專利名稱：重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人免疫缺陷病毒載體(以下稱HIV載體)，生產(chǎn)該載體的方法，以及能夠穩(wěn)定維持該載體的生產(chǎn)細(xì)胞。
遺傳工程的最近的迅速發(fā)展引發(fā)了分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種技術(shù)的興起。這要?dú)w功于遺傳信息分析的顯著進(jìn)步和基因功能的闡明，而且人們正在嘗試將這些成就應(yīng)用于實(shí)際治療方案。已取得最顯著的進(jìn)展的領(lǐng)域之一是基因療法。一方面，已發(fā)現(xiàn)了各種遺傳疾病的病原基因并進(jìn)行了譯碼，另一方面已開(kāi)發(fā)出通過(guò)物理和化學(xué)技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞里的方法；結(jié)果，基因療法已從臨床前實(shí)驗(yàn)階段發(fā)展到實(shí)際臨床應(yīng)用階段。
根據(jù)用于基因轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(靶細(xì)胞)的類型，可將基因療法分為生殖細(xì)胞基因療法或體細(xì)胞基因療法。另一種分類方法是將其分成增加基因療法，該方法包括添加新的(正常)基因，而保持異常(病原)基因不變；和取代基因療法，用正常基因取代異?；?。在目前階段，由于論理及技術(shù)原因，只有體細(xì)胞的增加基因療法可實(shí)際應(yīng)用。更具體地講，現(xiàn)行的基因療法是通過(guò)自體移植(來(lái)自體內(nèi)的基因療法)進(jìn)行的，其中，將靶細(xì)胞自患者體內(nèi)取出，并將待插入的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞里，然后將該細(xì)胞送回患者體內(nèi)。將來(lái)可行的方法涉及直接給患者體內(nèi)使用基因(體內(nèi)基因療法)。
上述基因療法的臨床應(yīng)用所面臨的主要技術(shù)挑戰(zhàn)之一是開(kāi)發(fā)一種能有效、一致地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞的方法。在80年代初期，嘗試過(guò)諸如顯微注射的物理技術(shù)；但由于以下原因這類方法最終未被商業(yè)化如低基因轉(zhuǎn)移效率、實(shí)現(xiàn)一致轉(zhuǎn)移的不可能性以及隨后的可用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)的限制。直到后來(lái)研制出能將外源基因有效插入靶細(xì)胞的重組病毒(病毒載體)之后，基因療法的臨床應(yīng)用才變得可能。
在美國(guó)，已有70種基因治療方法獲得許可，實(shí)際上，目前有不少于200個(gè)患者正接受基因治療。一種小鼠白血病病毒(MoMLV，或Moloney′s鼠白血病病毒)載體是最常見(jiàn)的基因轉(zhuǎn)移工具。MoM LV是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒，而且，如果其表面的包膜能特異地結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體的話，它能感染該宿主細(xì)胞。重組MoMLVs根據(jù)包膜類型能夠?qū)⒒蜣D(zhuǎn)移到不同類型細(xì)胞中，并可以分為僅能感染嚙齒動(dòng)物的親嗜型和能同時(shí)感染嚙齒動(dòng)物和人類細(xì)胞的兼嗜型。
制備重組MoMLV載體首先要構(gòu)建兩種質(zhì)粒，一個(gè)是輔助質(zhì)粒，它包括待編碼在MoMLV基因組里的gag、pol和env基因以及用于啟動(dòng)該基因的啟動(dòng)子；而另一個(gè)是載體質(zhì)粒，它具有插在作為藥物的基因兩端的MoMLV的末端重復(fù)序列(LTR)。在這種情況下，為了防止野生型病毒的產(chǎn)生，要預(yù)先從輔助質(zhì)粒上除去作為將該基因包裝成病毒顆粒的信號(hào)序列的包裝信號(hào)。相反，該包裝信號(hào)包含于載體質(zhì)粒中。在很多場(chǎng)合，將僅能識(shí)別或選擇由病毒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)基因插入載體質(zhì)粒的基因序列中。用這兩類基因?qū)?xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，可以在培養(yǎng)物的上清液中產(chǎn)生重組病毒載體。
近年來(lái)，已建立起作為更有效地制備MoMLV載體的工具的被稱為“包裝細(xì)胞”的細(xì)胞系。在這些細(xì)胞系中，輔助質(zhì)粒和/或制備MoMLV載體所必需的載體質(zhì)粒已穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組DNA中。使用這種細(xì)胞系有很多優(yōu)點(diǎn)，其中，特別值得一提的是以下優(yōu)點(diǎn)(1)克服了制備病毒載體時(shí)的轉(zhuǎn)染的復(fù)雜性；(2)與以磷酸鈣法為代表的轉(zhuǎn)染方法(該方法局限于基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的效率)相比，采用已將感興趣的基因轉(zhuǎn)入其中的包裝細(xì)胞有利于制備高效力的病毒載體；(3)如果轉(zhuǎn)染是通過(guò)磷酸鈣法分組進(jìn)行，則各組之間的基因轉(zhuǎn)移效率不同，所以不能均勻提供效力穩(wěn)定的病毒載體，但是，對(duì)于采用包裝細(xì)胞的制備方法來(lái)說(shuō)，情況則不是這樣，而且基因轉(zhuǎn)移效率的波動(dòng)也較?。缓?4)在磷酸鈣法中，制備大量的病毒載體相應(yīng)地需要用于轉(zhuǎn)染的大量質(zhì)粒，但使用包裝細(xì)胞時(shí)則不需要大量質(zhì)粒。
由于上述優(yōu)點(diǎn)以及其它優(yōu)點(diǎn)，目前制備MoMLV載體的最常見(jiàn)的方法是使用包裝細(xì)胞。
MoMLV載體的另一個(gè)特征是缺乏宿主專一性。這一特征表明，各種細(xì)胞都可以作為MoMLV載體的靶細(xì)胞，使得有可能與各種疾病相關(guān)聯(lián)地使用該載體。另一方面，該病毒載體所固有的缺乏宿主專一性使其應(yīng)用于人體時(shí)存在困難。
事實(shí)上，如果將這種病毒載體用于治療目的，在服用方法上必需要考慮某些因素。例如，當(dāng)把其用于血細(xì)胞時(shí)，目前所采用的方法包括如下步驟將待處理的細(xì)胞自人體內(nèi)取出，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，然后再把該細(xì)胞放回人體內(nèi)(來(lái)自體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移)；然而，該技術(shù)需要特殊裝置，因此，只能在有限的場(chǎng)合中用于治療目的。如果將該病毒載體用于處于某些器官或組織中的細(xì)胞，目前所采用的方法是在待治療的器官或組織上進(jìn)行局部使用；然而，該方法有一些問(wèn)題，例如，要進(jìn)行一個(gè)外科手術(shù)以便進(jìn)行所述局部使用。
為了解決上述問(wèn)題，已研制出組織特異性病毒載體。HIV載體是一種組織特異性病毒載體，能特異性地將基因轉(zhuǎn)移到CD4陽(yáng)性細(xì)胞中，并利用HIV包膜蛋白gp120在感染期間與CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞表面的CD4蛋白特異結(jié)合的能力(Shimada，T.，等，J.Clin.Invest.88，1043，1991)。預(yù)計(jì)用這種病毒載體通過(guò)基因療法進(jìn)行治療的疾病包括獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和成體T-細(xì)胞白血病(ATL)，這類病的死亡率極高，因?yàn)镃D4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞是病原劑，而且還未建立起治療此類病的方法。
獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是因?yàn)槿嗣庖呷毕莶《?HIV)感染CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞所致的疾病，而且，作為對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的嚴(yán)重?fù)p傷的結(jié)果，它會(huì)引起各種機(jī)遇性感染、淋巴瘤、神經(jīng)病等。目前所采用的HIV治療劑有被歸類為核苷酸類的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，和3′-疊氮-2′，3′-雙脫氧胸苷(AZT)，2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)，2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)等，或單獨(dú)使用或組合使用。不過(guò)，這些藥物均無(wú)排斥已感染細(xì)胞的能力；另外，這些藥物還存在一些大的問(wèn)題，如能引起嚴(yán)重的副作用，包括明顯的骨髓抑制和消化器官癥狀，以及出現(xiàn)抗藥性病毒株；在某些場(chǎng)合，迫切需要開(kāi)發(fā)出更有效、副作用較小、僅能出現(xiàn)極少的抗性病毒株的新型藥物。
就成體T-細(xì)胞白血病(ATL)而言，它是由Uchiyama等(Uchiyama，T.等，Blood，50，481-492，1977)提出的一種概念上的疾病，而HTLV-1被視為該疾病的病原性病毒(Hinuma，Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6476-6480，1981)；然而，有關(guān)ATL的發(fā)病機(jī)理和ATL細(xì)胞的生長(zhǎng)機(jī)理尚有待闡明。就急性淋巴細(xì)胞白血病而言，現(xiàn)已證實(shí)化療與放療和/或骨髓移植的組合能產(chǎn)生很高的恢復(fù)或治愈率。不過(guò)，對(duì)ATL來(lái)說(shuō)，用該方法治療未取得滿意效果，而且迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的治療方法。
近年來(lái)，將基因療法應(yīng)用于頑固性疾病治療的可能性一直處于臨床前階段。對(duì)于AIDS而言，已提出了各種巧妙利用HIV的復(fù)制機(jī)理的各種治療系統(tǒng)，其包括采用諸如TAR和RRE誘餌的RNA誘耳來(lái)抑制Tat和Rev的作用，Tat和Rev被認(rèn)為是HIV復(fù)制的有效加速劑(Sullenger，B.A.等，Cell 63，601，1990)；利用反義寡核苷酸與HIVmRNA或DNA雜交(Chatterjee，S.等，Science，258，1485，1992)；用核酶裂解HIV的RNA(Stevelo，K.M.等，Virology，190，176，1992)；和利用反顯性突變來(lái)抑制HIV復(fù)制所必需的蛋白的功能(Hope，T.J.等，J.Virol，66，1849，1992)。
就ATL而言，正在研究一種能將人單純性皰疹病毒上的胸苷激酶基因整合到ATL細(xì)胞中的系統(tǒng)，所述基因被表達(dá)，以便只有ATL細(xì)胞被9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤特異性致死(Kazunori Imada和Taku Uchiyama，ZOKETSU INSHI(Hematopoietic Factors)，5，4，501-503，1994)。
如上所述，作為組織特異性病毒載體，HIV載體有很高的使用價(jià)值，但其制備方法存在若干問(wèn)題?，F(xiàn)在所采用的制備HIV載體的方法是在即將使用之前用一種輔助質(zhì)粒和一種載體質(zhì)粒對(duì)COS細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。不過(guò)，如上文所述，轉(zhuǎn)染方法以磷酸鈣法為代表，該方法存在各種問(wèn)題，包括(1)操作繁瑣，(2)基因轉(zhuǎn)移的效率有限，(3)組與組間的基因轉(zhuǎn)移效率有波動(dòng)和(4)需要大規(guī)模制備質(zhì)粒。因此，一直需要建立一種能更有效、更一致地制備HIV載體的方法。
盡管HIV載體有可能用作組織特異性病毒載體，其制備方法涉及很多問(wèn)題，而且目前所使用的方法是在即將使用之前用輔助質(zhì)粒和載體質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。然而，該方法存在若干大的問(wèn)題，這些問(wèn)題歸納如下(1)組與組之間的轉(zhuǎn)染效率不同，所以載體的效力有波動(dòng)，從而不可能穩(wěn)定提供所述載體；(2)由于轉(zhuǎn)染操作的復(fù)雜性，不能大量制備這種載體；和(3)如果要制備大量HIV載體，必需相應(yīng)地制備大量質(zhì)粒載體。就MoMLV而言，已建立了輔助質(zhì)粒和載體質(zhì)粒穩(wěn)定地整合在其基因組DNA上的包裝細(xì)胞系；然而，尚未建立HIV載體的包裝細(xì)胞系。原因之一是，與用于維持MoMLV的細(xì)胞(該細(xì)胞是由小鼠產(chǎn)生的，如鼠3T3細(xì)胞)相比，必須將人的細(xì)胞用作維持HIV載體的細(xì)胞。
本發(fā)明是在上述條件下完成的，而且其目的之一是提供重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞，用于大規(guī)模、穩(wěn)定地制備HIV載體。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人通過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)，某些種類的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒能夠?qū)雱?dòng)物細(xì)胞并穩(wěn)定地維持在其中，并完成了本發(fā)明。所述輔助質(zhì)粒至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gap、pol和env基因序列，它缺乏包裝信號(hào)序列。
因此，本發(fā)明提供了一種重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞，該細(xì)胞是通過(guò)將重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞而獲得的，該質(zhì)粒至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag、pol和env基因序列，并缺乏包裝信號(hào)，所述生產(chǎn)細(xì)胞能穩(wěn)定地維持導(dǎo)入的基因。
本發(fā)明還提供了一種用于建立所述重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒，它至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag、pol和env基因序列，并具有一個(gè)插在所述基因序列上游的啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，所述重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒包括一種質(zhì)粒，這種質(zhì)粒至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag和pol基因序列并含有一個(gè)插在該基因序列上游的啟動(dòng)子；所述輔助質(zhì)粒還包括一種至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的env基因序列并含有一個(gè)插在該基因序列上游的啟動(dòng)子的質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，所述重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒包括至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag基因序列并有一個(gè)插在該基因序列上游的啟動(dòng)子的質(zhì)粒，至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的pol基因序列并有一個(gè)插在該基因序列上游的啟動(dòng)子的質(zhì)粒，以及至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的env基因序列并有一個(gè)插在該基因序列上游的啟動(dòng)子的質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供了一種用所述質(zhì)粒載體建立包裝細(xì)胞的方法，以及用該包裝細(xì)胞生產(chǎn)重組HIV載體的方法。


圖1是表示輔助質(zhì)粒CGPEC(-)結(jié)構(gòu)的示意圖；圖2是表示載體質(zhì)粒HXN結(jié)構(gòu)的示意圖；圖3是表示含于新霉素抗性細(xì)胞系的培養(yǎng)物上清液里的p24蛋白和負(fù)對(duì)照組的ELISA定量分析(初步篩選)曲線；和圖4是次級(jí)篩選結(jié)果的示意圖。
下面將對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案及本發(fā)明的構(gòu)成進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
可以用如下方法制備本發(fā)明的包裝細(xì)胞。用已知方法構(gòu)建圖1所示結(jié)構(gòu)的輔助質(zhì)粒；如圖所示，在野生型HIV基因組序列的gag、pol和env基因的上游有一個(gè)源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是所述基因的驅(qū)動(dòng)因子，并將一個(gè)作為報(bào)導(dǎo)基因的新霉素抗性基因和一個(gè)由人單純性皰疹病毒衍生的胸苷激酶啟動(dòng)子插在gag、pol和env基因序列的下游，并將這一組基因插入表達(dá)載體上，從而構(gòu)成所述輔助質(zhì)粒。
用于啟動(dòng)所述輔助質(zhì)粒上所含的gag、pol和env基因的啟動(dòng)子并不局限于源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子，并能被諸如由B19衍生的啟動(dòng)子和人單純性診疹病毒衍生的胸苷激酶啟動(dòng)子這樣的其它啟動(dòng)子所取代。報(bào)導(dǎo)基因也不局限于任何具體類型，而且除新霉素抗性基因之外，也可以根據(jù)具體的用途和目的使用諸如潮霉素抗性基因的報(bào)道基因。
至今尚未見(jiàn)有關(guān)野生型HIV以圖1所示輔助質(zhì)粒存在的報(bào)導(dǎo)。為了提高安全性，也可以用如下方法建立所述包裝細(xì)胞系在兩個(gè)或三個(gè)質(zhì)粒中重建gag、pol和env基因，并用這些質(zhì)粒對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
然后將構(gòu)建的輔助質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該細(xì)胞可以是任何類型的細(xì)胞，包括COS細(xì)胞，諸如HeLa細(xì)胞的癌細(xì)胞和諸如H9和CEM的淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的方法也不受任何限制，可以采本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的磷酸鈣法、脂轉(zhuǎn)染法和各種其它方法。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)幾天，從培養(yǎng)皿中脫附，并再接種到新的培養(yǎng)皿中。幾小時(shí)以后，向該培養(yǎng)液中加入適量的新霉素類似物G418，并僅選擇被外源基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。如果潮霉素抗性基因作為報(bào)道基因含于輔助質(zhì)粒的任一個(gè)序列中，還要向培養(yǎng)基中加入適量的潮霉素。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，然后逐個(gè)挑取所產(chǎn)生的集落并分別重新接種到新的培養(yǎng)皿中。再培養(yǎng)7-10天，然后保存培養(yǎng)物上清液用于以后的篩選。
可以用如下方法選擇用于生產(chǎn)HIV載體的包裝細(xì)胞。
用一部分上述培養(yǎng)物上清液作為樣品，通過(guò)ELISA方法對(duì)p24蛋白和/或gp120蛋白的表達(dá)力進(jìn)行定量，以便進(jìn)行初步篩選。也可以采用其它定量方法，如用熒光抗體進(jìn)行FACS(熒光激活細(xì)胞分選)分析，或通過(guò)Southern印跡或Northern印跡進(jìn)行基因分析。保存用上述方法之一發(fā)現(xiàn)的具有高蛋白表達(dá)力的克隆。
用通過(guò)初步篩選得到的克隆制備重組HIV載體，測(cè)定其效力以進(jìn)行次級(jí)篩選。用已知方法用載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每個(gè)克隆。以如下方法制備載體質(zhì)粒從野生型HIV基因組序列上缺失gag、pol和env基因，將一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因序列插入空白區(qū)，并將所得到的基因組插入表達(dá)載體中。待插入的報(bào)道基因不局限于任何具體類型，并可以選自諸如新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的藥物抗性基因，或編碼表面抗原如CD4蛋白的基因。培養(yǎng)2天以后，讓培養(yǎng)物上清液作用于CD4陽(yáng)性細(xì)胞(以進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo))，并再繼續(xù)培養(yǎng)2天。將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫附，并再接種到新的培養(yǎng)皿上。如果所插入的報(bào)導(dǎo)基因是藥物抗性基因，將相應(yīng)的藥加入培養(yǎng)溶液中。培養(yǎng)幾天后，用上述方法之一在蛋白水平或基因水平上分析報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)力。如在選擇中使用藥物抗性，進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以集落形式出現(xiàn)，可對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，以測(cè)定所制備的重組HIV載體的效力。比較由相應(yīng)的克隆獲得的重組HIV載體的效力，并將具有最高效力的克隆作為包裝細(xì)胞保存。
由此獲得的克隆可用于生產(chǎn)重組HIV載體。可以用任何已知方法用任何載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述包裝細(xì)胞，以制備任何重組HIV載體，如在臨床前實(shí)驗(yàn)中被用作標(biāo)記的載體或在基因療法中用于將藥物基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的載體。另外，可以用在其序列中含有報(bào)導(dǎo)基因的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，或用輔助質(zhì)粒和一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并用適于報(bào)導(dǎo)基因的方法進(jìn)行選擇，從而建立起能在細(xì)胞中穩(wěn)定地維持載體質(zhì)粒的新的包裝細(xì)胞系。采用這種新的包裝系的優(yōu)點(diǎn)是，在制備重組HIV載體時(shí)無(wú)需進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
上述包裝細(xì)胞的一個(gè)具體例子是由National Institute of Bioscienceand Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)保存的HCN-348，并按布達(dá)佩斯條約將1995年3月15日的原始保存物，保存號(hào)FERM P-14834，于1996年3月11日轉(zhuǎn)成國(guó)際保存物，保存號(hào)為FERMBP-5467。
以下實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明的，而不是用于限定本發(fā)明的。例1(構(gòu)建質(zhì)粒)用于構(gòu)建質(zhì)粒的所有方法都符合基因重組技術(shù)的一般方法。圖1表示輔助質(zhì)粒CGPE(-)的結(jié)構(gòu)；在野生型HIV基因組中的gag、pol和env基因序列的上游有一個(gè)用于啟動(dòng)這些基因的源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子(CMV)序列，一個(gè)新霉素抗性報(bào)道基因(neo)和由人單純性皰疹病毒產(chǎn)生的胸苷激酶的啟動(dòng)子(TK)插在gag、pol和env基因的下游，該組基因被插入含有氨芐青霉素抗性基因(amp)和SV40復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)的表達(dá)載體上，從而構(gòu)成輔助質(zhì)粒CGPE(-)。
圖2表示載體質(zhì)粒HXN的結(jié)構(gòu)；gag、pol和env基因被從野生型HIV基因組序列上缺失，并將一個(gè)新霉素抗性報(bào)導(dǎo)基因(neo)插入空白區(qū)，其上游有一個(gè)由人單純性皰疹病毒產(chǎn)生的胸苷激酶(TK)作為啟動(dòng)neo的啟動(dòng)子，并將該組基因插入含有氨芐青霉素抗性基因(amp)和SV40復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)的表達(dá)載體中，從而構(gòu)成載體質(zhì)粒HXN。例2(用輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并用藥物選擇轉(zhuǎn)染體)用常用的磷酸鈣法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。向用例1方法制備的10μg CGPE(-)中加入無(wú)菌純化水和氯化鈣溶液，使總體積為0.5mL。在搖動(dòng)條件下將該液體混合物滴加到HBSP緩沖液(0.5mL)中，并在室溫下放置30分鐘，以形成質(zhì)粒-磷酸鈣共沉淀物。在另一個(gè)步驟中，在9-cm的培養(yǎng)皿中將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至50％的鋪滿度。將共沉淀物加入培養(yǎng)溶液中，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)；然后用新的培養(yǎng)液取代上述培養(yǎng)液，再培養(yǎng)2天。然后，為了僅選擇將外源基因穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染體，以1,000μg/mL的終濃度將新霉素類似物G418加入培養(yǎng)溶液中并繼續(xù)培養(yǎng)10天。逐個(gè)分離存活的細(xì)胞群體(集落)，并在含有濃度為1000μg/mL的G418的新的培養(yǎng)液中進(jìn)一步培養(yǎng)，從而獲得新霉素抗性細(xì)胞系。例3(初級(jí)篩選通過(guò)ELISA對(duì)p24蛋白進(jìn)行定量)將在例2中獲得的新霉素抗性細(xì)胞系接種到3.5cm的培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)2天。分離各培養(yǎng)物的上清液，并通過(guò)ELISA方法對(duì)上清液中p24蛋白的濃度進(jìn)行定量。同樣對(duì)負(fù)對(duì)照組進(jìn)行定量分析，負(fù)對(duì)照組為未按例1和例2方法進(jìn)行處理的HeLa細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示。保存被初級(jí)篩選證實(shí)為p24陽(yáng)性的細(xì)胞系，用于次級(jí)篩選。例4(次級(jí)篩選制備重組HIV載體并測(cè)定其效力)將在例3中經(jīng)過(guò)初級(jí)篩選獲得的細(xì)胞系接種到9cm的培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)至50％的鋪滿度。通過(guò)磷酸鈣法用10μg的載體質(zhì)粒HXN(見(jiàn)圖2)轉(zhuǎn)染各培養(yǎng)的細(xì)胞系。培養(yǎng)2天，然后將培養(yǎng)物的上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，并以2000rpm離心10分鐘。將一部分(3mL)所得到的液體上清液分離，并與3mL新的培養(yǎng)液混合；用該混合物處理培養(yǎng)至50％鋪滿度的CD4陽(yáng)性HeLa細(xì)胞。用同樣的方法對(duì)負(fù)對(duì)照組進(jìn)行處理，負(fù)對(duì)照組為未經(jīng)過(guò)例1和例2的方法處理的HeLa細(xì)胞。培養(yǎng)2天，然后用胰蛋白酶和EDTA混合物對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行脫附，懸浮于含有1000μg/mLG418的新的培養(yǎng)液中，并再接種到9cm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)10天，然后用結(jié)晶紫對(duì)所得到的集落進(jìn)行染色(見(jiàn)圖4)。在負(fù)對(duì)照組中未形成可識(shí)別的集落，而在例3中所得到的細(xì)胞系中能形成可識(shí)別的集落；這表明本發(fā)明的細(xì)胞系能作為制備重組HIV載體用的包裝細(xì)胞。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞能夠比現(xiàn)有技術(shù)更有效地大規(guī)模、穩(wěn)定地制備HIV載體。
權(quán)利要求
1.一種重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞，是通過(guò)將至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag、pol和env基因序列的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒導(dǎo)入一種動(dòng)物細(xì)胞而獲得的，所述輔助質(zhì)粒缺乏包裝信號(hào)，所述生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定地維持所述基因。
2.一種用于建立權(quán)利要求1的重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒，它至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag、pol和env基因序列，并在所述基因序列的上游插入一個(gè)啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒，它包括至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag和pol基因序列并在所述基因序列上游插入了一個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，以及至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的env基因序列并在該基因序列上游插入了一個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求2的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒，它包括至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag基因序列并在該基因序列上游插入了一個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的pol基因序列并在該基因序列上游插入了一個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，以及至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的env基因序列并在該基因序列上游插入了一個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒。
全文摘要
重組人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞,是通過(guò)將至少含有由人免疫缺陷病毒基因組編碼的gag、pol和env基因序列并缺乏包裝信號(hào)的重組人免疫缺陷病毒輔助質(zhì)粒導(dǎo)入一種動(dòng)物細(xì)胞而獲得的,該生產(chǎn)細(xì)胞能穩(wěn)定地維持所述基因。本發(fā)明的人免疫缺陷病毒生產(chǎn)細(xì)胞能夠比現(xiàn)有技術(shù)更有效地大規(guī)模、穩(wěn)定地制備HIV載體。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1179179SQ96192628
公開(kāi)日1998年4月15日 申請(qǐng)日期1996年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月17日
發(fā)明者島田隆, 秋山勝?gòu)? 隈秀和, 鈴木要介 申請(qǐng)人:久光制藥株式會(huì)社