐ瓦M行的實驗，能成功的證明所應(yīng)用的溶菌酶二聚體組合物對體內(nèi)和體外癌組織細胞增殖有明顯的抑制效果，甚至有完全抑制的效果。這種治療作用可由不同的癌類型進一步證實，這些癌型包括并不限于本領(lǐng)域中已知的由病毒誘導(dǎo)或感染而引起的那些；這些病毒具體包括人類的乳頭瘤病毒，EB病毒、乙型肝炎病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV-1(成人T細胞白血病病毒)，HTLV-II(淋巴瘤病毒)和HIV-I(人類免疫缺陷病毒)及亞型。由這些病毒誘導(dǎo)或感染而引起的癌癥類型包括即子宮頸癌，泌尿生殖道癌，卡波濟肉瘤，原發(fā)肝細胞癌，白血病，T細胞淋巴瘤，艾滋病或其中的亞型。為動物和人類癌癥的預(yù)防和/或治療提供一種藥物組合物和一種方法是本發(fā)明的目的之一。當(dāng)溶菌酶二聚體組合物用于手術(shù)創(chuàng)傷后如下肢切除以后有或多或少感染的病人時，在該臨床試驗中意外的發(fā)現(xiàn)了這種高純度溶菌酶二聚體的又一有益用途。實驗證實二聚體的局部應(yīng)用不僅可有效地治療創(chuàng)傷部位的感染而且在治療部位可刺激毛發(fā)生長和毛發(fā)再生。這一意外發(fā)現(xiàn)引起進一步的研究，最終制備出用于毛發(fā)生長紊亂，尤其是免疫功能失?；蚬δ苷系K所引起的毛發(fā)生長紊亂，如斑禿的藥物組合物。這種組合物至少可部分滿足作為毛發(fā)生長刺激劑這一長期渴求組合物的標(biāo)準(zhǔn)。相信產(chǎn)生這一完全出乎意料效果的基本原理包括對免疫防御機制的刺激和增強作用，對細胞層淺表和皮膚血液循環(huán)的促進作用，對免疫功能的系統(tǒng)非特異性增強作用和也許包括其它一些尚未確定的作用。在魚場和養(yǎng)蜂場，傳統(tǒng)的抗生素被不同的包括溶菌酶二聚體在內(nèi)的非特異性免疫刺激劑所代替而進行的篩選實驗中發(fā)現(xiàn)了含有溶菌酶二聚體的藥物組合物的又意外和非常有趣的商業(yè)用途。魚的飼養(yǎng)中應(yīng)用免疫刺激劑來預(yù)防和/或治療魚類疾病是一有希望的新發(fā)展(Siwicki和Andenson1990；Siwicki等1994)。現(xiàn)在，應(yīng)用包括抗生素，藥物和化學(xué)物質(zhì)等用于魚類疾病治療的物質(zhì)對養(yǎng)魚池進行滅菌(Stoskopf，1993)。盡管每種治療至少對某一特殊疾病的治療部分有效，但隨著這些物質(zhì)在環(huán)境和魚肉中的積累以及對不同抗生素抗性的微生物病理性品系的出現(xiàn)，問題也出現(xiàn)了。在養(yǎng)蜂時，如果可以證明蜂感染了象細菌和/或病毒這樣的微生物就要大范圍殺死蜂群。這樣做可避免感染在其它的群體中擴散以此使所受的損失最小。這種需要為蜜蜂的預(yù)防和/或治療提供一種替代和可靠的方法，這種方法兼有抗生素的優(yōu)點，另外可增強蜜蜂的免疫系統(tǒng)而又不會導(dǎo)致抗生素抗性微生物品系的產(chǎn)生。而且，即使溶菌酶二聚體最終以檢測到的濃度存在于蜂蜜產(chǎn)品中應(yīng)該認為是質(zhì)量的提高而這非變質(zhì)，因為溶菌酶二聚體有非特異性免疫刺激效果的好處。通常免疫刺激劑包括一組在動物和人體內(nèi)增強非特異性細胞和體液防御機制的生物和合成組合物。象β-葡聚糖，脫乙酰殼多糖，左旋咪唑，微量礦物質(zhì)及礦物質(zhì)的組合，由許多植物和動物來源的各種產(chǎn)品，這樣的免疫刺激物對預(yù)防疾病有效。幾種類型的β-葡聚糖尤其對魚細胞和體液非特異性免疫應(yīng)答的刺激作用適用。包括吞噬作用和氧化性基團產(chǎn)生的非特異性防御機制快速被免疫刺激劑激活并且迅速準(zhǔn)備保護魚免受如病毒，細菌，支原體和真菌這樣的病原微生物和/或寄生蟲或其它病原體的侵襲。由此這些機制優(yōu)于特異性免疫應(yīng)答，因特異性免疫應(yīng)答需要很長一段時間來產(chǎn)生包括抗體裝配和特異細胞活性的特異性適合的免疫應(yīng)答。在第一個體內(nèi)實驗中所獲得非常令人鼓舞的結(jié)果顯示了對免疫防御機制的顯著增強作用，從而發(fā)起了溶菌酶二聚體對魚，尤其是鱒魚和鮭魚和蜜蜂的特異性和非特異性細胞、體液防御機制影響的詳細研究計劃。因此，本發(fā)明的一個目的是提供溶菌酶二聚體的新應(yīng)用，包括用于在魚和蜜蜂體內(nèi)刺激非特異性細胞和體液免疫應(yīng)答的藥物組合物的制備。本發(fā)明的另一目的是提供一種方法，通過一次或反復(fù)應(yīng)用含有溶菌酶二聚體的藥物組合物來誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)非特異性刺激，以預(yù)防和/或治療魚和蜜蜂自然發(fā)生疾病的方法。體內(nèi)實驗證明在某些情況下，例如魚已經(jīng)被用給它們的某些化學(xué)物質(zhì)或藥品中的副產(chǎn)品這樣不需要的生物活性物質(zhì)所損傷，可優(yōu)選應(yīng)用WO91/10731中報導(dǎo)的高純度溶菌酶二聚體對魚進行治療，這種二聚體所含不需副產(chǎn)品的量為重量的10％或更少，基本上不含有溶菌酶的單體形式。然而，為了減少魚場或/或養(yǎng)蜂的飼養(yǎng)費用，也可應(yīng)用低純度的溶菌酶二聚體制劑，只要其應(yīng)用的劑量不會由于毒性副產(chǎn)品特別是溶菌酶單體的存在，引起反面效果就行了。這里所指的溶菌酶二聚體即可直接用給需要它的病人又可用于常規(guī)蓋侖制劑中應(yīng)用的藥物組合物的制備。膠，軟膏或流體組合物中所包含溶菌酶二聚體的優(yōu)選濃度為0.01-10mg/m1，通常的濃度大約為0.1-1.0mg/ml。它們通常以無菌和無熱原組合物的形式制備，另外任選地包括至少一種生理溶劑和/或載體和/或至少一種合適的防腐劑。含有溶菌酶二聚體的藥物組合物打算主要用于局部和/或胃腸外應(yīng)用，包括局部注射，如在實體瘤的附近，或在身體表示外面包括皮下注射。在治療的過程中靜脈內(nèi)注射可替代或額外幫助。然而，也已證明粘膜內(nèi)應(yīng)用溶菌酶二聚體組合物也非常有效，優(yōu)選通過流體組合物的吸入(鼻，口，咽的粘膜)或通過流體或乳膏組合物或浸有溶菌酶二聚體物質(zhì)的栓劑的使用(例如陰道，子宮頸粘膜)。在某些情況下優(yōu)選口服應(yīng)用溶菌酶二聚體，優(yōu)選通常的蓋侖制劑形式，如片劑，膠囊或糖衣丸或丸劑，粒劑，絮狀或粉末形式。這些固體組合物通常所含活性藥物的量為0.01-10mg，優(yōu)選每1g總組合物中含0.01-1.0mg。它們也優(yōu)選另外包括至少一種合適的載體和/或防腐劑和/或其它常用的添加劑如調(diào)味或著色劑。另外，溶菌酶二聚體可溶在魚池的水中，因為相信活性藥物可通過魚鰓而被吸收。對于養(yǎng)蜂來說，溶菌酶二聚體組合物可以固體形式溶在為蜂準(zhǔn)備的飲用水、茶、糖溶液或其它常用的流體中，如作為食物的替代品。然而為了確保蜜蜂能攝取藥物，也可以水溶液和與蜂蜜混合的方式制備—優(yōu)選濃縮的。然而，組合物也可以滲透的方式用于口服。在某些情況下，如為了預(yù)防和/或治療泌尿生殖道的癌癥，局部應(yīng)用抗菌敷料或浸有有效劑量高純度溶菌酶二聚體的栓劑是有效和有益的。上面提到的各型溶菌酶二聚體組合物優(yōu)選單次或反復(fù)應(yīng)用的劑量為0.005-0.5mg/kg體重，特別優(yōu)選的劑量為0.01-0.1mg/kg體重。不用說最后藥物組合物中活性溶菌酶二聚體所需的濃度主要依賴于人或動物的大小和為相關(guān)病人制訂的治療或預(yù)防性療法計劃的類型。然而在多數(shù)情況下上面提到的濃度范圍對適當(dāng)?shù)闹委熓亲銐虻摹５钱?dāng)特殊用于獸藥時，有必要提高組合物中溶菌酶二聚體的濃度，使其值高于10mg/ml且低于二聚體產(chǎn)品在各個溶劑中的溶解度，即流體或軟膏中大約20mg/ml。若做到這一點，所應(yīng)用組合物的體積可適當(dāng)保持在適當(dāng)?shù)男∫员阌诓僮?。如果可能的話，前面提到的組合物聯(lián)合應(yīng)用的原始記錄優(yōu)選通過口服、胃腸外或局部應(yīng)用所進行的單一治療。由于這種高純度的溶菌酶二聚體具有基本無毒的特征所以含有該二聚體的組合物可長期應(yīng)用，即，經(jīng)月或甚至經(jīng)年而無有害的副作用。預(yù)防或治療性應(yīng)用藥物的時間間隔可典型地從每天1或多次到每周和每月的劑量，這依賴于各個病人和治療的急促及溶菌酶二聚體對免疫刺激的效果。正如上面所講，本發(fā)明通過高等級溶菌酶二聚體的得到至少可部分實現(xiàn)。產(chǎn)品的質(zhì)量的明顯不同，尤其是不需要的溶菌酶單體部分由圖1可證明泳道1為LMW預(yù)染色蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)磷酸化酶B142,000道爾頓，BSA97,000，卵白蛋白50,000，碳酸酐酶35,100，刀豆胰蛋白酶抑制劑29,700，溶菌酶21,900(Biorad，USA)；泳道2和泳道3是純化的溶菌酶二聚體LYDIUMKLP602(KLP-602)，Lot506449，實驗對照；泳道2加樣6.6μg，泳道3加樣19.8μg；泳道4和泳道5是另一批KLP-602，泳道4加樣6.6μg，泳道5加樣19.8μg；泳道6和泳道7是依照Sorrntino等，歐洲生化雜志124，183-189(1982)的方法而制備的溶菌酶二聚體制劑(KIW-607)；泳道6加樣6.6μg，泳道7加樣19.8μg。純化的溶菌酶二聚體制劑KLP-602包含的。二聚體比與之相比較的產(chǎn)品KIW-607多四倍，而KIW-607含有的單體比KLP-602多六倍。為了能對這里所講的發(fā)明有更為全面的理解，下面列出實施例。應(yīng)該這樣理解，這些實施例僅是以說明為目的而不應(yīng)理解為在任何方面對本發(fā)明的限制。實施例1溶菌酶二聚體(KLP-602)對AKR小鼠淋巴白血病的治療。材料和方法本研究中應(yīng)用七個月齡、2種性別的白血病系A(chǔ)KR小鼠，接種Graffi病毒，該病毒來自Wroclaw，波蘭科學(xué)學(xué)院，免疫和實驗治療研究所，近交系動物中心。AKR小鼠中，內(nèi)源性白血病病毒早期活性的發(fā)生可在七到九個月時引發(fā)，淋巴白血病的臨床癥候。小鼠分為三組，每組30只第1組(實驗組)給動物皮下注射KLP-602一次，劑量為20μg/kg溶于0.3cm3PBS中；第2組(實驗組)給動物注射2次KLP-602，劑量同上；第3組(對照)給動物注射2次0.3cm3的PBS。最后一次注射KLP-602后3-6周放血處死小鼠(每組中取10只)。每組中剩余10只活小鼠。進行以下檢測1.測量身體的總重量及內(nèi)臟器官如肝，脾，胸腺和頸外淋巴結(jié)的質(zhì)量，估算器官質(zhì)量與身體總重量的比率。治療效率按公式L/KX100％計算。其中L指用KLP-602治療鼠存活的時間，K指對照組存活的時間。2.肝，脾，胸腺和淋巴結(jié)等活組織的病理組織學(xué)檢測。切片用果莫里法的H+E染色以檢測網(wǎng)狀纖維。3.用化學(xué)發(fā)光(Ch1)法檢測血清中，自由基的水平，這種方法可檢測血清中非常微弱光子的發(fā)光。4.用NBT和化學(xué)發(fā)光(Ch1)實驗估測多形核細胞(PMN)的吞噬活性。結(jié)果給嚴(yán)重白血病AKR小鼠皮下注射20μg/kg的KLP-602一次(組I)和2次(組II)可引起統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異的體重增加，與對照組相比(組III)脾，胸腺，淋巴結(jié)和肝(最后一個統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異)等內(nèi)臟器官質(zhì)量增加，這些是在實驗開始3周后測量到的(表1)。實驗開始6周后，兩治療組的總體重增加，與對照組相比(第3組)，第1組的脾，胸腺和淋巴結(jié)的質(zhì)量減少，第2組肝和腸腺的質(zhì)量增加(表1)。表2給出了內(nèi)臟器官重量與總體重相比時的比例。三周后與2個實驗組(I和II)相比，組III(對照組)的胸腺質(zhì)量增加。六周后與第1組相比，第1組和第2組中脾，胸腺和淋巴結(jié)的質(zhì)量增加了。三周和六周后所進行的組織病理學(xué)檢測表明頸部淋巴結(jié)，含有淋巴細胞的胸腺和脾的增殖適度(實驗組)和過度(對照組)。然而僅在對照組發(fā)現(xiàn)肝有白血病浸潤。淋巴細胞中有卵圓或環(huán)形深染核，其中有許多核仁和不典型的有絲分裂像。這些細胞有稀疏的低分化的原始生發(fā)中心(centroblastic)細胞，網(wǎng)狀細胞和脾內(nèi)巨核細胞的增殖島相伴隨。脾，淋巴結(jié)和胸腺等淋巴器官的基質(zhì)含有稀疏的薄的網(wǎng)狀纖維?；瘜W(xué)發(fā)光檢測實驗3周后對照組小鼠血清中自由基的活性是K＝18×10-3。第2組中自由基的活性較低(K＝10×10-3)。六周后對照組的自由基水平是K＝10×10-3比第2組低(K＝16×10-3)，比第1組稍高(K＝1.5×10-3)。三周后，與對照組相比兩個實驗組PMN的吞噬活性明顯增加，為4688Ch1(第1組)，3485Ch1，(第2組)，對照組僅為2052Ch1。六周后第2組的吞噬活性同樣高(3264Ch1)而第1組的較低(2477Ch1)。三周后用NBT法檢測吞噬活性，兩治療組的明顯增加，第1組和第2組分別為0.27和0.26。六周后吞噬活性的增加降低并且只在第2組發(fā)生。對照組的吞噬活性為0.22。第1組和第2組中KLP-602的治療有效指數(shù)分別為128％和150％，在最小的125％之上。這些表明了KLP-602的顯著免疫刺激特性并且有進一步研究的資格。兩實驗組中白血病浸潤明顯小于對照組，甚至在一些小鼠中缺少。白血病浸潤存在于胸腺，脾和淋巴結(jié)。此外，他們在對照組動物的肝也找到了。實驗結(jié)果表明KLP-602能部分抑制或延緩AKR小鼠中白血病的進程。與此相反，用安慰劑治療的動物中迅速增大的淋巴器官伴隨有高度分化淋巴白血病的典型形態(tài)學(xué)變化。而且，KLP-602抑制小鼠血清中自由基的增加。在抑制自由基的過程與維生素A，C或錫等抗氧化劑的作用相似。有可能用KLP-602治療的AKR小鼠，其白血病細胞增殖的抑制依賴于抑制自由基產(chǎn)生的過程。對照組小鼠(不用KLP-602)自由基的水平較高并且與疾病的強度相關(guān)。用NBT和ch1兩種獨立的方法檢測，KLP-602也可刺激單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)的吞噬活性，并且這種吞噬活性刺激細胞介導(dǎo)的免疫。它也可調(diào)整TNF的合成。而且，T細胞與MPS一起可識別呈現(xiàn)于白血病細胞局部的腫瘤排斥抗原。腫瘤抗浸潤性淋巴細胞比淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)活性高50-100％，也在這些T細胞中。它們具有CD4或CD8或混合表型，且在細胞局部表達IL-2受體。還不清楚為什么它們能被腫瘤細胞所麻痹。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和MPS細胞的激活是基本的免疫和抗病毒機制。這些細胞的激活可導(dǎo)致干擾素的分泌并且間接地激活B細胞，T細胞或NK依賴的特異和非特異性免疫過程。MPS細胞通過它們的受體如Fc受體，C3受體或HLAII受體和植物血凝素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，尿激酶，胰島素和50個其它知之較少的受體而參予免疫過程。它們的表達和親和力的任何改變表明了細胞的活化。MPS細胞可吞噬NO敏感細胞，因為它們能合成這種物質(zhì)。激活的吞噬細胞叫做“憤怒的巨噬細胞”或“嗜殺欲”(“bloodthirsty”)細胞。MPS可通過它們的細胞毒性和細胞裂解特性而消滅病毒，破壞病毒產(chǎn)物并干擾其合成。初步用AKR小鼠所做研究得到的滿意的結(jié)果表明KLP-602能成功的用于AKR白血病小鼠的治療。表1.對照和實驗組小鼠的體重(g)和內(nèi)臟器官的質(zhì)量(mg)(x±S；下面的值為x)</tables>表2.對照組及實驗組小鼠內(nèi)臟器官的質(zhì)量與整體重量的比例(％)</tables>實施例2高純度的溶菌酶二聚體制劑(KLP-602)對斑禿毛發(fā)生長的作用。進行的研究是為了確定含有KLP-602的藥膏是否對斑禿的毛發(fā)生長有效。此外，對藥膏用到皮膚時的耐受性也進行了評價。材料和方法本研究是一對照、比較的臨床實驗。其中應(yīng)用了12個全身健康狀況良好，斑禿處于“毛發(fā)生長末期”(telogen)的受實驗者(2個男性患者10個女性患者)。他們的年齡從19歲到50歲。12個有斑禿而受長壓定(MINOXIDIL)治療的受實驗者(3個男性患者，9個女性患者)作為對照組。他們的年齡從19歲到49歲。兩治療組受實驗者性別和年齡的分布相似。患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括的標(biāo)準(zhǔn)1.斑禿處于“毛發(fā)生長末期”；2.年齡為18-50歲。排除的標(biāo)準(zhǔn)1.斑禿處于“營養(yǎng)不良”期；2.另一類型的脫發(fā)；3.任何其它的皮膚病。伴隨藥物除非全身的健康狀況需要治療否則不許應(yīng)用伴隨藥物。治療數(shù)目的分配研究過程中，把滿足選擇標(biāo)準(zhǔn)的病人按序列順序編碼到實驗組，研究者在每一病例報告表(CRF)的合適位置填寫相應(yīng)的數(shù)碼。試驗藥物依照最初的工藝由NIKA生產(chǎn)的毛發(fā)香脂裝在有經(jīng)校準(zhǔn)的微尖滴管的100ml精致塑料瓶中。依照護理皮膚科醫(yī)師的建議每天往頭皮上用三次0.05％KLP-602洗劑。經(jīng)皮膚醫(yī)師確診為斑禿后立即開始治療。每天在受侵襲的皮膚區(qū)域用2次2％的長壓定(MINOXIDIL)溶液。療程為16周。治療之后，隨訪觀察病人2個月。安全性的評價通過整個病史和研究開始、結(jié)束時的醫(yī)藥檢測對兩實驗組的受實驗者進行檢查。治療前后血液和尿液標(biāo)本的常規(guī)的實驗室檢測。實驗室的研究包括下列檢驗血液學(xué)血紅蛋白，血細胞比容，總的和不同的白細胞的計劃。血清生物化學(xué)ALT(GPT)，AST(GOT)，堿性磷酸酶，膽紅素。尿液尿液的浸漬片用于分析蛋白質(zhì)，血液和葡萄糖。在4個月的治療和2個月的隨訪期間每1個月看病人一次。每次出診都要詢問病人全身或局部是否存在不利癥候如易激怒，發(fā)熱，癢；檢查治療區(qū)域有無紅斑或其它局部的副作用。效果評價功效指標(biāo)1.首要的功效指標(biāo)是毛發(fā)生長2.第2個功效指標(biāo)是變化的頭皮的治愈時間。3.研究中在下面幾種情況下照相做證應(yīng)用KLP-602毛發(fā)藥膏前毛發(fā)生長時KLP-602毛發(fā)藥膏應(yīng)用結(jié)束時進行顯微鏡評價(毛發(fā)圖(trichogram))。從斑禿損傷邊緣所取毛發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)毛發(fā)圖可以對疾病的過程和嚴(yán)重程度以及治療的效果提供許多有利的信息。每次出診，都要估計頭皮的毛發(fā)生長征，按如下分類—無—輕微—可見的再生長(毫毛或少許散在孤立的末端毛發(fā))—中度—不完全(部分)—完全“美容可接受的”毛發(fā)生長是指足以覆蓋頭皮，遮蔽殘留的毛發(fā)脫失區(qū)域。結(jié)果所有參予本研究的受實驗者完成了4個月的治療和2個月的隨訪。(12名用0.05％的KLP-602治療，對照組的12名由2％的長壓定溶液治療)效果研究結(jié)束時調(diào)查者的評估是對功效最有益的評價。總起來講研究過程中KLP-602組的12名受實驗者中有8名(66％)，長壓定組的12名中有6名(50％)受實驗者，毛發(fā)生長增加。其中KLP-602組中有4名(33％)，長壓定組有3名(25％)，受實驗者有完全、美容的可接受的毛發(fā)生長。KLP-602組的12名中有3名(25％)受實驗者的毛發(fā)部分生長，長壓定組也有3名(25％)。KLP-602組的一名(9％)可觀察到最小的毛發(fā)生長。KLP-602組的12名中有4名(33％)。無毛發(fā)生長，長壓定組的12名中有6名(50％)無毛發(fā)生長。脫發(fā)范圍小于頭皮的25％時，KLP-602組和長壓定組在有毛發(fā)生長的分別為8/8和6/7。在兩個治療組中當(dāng)受實驗者脫發(fā)范圍超過頭皮的25％時均沒觀察到毛發(fā)再生。兩種中毛發(fā)生長反應(yīng)的平均時間與從1個月到3個月的療程有關(guān)。KLP-602組中的3名受實驗者在治療1個月后產(chǎn)生反應(yīng)。有1名女性1個月后毛發(fā)生長，大約有5mm長的末端毛發(fā)，斑禿的頭皮區(qū)域覆蓋著濃密的再生毛發(fā)。第2個月后在核實出診時，這位女性出現(xiàn)全禿(情態(tài)刺激—離婚)對以后的治療無反應(yīng)，研究結(jié)束時是陰性結(jié)果。長壓定組觀察到1名受實驗者治療1個月后有毛發(fā)再生。KLP-602組中治療2個月后有4個病人有毛發(fā)再生。3個月后KLP-602組和長壓定組分別觀察到有2名和3名受實驗者的毛發(fā)再生。安全性在治療和隨訪期間沒有發(fā)現(xiàn)全身性的副作用。研究結(jié)束時，兩治療組的實驗室血液和尿液值在基線和實驗結(jié)束時均無異常。在研究過程中發(fā)現(xiàn)局部的不利癥候KLP-602組的1名女性訴說在治療的第2個月毛皮有灼燒和瘙癢。她說這些癥狀與帶新假發(fā)有關(guān)。這種感覺在沒有進行任何額外治療的情況下2周內(nèi)消失，她沒有中斷治療并以良好的結(jié)果結(jié)束了實驗。一名用2％長壓定溶液治療的受實驗者訴說頭發(fā)油膩，毛皮檢查沒有發(fā)現(xiàn)明顯的臨床體征。病人說這與試驗有關(guān)但他仍愿意繼續(xù)治療。毛發(fā)再生與病人的年齡，斑禿區(qū)域的位置及現(xiàn)在發(fā)病的病程無明顯的關(guān)系，兩組的病史均很短、很相似，從一周到最多的一年。兩治療組中所有沒反應(yīng)的病人有至少持續(xù)了5年(5-15年)的斑禿病史。討論本研究是為了評估局部應(yīng)用0.05％KLP-602洗液的安全性和它對斑禿病人毛發(fā)生長的功效，并且在四個月的治療過程中與2％長壓定溶液的效果進行比較。含有KLP-602的毛發(fā)藥膏能很好地被病人耐受。治療過程中用0.05％KLP-602洗液治療的受實驗者有66％表現(xiàn)毛發(fā)生長增加而與之相對的長壓定組為50％。KLP-602組和長壓定組中所見到的有美容上可接受毛發(fā)生長的病人分別為33％和25％，脫發(fā)范圍小于頭皮25％的患者治療效果較好。0.05％KLP-602洗液易于局部應(yīng)用并且不引起任何局部或全身不利癥狀。鑒于進行研究的時間很短(16周)，所得的結(jié)果非常令人鼓舞。結(jié)論1.含有KLP-602的藥膏能被很好地耐受，不引起任何副作用。2.0.05％KLP-602的局部應(yīng)用方便、安全。3.研究過程中沒發(fā)現(xiàn)局部或全身的副作用，實驗室數(shù)值中無異常。4.由于短時間的治療(4個月)和2個月的隨訪，不可能完全估計治療的結(jié)果和成績，盡管這段時間對于觀察令人鼓舞的治療功效足夠長。5.試驗中所獲得的結(jié)果表明0.05％KLP-602洗液可與2％長壓定溶液相仿，甚至在斑禿治療中更有效。6.臨床前調(diào)查和研究中所獲得結(jié)果證明表示應(yīng)用KLP-602可誘導(dǎo)斑禿患者毛發(fā)生長?？偨Y(jié)本研究的進行是為了評估含KLP-602的毛發(fā)藥膏對斑禿毛發(fā)生長的功效和耐受力。每天應(yīng)用3次0.05％KLP-602洗液，在4個月的治療期間通常可以很好地耐受。沒有發(fā)現(xiàn)局部或系統(tǒng)性的副作用。KLP-602組的毛發(fā)生長反應(yīng)要更好于長壓定組。用0.05％KLP-602洗液治療的受實驗者有66％觀察到毛發(fā)生長反應(yīng)。斑禿面積小于頭皮25％的病人中產(chǎn)生中度或濃密毛發(fā)再生的百分率較高。0.05％KLP-602對于斑禿的治療是-值得注意的試劑。實施例3預(yù)防應(yīng)用溶菌酶二聚體以誘導(dǎo)對魚免疫系統(tǒng)的非特異性刺激。實驗設(shè)計本試驗中應(yīng)用300條虹鱒魚(大麻哈魚(Oncorhynchusmykiss)，鮭科家族)，體重為90-100g的健康魚。依照WO91/10731制備的溶菌酶二聚體(這里命名為“KLP-602”)所含不需要的副產(chǎn)品占重量的10％或更少，基本不含溶菌酶的單體形式，溶于PBS，制備成適于魚類腹腔注射，每公斤體重應(yīng)用10或100μg溶菌酶二聚體的注射液。每天用藥1次。治療的原始記錄包括不同組別的魚分別在第1天，在第1天和第3天，在第1天、第3天和第5天用藥。對照組的魚不應(yīng)用溶菌酶二聚體。最后1次注射后1，2，3，和4周從每一治療組和對照組中取10只樣品。固定魚，用含肝素的Vacuette(Greiner)從靜脈取2ml血。檢測PMN和MN細胞的吞噬活性，PMN和MN細胞的突發(fā)性呼吸活性和潛在的殺傷活性，PMN吞噬細胞的MPO活性及血清中溶菌酶和γ-球蛋白的水平。每組也有20只用于疾病(癤病)攻擊試驗。給魚1次腹腔注射在營養(yǎng)泡沫上培養(yǎng)了48h的殺鮭Ev單胞菌屬的菌懸液。檢測動物的死亡(死亡率)。并且通過從死亡動物的腎分離病原體來確定死亡和細菌感染間的關(guān)系。結(jié)果KLP-602治療組中上面所提到的所有免疫學(xué)指標(biāo)都明顯高于(P＜0.05)對照組的相應(yīng)值。這一意外的結(jié)果在所有的組都能觀察到，也就是說應(yīng)用KLP-6021次，2次或3次后，持續(xù)到最后1次注射后4周這一整個觀察過程。而且KLP-602治療組魚的死亡率也顯著低于對照組。突發(fā)性呼吸活性也相當(dāng)?shù)母?，?jīng)KLP-6022次和3次治療組的吞噬指數(shù)和中性粒細胞的髓過氧化物酶(MPO)也是如此。虹鱒魚對殺鮭氣單孢菌這一毒性細菌的挑戰(zhàn)的已知敏感性和從用溶菌酶二聚體預(yù)防性治療組觀察到的結(jié)果暗示實際上這種藥物能夠誘導(dǎo)短期內(nèi)保護以對所講微生物的攻擊。另外認識到，接受2或3劑KLP-602治療組的保護高于僅應(yīng)用了1次的治療組。結(jié)論魚中應(yīng)用高純度的溶菌酶二聚體可增強其非特異性的防御機制并且顯著提高其對微生物如殺鮭氣單孢菌(引起癤病)侵襲的保護作用。為了使因為反復(fù)發(fā)生魚類疾病，尤其是春天季節(jié)所造成的魚類損失最小化，這一發(fā)現(xiàn)在魚類飼養(yǎng)工業(yè)中對魚的預(yù)防和治療非常重要。實施例4治療性應(yīng)用溶菌酶二聚體以誘導(dǎo)魚免疫系統(tǒng)的非特異性刺激實驗設(shè)計在自然發(fā)生IPNV(傳染性胰腺壞死性病毒)感染的病程中和應(yīng)用包括二聚體的溶菌酶(KLP-602)組合物時所對非特異性防御機制進行的比較性研究中應(yīng)用了200條虹鱒魚。確定感染了IPNV后，部分魚接受KLP-602的治療，而對照組仍沒治療。用免疫學(xué)和血清學(xué)方法分析了表明非特異性細胞和體液防御機制特征的主要指標(biāo)。這些方法包括在2個月的觀察過程中每周檢測白細胞總數(shù)，相對白細胞計數(shù)，PMN和MN細胞的吞噬能力，突發(fā)性呼吸活性和潛在的殺傷能力，中性粒細胞的MPO活性，血漿中溶菌酶和血漿銅藍蛋白的活性，蛋白質(zhì)總量和γ-球蛋白水平。虹鱒魚的重復(fù)組的食物中含有非特異性刺激物KLP-602的量為20μg/kg體重。KLP-602的冷凍干燥品與營養(yǎng)物一起，既能以固體形式(絮狀，丸劑)口服應(yīng)用又可溶在魚池的水中應(yīng)用，即做為水溶液，經(jīng)過7天時間，假定藥物可通過魚鰓這一途徑而被吸收。此后每隔一間就從它們?nèi)?，分析非特異性細胞和體液防御機制的變化。每次隨機選擇10條魚用于免疫學(xué)檢測和IPNV的鑒定。此外，每天都要觀察全部魚的日常行為，形態(tài)學(xué)變化和死亡情況。結(jié)果自然感染IPNV的魚可觀察到免疫受抑。整個觀察時間內(nèi)，指標(biāo)顯示非特異性細胞和體液防御機制顯著下降，而喂含溶菌酶二聚體的食物一周后一些指標(biāo)如血漿銅藍蛋白水平，突發(fā)性呼吸活性，免疫球蛋白水平，溶菌酶活性與對照組相比顯著增高(例，血漿銅藍蛋白水平升高近31％，溶菌酶活性升高近40％，突發(fā)性呼吸活性升高近33％)。應(yīng)用KLP-602后，可清晰地認識到對非特異性防御機制的免疫刺激效果。用含KLP-602的食物喂養(yǎng)的組中累積死亡率也最低。結(jié)論用含有溶菌酶二聚體(KLP-602)的食物治療的魚，其非特異性免疫防御機制顯示出有利變化。這些變化與死亡率的下降相關(guān)，也就是說表明對IPNV引起的自然發(fā)生感染有保護作用，這些發(fā)現(xiàn)強烈建議進一步發(fā)展和優(yōu)選使用這里所提到的溶菌酶二聚體預(yù)防和/或治療魚類疾病的實施方案。權(quán)利要求1.溶菌酶二聚體，優(yōu)選按重量計含10％或更少的不需要的副產(chǎn)品并且基本上不含溶菌酶的單體形式，在制備用于預(yù)防和/或治療選自癌癥，毛發(fā)生長紊亂，魚類疾病和蜜蜂疾病的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說的預(yù)防性或治療性療法包括對人和動物免疫系統(tǒng)和/或再生系統(tǒng)的非特異性刺激。3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中的癌癥由病毒的作用感染或誘發(fā)，這些病毒選自人類乳頭瘤病毒，EB病毒，乙型肝炎病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，優(yōu)選成人T細胞白血病病毒(HTLV-1)，HTLV-2和HIV-1，包括HIV亞型。4.權(quán)利要求1或2刺激毛發(fā)生長的應(yīng)用，優(yōu)選因免疫功能失常而引起的毛發(fā)生長紊亂，最優(yōu)選斑禿。5.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其特征在于所說魚類疾病包括癤病和IPNV感染。6.權(quán)利要求1，2，和5的任一項的應(yīng)用，其特征在于所述魚類包括鮭魚科家族，尤其是虹鱒魚。7.前述任一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中溶菌酶二聚體是溶菌酶單體二聚體化的產(chǎn)物，溶菌酶單體來源于包括人，動物，卵，植物和微生物的自然資源，或通過化學(xué)合成和/或基因工程的方法來源。8.前述任一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中溶菌酶二聚體組合物以劑量0.005-5.0mg/kg單次或反復(fù)給藥，優(yōu)選0.01-1.0mg/kg體重。9.前述任一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中溶菌酶二聚體組合物是凝膠、軟膏或流體形式的組合物，優(yōu)選包括0.01-10mg/ml量的溶菌酶二聚體，最優(yōu)選的量為0.01-1.0mg/ml，其中組合物最好還包括至少一種生理上可接受的溶劑，載體和合適的防腐劑，從而可局部，口服或胃腸外給藥。10.權(quán)利要求1到8任一項的應(yīng)用，其中溶菌酶二聚體組合物是固體形式，特別是以片劑，膠囊，糖衣丸，粉末，丸，顆粒或絮狀形式存在，優(yōu)選組合物中包含的溶菌酶二聚體的量為0.01-10mg，優(yōu)選每1g總組合物0.1-1.0mg，為了口服施用最好還包括至少一種合適的載體，防腐劑和常規(guī)的藥用添加劑。11.權(quán)利要求1，2，7到9任一項的預(yù)防和/或治療應(yīng)用，任選病毒誘發(fā)的泌尿生殖道癌癥，其中溶菌酶二聚體的有效劑量以抗菌敷料或浸漬栓劑的形式局部施用。全文摘要本發(fā)明涉及到包含溶菌酶二聚體的藥物組合物,優(yōu)選高純度的即所含副產(chǎn)品為重量的10%或更少,并涉及到其新的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括局部,口服或胃腸外應(yīng)用這種組合物以誘發(fā)可變量對人和動物疾病預(yù)防和/或治療效果的非特異性免疫刺激,這些疾病包括癌癥、毛發(fā)生長紊亂、魚類疾病和蜜蜂的疾病。免疫系統(tǒng)的非特異性免疫刺激通過單次或反復(fù)應(yīng)用溶菌酶二聚體組合物而被誘導(dǎo)，優(yōu)選的濃度為5—500μg/kg體重。文檔編號A61P13/02GK1177303SQ96192331公開日1998年3月25日申請日期1996年1月13日優(yōu)先權(quán)日1995年1月13日發(fā)明者W·基茨卡申請人:尼卡健康產(chǎn)品有限公司