專利名稱：獲得細(xì)胞和創(chuàng)傷處理用的新型的、確定的酶混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從溶組織梭狀芽孢桿菌(Clostridium histolyticum)中提純的酶的具有確定組成的混合物以一種可重復(fù)的、標(biāo)準(zhǔn)化的方式從人或動(dòng)物組織中獲得細(xì)胞或組織碎片的用途，以及這些提純的酶用于創(chuàng)傷處理的應(yīng)用。
從組織中分離細(xì)胞的方法應(yīng)當(dāng)是可重復(fù)的，而且應(yīng)該保證對所獲得的細(xì)胞造成的傷害最小。通常，來自溶組織梭狀芽孢桿菌的具有不確定組成的含膠原酶的制劑被用于這一目的，但上述目標(biāo)不能以此可靠地完成。而使用其它的酶制劑或非酶方法則是少見的或只能提供較差的分離結(jié)果(1)、(9)。
通常使用的或被推薦使用的含有膠原酶的制劑(2)是從溶組織梭狀芽孢桿菌的培養(yǎng)液的濾液中獲得的，除了含有多種膠原酶和蛋白酶(3a)、(3b)外，它還含有由于蛋白水解作用而形成的這些酶的裂解產(chǎn)物以及其它的成分，其中一些成分是有害的而且不知其為何物。
根據(jù)現(xiàn)階段的知識，以一種來自溶組織梭狀芽孢桿菌的單一的酶獲得較高產(chǎn)量的活細(xì)胞是不可能的。相反，為了使組織有效地分解，需要來自這種細(xì)菌的各種酶的共同作用。然而，為達(dá)到這一目的所需的酶量的比率迄今為止還沒有被公開，使用者也得不到來自溶組織梭狀芽孢桿菌的酶的確定混合物。
基于上述問題，許多研究組織致力于使用提純的酶從組織中分離細(xì)胞。然而，這些研究都沒能導(dǎo)致使用純酶或任何完全確定的混合物。
Suggs等人(4)使用一種混合物分離了人的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，該混合物由提純了的膠原酶級分以及提純了的來自牛胰臟的胰蛋白酶組成。然而，所使用的富集了的膠原酶級分沒有各種酶的確定的組成，它還含有少量的諸如梭菌蛋白酶的物質(zhì)，這個(gè)分離結(jié)果與使用具有不確定組成的含有膠原酶的制劑所得到的結(jié)果沒有明顯的差別。使用上述混合物的單一組分是不可能獲得令人滿意的組織解離的。然而，使用胰蛋白酶用于細(xì)胞分離也不是沒有問題，因?yàn)檫@種蛋白水解酶破壞細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)。因而，舉例來說，它對連接在肝膜和脂肪細(xì)胞上的胰島素有損害作用。
Hefley(6)、(7)應(yīng)用提純的膠原酶級分的混合物從小鼠的顱骨中分離骨細(xì)胞。在這之前(7)，該作者報(bào)道了使用純提的膠原酶級分與中性蛋白酶的混合物成功地分離這些細(xì)胞的可能性。然而，在上述兩個(gè)研究中都使用了來自分離柱的洗脫液，其中底物專一性不同的各種膠原酶的含量和其它成分的含量都是未知的。
Wolters等人(8)使用中性蛋白酶和由Sigma提供的“VII型膠原酶”的混合物來從大鼠的胰臟內(nèi)分離島細(xì)胞，盡管并不知道這種混合物中所含有的各種膠原酶的種類和數(shù)量。另外，它還含有少量的梭菌蛋白酶和“非特異性蛋白酶”。中性蛋白酶被以一種高度純化的形式使用。上述兩種組分的混合物產(chǎn)生了較多數(shù)量的活體島細(xì)胞。
本發(fā)明涉及高純度的HP膠原酶、AZ膠原酶以及彈性蛋白酶這些單獨(dú)的酶，也涉及它們的混合物。
在以合成的六肽Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala作為底物的Graβmann和Nordwig(11)的分析中，HP膠原酶的比活至少是20U/mg，優(yōu)選為至少50U/mg。如果用于醫(yī)藥目的，其優(yōu)選的比活是100U/mg或更高。
在使用阿佐考(Azokoll)作為底物的Mandl等人(12)的分析中，AZ膠原酶的比活至少是10U/mg，優(yōu)選為至少30U/mg。如果用于醫(yī)藥目的，其優(yōu)選的比活是50U/mg或更高。
在以來自牛頸部韌帶的彈性蛋白為底物所進(jìn)行的分析中，彈性蛋白酶的比活至少是2U/mg，優(yōu)選為至少5U/mg。如果用于醫(yī)藥目的，其優(yōu)選的比活是12U/mg或更高。
本發(fā)明還涉及使用一種HP膠原酶和彈性蛋白酶的混合物，加入或不加入AZ膠原酶和/或梭菌蛋白酶，用以從人或動(dòng)物組織中分離細(xì)胞或組織碎片。
本發(fā)明還涉及這些酶單獨(dú)或作為混合物的組分的直接或間接的應(yīng)用，用于醫(yī)療用途，例如用于創(chuàng)傷處理。
為了用于組織解離，舉例來說，可將混合物以冷凍干燥形式裝入小瓶中，其中的量足以使一只大鼠的肝臟(該器官的濕重大約為9-11g)解離。
合適的混合物至少含有下列提純的酶中的兩種HP膠原酶(50-300U；優(yōu)選為70-170U)和彈性蛋白酶(5-70U；優(yōu)選為10-25U)，加入或不加入AZ膠原酶(1-20U，優(yōu)選是2-8U)和/或梭菌蛋白酶(10-280U，優(yōu)選是20-50U)。上述數(shù)字顯示的是一個(gè)單元-例如一支小瓶中-的混合物所具有的量。
對所使用的酶的純度的判斷標(biāo)準(zhǔn)是每種情況下它們的比活，在通常被用于這一目的的電泳方法中顯示其均勻性(SDS凝膠電泳，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的等電聚焦和電泳)。純化后的酶的比活值比起始物質(zhì)的比活值高100倍以上。
具有下列比活的純化酶被用于制備混合物比活至少是20U/mg的HP膠原酶，至少是2U/mg的彈性蛋白酶，至少是10U/mg的AZ膠原酶，至少是10U/mg的梭菌蛋白酶。
由于這類有確定組成的混合物具有能夠協(xié)同作用的膠原水解酶、彈性蛋白水解酶(sic)和蛋白水解酶，它們特別適用于從人和動(dòng)物組織中無損傷地和有效地分離細(xì)胞或組織碎片。
由于在每種情況下所使用的制劑都來自已知其性質(zhì)的純化后的酶，對各個(gè)批次的費(fèi)時(shí)和昂貴的檢測就不再必要了，這是相當(dāng)有利的。這省去了為了細(xì)胞的功能鑒定而需要進(jìn)行的工作，或至少使工作量變小了。由于上述的原因，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)量可在很多領(lǐng)域內(nèi)減少。
使用沒有經(jīng)過很好純化的酶，或使用具有較低比活的酶，通常會(huì)導(dǎo)致在上述應(yīng)用中細(xì)胞的產(chǎn)量較低，而且還會(huì)產(chǎn)生通常的問題分離結(jié)果缺乏重復(fù)性，缺乏批次的一致性，可能具有不利影響的未知組分的存在。
對文獻(xiàn)中報(bào)道的很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以作出解釋，原因是在制備、提純或鑒定過程中伴生的蛋白酶導(dǎo)致了酶的裂解。對每一種單一的酶在細(xì)胞分離中對實(shí)驗(yàn)結(jié)果所作出的貢獻(xiàn)也是難以解釋的，原因是在一些情況下由膠原酶、彈性蛋白酶和蛋白酶所產(chǎn)生的碎片保留了它們的酶活性。然而，對底物特異性改變的程度沒有作出解釋。另外，許多商品含膠原酶的制劑有時(shí)只含有初始的膠原酶的裂解產(chǎn)物。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，制劑的生產(chǎn)者或細(xì)胞分離方法的使用者也不可能清楚地使含膠原酶的制劑標(biāo)準(zhǔn)化。
由于本發(fā)明中純化的酶的混合物在裂解組織時(shí)有廣泛的活性，它們適用于所有的人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞，優(yōu)選的組織碎片和/或細(xì)胞來自膽管、血液系統(tǒng)、腺體、血管系統(tǒng)、腦、皮膚、心臟、腸、胰島、肝臟、肺、胃、脾、肌肉、臍帶、神經(jīng)、腎、胰、脊髓、甲狀腺、終端回腸、腫瘤組織、子宮、消化道和舌。
使用所描述的混合物分離的細(xì)胞或組織碎片非常適用于細(xì)胞和組織的移植以及用于基因治療(例如胰島、島細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、脂肪細(xì)胞)、免疫治療或創(chuàng)傷愈合中。
本發(fā)明混合物的一個(gè)十分重要的用途是分離肝細(xì)胞、島細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、卵母細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。在這些應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)對上述方法的標(biāo)準(zhǔn)化和改進(jìn)是十分有利的。
例如，一種具有確定組成的含有底物特異性不同的兩種膠原酶以及一種彈性蛋白酶的混合物被證實(shí)十分適于從大鼠肝臟(使用實(shí)施例A、D、E)和人肝臟(使用實(shí)施例F)中分離肝細(xì)胞，從大鼠肝臟中分離膽管上皮細(xì)胞(使用實(shí)施例G)，從人類臍帶中分離內(nèi)皮細(xì)胞(使用實(shí)施例[sic]H)，從人腫瘤中分離腫瘤細(xì)胞(使用實(shí)施例I)以及從豬胰臟中分離島細(xì)胞(使用實(shí)施例J)。
與具有不確定組成的最好的含膠原酶的酶制劑相比，本發(fā)明混合物的分離效果較好或至少是一樣好。
本發(fā)明的混合物可用于替代所有通常所使用的含膠原酶的制劑，因?yàn)樗鼈兒惺菇M織解離所必需的各種的成分。這就避免了目前所使用的含膠原酶的制劑的缺點(diǎn)，其中的一個(gè)原因是本發(fā)明的混合物具有一致的組成。
上述混合物的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域是以一種可重復(fù)的、標(biāo)準(zhǔn)化的方式，按照Berry和Friend(9)、(10)已被接受的方法從肝臟中獲得肝細(xì)胞，迄今為止其中使用的是沒有確定組成的含膠原酶的酶制劑；以及通過使用現(xiàn)有技術(shù)的混合物更好地從胰臟組織中獲得完整的島細(xì)胞。
另一個(gè)主要的應(yīng)用領(lǐng)域是在創(chuàng)傷愈合中。這其中所使用的酶的純度越高越好。
I.來自溶組織梭狀芽孢桿菌的酶的制備和性質(zhì)1.HP膠原酶a.制備用硫酸銨分級沉淀蛋白質(zhì)酶純化過程中的所有操作均在4-8℃下進(jìn)行。
將200g粗膠原酶溶于3l水中，然后將680g粉末狀的硫酸銨加入到該溶液中。用離心方法將蛋白質(zhì)沉淀A1除去；再將420g硫酸銨加入上清液中。用離心方法將這次沉淀的蛋白質(zhì)級分A2分離，將該沉淀溶于1l水中并在水中透析。然后通過超濾膜(排阻限為10,000Da)將其濃縮至大約100ml。然后將該濃縮液凍干。所得到的粉末狀蛋白質(zhì)級分A2主要含有HP膠原酶和AZ膠原酶。
通過金屬螯合親合色譜對HP膠原酶和AZ膠原酶進(jìn)行色譜分離用負(fù)載有Zn2+的螯合型瓊脂糖6B對HP膠原酶和AZ膠原酶進(jìn)行色譜分離。具體作法是將該物質(zhì)加入分離柱(5×100cm)中，高度是70cm，用起始緩沖液(500mM醋酸鈉+20mM醋酸鈣，pH8.0)平衡。用TRIS〔三(羥甲基)氨基甲烷〕將起始緩沖液的pH調(diào)至8.4，然后將約1.2g的蛋白質(zhì)級分A2溶于15ml該緩沖液中并加入到分離柱上，用起始緩沖液將蛋白質(zhì)級分A2的各種成分從分離柱中洗滌出來。在隨后用緩沖液A(500mM醋酸鈉+20mM醋酸鈣，用醋酸將pH調(diào)至6.3)進(jìn)行的洗脫中，在分離級分中首先收集的是AZ膠原酶，然后是HP膠原酶。
用超濾膜(排阻限為10,000 Da)將HP膠原酶和AZ膠原酶這兩種分離的級分分別濃縮至50-100ml，然后在水中透析，再用超濾膜(排阻限為10,000 Da)將它們濃縮至大約10ml。
HP膠原酶的最后純化HP膠原酶的最后純化使用一臺Pharmacia FPLC設(shè)備在一臺Mono Q陰離子交換器(HR 10/10，Pharmacia)上進(jìn)行。具體作法是將1ml緩沖液B和2ml含有來自上述色譜分離步驟的含HP膠原酶的級分的混合物加入到已經(jīng)用緩沖液B(20 mM TRIS/HCl pH7.5)平衡的分離柱的上部。
在用緩沖液B洗滌后，用緩沖液C(20m M TRIS/HCl+20mM NaCl，pH7.5)將HP膠原酶以純化的形式從分離柱中洗脫。
b.性質(zhì)HP膠原酶之所以被命名為“HP”是因?yàn)樗軌蚴钟行У亓呀饬腪-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala。因此它適合于對活力的特異性檢測。HP膠原酶的特性是它能夠只在很小的程度上轉(zhuǎn)化失活的膠原，例如明膠或阿佐考。然而它卻破壞牛肌鍵膠原以及以很高的轉(zhuǎn)化率使實(shí)施例2b中提到的合成肽裂解，部位是在甘氨酸和甘氨酸之間或者任何氨基酸和甘氨酸之間。
應(yīng)該特別強(qiáng)調(diào)的是HP膠原酶與AZ膠原酶一道(反之亦然，即任何至少含有HP和AZ膠原酶的混合物)對天然膠原的裂解有超加效應(yīng)。在用于組織解離時(shí)，體外的協(xié)同效應(yīng)也是十分重要的(例如應(yīng)用實(shí)施例G)。
在使用合成底物Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala進(jìn)行的分析中，HP膠原酶的最高比活是146 U/mg(11)。與起始物質(zhì)相比，酶的比活力相應(yīng)地提高了大約100倍。
以這種方式純化的HP膠原酶在SDS凝膠電泳中和在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的等電聚焦和電泳中都只形成一條譜帶。
由SDS凝膠電泳測定其分子量為106,000 Da。其等電點(diǎn)為pH5.8-6.0。
2.AZ膠原酶a.制備酶純化過程中所有操作均在4-8℃下進(jìn)行。對AZ膠原酶的前兩步純化過程(分級蛋白質(zhì)沉淀和金屬螯合親合色譜)描述于1中。
AZ膠原酶的最后純化AZ膠原酶的最后純化是在Pharmacia FPLC設(shè)備的輔助下在Mono Q陰離子交換器(HR 10/10，Pharmacia)上進(jìn)行的。具體作法是將1ml緩沖液D(20mM醋酸鈣，pH7.2)和1ml含有AZ膠原酶的級分(來自上述的金屬螯合親合色譜)的混合物加入到已經(jīng)用緩沖液D平衡的分離柱的上部。
在用緩沖液D洗滌后，用緩沖液E(20mM醋酸鈣，pH5.0)將AZ膠原酶從分離柱中洗脫。
b.性質(zhì)AZ膠原酶之所以被命名為“AZ”是因?yàn)樗軌蚴钟行У亓呀獾孜锇⒆艨肌Ｋ奶匦允悄軌蛴行У剞D(zhuǎn)化失活的膠原，比如明膠或阿佐考，但它也能轉(zhuǎn)化牛肌鍵膠原。然而，它不能破壞短鏈的合成的肽，比如2-呋喃丙烯酰-Leu-Gly-Pro-Ala、4-苯偶氮基芐氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg以及Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala。
在由Mandl等人(12)開發(fā)的使用阿佐考作為底物的分析中，AZ膠原酶的最高比活是82U/mg。與起始物質(zhì)相比，酶的比活力相應(yīng)地提高了大約80倍。
以這種方式純化的AZ膠原酶在SDS凝膠電泳中和在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的等電聚焦和電泳中都只形成一條譜帶。
由SDS凝膠電泳測定其分子量為111,000 Da。其等電點(diǎn)為pH 5.9-6.1。
3.彈性蛋白酶a.制備酶純化過程中的所有操作均在4-8℃下進(jìn)行。
彈性蛋白酶純化的第一步是按照描述于1.a中的方法用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)。
將蛋白質(zhì)沉淀A1溶于1l水中，通過超濾膜(排阻限為10,000 Da)將其濃縮至大約170ml并在0.1mM的醋酸鈣溶液中透析。隨后通過超濾膜(排阻限為10,000 Da)將該酶溶液再次濃縮至大約50ml，然后將其凍干。
最后的純化在SEPHADEX G100或G200(Pharmacia)的凝膠色譜上進(jìn)行。
b.性質(zhì)彈性蛋白酶的性質(zhì)是它能夠以高的轉(zhuǎn)化率裂解彈性蛋白。其比活(參見3.C.)是18U/mg。與起始物質(zhì)相比，酶的比活力相應(yīng)地提高了大約80倍。
以這種方式純化的彈性蛋白酶在SDS凝膠電泳中和在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的等電聚焦和電泳中都只形成一條譜帶。
由SDS凝膠電泳測定彈性蛋白酶的分子量是35,000 Da。
c.活力測定酶活力的測定使用彈性蛋白作為底物。
將20mg精細(xì)粉碎的牛頸部韌帶的彈性蛋白溶解在0.4ml的緩沖液(50mM TRIS/HCl+10 mM醋酸鈣，pH7.2)中，在37℃的水溶中預(yù)先保溫振搖5分鐘。然后通過加入溶解于0.1ml緩沖液中的彈性蛋白酶使反應(yīng)開始，并繼續(xù)在37℃下振搖10分鐘(振幅25mm，速率150轉(zhuǎn)/分)。然后加入3.5ml的冰水，馬上將未反應(yīng)的彈性蛋白在一個(gè)過濾器中除去。濾液的消光值E在280nm波長下用分光光度計(jì)上測量。以相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所不同的是只有將彈性蛋白除去后才向混合物中加入彈性蛋白酶溶液，以這樣得到的消光值EB作為空白。然后用同樣的方法在280nm下測定這種濾液的消光值EB。
彈性蛋白酶的活力以單位〔U〕表示。1U被定義為在給定的實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘溶解1mg彈性蛋白的酶活力。彈性蛋白的溶解量是通過測定來自被測混合物的濾液在280nm下的消光值確定的。
用下述公式計(jì)算比活
ΔE＝E-EB〔sic〕F＝1.376因子F是用如下方法確定的使用彈性蛋白酶將10mg特定批號的彈性蛋白完全溶解，測定相應(yīng)的消光度差值ΔE。將因子F與消光度差值ΔE相乘就得到了每ml被測混合物中所溶解的彈性蛋白的毫克數(shù)。
4.梭菌蛋白酶a.制備用Ullmann和Jakubke(14)描述的方法分離梭菌蛋白酶。
對該酶比活的測定方法如下在用2mM的1，4-二硫赤蘚糖醇溶液將梭菌蛋白酶溶液預(yù)先活化3小時(shí)以后使用合成的底物α-N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(＝BAEE)(15)。其比活大約為83U/mg。
b.性質(zhì)硫醇蛋白酶梭菌蛋白酶的特性是它能夠在多肽鏈中和合成的底物中在氨基酸L-精氨酸的后面特異性地切開。
用SDS電泳測定其分子量為55,000Da。
II.應(yīng)用實(shí)施例在下述實(shí)施例中，A-J顯示的是在從動(dòng)物和人組織中分離細(xì)胞和組織碎片時(shí)純化酶的一些混合物的特別適用性。實(shí)施例K和L顯示的是在用于創(chuàng)傷愈合時(shí)純化酶的適用性。
本發(fā)明不被這些應(yīng)用實(shí)施例所限定。實(shí)施例A使用三種酶的混合物從肝臟中分離肝細(xì)胞使用Berry和Friend(9)的標(biāo)準(zhǔn)方法和Seglen(6)的修正方法分離肝細(xì)胞。通過i.p.注射戊巴比妥鈉(35mg戊巴比妥/kg體重)使Wistar大鼠麻醉。打開腹腔后將套管插入門靜脈，打開下腔靜脈后，在恒定的靜水壓下(12cm水柱，可變的流量)，將下述的pH為7.4±0.05的充有碳合氣的溶液在36-36.8℃下輸入灌注1. 5分鐘 大約100ml不含Ca2+的細(xì)胞緩沖液2. 5分鐘 大約100ml不含Ca2+、含有EGTA(0.42mM)的細(xì)胞緩沖液3. 8分鐘 大約200ml不含Ca2+的細(xì)胞緩沖液4. 5-30分鐘 大約100-600ml的細(xì)胞緩沖液，其中溶有提純后的酶的凍干的混合物。細(xì)胞緩沖液120.0 mM NaCl1.29 mM CaCl25.50mM D(+)-葡萄糖 1.19 mM KH2PO44.81mM KCl 1.20 mM MgSO415.0mM NaHCO310.0 mM HEPES碳合氣含有95％O2和5％CO2(V/V)的氣體混合物。
酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于87.5ml的細(xì)胞緩沖液中。
當(dāng)肝臟組織變軟后就停止灌注。在剝除了肝纖維囊后，將肝細(xì)胞從肝臟組織中抖落下來并用一個(gè)篩網(wǎng)(網(wǎng)眼寬度100μm)過濾。過濾后，在碳合氣的環(huán)境中將細(xì)胞在37℃下水浴中振搖20分鐘。以50倍的重力加速度在細(xì)胞緩沖液中進(jìn)行三次2分鐘的離心以收集完整的肝細(xì)胞。在每次離心后將主要含有死細(xì)胞的上清液棄去?；畹母渭?xì)胞、肝細(xì)胞對或多個(gè)肝細(xì)胞聚集體的含量是在將所得到的細(xì)胞團(tuán)再次懸浮后通過顯微鏡在一個(gè)Burker計(jì)數(shù)室中確定的(用0.08％濃度的錐蟲藍(lán)染色，2分鐘)。結(jié)果使用上述的酶混合物進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)(n＝4)，所得到的細(xì)胞懸浮液平均含有88.7％的活細(xì)胞，每個(gè)肝臟的細(xì)胞產(chǎn)量是360×106個(gè)。
使用具有非常高的特異性水解膠原活力的含有膠原酶的不確定組成的制劑進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果導(dǎo)致了嚴(yán)重的細(xì)胞損害和僅僅72.5％的活細(xì)胞比率(n＝4)。實(shí)施例B使用兩種酶的混合物從肝臟中分離肝細(xì)胞實(shí)施方法類似于實(shí)施例A，但使用下列酶混合物60U的HP膠原酶和3U的彈性蛋白酶。所得到的細(xì)胞懸浮液中平均含有90.5％的活細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)量為263×106個(gè)(n＝2)。實(shí)施例C使用四種酶的混合物從肝臟中分離肝細(xì)胞實(shí)施方法類似于實(shí)施例A，但使用下述酶混合物30U的HP膠原酶，5U的AZ膠原酶，3U的彈性蛋白酶和16U的梭菌蛋白酶。
所得到的細(xì)胞懸浮液平均含有83％的活細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)量是232×106個(gè)(n＝2)。實(shí)施例D通過在四個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室中，與有不確定組成的含有膠原酶的制劑的比較而顯示的用三種酶的混合物從大鼠肝臟中分離肝細(xì)胞的結(jié)果的廣泛的有效性在不同的實(shí)驗(yàn)室之間細(xì)胞分離的方法有微小的差別，但這對于分離肝細(xì)胞的結(jié)果可能是重要的。為了檢查實(shí)施例A中提到的混合物的效果，在四個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了大量的肝細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，它們都獨(dú)立使用各自的方法。
所使用的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于87.5ml的細(xì)胞緩沖液中(同實(shí)施例A)。
使用下述五種參數(shù)對肝細(xì)胞的分離結(jié)果進(jìn)行測量1.顯微鏡檢測活肝細(xì)胞的含量(用錐蟲藍(lán)染色排除法來確定所得到的細(xì)胞懸浮液中所有肝細(xì)胞中的活細(xì)胞％數(shù))，2.確定所分離的所有肝細(xì)胞的數(shù)量，3.確定每克動(dòng)物重量中所分離的所有肝細(xì)胞的數(shù)量，4.確定單個(gè)細(xì)胞的含量(從所得到的細(xì)胞懸浮液中所有聚集形式的細(xì)胞為基準(zhǔn)的％數(shù)，即以兩個(gè)或多個(gè)聚集的肝細(xì)胞相比較)，5.建立起成功解離組織所需的膠原酶溶液灌注的時(shí)間安排。
在這些檢測中，與傳統(tǒng)的制劑相比，本發(fā)明的酶混合物顯示了更多的可重復(fù)性結(jié)果。實(shí)施例E使用三種酶的混合物從大鼠肝臟中分離肝細(xì)胞細(xì)胞功能的維持為了證明本發(fā)明的混合物不僅適合于在分離肝細(xì)胞時(shí)得到簡單的結(jié)果而且還特別考慮了細(xì)胞的功能，使用一種含膠原酶的制劑在大鼠肝臟上進(jìn)行了細(xì)胞分離的比較，該制劑特別適用于上述目的而且沒有確定的組成。
使用Berry和Friend(9)的標(biāo)準(zhǔn)方法和Seglen(16)的修正方法來分離肝細(xì)胞。
所使用的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于87.5ml的用于從大鼠肝臟中分離肝細(xì)胞的細(xì)胞緩沖液中(同實(shí)施例A)。
通過下述參數(shù)來確定大鼠肝細(xì)胞的簡單分離結(jié)果用錐蟲藍(lán)染色排除法確定的活細(xì)胞的含量，每克肝臟的細(xì)胞產(chǎn)量，單個(gè)細(xì)胞的含量(以％為單位)。
以下述涉及肝細(xì)胞功能(21，22)的參數(shù)來進(jìn)一步確定所得到的細(xì)胞懸浮液的質(zhì)量ATP含量，耗能(EC)，利度卡因鹽酸鹽代謝為一乙基甘氨酸二甲基苯胺(MEGX)，以及在21μM濃度的底物中對膽汁?；撬?(3α，7α，12α-三羥基-5β-膽烷-24-?；?-2-氨基-乙基磺酸)的吸收。
在所考察的任何參數(shù)中都沒有顯示出這兩種含膠原酶的制劑的明顯差別。
無論根據(jù)對分離的簡單結(jié)果的評價(jià)還是根據(jù)對不同的細(xì)胞功能-如微分物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶貏e功能，或者肝細(xì)胞的與細(xì)胞色素P450有關(guān)的酶的特別代謝活力-的評價(jià)，都可以顯示出用本發(fā)明的酶混合物所分離的肝細(xì)胞完全未受到損害。實(shí)施例F使用三種酶的混合物從人肝臟中分離肝細(xì)胞使用一種活體灌注技術(shù)(21)根據(jù)Berry和Friend(9)的方法以及Seglen(16)的修正方法(16)來分離肝細(xì)胞。
所使用的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶以及21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于50ml的細(xì)胞緩沖液中。
用下列參數(shù)來確定人肝細(xì)胞的分離結(jié)果用錐蟲藍(lán)染色排除法檢測的活細(xì)胞含量以及每克肝臟的細(xì)胞產(chǎn)量。
結(jié)果顯示用本發(fā)明的混合物也可以以恒定的結(jié)果從人肝臟中成功地分離肝細(xì)胞(活細(xì)胞的含量為85-90％)。實(shí)施例G從大鼠肝臟中分離膽上皮細(xì)胞在一系列的實(shí)驗(yàn)中(n＝4)，根據(jù)描述于文獻(xiàn)(18)中的方法從大鼠肝臟中分離膽上皮細(xì)胞。這要求在第一步的組織解離中首先用酶法從組織收集物中除去肝細(xì)胞，在第二步中用胰蛋白酶從剩余的組織殘留物中分離膽上皮細(xì)胞。
用于除去肝細(xì)胞的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于87.5ml的細(xì)胞緩沖液中。
在所有的制劑中，活的上皮細(xì)胞的含量都高于95％，細(xì)胞產(chǎn)量為每個(gè)肝產(chǎn)生4-6×106個(gè)細(xì)胞(n＝4)。使用上述的酶混合物極大地方便了用胰蛋白酶從剩余的管狀系統(tǒng)中分離膽上皮細(xì)胞，原因是在第一步后所得到的剩余組織中基本上不含肝細(xì)胞。
迄今所用的獲取膽上皮細(xì)胞的方法存在的問題是，殘留于細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞、以及Kupffer細(xì)胞和其它類型的細(xì)胞通常難于從待分離的上皮細(xì)胞中除去。
使用上述的純酶的混合物能夠明顯地節(jié)省時(shí)間和花費(fèi)，原因是與迄今所使用的方法相比，肝組織的解離得到了明顯的改進(jìn)，而且基本上是完全的。這表明對通常大量存在的作為雜質(zhì)的肝細(xì)胞的去除是令人滿意的。實(shí)施例H使用三種酶的混合物從人臍帶中分離內(nèi)皮細(xì)胞用Jaffe(17)的方法從人的臍靜脈中分離內(nèi)皮細(xì)胞。具體作法是將臍帶(20～30cm長)平分成兩半，向其中成對地灌入特別的酶溶液，在含有5％CO2的培養(yǎng)箱中在37℃下保溫15分鐘。將脫落的細(xì)胞除去并保存在初生培養(yǎng)基中以用于檢測。經(jīng)過四天的培養(yǎng)，在將非粘附細(xì)胞洗去之后確定能夠分裂的活細(xì)胞的產(chǎn)量。
該酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于87.5ml的細(xì)胞分離緩沖液中。
在細(xì)胞接種的后一天將非粘附細(xì)胞(紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)洗去。在第四天將培養(yǎng)基換掉。通常在不晚于接種后的第八天達(dá)到細(xì)胞的鋪滿(＞105個(gè)細(xì)胞/cm2)。由FACS試驗(yàn)顯示，平鋪的細(xì)胞菌苔含有95％以上的內(nèi)皮細(xì)胞，試驗(yàn)中使用的抗體為對抗與凝血因子VIII有關(guān)的抗原(Vonwillebrand凝血因子)或兩種內(nèi)皮非特異性表面抗原(EN-4，PAL-E)，試驗(yàn)中還使用了清除受體的熒光配體(dil-Ac-LDL)。
用上述純化的酶的混合物所得到的產(chǎn)量(n＝2)超過了用不確定組成的含有膠原酶的酶制劑所得到的產(chǎn)量。四天后的細(xì)胞密度是1.8×104個(gè)/cm2。使用迄今為止所公開的方法而得到的細(xì)胞密度明顯低于上值。在使用了上述的混合物后，在更早的時(shí)間內(nèi)(僅5-6天之后)就達(dá)到了單層的細(xì)胞鋪滿。
在使用不同的酶制劑酶促分離內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，在任何情況下都不會(huì)損傷臍靜脈。所除去的細(xì)胞令人滿意地被分離。沒有觀察到細(xì)胞中毒現(xiàn)象。在一小時(shí)后發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
對所制備的第一代細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(內(nèi)皮縮血管肽的產(chǎn)生，LDH的釋放)。所有由此得到的數(shù)值都在正常范圍之內(nèi)。因而這些細(xì)胞與對照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相比沒有功能上的差別，在對照實(shí)驗(yàn)中使用不確定組成的含有膠原酶的制劑來分離細(xì)胞。
所使用的純化后的酶的混合物在提高細(xì)胞產(chǎn)量方面的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，這將導(dǎo)致單層的細(xì)胞鋪滿的更快形成以及所分離的細(xì)胞的最佳的完整性(細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能)。
例如，用含有HP膠原酶和彈性蛋白酶的其它混合物以及含有HP膠原酶、AZ膠原酶、彈性蛋白酶和梭菌蛋白酶的混合物來代替上述的酶混合物也得到了相當(dāng)好的結(jié)果。實(shí)施例I使用三種酶的混合物從人腫瘤中分離腫瘤細(xì)胞用方法(23)從人腫瘤中分離腫瘤細(xì)胞。
所使用的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶于28.4ml的細(xì)胞分離緩沖液(Ringer乳酸鹽/PBS)中。
對分離結(jié)果的確定是通過用錐蟲藍(lán)染色排除法來測定活細(xì)胞的含量以及對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)來完成的。在對細(xì)胞分離的直接比較中，在四種不同的腫瘤組織上使用了本發(fā)明的酶混合物以及十分適用于上述目的的無確定組成的含有膠原酶的制劑。結(jié)果本發(fā)明的酶混合物可令人十分滿意地被用于從人腫瘤中分離腫瘤細(xì)胞。
在實(shí)驗(yàn)的變化范圍內(nèi)，本發(fā)明的分離結(jié)果與使用所選擇的含有膠原酶的制劑而得到的結(jié)果一致，后者十分適用于腫瘤細(xì)胞分離且無確定組成。
根據(jù)上述的結(jié)果，由于使用本發(fā)明的酶混合物可以成功地解離人腫瘤組織中多種結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，它通常達(dá)到或改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)(分離的結(jié)果、分離的細(xì)胞的質(zhì)量、方法變量的維持)，因而可以認(rèn)為本發(fā)明的酶混合物適用于其它動(dòng)物以及人類組織的解離。實(shí)施例J使用三種酶的混合物從豬胰臟中分離島細(xì)胞為了從豬胰臟中分離島細(xì)胞，使用了著名的Ricordi制備方法，其中引入了一些重要的修改(24)，其中包括改進(jìn)對分離結(jié)果的監(jiān)視。在上述情況中，在通過胰管進(jìn)行灌注后，膠原酶溶液會(huì)在特別標(biāo)準(zhǔn)化的條件下對胰腺組織作用較長的時(shí)間。將已剝落的島細(xì)胞在較低的溫度下連續(xù)地排入一個(gè)存儲(chǔ)容器中；在解離完成后，在胰臟組織中已經(jīng)部分與其母體脫離的島細(xì)胞完全脫落并通過輕柔的機(jī)械處理被分離。
從胰臟中分離島細(xì)胞對含有膠原酶的制劑有特別高的要求，原因是對于從胰腺中成功分離完整島細(xì)胞的機(jī)理并不完全清楚。
本發(fā)明的確定的酶混合物的適用性通過下述實(shí)施例得到證實(shí)。這表明，目的是分離巨大的天然細(xì)胞聚集體(胰島)的成功的組織解離也同樣適用于具有這種組織形態(tài)的其它物種的胰臟(例如人的胰臟)。一些經(jīng)驗(yàn)通常認(rèn)為從豬胰臟中分離島細(xì)胞要比從其它物種中分離島細(xì)胞更為困難，這就支持了上述的應(yīng)用前景。例如，已知使用傳統(tǒng)的無確定組成的含有膠原酶的制劑很容易使來自豬胰臟的島細(xì)胞解離成較小的、無用的碎片(25)。由島細(xì)胞聚集體的特殊性質(zhì)可對此作出解釋，聚集體中含有很多對蛋白酶敏感的細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸，在內(nèi)分泌與外分泌細(xì)胞之間以及內(nèi)分泌細(xì)胞與島細(xì)胞之間都有。因而改進(jìn)分離方法的目標(biāo)只能是獲得大量完整的島細(xì)胞的聚集體，而且聚集體＜100μm的解體只能在很小的程度上進(jìn)行。
在這個(gè)應(yīng)用實(shí)施例中使用的用于從豬胰臟中分離島細(xì)胞的酶混合物是130U的HP膠原酶、5U的AZ膠原酶和21U的彈性蛋白酶的凍干物，它溶解于10ml的分離緩沖液中。向該溶液中例行地加入脫氧核糖核酸酶(0.4mg/10ml，440 Kunitz單位/mg，Sigma)。
可以通過所得到的完整細(xì)胞的聚集體的尺寸分布以及其它的常用參數(shù)來確定分離的結(jié)果。
使用本發(fā)明的酶混合物的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)可以說是，大于100μm的自由島細(xì)胞的比率要高于傳統(tǒng)制備方法中的比率。實(shí)施例K體內(nèi)創(chuàng)傷處理的實(shí)驗(yàn)考察在創(chuàng)傷的愈合中，膠原酶與有效地去除壞死組織、使損傷部位的細(xì)胞恢復(fù)以及胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
在由Webster(19)描述的創(chuàng)傷清洗的體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)中，在大鼠體內(nèi)檢查純化的酶的組織分解特性。
在用于三度燒傷時(shí)，在最初的16小時(shí)內(nèi)觀察到失活組織的解離率增加，這依賴于所使用的純化酶的量。將這些酶單獨(dú)使用或與其它酶組合使用。當(dāng)使用HP膠原酶(3-48 U/cm2，優(yōu)選為16U/cm2)、AZ膠原酶(0.2-3 U/cm2，優(yōu)選為1U/cm2)和彈性蛋白酶(1-12 U/cm2，優(yōu)選是3U/cm2)的混合物時(shí)得到了最佳的結(jié)果。在這種情況下，15只動(dòng)物中的8只的瘡痂被完全解離，15只動(dòng)物中的6只的瘡痂被部分解離。在后面的情況中，與對照組相比，用機(jī)械方法除去壞死組織變得十分容易。
在使用了同等的量和較短的4個(gè)小時(shí)的處理時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)了壞死物質(zhì)的軟化，在任何情況下都可以令人滿意地將瘡痂除去(與對照組相比)。
除了這種混合物外，還可以成功地使用其它的混合物，例如HP膠原酶(3-48U/cm2)和彈性蛋白酶(1-12U/cm2)的混合物。實(shí)施例L體外創(chuàng)傷處理的實(shí)驗(yàn)考察解離壞死組織所得到的結(jié)果(實(shí)施例K)在一個(gè)體外模型中進(jìn)一步得到了表征。用HP膠原酶、AZ膠原酶和/或彈性蛋白酶對實(shí)施例K中提到的燒傷瘡痂在振蕩的緩沖溶液中處理2、4、6和24小時(shí)后，測定所釋放的4-羥基脯氨酸(20)。
所使用的純化酶的活力與有效比較量的含膠原酶的制劑的相對活力相同。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)的簡化中忽略了含有膠原酶的制劑中其它組分對羥基脯氨酸釋放的各自的貢獻(xiàn)。
在使用純化酶時(shí)，與使用相應(yīng)數(shù)量的含膠原酶的制劑相比，在所有情況下都可以發(fā)現(xiàn)可比擬的量的羥基脯氨酸的釋放，它明顯地與時(shí)間有關(guān)。
根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明的純化酶和酶混合物也可應(yīng)用于治療領(lǐng)域，例如在創(chuàng)傷處理中和在瘢痕瘤和纖維組織瘤的處理中。它們可外用或用于注射。
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權(quán)利要求
1.一種可從溶組織梭狀芽孢桿菌中得到的酶，它既可以是a)一種膠原酶，在以合成的六肽Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala作為底物的Nordwig和Strauch的分析中，它的比活至少是20 U/mg，它可以只在很小的程度上轉(zhuǎn)化失活的膠原，例如明膠和阿佐考，然而它卻破壞牛肌鍵膠原，由SDS凝膠電泳測定其分子量為106,000 Da，其等電點(diǎn)為pH5.8至6.0，或者b)一種膠原酶，在以阿佐考(Azokoll)作為底物的Mandl等人的分析中，它的比活至少是10 U/mg，它可以有效地轉(zhuǎn)化失活的膠原，例如明膠和阿佐考，而且可以轉(zhuǎn)化牛肌鍵膠原，然而它不能破壞短鏈的合成蛋白，比如2-呋喃丙烯酰-Leu-Gly-Pro-Ala、4-苯偶氮基芐氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[sic]和Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala，由SDS凝膠電泳測定其分子量為111,000 Da，其等電點(diǎn)為pH5.9至6.1，或者c)彈性蛋白酶，在以來自牛頸部韌帶的彈性蛋白作為底物的分析中，它的比活至少是2U/mg，由SDS電泳測定其分子量為35,000 Da，也可以是上述酶的混合物，其中酶a)的比活至少為20 U/mg，酶b)的比活至少為10 U/mg，酶d)[sic]的比活至少為2U/mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶混合物，其中附加性地含有硫醇蛋白酶-梭菌蛋白酶。
3.權(quán)利要求1中酶a)和酶c)的混合物用于從人或動(dòng)物組織中分離細(xì)胞或組織碎片的用途。
4.權(quán)利要求1中酶a)、b)和c)的混合物用于從人或動(dòng)物組織中分離細(xì)胞或組織碎片的用途。
5.權(quán)利要求2的混合物用于從人或動(dòng)物組織中分離細(xì)胞或組織碎片的用途。
6.權(quán)利要求1的酶單獨(dú)或以混合物形式、或者權(quán)利要求2的酶用于創(chuàng)傷處理或用于處理與膠原蛋白代謝改變有關(guān)的失調(diào)的用途。
7.純態(tài)的HP膠原酶。
8.純態(tài)的AZ膠原酶。
9.純態(tài)的彈性蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用有確定組成的從溶組織梭狀芽孢桿菌中提純的酶的混合物以一種可重復(fù)的、標(biāo)準(zhǔn)化的方法從人或動(dòng)物組織中獲得細(xì)胞或組織碎片的方法,還涉及這些酶和它們的混合物;本發(fā)明還涉及這些酶的直接或間接的醫(yī)療用途,其中將其單獨(dú)使用或作為混合物使用,例如用于創(chuàng)傷處理。
文檔編號A61K38/43GK1178552SQ96192616
公開日1998年4月8日 申請日期1996年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月12日
發(fā)明者C·O·馬克特, H·湯姆, J·韋曼, W·扎恩 申請人:諾爾股份公司