專利名稱：Tau－Tau結(jié)合的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau蛋白(T形物蛋白)結(jié)合和病理性神經(jīng)微絲聚積物質(zhì)的新方法。本方法特別用于篩選、預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病的物質(zhì)。
阿耳茨海默氏病(簡(jiǎn)稱AD)是老年性癡呆最常見(jiàn)的原因[Lingstone(1994)疾病等級(jí)，癡呆(Burns和Levy編)Chapman & Hall倫敦，21-35頁(yè)]。阿耳茨海默氏病患者的特征表現(xiàn)為進(jìn)行性癡呆伴隨逐漸加重的記憶力喪失，辨認(rèn)、感覺(jué)和語(yǔ)言能力受干擾，以及全腦智力減退(Roth，Zversen(1996)英國(guó)醫(yī)學(xué)通報(bào)，42(特刊))。
AD的主要病理特征為老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，兩者中均含有由微管結(jié)合蛋白Tau構(gòu)成的雙股螺旋形纖絲(PHF)(Wischik等(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊，85，4506-4510)。老年斑中還存在β-淀粉樣纖維，這些纖維來(lái)源于尚未探明的淀粉樣前體蛋白(APP)形成過(guò)程中的畸變(APP；Kang等(1987)自然，325，733-736)。
對(duì)AD的研究一直著眼于正常的微管結(jié)合蛋白Tau的喪失(Mukaetova-Ladinska等(1993)美國(guó)病理雜志，143，565-578；Wischik等(1995a)神經(jīng)生物老化，16409-417；Lai等(1995b)神經(jīng)生物老化，16433-445)，病理性雙股螺旋纖絲的聚集(PHFs；Mukaetova-Ladinska等(1993)，出處同前；Harrington等，(1994a)癡呆，5，215-228；Harrington等(1994b)美國(guó)病理學(xué)雜志，145，1472-1484；Wischik等，(1995a)，出處同前)；以及作為識(shí)別力損傷的明顯辨別標(biāo)志的額中部皮層突觸的喪失(Terry等(1991)神經(jīng)病學(xué)年刊，30，572-580)。突觸的喪失(Terry等，出處同前)以及錐體細(xì)胞的喪失(Bondareff等(1993)普通精神病學(xué)文獻(xiàn)，50，350-356)均與Tau反應(yīng)性神經(jīng)原纖維病理的形態(tài)測(cè)定相關(guān)，這在分子水平上關(guān)系到AD中Tau蛋白池從溶解形式轉(zhuǎn)化為聚合形式(PHFs)的完全重分配(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出處同前；Lai等，(1995)，出處同前)。這些轉(zhuǎn)化的一種可能解釋為病理性Tau蛋白重分配形成雙股螺旋形纖絲(PHFs)，使錐體細(xì)胞內(nèi)聚合狀態(tài)的軸突微管蛋白產(chǎn)生失衡，造成皮層-皮層交聯(lián)通路的軸突傳導(dǎo)障礙(Wischik等(1995a)，出處同前；(Wischik等(1995b)神經(jīng)生物老化，(在印刷中)；Wischik等(1995c)，AD中雙股螺旋形纖絲的結(jié)構(gòu)、生化和分子病理，A.Goate，F(xiàn).Ashall編(在印刷中)；Lai等，(1995)，出處同前)。從體細(xì)胞到遠(yuǎn)距離神經(jīng)皮層的突觸傳導(dǎo)障礙會(huì)造成突觸喪失及識(shí)別力損傷。另一些因素包括錐體細(xì)胞中PHF聚積的直接毒性(Bondareff等，(1993)，普通精神病學(xué)文獻(xiàn)，50350-356；(1994)，神經(jīng)病理學(xué)與實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)雜志，50158-164)和損傷細(xì)胞功能的Tau聚積性可能的直接毒性(Mena等，(1991)，神經(jīng)病理學(xué)與實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)雜志，50474-490)。
盡管分子病理模型的研究強(qiáng)調(diào)β-淀粉樣聚積的神經(jīng)毒性作用[Harrington，Wischik(1994)探討AD的分子病理生物學(xué)癡呆(A.Bums，R.Levy編)Chapman & Hall，倫敦，211-238頁(yè)]，但有關(guān)β-淀粉樣聚積與人類識(shí)別力損傷相關(guān)聯(lián)的證據(jù)不足。APP轉(zhuǎn)變過(guò)程可能只是引發(fā)Tau蛋白轉(zhuǎn)化的多種因素之一。其它引發(fā)因素包括未明的與載脂蛋白E4(apoE4)相關(guān)的過(guò)程(Harrington等，(1994b)，出處同前)、染色體21的三體性[Mukaetova-Ladinska等(1994)腦功能不全展望，7311-329]以及環(huán)境因素，例如鋁亞毒性環(huán)境長(zhǎng)期暴露(Harrington等(1994c)Lancet，343，993-997)?？赡苷T發(fā)一般模式的Tau-蛋白作用障礙的明確病因?qū)W因素包括谷氨酸-391(Glu-391)處C-末端截?cái)唷HF-Tau多聚體的形成、可溶性tau蛋白的丟失以及異常磷酸化Tau種類的聚積[Wischik等，(1996)國(guó)際精神病學(xué)評(píng)論(印刷中)]。
作為抗蛋白酶PHF核心成分的微管交聯(lián)蛋白tau片段93/95是來(lái)自Tau蛋白微管交聯(lián)區(qū)的氨基酸殘基片段[Wischik等，(1988)，出處同前；Kanda等，(1988)，神經(jīng)原，1，827-834；Jakes等(1997)歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，10，2725-2729；Novak等(1993)，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，12，365-370]。Tau蛋白在成人腦中有6種351至441個(gè)氨基酸殘基組成的固型體[Goedert等，(1989)，神經(jīng)原，3，519-526]。在一般結(jié)構(gòu)中tau分子的組成是一個(gè)有252個(gè)殘基的N-末端區(qū)(從微管分子處凸出來(lái))、一個(gè)由3或4個(gè)前后重復(fù)構(gòu)成的93-125個(gè)殘基的前后重復(fù)區(qū)(該區(qū)為微管結(jié)合區(qū))、以及一個(gè)含64個(gè)殘基的C-末端尾。每個(gè)前后重復(fù)結(jié)構(gòu)由一種含19個(gè)殘基的微管蛋白結(jié)合區(qū)段和一種含12個(gè)殘基的連接區(qū)段構(gòu)成[Butner，和Kirschner，(1991)，細(xì)胞生物學(xué)雜志，115，717-730；

圖1]。tau蛋白的主要有效成份是一種來(lái)源于3-或4-重復(fù)同型體的12(KDa)的片段。該片段可以從富含抗蛋白酶的核心PHF制劑中提取，但每一同型體都限制在3個(gè)前后重復(fù)結(jié)構(gòu)的平衡狀態(tài)(Jakes等，出處同前；圖2)。該片段的N和C-末端邊界限定了特征性抗蛋白酶PHF核心tau單位的確切范圍，該范圍根據(jù)Butner和Kirschner定義的正常分子結(jié)合體/連接體的結(jié)構(gòu)按14/16個(gè)殘基發(fā)生周期性變化(Butner，Kirschner，出處同前，圖1)，并在與Glu-391或4-重復(fù)同型體的3個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)相同的位置發(fā)生C-末端截?cái)?Novak等(1993)，出處同前，圖3)。一種單克隆抗體(mAb423)可以特異性識(shí)別該C-末端截點(diǎn)，并應(yīng)用該抗體進(jìn)行的組織學(xué)研究表明在整個(gè)神經(jīng)原纖維退化過(guò)程中都在Glu-391有C-末端截?cái)嗟膖au蛋白(Mena等(1995)神經(jīng)病理學(xué)報(bào)，89，50-56；Mena等(1996)神經(jīng)病理學(xué)報(bào)(印刷中))。因此，涉及PHF形成的翻譯后修飾可能是一種異常的蛋白水解作用。
現(xiàn)在已發(fā)展的一些方法可以識(shí)別AD人的腦組織中不同tau-蛋白池，包括正?？扇苄訲au蛋白、磷酸化Tau蛋白、以及抗蛋白酶PHFs[Harrington等，(1990)(1991)(1994a)，出處同前]。這些方法已經(jīng)被推廣應(yīng)用于研究嚴(yán)重的AD和Down′s綜合征[Mukaetovce-Ladinska等，(1993)(1995)，出處同前]，也應(yīng)用于早期AD患者(Wischik等(1995a)，出處同前；Lai等(1995)，出處同前)和其它由神經(jīng)病理性診斷的病例(包括雷維小體病和帕金森氏病引起的老年癡呆)的前瞻性研究(Harrington等，(1994a)(1994b)，出處同前)。根據(jù)腦組織中完整的PHF構(gòu)成能明確區(qū)別有或沒(méi)有阿耳茨海默型癡呆的患者，兩者PHF含量存在19倍的差異，在顳部皮層中可達(dá)40倍。組織學(xué)研究認(rèn)為主要的PHF聚積點(diǎn)(按抗蛋白酶PHFs或磷酸化tau蛋白形成的聚積來(lái)說(shuō))與年齡控制區(qū)無(wú)差別(Harrington等，(1994a)(1994b)，出處同前)。而且載脂蛋白E4基因型在雷維小體病皮層和在AD中具有相同程度的E4等位基因。因此，E4等位基因的存在不是AD tau蛋白病理特征的唯一原因，因?yàn)樵摬±硖卣魃形丛诶拙S小體病中發(fā)現(xiàn)(Harrington等(1996)出處同前)。
正常溶解性tau蛋白的數(shù)量是鑒別有或沒(méi)有AD病例的另一參數(shù)。盡管白質(zhì)中tau蛋白水平比灰質(zhì)中高，但對(duì)于軸突微管交聯(lián)蛋白，灰質(zhì)中的數(shù)量也能反映傳入神經(jīng)軸突的分布。AD患者存在明顯的正?？扇苄詔au蛋白喪失，該喪失均勻地影響到全腦各部位(Mukaetova-Ladinska等，(1993)，出處同前)。這種腦衰退的分子基礎(chǔ)尚屬未知，也無(wú)法用tau蛋白mRNA減少來(lái)解釋(Goedort等，(1988)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊，85，4051-4058)。PHFs聚積和可溶性tau蛋白喪失造成了tau蛋白池解剖上的再分配由白質(zhì)占主體轉(zhuǎn)變?yōu)榛屹|(zhì)占主體，由額面占主體轉(zhuǎn)變?yōu)轱D壁占主體。
AD中全腦tau蛋白再分配的程度可用圖4中顯示的數(shù)據(jù)表示。該圖對(duì)全部正?；顒?dòng)的tau蛋白池和PHF交聯(lián)tau池進(jìn)行了比較，對(duì)照組中97％的tau蛋白池處于可溶狀態(tài)，而AD中87％的處于不可溶狀態(tài)，而且?guī)缀跞繛榻財(cái)嘈问胶途酆铣蒔HFs形式(Mukaetova-Ladinska等(1993)，出處同前)。應(yīng)用臨床診斷儀CAMDEX對(duì)早發(fā)AD病患者進(jìn)行的前瞻性研究(Roth等(1986)，英國(guó)精神病學(xué)雜志，149，698-709)和按Braak的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的尸體解剖(Braak(1991)，神經(jīng)病理學(xué)報(bào)，82，239-259)研究表明可溶性Tau蛋白的喪失與纏結(jié)數(shù)及PHF聚積的程度直接相關(guān)(Lai等，(1995)，出處同前)。
盡管異常磷酸化tau蛋白被認(rèn)為可能是一種PHF前體(Lee等(1991)科學(xué)，251，675-678；Goedert等，(1994)微管(Hyams，Llogd編)183-200頁(yè)，John Wiley and Sons，紐約)，但在許多曾被認(rèn)為是PHF結(jié)合的tau蛋白異常磷酸化的部位，正常tau蛋白也發(fā)生了磷酸化(Matsuo等，(1994)，神經(jīng)元，13，989-1002)，對(duì)早發(fā)AD研究發(fā)現(xiàn)，非溶解性高度磷酸化tau蛋白最早出現(xiàn)于可測(cè)知的tau蛋白重分配后轉(zhuǎn)化為PHFs后(Lai等，1995；圖5)。尚無(wú)證據(jù)表明磷酸化tau蛋白在出現(xiàn)PHFs或神經(jīng)原纖維混亂之前有選擇性的聚集(Lai等，(1995)，同前)。同樣，也無(wú)證據(jù)表明在病理進(jìn)程中有磷酸化tau蛋白供應(yīng)PHF-結(jié)合池(Lai等，(1995)，同前)。tau蛋白的磷酸化至今仍是一種異?，F(xiàn)象，它可能是在病理階段影響大約5％PHFs的一種次級(jí)過(guò)程(Wischik等(1995a)(1995c)同前)。
早期AD研究還表明溶解性tau蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)镻HFs的轉(zhuǎn)化率與PHF水平呈等比級(jí)數(shù)關(guān)系隨周圍高水平的PHFs聚集率而逐漸增長(zhǎng)(Lai等，(1995)，出處同前，圖6B)。而且，病理進(jìn)程中所觀察到的溶解性Tau喪失率不能充分解釋PHFs聚集率，當(dāng)周圍溶解性tau水平降至580pmol/g以下時(shí)，可引起進(jìn)行性新的tau合成，并進(jìn)入PHF組成系統(tǒng)(圖6A)。因此PHF聚集率并非由溶解性前體的狀態(tài)或聚集濃度決定。(該前體的狀態(tài)和聚集情況即使在AD中也是完全正常的)。(Wischik等，(1995a)(1995b)出處同前)。更確切地說(shuō)，可溶性tau蛋白轉(zhuǎn)化為PHFs的轉(zhuǎn)化率是由周圍PHF-tau水平?jīng)Q定的，這就提示，在tau蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)镻HF聚積時(shí)的關(guān)鍵性翻譯后的修飾決定了PHF聚積的發(fā)生。
這些發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可能解釋為Tau蛋白在轉(zhuǎn)變?yōu)镻HF聚積時(shí)遭受了結(jié)構(gòu)上的變化。這一變化與前后重復(fù)區(qū)的半重復(fù)階段的轉(zhuǎn)變相聯(lián)系，如以前的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一樣(Novak等(1993)，出處同前)。該tau蛋白結(jié)構(gòu)的變化使高親和tau蛋白捕獲位點(diǎn)暴露，捕獲tau蛋白并誘導(dǎo)另一tau分子發(fā)生結(jié)構(gòu)調(diào)整，等等。這種決定PHF聚積率的tau蛋白關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)變化不是可溶性tau所需的化學(xué)修飾，而是一個(gè)由tau蛋白結(jié)合到病理性基體時(shí)發(fā)生的誘導(dǎo)性結(jié)構(gòu)改變。這一過(guò)程也可被非tau蛋白啟動(dòng)，例如APP代謝產(chǎn)物(Caputo等(1992)腦研究，597，227-232)、修飾后線粒體蛋白(Wallale(1994)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊，91，8739-8746)等。一旦tau捕獲過(guò)程發(fā)生，將使下一捕獲過(guò)程的發(fā)生率超出病理性tau復(fù)合物的降解率。PHF核心tau復(fù)合物抗蛋白酶的作用會(huì)限制這一降解過(guò)程(Wischik等(1988)，出處同前；Jakes等，出處同前)。一般認(rèn)為，在沒(méi)有任何可溶性tau蛋白間插性化學(xué)修飾的干擾下，tau蛋白淀粉樣作用過(guò)程會(huì)被啟動(dòng)并呈等比級(jí)數(shù)速度發(fā)展。
圖7概括描述了AD中tau蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)镻HFs的過(guò)程。PHF核心主要的蛋白組成形式是一種截至93個(gè)殘基的tau蛋白，該片段是tau分子前后重復(fù)區(qū)的移碼翻譯形成的，tau分子的前后重復(fù)區(qū)在正常情況下作為微管結(jié)合區(qū)。PHF系統(tǒng)的裝配可以看作為一種重復(fù)序列的結(jié)果，其中病理性tau-tau結(jié)合起到主導(dǎo)作用。游離tau蛋白的這種結(jié)合只有在不對(duì)稱情況中才有助于生理性聚積，在這種情況中tau分子經(jīng)受了病理性捕獲，例如APP代謝產(chǎn)物(caputo等(1992)神經(jīng)生物學(xué)，老化，13，267-274)，或修飾后線粒體蛋白(Jancsit等，(1989)細(xì)胞能動(dòng)力與細(xì)胞骨架，14，372-381；Wallace，出處同前)。下一tau蛋白結(jié)合由捕獲種類的不完全蛋白水解過(guò)程促進(jìn)，最后只剩下截形的tau蛋白單位。一旦一個(gè)全長(zhǎng)或截形tau單位與另一全長(zhǎng)tau分子結(jié)合，病理性復(fù)合物的不完全蛋白水解過(guò)程將產(chǎn)生一個(gè)核心tau單位的二聚體，伴隨著失去前一完整tau分子的N-或C-末端區(qū)。蛋白水解過(guò)程的局限性是由tau-tau結(jié)合區(qū)域決定的，該區(qū)域與最小抗蛋白酶tau單位準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，對(duì)這方面我們已作了報(bào)道(Novok等，(1993)，出處同前)(見(jiàn)圖16，17)。但是，不完全水解的最終結(jié)果是核心tau單位的再生，該tau單位能捕獲下一全長(zhǎng)tau分子，這一過(guò)程不斷重復(fù)直到可獲得的tau-蛋白池耗竭，其中需要兩個(gè)關(guān)鍵步驟首先是截?cái)嗟膯挝恢貜?fù)捕獲全長(zhǎng)tau蛋白，第二是截?cái)嘟Y(jié)合的全長(zhǎng)tau蛋白，再產(chǎn)生核心單位。
到目前為至，尚無(wú)檢測(cè)病理性tau-tau交聯(lián)的可靠方法的報(bào)導(dǎo)，也無(wú)關(guān)于調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau結(jié)合的藥物的發(fā)表。
在本申請(qǐng)權(quán)利要求書中提出了解決以上問(wèn)題的具體方案的技術(shù)特征。
因此，本發(fā)明涉及檢測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau結(jié)合制劑的方法，該方法包括a)一種tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與b)一種推測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau交聯(lián)的制劑并與c)一種能與a)中tau蛋白結(jié)合的標(biāo)記的tau蛋白或其標(biāo)記的衍和物接觸，或與不同于a)中的tau蛋白，而也能與a)中的tau蛋白結(jié)合的tau蛋白或其衍生物接觸，以及d)tau-tau結(jié)合的檢測(cè)。
與聚合反應(yīng)有關(guān)的tau蛋白修飾轉(zhuǎn)化為PHFs的過(guò)程是由物理結(jié)構(gòu)變化而不是由tau蛋白的任何化學(xué)翻譯后的修飾而進(jìn)行的。但令人吃驚的是，通過(guò)把tau先結(jié)合到固相上，將這種由病理性tau捕獲發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的體內(nèi)修飾轉(zhuǎn)移或按上述過(guò)程進(jìn)行的體外方法是可能的。從新生大鼠腦中分離出的tau蛋白完全不能結(jié)合到PHF的核心tau單位上(圖14，“POTr”)。但以前已經(jīng)被動(dòng)結(jié)合到固相基質(zhì)上的新生tau蛋白能夠被誘導(dǎo)與無(wú)修飾的全長(zhǎng)tau蛋白結(jié)合，該全長(zhǎng)tau蛋白與核心tau單位有相同的高親和力。因此，將一種不能發(fā)生病理性結(jié)合的tau蛋白轉(zhuǎn)化為能捕獲另一種高親和力的tau分子所需要的關(guān)鍵性因素是由新生tau蛋白與固相物質(zhì)發(fā)生被動(dòng)結(jié)合所導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化。這表明高親和tau捕獲位點(diǎn)的暴露能被發(fā)生在tau蛋白與適當(dāng)物質(zhì)結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)變化所誘導(dǎo)。
根據(jù)本發(fā)明，在體外實(shí)驗(yàn)中再現(xiàn)的病理性結(jié)合的某些重要特性與在人腦中所見(jiàn)到的相同，特別是結(jié)合在丙氨酸-390(Ala-390)(圖21，SEQ ID NO4)終止的核心tau單位的全長(zhǎng)tau蛋白，該核心tau單位因此而缺乏被單克隆抗體423(mAb423)識(shí)別所需的Glu-391，在用廣譜蛋白酶(鏈霉蛋白酶)消化處理該結(jié)合的tau復(fù)合物后，能以一種定量依賴于鏈霉蛋白酶消化(圖16)程度的方式與mAb423發(fā)生反應(yīng)(圖16)。N-末端tau蛋白免疫反應(yīng)性的消化依賴性的喪失可表明它與獲得核心PHF的特征mAb423免疫反應(yīng)性相平行(圖16)。因此從PHF核心分離并在AD患者腦中生成tau單位的必要條件是病理性tau-tau相互作用。這已在體外實(shí)驗(yàn)中再現(xiàn)。
而且，全長(zhǎng)tau蛋白重復(fù)循環(huán)結(jié)合到Ala-390上終止的tau單位上，接著用鏈霉蛋白酶處理，再與全長(zhǎng)tau結(jié)合，以及再進(jìn)行鏈霉蛋白酶的消化，就這樣一直到4個(gè)循環(huán)完成，都與Glu-391C-末端截?cái)嗟膖au蛋白逐漸聚集相關(guān)(圖17)，并且每一循環(huán)都伴有全長(zhǎng)tau蛋白結(jié)合能力的逐漸增加(圖18)。這表明圖7所示的模型中蛋白酶解的重要作用是防止飽和，并因此促進(jìn)可溶性tau無(wú)限制逐漸轉(zhuǎn)化到PHF核心截?cái)嗟膖單位。
已證明圖7中所有步驟均能在體外實(shí)驗(yàn)中復(fù)制。這一進(jìn)程的關(guān)鍵條件是tau捕獲階段的高親和力。這可證明對(duì)該結(jié)合情況的鑒定可用來(lái)尋找能阻斷高親和力tau-tau結(jié)合的化合物。
大多數(shù)有抑制能力化合物在其與tau蛋白的摩爾比為1∶1時(shí)，可顯示20％的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，進(jìn)一步的抑制大約在其摩爾比提高到10∶1時(shí)才能顯現(xiàn)(圖19)。
因?yàn)榍昂笾貜?fù)區(qū)作為整體發(fā)揮作用，所以出乎意料的是病理性tau-tau結(jié)合的選擇性競(jìng)爭(zhēng)的抑制作用不干擾同一分子區(qū)的tau與微管蛋白的正常結(jié)合是可能的。確定任何可能干擾的方法(即干擾tau或其衍生物與微管蛋白分子的結(jié)合)，包括將解聚的微管蛋白制劑或用紫杉酚固定的微管蛋白制劑與一種估計(jì)能調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau交聯(lián)的制劑和一種上述c)中提到的tau化合物接觸，接著檢測(cè)tau-微管蛋白的結(jié)合。
“tau蛋白”這一術(shù)語(yǔ)指的是以上提到的tau蛋白家族中的任一種蛋白及其衍生物。tau蛋白是大量蛋白家族中的一類，這些蛋白家族在結(jié)合和分解的重復(fù)循環(huán)中與微管發(fā)生共純化(Shelanski等，(1973)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊)，70，765-768)，并且tau蛋白還被稱為微管結(jié)合蛋白(MAPs)。此外tau家族包含一個(gè)特征性N-末端片段，該片段為該tau蛋白家族的所有成員共有；一個(gè)插入到N-末端片段中在腦中發(fā)展調(diào)型的約50個(gè)氨基酸構(gòu)成的序列；一個(gè)特征性前后重復(fù)區(qū)，由31-32個(gè)氨基酸前后重復(fù)3或4次構(gòu)成；以及一個(gè)C-末端尾(圖2)。
在本發(fā)明的一優(yōu)選方案中，tau蛋白包含圖21的氨基酸序列(SEQ IDNO5)，被稱為“T40”(Goedert等，(1989)，神經(jīng)元3519-526)，或其片段，并且其形狀是含有2個(gè)N-末端插入和4個(gè)前后重復(fù)結(jié)構(gòu)的tau蛋白。
“tau核心片段”是指最基本形式的tau片段，含有一個(gè)由前后重復(fù)區(qū)產(chǎn)生的截形的tau蛋白序列，該前后重復(fù)區(qū)在適當(dāng)條件下能與另一高親和性tau蛋白的前后重復(fù)區(qū)結(jié)合。一般說(shuō)來(lái)，優(yōu)選的tau蛋白、tau蛋白衍生物以及tau蛋白核心片段都具有一氨基酸序列，該序列至少有70％與相應(yīng)人類tau蛋白氨基酸序列(圖21，SEQ ID NO5)相同。至少80％為更優(yōu)選，至少90％為最優(yōu)選，并且它們的特征在于這些優(yōu)選tau蛋白能與人類tau核心片段結(jié)合。本發(fā)明檢測(cè)方法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在它包括了具有圖22中所示的氨基酸序列的tau核心片段(SEQ ID NO6；Novak等，1993)。這一由大腸桿菌在體外表達(dá)的重組tau肽與從抗蛋白酶PHF核心制劑中分離出的相應(yīng)(Wischik等(1988)，出處同前；Jakes等，(1991)出處同前)。“tau核心片段”也包括它在以下所述的及在圖25、26中提及的衍生物(SEQ ID NO9，10)。
“tau蛋白衍生物”及“tau核心片段衍生物”包括天然或非天然生成的tau蛋白以及相關(guān)蛋白的片段。所謂相關(guān)蛋白是指那些至少含有與tau蛋白前后重復(fù)區(qū)部分相似的氨基酸序列的蛋白，即天然tau或其片段中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已被取代或除去而未喪失結(jié)合活性的蛋白。與前后重復(fù)區(qū)有相似序列的天然蛋白，其實(shí)例有微管結(jié)合蛋白(MAP2；圖25、26；SEQ ID NO9，10；Kindler和Garner(1994)，分子腦研究，26，218-224)。這樣的類似物可由已知的肽化學(xué)方法或DNA重組技術(shù)制備。
“tau蛋白衍生物”和“Tau核心片段衍生物”是指那些可用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法從殘基的側(cè)鏈或N，C-末端基團(tuán)制備的衍生物。這些衍生物包括羧基脂肪族酯、羧基與氨或者與伯或仲胺反應(yīng)而產(chǎn)生的羧基酰胺、氨基酸殘基中游離的氨基團(tuán)與酰基(例如鏈烷醇或碳環(huán)芳?；鶊F(tuán))形成的N-酰基衍生物或游離羥基團(tuán)(例如絲氨?；蛱K氨酰基殘基)與?；糠中纬傻腛-?；苌铩?br> 核心PHF tau片段可用Wischik等所述的方法從AD患者腦組織中分離出來(lái)(1988，1995a出處同前)，這種方法依賴于一系列不同速度的離心。這些離心步驟是在經(jīng)驗(yàn)確定的緩沖液和濃度條件下進(jìn)行的。最后關(guān)鍵性的一步離心在從1.05到1.18密度之間連續(xù)變化的蔗糖密度梯度以及10μg/ml鏈霉蛋白酶存在下進(jìn)行的，在高濃度氯化銫緩沖墊層交界面上形成一抗蛋白酶PHF核心片段。tau蛋白是從PHF核心中釋放出來(lái)在pH＝5.5的上清液(50mmol氨基乙酸酯)中一種基本純化的制劑，該上清液經(jīng)濃縮甲酸處理PHF制劑，凍干，并在pH5.5的緩沖液中進(jìn)行聲處理后獲得。
正常可溶性tau可從死后3小時(shí)內(nèi)尸解的AD患者、對(duì)照組人腦組織或動(dòng)物腦組織中分離出來(lái)，微管蛋白可按Shelanski等所述(1973，同前)通過(guò)溫度依賴性的三個(gè)結(jié)合-分解循環(huán)獲得。tau蛋白可經(jīng)凝膠過(guò)濾從耐熱級(jí)份中純化制備(Hezzog，Weber(1978)歐洲分子生化雜志，92，1-8)。或者也可按Lindwall和Cole(1984；生物化學(xué)雜志，259，12241-12245)的方法分離，這種方法以tau蛋白在2.5％高氯酸中的溶解性為基礎(chǔ)。
tau蛋白和其片段的產(chǎn)生也可用傳統(tǒng)的DNA重組技術(shù)。該技術(shù)屬于該領(lǐng)域的已知技術(shù)，在文獻(xiàn)中有詳細(xì)報(bào)道，例如Sambrook，F(xiàn)risch和Maniatis編的“分子克隆、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(1989)，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室，紐約；及Ausubel等的“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案”Green出版社，Association & Wileyinterscience。
而且，編碼全部或部分tau蛋白的DNA分子或其衍生片段可經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)獲得，編碼相關(guān)的DNA分子3′，5′部位的引物可合成為需要的tau蛋白，也可用來(lái)擴(kuò)增tau蛋白家族中的各個(gè)成員。
目前已知的制備微管蛋白或其片段的方法由Slobuda等在“細(xì)胞活動(dòng)”(R.Goldman，T，Pollard和J.Rosenbanm編，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室，ColdSpring港，紐約，1171-1212頁(yè))一書中進(jìn)行了說(shuō)明。
DNA序列和DNA分子可應(yīng)用多種宿主/載體聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。例如，可應(yīng)用的表達(dá)載體包含染色體片段、非染色體片段及合成的DNA序列片段。這些載體的例子有病毒載體，如多種已知的SV40(猿猴病毒40)；細(xì)菌載體如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒；噬菌體DNA載體如大量的噬菌體λ衍生物，MB及其它絲狀單鏈DNA噬菌體；以及酵母中應(yīng)用的載體如2μ質(zhì)粒衍生物；用于真核生物細(xì)胞的載體(更優(yōu)選用于動(dòng)物細(xì)胞的載體)如包含來(lái)自SV40、腺病毒和/或反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA序列的載體。
這里所述的“DNA序列”是指其形式為分散片段或較大DNA結(jié)構(gòu)成分的DNA聚合物，來(lái)自至少分離一次的基本上純化形式DNA，即，未污染的內(nèi)源性物質(zhì)并且其量和濃度為使其序列和其組成的核酸序列能用標(biāo)準(zhǔn)生化方法(例如應(yīng)用克隆載體)鑒定、調(diào)控及恢復(fù)。這些序列優(yōu)選不含非翻譯區(qū)(或內(nèi)含子，典型存在于真核生物基因中)的連續(xù)的開(kāi)放讀框形式。但是，也能選用含有相關(guān)序列的基因組DNA。非翻譯區(qū)DNA序列可存在于開(kāi)放讀框的5′或3′位置，同樣也不干擾編碼區(qū)的調(diào)控或表達(dá)。
這里所說(shuō)的“表達(dá)載體”“表達(dá)質(zhì)?！笔侵赴D(zhuǎn)錄單位的質(zhì)粒。該轉(zhuǎn)錄單位的裝配成分包括(1)一遺傳因子或在基因表達(dá)中具有調(diào)控作用的一些因子，例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(2)能轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)序列或編碼序列，(3)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯的啟動(dòng)及終止序列。在多種真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用的結(jié)構(gòu)因子優(yōu)選包含有能被宿主細(xì)胞用于進(jìn)行細(xì)胞外分泌翻譯蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列?；蛘撸跓o(wú)前導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的重組蛋白表達(dá)的位置，可以含有N-末端蛋氨酸殘基。該殘基隨后可以從表達(dá)的重組蛋白斷裂而提供最終產(chǎn)物。
用以表達(dá)DNA序列的宿主細(xì)胞可從多種已知的宿主中選擇，這些宿主的例子有原核生物或真核生物細(xì)胞。從不同的保芷單位可獲得大量這樣的宿主，例如ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保芷中心)或德意志微生物保芷中心(DSM)。原核生物細(xì)胞宿主的例子包括大腸桿菌、枯葉桿菌及其它的一些菌株。優(yōu)選宿主是可購(gòu)得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠3T3細(xì)胞、或神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株(如NIE-115、N2A、PC-12、或SV40轉(zhuǎn)染的非洲綠猿腎細(xì)胞株COS等。
用本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化的原核或真核生物細(xì)胞經(jīng)發(fā)酵制備的tau蛋白能應(yīng)用以下已知方法純化為基本的同型體，例如用不同速度離心的方法、與硫酸銨共沉淀、在常壓或低壓下透析、制備性等電聚焦、制備性凝膠電泳、或多種層析法例如凝膠過(guò)濾、高效液相色譜(HPLC)、離子交換層析、反相層析以及親和層析(例如應(yīng)用Sepharose Blue CL-6B束縛載體的單克隆抗體)。
根據(jù)本發(fā)明將tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與另一tau蛋白及推測(cè)有調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau結(jié)合的制劑共同孵育。tau-tau結(jié)合程度與該制劑的抑制能力相關(guān)，可用以下各種方法檢測(cè)
優(yōu)選方法tau蛋白或其含有tau核心片段的片段與一tau衍生物孵育，該衍生物具有明確的與第一種tau蛋白不同的免疫學(xué)特性。在這種情況下，tau衍生物的結(jié)合可用多克隆抗體或單克隆抗體或其衍生物檢測(cè)。以下的這一種檢測(cè)tau-tau結(jié)合的鑒定方法就是這類檢測(cè)方法的例子將相應(yīng)于核心片段的截形tau蛋白與受試物質(zhì)及全長(zhǎng)tau蛋白或截形tau蛋白片段一起孵育，該片段能模擬含水相中核心PHF的tau單位(圖8，10)。
在此情況下，tau-tau結(jié)合可用傳統(tǒng)的方法應(yīng)用識(shí)別抗體進(jìn)行免疫生化檢測(cè)，該抗體能識(shí)別全長(zhǎng)tau蛋白的N-末端區(qū)段，例如抗體mAb423能識(shí)別Glu-391截?cái)嗟膖au核心片段。有利的是，本發(fā)明的單克隆抗體自身攜帶有標(biāo)記物或直接或間接與標(biāo)記物偶聯(lián)的基團(tuán)，這將在下面舉例說(shuō)明。也能使用由相應(yīng)的tau抗原注射到動(dòng)物(優(yōu)選家兔)體內(nèi)而產(chǎn)生的多克隆抗血清，應(yīng)用免疫親和純化法可以恢復(fù)該抗血清，該方法包括將多克隆抗體經(jīng)過(guò)一限制性抗原柱并用傳統(tǒng)方式洗脫該多克隆抗體。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括應(yīng)用一種能直接對(duì)抗位于tau蛋白N-末端附近Gly-16和Glu-26之間的人類特異性區(qū)段的抗體。該類抗體的應(yīng)用使本方法能夠檢測(cè)全長(zhǎng)重組人類tau蛋白與來(lái)自其它動(dòng)物(如大鼠)在不同發(fā)育階段的全長(zhǎng)tau同種型之間的結(jié)合。截形tau蛋白的結(jié)合可用一種特定抗體檢測(cè)，例如用mAb423能檢測(cè)在Glu-391末端截?cái)嗟腡au片段與在Ala-390末端截?cái)嗟南嗨破沃g的結(jié)合，后者不能被Ab423識(shí)別(圖8)。
這些抗體或其片段能應(yīng)用于本學(xué)科已知的任一免疫檢測(cè)系統(tǒng)，包括但不僅限于放射免疫檢測(cè)、“三明治”檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、熒光免疫測(cè)定、蛋白A免疫檢測(cè)等方法。
以下tau-tau結(jié)合檢測(cè)的構(gòu)型屬優(yōu)選(圖10)將tau片段特別是重組tau片段(相應(yīng)于核心PHF截?cái)嗟膖au單位)在不會(huì)促進(jìn)tau-tau結(jié)合的緩沖液條件下結(jié)合到固相物質(zhì)板上，例如傳統(tǒng)的ELISA板上。該截?cái)嗟膖au蛋白與固相的結(jié)合優(yōu)選的是被動(dòng)結(jié)合，這是因?yàn)樵谇昂笾貜?fù)區(qū)內(nèi)有高親和力的tau-tau結(jié)合位點(diǎn)。所用的固相物質(zhì)通常為聚氯乙烯。也可以是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯或聚丙烯等聚合物。固相支持物可以采用管、珠、盤、微板形式或其它適合于檢測(cè)方法的表面，它在被動(dòng)結(jié)合tau蛋白時(shí)暴露高親和力的捕獲位點(diǎn)。結(jié)合后，清洗該固相抗體結(jié)合物作為測(cè)試樣品。
確定適當(dāng)?shù)木彌_液條件，使核心PHF截?cái)嗟膖au單位與固相結(jié)合時(shí)不存在自身結(jié)合，也不干擾前后重復(fù)區(qū)內(nèi)高親和力的捕獲位點(diǎn)。圖8建立的檢測(cè)系統(tǒng)中，Ala-390截?cái)嗟暮诵膖au單位首先與固相基體結(jié)合，然后與Glu-391末端截?cái)嗟膖au單位共孵育。只有后者能檢測(cè)mAb423的免疫反應(yīng)性。圖9顯示了該檢測(cè)方法的特性，其中只有在預(yù)期有tau-tau結(jié)合的條件下才能顯示mAb423的免疫活性。堿性緩沖液(碳酸鈉，tris等)pH值范圍優(yōu)選9-10，例如選用碳酸鈉緩沖液(50mM，pH9.6)可忽略核心tau單位的自身結(jié)合(圖9)。因此，被動(dòng)結(jié)合到固相上的核心tau單位板就是在這種緩沖液中制備的。如果需要，解聚的微管蛋白制劑或在相同緩沖液中的微管制劑也能用平板培養(yǎng)法來(lái)測(cè)定tau-微管蛋白結(jié)合的被動(dòng)結(jié)合。用以阻斷多余結(jié)合位點(diǎn)的合適試劑有牛奶提取物、牛血清蛋白、明膠等。將結(jié)合了核心tau單位的固相轉(zhuǎn)至生理性緩沖液中并與全長(zhǎng)tau一起孵育為標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合鑒定形式(圖10)后，可以顯示極高親和力捕獲的正常全長(zhǎng)tau蛋白。在固相板上未預(yù)先鋪上核心tau單位的未見(jiàn)到全長(zhǎng)tau的結(jié)合。當(dāng)兩者共存時(shí)，結(jié)合依賴于兩種tau蛋白的濃度。當(dāng)固相或液相都飽和時(shí)，另一種類tau蛋白的結(jié)合常數(shù)依據(jù)所測(cè)tau蛋白同型體的不同在8-25nm之間變化(圖11)。tau-tau結(jié)合緩沖液的條件應(yīng)包括適當(dāng)?shù)柠}濃度及適當(dāng)?shù)膒H值(圖12，13)，該鹽濃度優(yōu)選50-400nm的氯化鈉，更優(yōu)選100-200nM氯化鈉或有相當(dāng)離子強(qiáng)度的相應(yīng)的鹽或鹽的混合物，例如PBS(137mMNaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mMNCl2HPO4，2.68mM KCl)。pH值應(yīng)在4-10范圍，優(yōu)選5-8。為了飽和過(guò)剩的結(jié)合位點(diǎn)并避免非特異結(jié)合，固相應(yīng)與阻斷劑一起孵育，例如牛奶提取物、小牛血清或明膠(優(yōu)選)。將被動(dòng)結(jié)合的核心tau單位轉(zhuǎn)移到生理性緩沖液中后，能夠顯示正常全長(zhǎng)tau蛋白極高捕獲親和力(緩沖液Kd＝8-25nM，依據(jù)測(cè)試的具體tau種類而定)。
含有tau蛋白(該tau蛋白能結(jié)合到固相tau蛋白上)的液相，與被測(cè)物一起加到固相tau蛋白上，放置片刻使其充分結(jié)合，然后將結(jié)合的tau復(fù)合物在加有抗體的制劑中清洗，該抗體選擇性檢測(cè)二次結(jié)合的tau蛋白，而不是最初的固相tau蛋白?？贵w與作為指示的分子結(jié)合，用以顯示第二種tau蛋白的結(jié)合的信號(hào)。
或者，應(yīng)用能與第一種未標(biāo)記的tau特異抗體結(jié)合的第二種抗體也能檢測(cè)結(jié)合的情況，在這種情況下，該二抗與報(bào)告分子結(jié)合。
“報(bào)告分子”在本說(shuō)明書中是指這樣一種分子依據(jù)其化學(xué)特性能提供一種可供分析檢測(cè)的標(biāo)記，該標(biāo)記能檢測(cè)抗原限制性抗體。檢測(cè)必須至少能相對(duì)定量，即能按絕對(duì)單位計(jì)算或與一包含有已知正常抗原水平的標(biāo)準(zhǔn)(或標(biāo)準(zhǔn)系列)對(duì)照來(lái)確定樣品中抗原的數(shù)量。
本檢測(cè)方法中最常用的報(bào)告分子為酶或熒光團(tuán)。在酶免疫測(cè)定時(shí)，經(jīng)常通過(guò)戊二醛或過(guò)碘酸鹽將酶接到第二抗體上。這種標(biāo)記很容易識(shí)別，有多種不同的接合技術(shù)均是專業(yè)人員已知的。通常所用的酶有辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。
結(jié)合了特異性酶的基質(zhì)一般可以進(jìn)行選擇生產(chǎn)，經(jīng)相應(yīng)酶水解后，產(chǎn)物發(fā)生可檢測(cè)的顏色變化。例如對(duì)硝基苯磷酸鹽適合于用堿性磷酸酶輟合物，對(duì)于過(guò)氧化物酶輟合物，常用于標(biāo)記1，2-苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。也可用熒光底物標(biāo)記，此時(shí)將產(chǎn)生一種熒光性產(chǎn)物而不是上述的顯色底物。在所有情況下，酶標(biāo)抗體加到相應(yīng)的tau-tau蛋白復(fù)合物上，能再結(jié)合其它復(fù)合物，然后將過(guò)剩的反應(yīng)物洗掉。將含有適當(dāng)?shù)孜锏娜芤?過(guò)氧化氫)加到三級(jí)復(fù)合物抗體-抗原-標(biāo)記物上。該底物與結(jié)合到抗體上的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可見(jiàn)信號(hào)，它可通過(guò)分光光度計(jì)定量評(píng)價(jià)血清樣本中抗原的量。
或者，熒光化合物如熒光素，或若丹明，也可經(jīng)化學(xué)方法標(biāo)記到抗體上而不改變抗體的結(jié)合能力。當(dāng)用特定波長(zhǎng)的光激活后，熒光標(biāo)記抗體吸附光能，使分子處于激活狀態(tài)，發(fā)出特定的較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。應(yīng)用光顯微鏡可以觀察到這種發(fā)光的特定顏色。在酶免疫測(cè)定(EIA)時(shí)，熒光標(biāo)記的抗體可與一級(jí)抗體-tau蛋白-肽復(fù)合物結(jié)合。洗去未結(jié)合反應(yīng)物后，將保留下三級(jí)復(fù)合物暴露在適當(dāng)波長(zhǎng)的光下，熒光觀察顯示抗原的存在。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中與受測(cè)物一起加到液相中的第二種tau蛋白可以與前面提到的報(bào)告分子結(jié)合，該第二種tau蛋白可以直接被修飾(例如用放射性或酶促方法標(biāo)記)或在該分子的一個(gè)區(qū)內(nèi)(例如N-末端區(qū))被接合(例如與一熒光團(tuán)接合)，例如該N末端區(qū)段，它不包含高親和力的tau-tau結(jié)合位點(diǎn)，因此其本身的作用是可以作為tau-tau結(jié)合測(cè)定中的配體，也可作為報(bào)告分子。
本發(fā)明的特別優(yōu)選方案在實(shí)施例1中作了詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明方法中應(yīng)用的抗體及其片段可用傳統(tǒng)技術(shù)制備，即對(duì)tau抗原決定簇選擇性的單克隆抗體可采用Kohler和Milstein的方法獲得。相對(duì)于tau抗原決定簇的適當(dāng)單克隆抗體可用已知的方法修飾以獲取Fab片段或(Fab′)2片段、嵌合的、人源化的或單鏈的抗體結(jié)構(gòu)。
應(yīng)用單克隆抗體測(cè)定tau-tau相互作用中的結(jié)合親合力并顯示體外實(shí)驗(yàn)中的結(jié)合與人腦中發(fā)生的結(jié)合之間免疫化學(xué)關(guān)系的實(shí)施例如下識(shí)別N-末端或C-末端tau決定簇的單抗能測(cè)定截?cái)嗟呐c全長(zhǎng)的tau蛋白之間的結(jié)合。能識(shí)別人類特異抗原決定簇的抗體是特別有用的抗體。一種單抗(標(biāo)記為AK999)能識(shí)別在tau蛋白的Gly-16和Gln26之間的人特異性抗原決定簇，因此也能測(cè)定全長(zhǎng)tau蛋白之間的結(jié)合，若其是由非人源化產(chǎn)生的話(Lai(1995)“tau蛋白的異常磷酸化在阿耳茨海默氏病的神經(jīng)原纖維病理發(fā)展中的作用”，博士論文，(劍橋大學(xué))?？贵w342能識(shí)別位于Ser-208和Asn-265之間的一種非特異性的普通tau抗原決定簇(圖21，SEQ IDNO4)，該抗原決定簇在tau-tau相互作用中將會(huì)部分地被阻塞(Lai，出處同前)。
其它有用的抗體已有報(bào)道抗體423識(shí)別在Glu-391處C-末端截?cái)嗟膖au蛋白(Novak等，(1993)，出處同前)。這種截?cái)嘧饔米匀话l(fā)生在AD病例中PHF團(tuán)形成的過(guò)程(Mena等，(1995)(1996)，出處同前；Novak等，(1993)，出處同前；Mena等，(1991)，出處同前)。相同的C-末端截?cái)嘣隗w外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)全長(zhǎng)tau結(jié)合到Ala-390截?cái)嗟膖au片段后，該片斷不能被mAb423識(shí)別(Novak等(1993)同前)，接著用廣譜蛋白酶(鏈霉蛋白酶)消化(圖16)。在這一過(guò)程中mAb423免疫反應(yīng)性的唯一可能來(lái)源是結(jié)合的全長(zhǎng)tau蛋白發(fā)生消化作用，這可以用濃度依賴法通過(guò)增加鏈霉蛋白酶濃度來(lái)顯示(圖16)。以上表明在體外產(chǎn)生tau-tau結(jié)合的分子構(gòu)型與腦中產(chǎn)生的構(gòu)型能確切地相對(duì)應(yīng)，因此在體外實(shí)驗(yàn)中顯示的對(duì)tau-tau結(jié)合的選擇性抑制同樣也能應(yīng)用于人腦。
抗體7.51識(shí)別一種位于tau蛋白的倒數(shù)第三個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)的普通tau蛋白抗原決定簇(Novak等(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊，88，5837-5841)。當(dāng)tau結(jié)合到與PHF類似的免疫化學(xué)構(gòu)型時(shí)，該tau抗原決定簇被阻塞，但用甲酸處理后可以再暴露(Harrington等(1990)(1991)，出處同前；Wischik等(1995a)出處同前)。正?？扇苄詔au或結(jié)合微管的tau能用mAb7.51檢測(cè)而無(wú)需甲酸處理(Harrington等(1991)，出處同前；Wischik等(1995a)，出處同前)。在tau-tau結(jié)合的測(cè)定中全長(zhǎng)tau的結(jié)合與mAb7.51抗原決定簇的不完全阻斷有關(guān)。
本發(fā)明應(yīng)用的酚噻嗪在Ki為98-108nM(圖19)時(shí)發(fā)生了結(jié)合的抑制作用，其與tau蛋白摩爾比為1∶1時(shí)顯示20％的抑制，進(jìn)一步的抑制作用在摩爾比達(dá)10∶1時(shí)大致呈線性，這與以下假說(shuō)相一致tau-tau結(jié)合是由有限數(shù)量的飽和結(jié)合位點(diǎn)決定的，因此具有特異性；而無(wú)協(xié)同性，即一個(gè)tau分子的結(jié)合不影響另一tau分子在發(fā)生抑制的位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合；結(jié)合是可逆的，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在平衡時(shí)結(jié)合僅由tau濃度和結(jié)合的親和力決定。
考慮到tau前后重復(fù)區(qū)作為微管蛋白結(jié)合區(qū)的正常功能，同時(shí)在相同的分子區(qū)也含有用于PHF集合的捕獲位點(diǎn)，如果更細(xì)微的分子差異能在兩種類型的結(jié)合間顯示，則只有藥物干預(yù)才可能阻止tau的病理性結(jié)合，這將會(huì)選擇性抑制病理性tau-tau結(jié)合而不抑制正常tau-微管蛋白的結(jié)合，因?yàn)樵S多正常的細(xì)胞作用過(guò)程，特別是突觸小泡的軸突遷移(Okabe，Hirokaua(1990)自然343，479-482)，都是依賴于細(xì)胞在聚合狀態(tài)時(shí)維持微管蛋白的能力。前面的實(shí)驗(yàn)顯示了兩者間免疫化學(xué)的差異(在tau-tau結(jié)合時(shí)阻塞mAb7.51抗原決定簇而在tau-微管蛋白結(jié)合時(shí)不阻塞；Harringon等(1991)，出處同前；Novak等(1991)，出處同前)和分子差異(相對(duì)于微管蛋白結(jié)合區(qū)的正常區(qū)段/連接物區(qū)段，在類似PHF構(gòu)型中結(jié)合的tau顯示出14/16氨基酸殘基的移碼，這可由特征性N-，C-末端蛋白水解斷裂位點(diǎn)來(lái)證明；Novak等(1993)，出處同前圖3)。使人驚奇的是，這些差異也是在完善的藥物分類內(nèi)應(yīng)用小分子進(jìn)行藥物鑒別的基礎(chǔ)。特別是那些能抑制病理性tau-tau結(jié)合的酚噻嗪對(duì)正常tau-微管蛋白的結(jié)合是否有抑制作用，對(duì)此也做了試驗(yàn)。可以看出，tau摩爾比高達(dá)1000∶1基本上不抑制結(jié)合。盡管如此，tau的過(guò)多磷酸化(這已表明了對(duì)tau微管蛋白的抑制作用)，在tau-微管蛋白結(jié)合測(cè)定中也能產(chǎn)生類似的抑制作用(Lai，出處同前)。因此，本發(fā)明提供的化合物抑制病理性tau-tau結(jié)合而不抑制tau與微管蛋白的正常結(jié)合。這是本發(fā)明的關(guān)鍵所在，因?yàn)檫@表明了在這里所述的篩選系統(tǒng)基礎(chǔ)上本發(fā)明化合物的技術(shù)可行性，該篩選系統(tǒng)可以用藥物來(lái)鑒別PHF前后重復(fù)區(qū)的病理性結(jié)合和正常的tau-微管蛋白的結(jié)合。
到目前為止唯一的PHF核心微管結(jié)合蛋白是tau蛋白。盡管如此，但PHFs均積聚在軀體的樹(shù)突間隙中，該間隙中MAP2是主要的微管結(jié)合蛋白(Matus，A，微管(Hyams，Lloyd編)，155-166頁(yè)，John Voley & Sons紐約)。MSP2同型體的前后重復(fù)區(qū)幾乎與tau蛋白相同，但兩者在N-末端區(qū)的序列和范圍都有顯著差異(圖25，26，SEQ ID NO9，10)。正如在實(shí)施例3中所示，在前后重復(fù)區(qū)的聚集不是選擇性針對(duì)特異性tau核心氨基酸序列，并且酚噻嗪抑制劑(如硫堇)的抑制活性也不依賴tau的特有序列。
另外，本發(fā)明也涉及相應(yīng)的體內(nèi)方法，這些方法用于篩選能調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau結(jié)合的藥物。該tau-tau結(jié)合的特征是用tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物或者用表達(dá)tau蛋白或含有tau核心片段衍生物的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，與一種推測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合的制劑接觸，然后檢測(cè)該細(xì)胞株的活性和/或形態(tài)。
實(shí)施例4和5顯示，當(dāng)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的全長(zhǎng)tau蛋白以及該蛋白的細(xì)胞骨架分布不受潛在的tau-tau結(jié)合抑制劑培養(yǎng)細(xì)胞的干擾時(shí)，成纖維細(xì)胞是完全存活的，酚噻嗪硫堇未顯示明顯內(nèi)在毒性。但當(dāng)PHF的轉(zhuǎn)基因核心tau單位表達(dá)時(shí)，成纖維細(xì)胞死亡或呈現(xiàn)全形態(tài)異常。轉(zhuǎn)染物的存活頻率和截?cái)嗟膖au的表達(dá)水平，受轉(zhuǎn)染后硫堇中細(xì)胞的生長(zhǎng)而按劑量依賴方式增加。表達(dá)截?cái)嗟膖au的活性轉(zhuǎn)染子依賴于硫堇，并伴隨提取后的低存活性而逆轉(zhuǎn)為異常形式。
這些發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明在無(wú)神經(jīng)元的細(xì)胞系統(tǒng)中的具體體現(xiàn)，即證實(shí)了細(xì)胞中高水平的PHF核心單位具有毒性；這種毒性可被病理性tau-tau結(jié)合作用的選擇性抑制劑化合物逆轉(zhuǎn)；這些化合物不干擾正常tau與微管蛋白在體外的正常結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)同時(shí)適用于其它實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，包括可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)及有截形tau蛋白的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)染。
盡管前述結(jié)果都支持tau-tau結(jié)合抑制劑在逆轉(zhuǎn)被截形tau單位毒性時(shí)的應(yīng)用，但還需要建立這些過(guò)程的神經(jīng)元模型。一般說(shuō)來(lái)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株在分化過(guò)程中經(jīng)受了復(fù)雜的細(xì)胞骨架改變，該分化過(guò)程依賴于微管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和神經(jīng)絲網(wǎng)絡(luò)的相應(yīng)發(fā)育之間的平衡。更高分子量的微管結(jié)合蛋白(MAPIA，MAPIB)被認(rèn)為是在這些細(xì)胞骨架系統(tǒng)之間的橫橋(Schoenfied等(1989)，神經(jīng)科學(xué)雜志，9，1712-1730)。用解聚劑(Wisniewski，Terry實(shí)驗(yàn)研究，17，577-587)或鋁(Langui等(1988)，腦研究，438，67-76)直接干擾微管系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致中間微絲斷裂并在細(xì)胞質(zhì)中形成特征螺環(huán)(WishcidcCrowther(1986)英國(guó)醫(yī)學(xué)通報(bào)，42，51-56)。相同的神經(jīng)微絲細(xì)胞骨架聚集可在未發(fā)生分化的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株中自發(fā)產(chǎn)生。MAPS在這些聚集體形成時(shí)的作用目前尚不清楚。但這些聚集體的形成、促染和抑制表明了微管細(xì)胞骨架連結(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)神經(jīng)系細(xì)胞骨架至新生軸突的能力。
實(shí)施例6和7表明硫堇等酚噻嗪抑制劑在濃度為2μm時(shí)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞株不產(chǎn)生毒性，硫堇也不干擾轉(zhuǎn)基因tau蛋白加入到內(nèi)源性微管網(wǎng)絡(luò)。隨著表達(dá)截形tau質(zhì)粒穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，活性神經(jīng)細(xì)胞株的產(chǎn)生，需要有酚噻嗪的存在。而且截形tau蛋白的結(jié)構(gòu)表達(dá)促進(jìn)了pNFH聚集體的形成，而后者又能被全長(zhǎng)tau蛋白的表達(dá)所抑制。細(xì)胞質(zhì)pNFH聚集體的形成被酚噻嗪(如硫堇)抑制，而且pNFH免疫反應(yīng)性在神經(jīng)元進(jìn)程中的體現(xiàn)也由這些化合物促進(jìn)。
這些發(fā)現(xiàn)表明神經(jīng)元細(xì)胞株穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染截形tau具有固有毒性，通過(guò)生存細(xì)胞中微管系統(tǒng)的去穩(wěn)定，導(dǎo)致神經(jīng)絲聚集體的形成，該聚集體不能被運(yùn)送到正在生成的軸突上。這些作用能被體外具有阻斷tau-tau聚集能力的化合物所抑制，并且這種作用可受內(nèi)源性tau或其它穩(wěn)定微管所需的MAPs的表達(dá)作用的影響。硫堇等酚噻嗪竟然也具有阻斷未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中神經(jīng)絲聚集體的能力，這是由于促進(jìn)神經(jīng)元分化或直接抑制神經(jīng)絲聚集體的形成所發(fā)揮的作用。除了它們?cè)陬A(yù)防AD中tau聚集的用途之外，這些化合物在治療以病理性神經(jīng)絲聚集為特征的疾病(例如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，雷維小體病)時(shí)還有潛在的作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)神經(jīng)絲亞單位的轉(zhuǎn)基因小鼠在退化的大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中選擇性地發(fā)育神經(jīng)絲，致使肌肉萎縮(Cote等，(1993)，細(xì)胞73，35-46；Xu等，(1993)，細(xì)胞，73，23-33)。其它的神經(jīng)元退行性紊亂，如皮克病和進(jìn)行性神經(jīng)核上麻痹，在齒狀回和新大腦皮層的衛(wèi)星錐體細(xì)胞中出現(xiàn)截形tau的聚集。前述的化合物也在這些神經(jīng)退行性紊亂中起作用。
因此，本發(fā)明特別涉及上述的體內(nèi)方法，在這種方法中優(yōu)選細(xì)胞株為成纖維細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞株，更優(yōu)選成纖維細(xì)胞3T3、PC-12或NIE-115細(xì)胞珠。這些細(xì)胞株優(yōu)選用至少包含有核心tau單位的截形tau蛋白轉(zhuǎn)染，tau蛋白的表達(dá)可按結(jié)構(gòu)或在可誘導(dǎo)的調(diào)控下進(jìn)行，或者這種tau蛋白也可或直接轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明也涉及由上述任一方法獲得的能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合的化合物。
根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明也提供了式I酚噻嗪及其藥用鹽的應(yīng)用，
其中R1、R2、R3、R4、R6、R7和R9可獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基或烷氧基；R2，R8可獨(dú)立地選自氫或
R5選自氫，羥基、羧基、取代或未取代的烷基，鹵烷基、烷氧基或單鍵；R10和R11可獨(dú)立地選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵；它們用于生產(chǎn)預(yù)防和治療病理性tau-tau或病理性神經(jīng)絲聚集的藥物組合物，特別是用于預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或雷維小體病的藥物組合物。
這里所用的“烷基”一詞是指直鏈或支鏈基團(tuán)，優(yōu)選有1-8個(gè)，更優(yōu)選1-6個(gè)碳原子。例如“烷基”可以是甲基，乙基，正丙基，異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、叔戊基、己基、異己基等。本發(fā)明應(yīng)用的烷基合適的取代基包括巰基、硫醚、硝基、氨基、芳氧基、鹵素、羥基和羰基團(tuán)，也包括芳基、環(huán)烷基和無(wú)芳基的雜環(huán)基團(tuán)。
“烷氧基”是指上面提到的烷基團(tuán)同時(shí)攜帶氧原子，該氧原子間隔于烷基和其結(jié)合的基本殘基之間。
“鹵烷基”代表一種具有3-4個(gè)碳原子與1、2或3個(gè)鹵素原子結(jié)合的直鏈或支鏈烷基。典型的鹵烷基團(tuán)有氯甲基，2-溴甲基、1-氯異丙基、3-氟丙基、2，3-二溴丁基、3-氯異丁基、碘-叔-丁基、三氟甲基等。
“鹵素”是指氟，氯，溴或碘。
本發(fā)明的一些化合物具有1個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱取代的碳原子，因此存在外消旋的和光學(xué)活性的形式，本發(fā)明旨在包括外消旋形式的化合物及其任何的光學(xué)活性形式。
藥用酸加成鹽是分子式(I)的基本化合物與無(wú)機(jī)酸(例如氫鹵酸如氫氯酸和氫溴酸)、硫酸，硝酸，磷酸等)或有機(jī)酸(例如乙酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸等)形成的化合物。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中提供了上述酚噻嗪及其藥用鹽，其中R1、R3、R4、R6、R7和R9各自選自-H、-CH3、-C2H5、或-C3H7；R2和R8各自選自
其中R10，R11各自選自單鍵，-H、-CH3、-C2H5，或C3H7；R5是單鍵，-H、-CH3、-C2H5，或C3H7。
特別優(yōu)選的是以下一些酚噻嗪a)甲苯胺藍(lán)O
b)硫堇
c)天藍(lán)A
d)天藍(lán)B
和e)1，9-二甲基亞甲蘭
能阻斷病理性tau-tau結(jié)合的化合物，優(yōu)選酚噻嗪(圖23，24)，其特征是結(jié)合系數(shù)小于0.4，對(duì)tau-微管蛋白結(jié)合沒(méi)有抑制，其與tau摩爾濃度比優(yōu)選1000∶1。
本發(fā)明中應(yīng)用的酚噻嗪是本領(lǐng)域已知的，并能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備(例如Merck Manual，Houben-Weyl，BeilsteinE III/IV 27，1214ff，雜環(huán)化學(xué)雜志，21，613(1984)等)。
具有上述分子式的化合物、其藥用鹽或其它具有測(cè)定中所需特性的化合物，在進(jìn)一步毒性試驗(yàn)后能被用作藥物(例如以藥物制劑的形式)。亞甲蘭在以前的廣譜適應(yīng)癥中的藥劑作用包括治療正鐵血紅蛋白血癥和預(yù)防躁狂抑郁精神病(Naylor(1986)生物精神病學(xué)21，915-920)及系統(tǒng)性給藥后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)穿透(Muller(1992)解剖學(xué)報(bào)，144，39-44)。天藍(lán)A和B是亞甲蘭的正常代謝降解產(chǎn)物(Disanto和Wagner(1972a)藥學(xué)科學(xué)雜志，61，598-602；Disanto和Wagner(1972b)藥學(xué)科學(xué)雜志，61，1086-1094)。這些藥物的用法可采用腸胃外給藥例如口服(以片劑、糖衣片劑、糖衣丸、硬或軟膠囊、溶液劑、乳劑、懸浮劑的形式)或鼻腔吸入(例以鼻噴霧形式)或從直腸給藥(例如栓劑)。但腸胃外給藥也可采用肌注或靜脈點(diǎn)滴(例如以注射液的形式)。
具分子式(I)的化合物及其藥用酸加成鹽在制備片劑、糖衣片劑、糖衣丸、硬膠囊過(guò)程中可加入藥用惰性的無(wú)機(jī)或有機(jī)賦形劑?？梢杂萌樘?、玉米淀粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其鹽等作為片劑、糖衣丸、硬膠囊的賦形劑。
軟膠囊中適合的賦形劑可以是植物油、蠟、脂肪、半固態(tài)或液態(tài)多元醇等。
溶液劑和糖漿制品的適合賦形劑可以是水、多元醇、糖精、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖等。
注射液的適合賦形劑可以是水、酒精、多元醇、甘油、植物油等。
栓劑中合適賦形劑是天然油或硬化油、臘、脂肪、半液態(tài)或液態(tài)多元醇等。
此外，這些藥物制劑中也可含有防腐劑、增溶劑、增粘劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、甜味劑、色素、香味素，用以改變滲透壓的鹽類、緩沖液、包衣劑或抗氧化劑。它們也可含有具有其它療效的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，具有上述分子式的化合物及其藥用鹽可用于治療或預(yù)防阿耳茨海默氏病，特別用于阻斷、調(diào)節(jié)，和抑制病理性tau-tau結(jié)合。劑量可在較寬的限度內(nèi)變化，但要適合每一具體病例的個(gè)體要求。一般說(shuō)來(lái)，口服給藥時(shí)日劑量約50-約700mg應(yīng)當(dāng)是足夠的，優(yōu)選約150-約300mg，分成1到3單位劑量服用，每單位劑量相同。但如果需要也可超出上面給出的上限。
參考附圖可以更好的理解本發(fā)明圖1tau蛋白與微管結(jié)合(Butner，Kirschner(出處同前)之后作了修改)。
圖2tau蛋白同型體的示意結(jié)構(gòu)，與圖21所示的氨基酸和cDNA序列相對(duì)應(yīng)。N-末端區(qū)的252個(gè)殘基中包含1或2個(gè)由58個(gè)殘基組成的插入子(“1”，“2”)，后接93-125個(gè)殘基組成的前后重復(fù)區(qū)包括3或4個(gè)前后重復(fù)，以及一個(gè)由64個(gè)殘基組成的C-末端結(jié)尾。從富含抗蛋白酶PHF核心的制劑中分離出的tau片段被命名為
由來(lái)自3-或4-重復(fù)同型體兩者衍生的各種混合物，但包括93-95個(gè)殘基，相當(dāng)于3-重復(fù)，相對(duì)于前后重復(fù)區(qū)的正常組織的銜接而言是由14-16個(gè)殘基移碼的。所有種類的
和正常tau蛋白都可被mAb7.51識(shí)別，但mAb423只能識(shí)別那些以Glu-391為結(jié)尾的
片段。該圖也顯示了mAb499、AT8和342抗原決定簇的位置。
圖3對(duì)來(lái)自核心PHF制劑的12kDa的F5.5片段的N-末端序列進(jìn)行分析，揭示了存在6種不同的肽，可以歸為3對(duì)由
或4-重復(fù)的同型體組成的組，即3-重復(fù)同型體(A
3；SEQ ID NO1)；或4-重復(fù)同型體(B重復(fù)1-3；SEQ ID NO2，或C重復(fù)2-4；SEQ ID NO3)的同型體(Jakes等，出處同前)。mAb423的免疫反應(yīng)性可用于確定Glu-391處的C-末端界限(箭頭所示，Novak等，(1993)，出處同前)。N-和C-末端的界限又能用來(lái)確定PHF核心內(nèi)前后重復(fù)區(qū)的相，該P(yáng)HF核相對(duì)于該序列同源重復(fù)，存在14-16個(gè)殘基的變移。這個(gè)最小的抗蛋白酶核心PHF tau單位長(zhǎng)93或95個(gè)殘基，相當(dāng)于3個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)。該單位的界限相對(duì)于Butner和Kirschner(同前)所提出的微管蛋白結(jié)合區(qū)(下線顯示)而言也是在相之外。
圖4對(duì)照組和AD組中的全部tau蛋白的含量，正?？扇苄詔au(白色)形式在對(duì)照組中占優(yōu)勢(shì)，而在AD組中該優(yōu)勢(shì)的tau聚合成PHF的形式(黑色)。
圖5在AD的早期，可溶性tau、磷酸化tau及纏結(jié)數(shù)的變化(Lai等，(1995)出處同前)。橫坐標(biāo)顯示PHF-tau蛋白聚積。伴隨有正?？扇苄詔au的相對(duì)喪失。磷酸化tau的首次出現(xiàn)與纏結(jié)的首次出現(xiàn)密切相關(guān)。但是，這兩者只有在tau蛋白從可溶性變?yōu)榫酆舷嗟脑俜峙浒l(fā)生后才出現(xiàn)。
圖6AD早期新生tau轉(zhuǎn)變成可溶性tau池(a)的轉(zhuǎn)化率(計(jì)算值)與可溶性tau形成PHF池的轉(zhuǎn)化率(Lai等，(1995)，出處同前)。當(dāng)可溶性tau水平低于580pmo/g時(shí)，需要不斷形成更多的新tau以趕上PHF的合成速度，并以負(fù)反饋的形式調(diào)整周圍可溶性tau水平(a)，可溶性tau轉(zhuǎn)化為PHFs的轉(zhuǎn)化速率與周圍PHF-tau水平(b)呈幾何等級(jí)關(guān)系。
圖7AD中tau蛋白轉(zhuǎn)化為PHF的假說(shuō)情況。一旦tau蛋白被固定并截?cái)?，就暴露高親合力的病理性tau捕獲位點(diǎn)。當(dāng)另一tau分子被捕獲時(shí)，只可能產(chǎn)生部分的蛋白水解，因?yàn)楦哂H合的tau-tau結(jié)合區(qū)受到保護(hù)不發(fā)生水解，剩余的另一高親合tau捕獲位點(diǎn)可以再捕獲另一tau分子。該tau蛋白池從可溶性到截形PHF結(jié)合相的再分配是由重復(fù)進(jìn)行高親合性tau捕獲和不完全水解所引起的自催化過(guò)程。
圖8測(cè)定兩個(gè)截形tau單位結(jié)合的構(gòu)型。首先將Ala-390截形的tau蛋白(“a”)涂到ELISA板上(碳酸鈉緩沖液50mM，pH9.6)。然后第二個(gè)Glu-391截形的tau蛋白(“e”)在圖9所示的多種緩沖液條件下孵育。因?yàn)橹挥小癳”這種tau能被mAb423識(shí)別，因此mAb423免疫反應(yīng)性只測(cè)定在第二次孵育期間結(jié)合的tau蛋白。
圖9“e”種tau蛋白(0或20μg/ml)與“a”種tau蛋白(0或10μg/ml)在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(“nomal”)、蒸餾水(“water”)及碳酸鈉緩沖液(“Carbonate”50mM，pH9.6)中的結(jié)合?？v坐標(biāo)表示mAb免疫反應(yīng)性，當(dāng)單獨(dú)涂“a”時(shí)，沒(méi)有免疫反應(yīng)性，因?yàn)閙Ab423不能識(shí)別“a”。當(dāng)“e”不首先與“a”板孵育時(shí)，也無(wú)免疫反應(yīng)性。這是因?yàn)樽钄嗔怂玫姆乐埂癳”非特異性結(jié)合到ELISA板上的條件。只有當(dāng)“a”和“e”都存在的條件下免疫反應(yīng)性才能顯示，這是只對(duì)結(jié)合有“a”的“e”的特定檢測(cè)的結(jié)果。當(dāng)“e”加到Na2CO3緩沖液中時(shí)無(wú)結(jié)合發(fā)生。因此該條件代表當(dāng)初用“a”涂板的最佳條件，因?yàn)樵诖藯l件下自身聚集最少。
圖10全長(zhǎng)tau(“t”)與原先已被動(dòng)結(jié)合到固相上(“a”)的截形核心tau單位進(jìn)行結(jié)合所測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)型。將對(duì)應(yīng)于核心PHF的截形tau單位的重組tau片段(“a”)在不利于tau-tau結(jié)合的條件下(圖9)在一塊ELISA板上涂成不同的濃度。鎖定后，在允許選擇性測(cè)定tau-tau結(jié)合的條件下將全長(zhǎng)重組tau(“t”)涂到板上。應(yīng)用一種適當(dāng)?shù)目贵w(該抗體能識(shí)別全長(zhǎng)tau的“N-末端附近的抗原決定基)檢測(cè)結(jié)合情況。這種抗體不能識(shí)別“a”。
圖11確定全長(zhǎng)tau(“T40”)與Ala-390處終止的截形核心tau單位進(jìn)行結(jié)合的Kd值，用mAb499測(cè)定結(jié)合的全長(zhǎng)人類tau。上圖橫坐標(biāo)表示T40的濃度，縱坐標(biāo)表示mAb499的免疫反應(yīng)性。每一結(jié)合曲線都是在所示的“a”的涂板濃度下獲得的。沒(méi)有“a”就不發(fā)生結(jié)合，證明在所用的測(cè)定條件下不存在T40的非特異性結(jié)合。結(jié)合既依賴于T40的濃度也依賴于“a”的濃度。下圖表示對(duì)應(yīng)于每一“a”涂板濃度時(shí)計(jì)算得到的Kd值。隨著“a”濃度的增加，曲線逐漸接近飽和狀態(tài)，該圖顯示使T40與截形核心tau單位結(jié)合的飽和KCl值為22.8nM。
圖12按圖10所示的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方案，將以10μg/ml涂板的“a”并加如圖所示濃度(0-50μg/ml)的T40，在恒定的pH(pH＝7.4)值而氯化鈉濃度不同的條件下測(cè)定結(jié)合情況。在生理性鹽濃度為137mM附近有一高峰。在中等鹽濃度下結(jié)合減少，但在極低鹽濃度下變得更易結(jié)合。
圖13與圖12所示的實(shí)驗(yàn)相似，保持氯化鈉濃度為137mM，但pH值在0-10間改變，在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(；PBS”pH＝7.4)中進(jìn)行結(jié)合并作比較。結(jié)果顯示，在極端pH值時(shí)的結(jié)合被降低。所示的結(jié)合可用mAb499和342檢測(cè)。
圖14這兩條曲線表示在固相中使用截形核心tau單位“a”，并應(yīng)用Biernet等(1992，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，11，1593-1597)的方法在體外孵育全長(zhǎng)tau蛋白，包括磷酸化的(T40P)和未磷酸化的tau蛋白(T40)，由此測(cè)得的典型的結(jié)合情況。在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行磷酸化使Kd值降低了10倍，但在水相和固相中的磷酸化狀態(tài)不同，磷酸化對(duì)結(jié)合阻抑作用的總體影響平均為20倍。盡管有人提出胎化狀態(tài)的磷酸化對(duì)確定病理性tau-tau結(jié)合很重要，但大鼠胚胎tau(“POTr”)引入水相時(shí)不能與核心tau單位發(fā)生病理性結(jié)合。
圖15與圖14相反，胚胎tau被動(dòng)結(jié)合到固相后，能結(jié)合全長(zhǎng)非磷酸化的tau。在A中顯示一組典型的結(jié)合曲線，全長(zhǎng)tau(T40)濃度和胚胎tau(“PO Tau”)的濃度在如圖所示的范圍內(nèi)變化。B中顯示了Kd的漸近曲線。伴隨全長(zhǎng)tau與截形核心tau單位的結(jié)合，全長(zhǎng)tau與固定的胚胎tau的結(jié)合有相同的Kd值，大約為20nM。因此，簡(jiǎn)單地通過(guò)被動(dòng)聚結(jié)到固相上，可將胚胎tau轉(zhuǎn)變?yōu)閠au結(jié)合形式，該胚胎tau當(dāng)存在于水相時(shí)不與tau發(fā)生結(jié)合(圖14)。因此說(shuō)明tau與固相基質(zhì)的被動(dòng)結(jié)合暴露高親和的tau捕獲位點(diǎn)。
圖16用含水相或固相的幾種tau蛋白測(cè)定tau-tau結(jié)合時(shí)的Kd值比較。水相中全長(zhǎng)重組tau的磷酸化可使其結(jié)合作用抑制10倍，胚胎或新生鼠的tau不發(fā)生結(jié)合，如圖14所示。當(dāng)固相中用新生tau時(shí)，T40以相同的親和力結(jié)合截形tau核心PHF單位。T40在水相中的磷酸化對(duì)結(jié)合產(chǎn)生30倍的抑制作用。新生tau在固相中的高磷酸化也有相當(dāng)程度的抑制作用，在該兩種相中高磷酸化均可產(chǎn)生50倍抑制作用。因此與磷酸化假說(shuō)相反，磷酸化抑制了本測(cè)定的所有情況下tau蛋白的病理性自身聚集。
圖17聚集的全長(zhǎng)tau蛋白水解消化過(guò)程。(A)全長(zhǎng)tau(20μg/ml)與dGA(20μg/ml)在PBS中結(jié)合，清洗，并與鏈霉蛋白酶在水中按圖所示濃度孵育5分鐘。免疫反應(yīng)性用mAb 342(▲)、499(o)和423(·)測(cè)定。(B)全長(zhǎng)tau(10μg/ml)(該tau在固相中沒(méi)有dGA存在時(shí)產(chǎn)生自身聚集)經(jīng)簡(jiǎn)單消化后用mAb342(▲)和423(·)測(cè)定其免疫反應(yīng)性。在上述兩種情況下，mAb′s499或(和)342的蛋白酶濃度依賴性的免疫反應(yīng)性丟失，同時(shí)得到mAb423免疫反應(yīng)性。(c)簡(jiǎn)略描述了A的結(jié)果。先將截形dGA涂在孵育過(guò)的固相上，與具有高親和力的全長(zhǎng)tau經(jīng)重復(fù)區(qū)的相互作用發(fā)生結(jié)合。兩種蛋白在消化前都缺乏mAb423抗原決定簇。蛋白水解消化的復(fù)合物(點(diǎn)線)去除了全長(zhǎng)tau蛋白的N-末端部分，丟失了所示位置的mAb499和342抗原決定簇。mAb423免疫反應(yīng)性的獲得表示全長(zhǎng)tau在Glu-391處截?cái)?。蛋白水解穩(wěn)定的復(fù)合物在N-末端的確切范圍尚不清楚，但可確定其不包括緊鄰重復(fù)區(qū)的mAb342抗原決定簇，而應(yīng)包括tau結(jié)合區(qū)。
圖18通過(guò)重復(fù)tau捕獲積累截形tau蛋白。以固相中截形tau蛋白片段(dGA 20μg/ml)開(kāi)始，結(jié)合全長(zhǎng)重組人類tau(20μg/ml)，用鏈霉蛋白酶(1ng/ml)消化5分鐘，洗脫，然后再與另一全長(zhǎng)tau(20μg/ml)一起孵育，再次消化。該結(jié)合/消化的循環(huán)重復(fù)四次；前后各測(cè)定mAb499的免疫反應(yīng)性，每次用鏈霉蛋白酶消化后測(cè)定mAb423活性。(A)伴隨每一消化循環(huán)而發(fā)生的復(fù)合物鏈霉蛋白酶消化作用，與Glu-391截形蛋白在固相中積累增加的關(guān)系。(B)通過(guò)顯示N-末端tau(mAb499)免疫反應(yīng)性檢測(cè)全長(zhǎng)tau的結(jié)合，經(jīng)鏈霉蛋白酶消化后這樣的結(jié)合完全消除。隨后的孵育循環(huán)中，在水相恒定濃度中孵育的全長(zhǎng)tau結(jié)合能力增加。循環(huán)后剩余的免疫反應(yīng)性不能解釋mAb499免疫活性的增加。因此經(jīng)鏈霉蛋白酶消化后的蛋白水解穩(wěn)定的復(fù)合物保持了與其它tau結(jié)合的能力，并且這種結(jié)合能力隨截形tau在固相的聚積而增加。
圖19原形抑制性酚噻嗪濃度增加時(shí)(橫坐標(biāo))相對(duì)的tau-tau結(jié)合情況(縱軸)。這種抑制作用用標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制模式表示，計(jì)算值Ki為98-108nM。這些近似值之間的相關(guān)系數(shù)為0.99，這一系數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是很高的(如圖所示)。
圖20硫堇對(duì)tau-tau結(jié)合的選擇性抑制。如圖實(shí)圈所示在液相和固相測(cè)定中各用489nM的截形tau蛋白。在該tau-微管蛋白測(cè)定中，用解聚的微管蛋白以200nM(濃度)涂板(空圈)，tau在400nM濃度下孵育。結(jié)合的數(shù)據(jù)用數(shù)學(xué)上的標(biāo)準(zhǔn)模式描述，該模式假定在高親和力的tau俘獲位點(diǎn)存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Ki值用Kd值來(lái)計(jì)算。Kd值是用全長(zhǎng)tau時(shí)從相應(yīng)的結(jié)合情況獲得。圖上的各點(diǎn)數(shù)據(jù)代表四次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值。
圖21人類tau蛋白同型體的核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。該序列從人類tau40(htau40)cDNA克隆推測(cè)，與前面確定的三重復(fù)形式(Goedert等(1988)，出處同前)不同的是該序列在氨基末端區(qū)(下劃線)插入額外58個(gè)氨基酸重復(fù)結(jié)構(gòu)，以及一個(gè)前述(Goedert等(1989歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，8，393-399))的31個(gè)氨基酸組成的額外重復(fù)結(jié)構(gòu)(下劃線)，核酸按5′→3′方向編碼。htau40cDNA克隆(Goedert等(1989b)，神經(jīng)元，3，519-526)包含的上述這一序列是插入一個(gè)Ndel位點(diǎn)(5′端)和一個(gè)3′端的EcoRl位點(diǎn)到該克隆的終止(***)。
圖22氨基酸和cDNA序列的PHF核心tau單位(SEQ ID NO6；Novak等(1993)，出處同上)，以及構(gòu)成優(yōu)選的核心tau單位所用的引物(SEQ IDNO7和8)。
圖23化合物抑制tau-tau相互結(jié)合的等級(jí)。該等級(jí)以相對(duì)于不用化合物時(shí)所顯示的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合為基礎(chǔ)來(lái)劃分，取濃度為1或10μg/ml時(shí)的平均值。該等級(jí)中“1”相當(dāng)于無(wú)該化合物存在時(shí)的結(jié)合情況，而“0.2”表示聚結(jié)降至被測(cè)物濃度為1和10μg/ml時(shí)結(jié)合被抑制20％的平均值。因此該值越低表明化合物對(duì)于e和a兩種結(jié)合的抑制越有效。如圖所示，前5種酚噻嗪標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合系數(shù)低于0.4，也就是說(shuō)1-10μg/ml范圍內(nèi)的結(jié)合比在無(wú)該化合物存在時(shí)的結(jié)合少40％。
圖24根據(jù)圖17的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合所測(cè)試的這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖25代表tau蛋白、MAP2(成人形式)、MAP2c(青少年形式)及高分子量tau(在外周神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的)的簡(jiǎn)圖。這些蛋白都具有相似的微管結(jié)合區(qū)，但N-末端區(qū)的序列和范圍有顯著不同。青少年形式的tau與MAP2只有3個(gè)前后重復(fù)結(jié)構(gòu)。MAP2中也存在4-重復(fù)形式。
圖26人類tau(上線，SEQ ID NO9)與人MAP2(下線，SEQ ID NO10)的前后重復(fù)區(qū)的序列差別?？v箭頭顯示Glu-391末端的截形PHF核心片段的界線。微管蛋白結(jié)合區(qū)用下劃線表示。
圖27pIF2表達(dá)載體是以SV40為基礎(chǔ)的真核細(xì)胞表達(dá)載體(pSV2neo；Sambrook等，(1989)，出處同前；SEQ ID NO11和12經(jīng)修飾后包含一個(gè)啟動(dòng)外源DNA表達(dá)的β-珠蛋白啟動(dòng)子(M.N.Neuberger)。該載體具有遺傳霉素選擇用的抗新霉素標(biāo)記。
圖28轉(zhuǎn)染PIF2∷740的小鼠成纖維細(xì)胞3T3，表達(dá)全長(zhǎng)人類tau蛋白(T40)，用mAb7.51(上圖)和mAb499(下圖)進(jìn)行免疫標(biāo)記。細(xì)胞形成細(xì)長(zhǎng)的過(guò)程，能看到tau免疫反應(yīng)性在核周體內(nèi)有細(xì)胞骨架的分配。
圖29轉(zhuǎn)染PIF∷dGAE的小鼠成纖維細(xì)胞3T3，表達(dá)Glu-391截形PHF核心tau片段，用mAb7.51作免疫標(biāo)記。早期轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在無(wú)硫堇下生長(zhǎng)。細(xì)胞總體異常、多核、形成空泡、胞質(zhì)中含有tau蛋白聚集。
圖30脂質(zhì)轉(zhuǎn)染/tau蛋白轉(zhuǎn)移至PIF2T40轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞內(nèi)。顯示不含(無(wú)陰影)或含(陰影)3.5μM硫堇時(shí)，加入大約等摩爾濃度的全長(zhǎng)tau(T40，220nM)和截形tau(dGAE，300nM)時(shí)的相對(duì)細(xì)胞存活情況(相對(duì)于不用蛋白處理的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染后正常細(xì)胞計(jì)數(shù))，如圖所示。截形tau比全長(zhǎng)tau毒性更大(p＝0.02)，盡管摩爾濃度相同，但全長(zhǎng)tau比截形tau的總蛋白重大5倍。
圖31(A)截形tau毒性的逆轉(zhuǎn)截形tau的毒性經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移至表達(dá)全長(zhǎng)tau的3T3細(xì)胞，這種毒性是具有濃度依賴性的。與無(wú)硫堇(虛線)相比，硫堇(實(shí)線)存在時(shí)所有三種截形tau濃度下的毒性顯著逆轉(zhuǎn)。(B)在類似的實(shí)驗(yàn)中將全長(zhǎng)tau經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)至表達(dá)全長(zhǎng)tau的3T3細(xì)胞中。tau毒性和硫堇的作用都大大降低。
以下實(shí)施例用以解釋本發(fā)明的具體細(xì)節(jié)，并非由此而限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1tau-tau結(jié)合的測(cè)定本測(cè)定是在一個(gè)96孔的PVC微量滴定板上進(jìn)行的，所加溶液及取得的讀數(shù)均按各個(gè)孔而定。
a)將50μl純化的截形tau肽，以50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中的0+50μg/ml(0，1，5，10，50μg/ml)不同濃度加到各孔并在37℃下孵育1小時(shí)，b)用水(含或不含0.05％吐溫)清洗微量滴定板的孔3次。
c)將200μl 2％的牛奶提取物溶液(“Marvel”)與磷酸鹽緩沖生理鹽水(“PBS”，137mM氯化鈉，1.47mM磷酸二氫鉀，8.1mM磷酸氫二鈉，2.68mM氯化鉀)混和加到各孔并在37℃下孵育1小時(shí)。
d)如b)所示清洗加樣板。
e)將50μl全長(zhǎng)重組tau在1％明膠、0.05％吐溫的PBS中的溶液按上面a)中相同的濃度范圍加到各個(gè)孔中，并在37℃下孵育1小時(shí)。
f)如b)所示清洗加樣板。
g)將50μl單抗499(mAb499)以1/2稀釋的組織培養(yǎng)上清液與含2％牛奶提取物(“Marvel”)的PBS一起加到各孔，并在37℃孵育1小時(shí)。
h)如b)所示清洗加樣板。
i)將50μl二抗(用印記法親和純化的山羊抗小鼠IgG(H+L)與辣根過(guò)氧化物酶-Biorad分類號(hào)170-6516結(jié)合)與1/1000稀釋的含0.05％吐溫的PBS一起加到各孔中，37℃孵育1小時(shí)。
j)用0.05％吐溫水溶液洗3次板，再用水洗一次。
k)顯色溶液的配制如下在二甲基亞砜中溶解10-15mg3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，BCL分類號(hào)784 974)至終濃度為10mg/ml(TMB溶液)。加10mL乙酸鈉的基料(0.5M，pH5.0)至90mL水中，攪拌并慢慢加1mL TMB溶液，再加10μl過(guò)氧化氫。
l)將50μl TMB溶液加入各孔使其發(fā)生過(guò)氧化物酶顯色反應(yīng)，應(yīng)用動(dòng)力學(xué)L1 softmax軟件包在650nm處，用分子微盤讀數(shù)儀顯示其顯色速度超過(guò)2分鐘。實(shí)施例2重組tau片段的制備Tau-cDNA是用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sombrook等，出處同前)由死后3小時(shí)的AD患者腦組織中分離的mRNA制備的。應(yīng)用合成的17個(gè)單元聚合的寡核苷酸探針檢測(cè)cDNA文庫(kù)，該探針來(lái)自部分PHF核心蛋白序列(Goedert等，(1988)，出處同前)。全長(zhǎng)cDNA的克隆被亞克隆到M13mp18的EcoRI位點(diǎn)并用定位誘變并在啟動(dòng)密碼子鄰近介入NdeI位點(diǎn)。將NdeI和EcoRI切割后產(chǎn)生的cDNA片段在T7RNA聚合酶啟動(dòng)子下游亞克隆到NdeI/EcoRI切割表達(dá)質(zhì)粒pBK172中(Mclcod等(1987)，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，6，729-736)。pRK172來(lái)自pBR322，它是在大腸桿菌中以高考貝數(shù)增殖以便消除pBR322拷貝數(shù)控制區(qū)。該質(zhì)粒攜帶抗氨芐青霉素基因，可用于選擇重組克隆。
編碼截形tau的結(jié)構(gòu)來(lái)自Novak等所述的mRNA(1993，出處同前)。用該mRNA作為PCR模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，應(yīng)用特定的寡核苷酸作引物。有義引物含有-個(gè)NdeI位點(diǎn)和反義引物含有EcoRI切點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增片段亞克隆到上述pRK172中。用于擴(kuò)增dGAE的引物序列由圖22給出。用于表達(dá)全部DNA片段的真實(shí)性由雙股全長(zhǎng)序列確定。
構(gòu)建htau40(T40)cDNA的具體細(xì)節(jié)在Goedert等的文章(1989，出處同前)中有報(bào)道，該序列是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的最大形式的tau序列并且它編碼tau蛋白，該tau蛋白的N-末端各含29個(gè)氨基酸的插入子和在微管蛋白結(jié)合區(qū)含31個(gè)氨基酸構(gòu)成的額外重復(fù)結(jié)構(gòu)。該DNA序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列見(jiàn)圖21(SEQ ID NO4)。
重組質(zhì)粒用以轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)，一種用于原核生物表達(dá)的菌株。該質(zhì)粒攜帶有一個(gè)在lacUV5啟動(dòng)子調(diào)控下的噬菌體T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝(Studier，Moffat(1986)，分子生物學(xué)雜志，189，113-130)。呈指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基用IPTG(異丙基硫半乳糖苷)誘導(dǎo)3小時(shí)。
大規(guī)模純化(1升細(xì)胞培養(yǎng)基)tau片段可用Goedert和Jakes所述的方法進(jìn)行(1990，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志，9，4225-4230)，可略作調(diào)整。在液氮中速凍細(xì)胞團(tuán)以破裂細(xì)胞，該細(xì)胞團(tuán)懸浮在含50mM PIPES及1mMDTT(pH6.8)的緩沖液中。熱穩(wěn)定蛋白在上清液中用PIPES/DTT透析，然后加到一在相同的緩沖液中平衡過(guò)的磷酸纖維素柱中。用含氯化鈉(0-0.5M)的上述緩沖液洗脫tau蛋白，用SDS-PAGE和Coomassie染色法及免疫雜交法分析洗脫后的各級(jí)分，將這些含有tau的級(jí)分混合后用25mM MES、1mMDTT(pH6.25)透析，并以約5mg/ml的濃度存放在-20℃，蛋白濃度用Lowry法測(cè)定(Harrington(1990)，出處同前)。實(shí)施例3胚胎MAP2C與截形或全長(zhǎng)tau進(jìn)行結(jié)合PHFs中缺乏MAP2的一個(gè)可能解釋為MAP2在PHFs中不能與PHF的核心tau單位結(jié)合，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥貜?fù)區(qū)的序列不同。這已用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法用2種組成成分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在固相中的截形tau與在液相中的胚胎MAP2C，以及固相中的MAP2C與液相中的全長(zhǎng)tau。這兩種情況都出現(xiàn)了結(jié)合，硫堇可以阻斷tau/MAP2結(jié)合。因此，在前后重復(fù)區(qū)的聚集不是選擇tau，酚噻嗪抑制劑(例如硫堇)的抑制活性不依賴于tau序列。MAPs為什么不存在于PHFs的確切原因目前尚不清楚，可能包括如下因素成人型MAP2中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)N-末端區(qū)的構(gòu)成；細(xì)胞內(nèi)腔隙的差異；或MAP2分子形成過(guò)程中的其它差異。實(shí)施例4人類tau蛋白轉(zhuǎn)染小鼠3T3細(xì)胞在β-珠蛋白啟動(dòng)子控制下，用含有全長(zhǎng)或截形tau蛋白的真核生物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞3T3。該載體含有抗新霉素基因，可以作為選擇性標(biāo)記(PSV2neo；Sambrook等(1989)，出處同前，M.N.Neuberger改進(jìn))。細(xì)胞培養(yǎng)在含抗微生物制劑和10％小牛胚胎血清的DMEM中進(jìn)行，37℃含5％CO2的環(huán)境。用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣配方或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(生產(chǎn)手冊(cè)，Gibco BRL)來(lái)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA。具有完整質(zhì)粒DNA的細(xì)胞用含遺傳霉素(0.5mg/ml；Southern和Berg(1982)，分子遺傳學(xué)與應(yīng)用遺傳學(xué)雜志，1，327)的培養(yǎng)基篩選。
表達(dá)全長(zhǎng)tau蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3成纖維細(xì)胞很容易制備。蛋白的表達(dá)可以用一般的(mAb7.51)和人類特異性的(mAB499)抗tau抗體來(lái)顯示(圖28)，或通過(guò)細(xì)胞提取物免疫雜交法(未表示)顯示。用攜帶截形核心tau單位的相同載體轉(zhuǎn)染后可形成2個(gè)活性細(xì)胞株。截形tau能在這些細(xì)胞中表達(dá)，但這些細(xì)胞的形態(tài)異常與表達(dá)全長(zhǎng)tau的細(xì)胞有所不同(圖29)。該細(xì)胞異常包括細(xì)胞發(fā)展停止、長(zhǎng)園細(xì)胞形成、細(xì)胞質(zhì)中聚集tau、胞質(zhì)出現(xiàn)空泡。但這些細(xì)胞是不穩(wěn)定的，若無(wú)遺傳霉素存在，易逆轉(zhuǎn)為非tau蛋白表達(dá)的形式。截形tau的毒性可用細(xì)胞中毒性tau-tau結(jié)合或截形tau與內(nèi)源性小鼠MAPs結(jié)合來(lái)解釋，該內(nèi)源性MAPs是細(xì)胞所必需的。實(shí)施例5tau轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在酚噻嗪抑制劑中的生長(zhǎng)如果原形酚噻嗪抑制劑能在體內(nèi)阻斷自身聚集，截形核心tau單位的毒性可以部分的逆轉(zhuǎn)。只有當(dāng)該化合物在鎖定tau-tau結(jié)合所需的濃度下不具有內(nèi)源性毒性時(shí)才可能實(shí)現(xiàn)毒性逆轉(zhuǎn)。對(duì)3T3細(xì)胞毒性最低的抑制劑是硫堇和吖啶黃。當(dāng)3T3細(xì)胞延長(zhǎng)暴露于這些化合物時(shí)(其濃度顯著超出Ki值(100nM)時(shí)在體外抑制tau-tau結(jié)合)，仍能存活。實(shí)際上，3T3細(xì)胞在2μM硫堇中能存活數(shù)月。
通過(guò)在一定濃度范圍的硫堇中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了全長(zhǎng)tau蛋白的3T3成纖維細(xì)胞，可以檢測(cè)硫堇在體內(nèi)對(duì)tau-微管蛋白結(jié)合的影響，在濃度為4-8μM時(shí)，可以見(jiàn)到tau免疫反應(yīng)性的正常細(xì)胞骨架分布與體外實(shí)驗(yàn)中已知的抑制tau-微管蛋白結(jié)合的Ki具有可比性(8μM)，但在3T3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)濃度范圍(0.5-2μM)內(nèi)不產(chǎn)生作用。這些發(fā)現(xiàn)表明在原形抑制劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株而不損傷細(xì)胞活性和全長(zhǎng)tau蛋白正常細(xì)胞骨架分布的可能性。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞在tau-tau結(jié)合抑制劑存在時(shí)的生長(zhǎng)，以劑量依賴性的形式增加了轉(zhuǎn)染截形tau細(xì)胞的活性。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在高濃度硫堇環(huán)境中時(shí)轉(zhuǎn)染了截形tau的活性細(xì)胞株數(shù)量增加，而且截形tau表達(dá)的強(qiáng)度(可用免疫組化法以半定量的方式測(cè)定)也有所增加。
當(dāng)在硫堇存在下轉(zhuǎn)染細(xì)胞株時(shí)，3T3細(xì)胞的形態(tài)及截形tau蛋白的分布很少發(fā)生異常，截形tau蛋白的出現(xiàn)與內(nèi)生的微管蛋白網(wǎng)絡(luò)一致，但該tau蛋白染色比全長(zhǎng)tau更易被破壞。當(dāng)去除硫堇后，截形tau高表達(dá)的細(xì)胞與細(xì)胞胞質(zhì)碎片形成聚集物，這與缺乏硫堇時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的最初表現(xiàn)一致。實(shí)施例6未轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元細(xì)胞株神經(jīng)元細(xì)胞株(N2A，NIE-115)在含有2％或10％小牛胎胚血清和5％馬血清的DMEM中，在涂有膠原的組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)，5％CO2、37℃。轉(zhuǎn)染之前先對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞株進(jìn)行免疫組化研究，以明確胞質(zhì)與mAb423的聚集免疫反應(yīng)性，經(jīng)用二丁酰環(huán)腺苷酸(db-cAMP在組織培養(yǎng)中來(lái)自分化的神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞)簡(jiǎn)單處理后，該mAb423在未分化的神經(jīng)母細(xì)胞(N2A細(xì)胞)的胞質(zhì)和PC-12細(xì)胞中產(chǎn)生。這些結(jié)構(gòu)與識(shí)別神經(jīng)微絲蛋白的抗體具有免疫反應(yīng)性(NFH；SMI-31，Sternberger等(1985)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院匯刊，82，4274-4276)，與MAP1A識(shí)別抗體具有更少的免疫反應(yīng)性，該識(shí)別抗體可與神經(jīng)微絲結(jié)合。分化過(guò)程中內(nèi)源性mAb423免疫反應(yīng)性由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到軸突。從這些細(xì)胞的mAb423免疫反應(yīng)性發(fā)生免疫沉淀作用導(dǎo)致有230KDa的凝膠活動(dòng)性tau種類的識(shí)別，該tau可被SMI-31識(shí)別。這些結(jié)果提示在嚙齒類神經(jīng)原細(xì)胞株中可被mAb423識(shí)別的結(jié)構(gòu)包括高分子量聚集狀態(tài)的神經(jīng)微絲蛋白，但也不排出除包含有變態(tài)MAPs的可能性，因此我們稱之為假定的NFH聚集(PNFH)。PNFH在胞質(zhì)中聚集的劑量依賴性抑制作用可在未轉(zhuǎn)染的PC-12細(xì)胞中通過(guò)硫堇顯示。實(shí)施例7用全長(zhǎng)和截形tau蛋白轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞株及tau聚集抑制劑的效用A.PC-12細(xì)胞PC-12細(xì)胞用PIF2載體轉(zhuǎn)染，該載體包含有Glu-391截形的PHF-核心tau片段或全長(zhǎng)tau蛋白。與3T3成纖維細(xì)胞一樣，轉(zhuǎn)染后若不在硫堇中生長(zhǎng)，將無(wú)轉(zhuǎn)染的截形tau的活性細(xì)胞存在。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株在有或無(wú)dbcAMP和有或無(wú)硫堇的情況下進(jìn)行分析，檢測(cè)兩個(gè)終點(diǎn)胞質(zhì)PNFH聚結(jié)的形成及PNFH免疫反應(yīng)性分布到軸突。
與db-cAMP簡(jiǎn)單孵育可使細(xì)胞中神經(jīng)微絲聚集的含量從9％增加至37％(P＜0.001)，在截形tau轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也可見(jiàn)到這種效應(yīng)(由10％增加到47％，P＜0.001)，而截形tam本身的鑒別效果很明顯(P＝0.005)。相對(duì)于db-cAMP來(lái)說(shuō)，用截性tau轉(zhuǎn)染促進(jìn)了PNFH聚集的形成。
db-cAMP處理后抽出硫堇能使細(xì)胞PNFH聚集的頻率加倍。(由27％到49％，P＝0.05)，這用效應(yīng)可見(jiàn)于用全長(zhǎng)tau轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(16％到32％)和截形tau轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(36％到60％)。另一效應(yīng)是硫堇依賴性的PNFH免疫反應(yīng)性轉(zhuǎn)至軸突。這種情況在轉(zhuǎn)染有截形tau而非轉(zhuǎn)染有全長(zhǎng)tau蛋白的PC-12細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中特別明顯(pNFH-軸突指數(shù)在有或無(wú)硫堇時(shí)分別為0.49對(duì)0.04，P＝0.07)。B.NIE-115細(xì)胞一般說(shuō)來(lái)，在N2A細(xì)胞質(zhì)中所見(jiàn)的pNFH聚集不發(fā)生在未轉(zhuǎn)染的NIE細(xì)胞中，而pNFH免疫反應(yīng)性在分化過(guò)程中通常體現(xiàn)在成長(zhǎng)期軸突中，盡管在早期的核周弧中也能見(jiàn)到。NIE細(xì)胞用含有全長(zhǎng)或截形tau蛋白的pIF2載體轉(zhuǎn)染，并在硫堇中生長(zhǎng)。然后，檢測(cè)有或無(wú)硫堇時(shí)加入db-cAMP的效應(yīng)。
與PC-12細(xì)胞一樣，NIE細(xì)胞在缺乏硫堇時(shí)，無(wú)截形tau轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定NIE細(xì)胞存在。轉(zhuǎn)染截形tau的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)tau的細(xì)胞相比，在胞質(zhì)中pNFH聚集顯著升高(由9％對(duì)26％，P＜0.001)。與db-cAMP一起孵育時(shí)可在轉(zhuǎn)染截形tau的細(xì)胞中產(chǎn)生pNFH聚集而不在轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)tau的細(xì)胞中產(chǎn)生(0％對(duì)36％P＜0.001)。
在全長(zhǎng)tau轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中硫堇的存在不干擾轉(zhuǎn)基因tau蛋白進(jìn)入微管細(xì)胞骨架，包括微管形成中心、分散的胞質(zhì)分布并擴(kuò)散至軸突。在轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)tau的細(xì)胞中撤回硫堇可增加pNFH聚積的含量(7％對(duì)16％，P＝0.03)。在轉(zhuǎn)染截形tau的細(xì)胞中撤出硫堇可導(dǎo)致特定細(xì)胞株中pNFH的聚積增加(如NIE-ND6，14％對(duì)44％P＝0.07)，并抑制分化。這種現(xiàn)象以前只在未分化N2A細(xì)胞中出現(xiàn)而不在NIE細(xì)胞中出現(xiàn)。
與PC-12細(xì)胞一樣，pNFH進(jìn)入軸突的硫堇依賴性體現(xiàn)能在特定細(xì)胞中(例如NIE-NDI，pNFH-軸突指數(shù)在有無(wú)硫堇時(shí)分別為0.1對(duì)0.66，P＝0.01)用db-cAMP處理后顯示。pNFH轉(zhuǎn)至軸突的硫堇依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)可被定量地看作是有硫堇存在時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中胞質(zhì)和軸突神經(jīng)微絲NHF免疫反應(yīng)性之間關(guān)系的回復(fù)。(有或無(wú)硫堇時(shí)分別為r＝-0.52對(duì)r＝+0.52，P＝0.01及0.02)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)洲BS(E)國(guó)家瑞士(F)郵編(ZIP)CH-4070(G)電話061-688 51 08(H)傳真061-688 13 95(I)電報(bào)962292/965542 hlr ch(ii)發(fā)明題目Tau-Tau蛋白結(jié)合的抑制(iii)序列數(shù)12(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介形式軟盤(B)計(jì)算機(jī)相容的IBM PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，版本號(hào)1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp20 25 30
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His35 40 45Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe50 55 60Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His65 70 75 80Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe85 90 95Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu100 105(2)SEQ ID NO2的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度108個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp20 25 30Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu50 55 60Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn100 105(2)SEQ ID NO3的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)股形(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys1 5 10 15His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp20 25 30Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His35 40 45Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe50 55 60Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His65 70 75 80Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe85 90 95Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu100 105(2)SEQ ID NO4的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1326個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1-1326(xi)序列描述SEQ ID NO4ATG GCT GAG CCC CGC CAG GAG TTC GAA GTG ATG GAA GAT CAC GCT GGG 48Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly1 5 10 15ACG TAC GGG TTG GGG GAC AGG AAA GAT CAG GGG GGC TAC ACC ATG CAC 96Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His20 25 30CAA GAC CAA GAG GGT GAC ACG GAC GCT GGC CTG AAA GAA TCT CCC CTG 144Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu35 40 45CAG ACC CCC ACT GAG GAC GGA TCT GAG GAA CCG GGC TCT GAA ACC TCT 192Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser50 55 60GAT GCT AAG AGC ACT CCA ACA GCG GAA GAT GTG ACA GCA CCC TTA GTG 240Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val65 70 75 80GAT GAG GGA GCT CCC GGC AAG CAG GCT GCC GCG CAG CCC CAC ACG GAG 288Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu85 90 95ATC CCA GAA GGA ACC ACA GCT GAA GAA GCA GGC ATT GGA GAC ACC CCC 336Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro100 105 110AGC CTG GAA GAC GAA GCT GCT GGT CAC GTG ACC CAA GCT CGC ATG GTC 384Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val115 120 125AGT AAA AGC AAA GAC GGG ACT GGA AGC GAT GAC AAA AAA GCC AAG GGG 432Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly130 135 140GCT GAT GGT AAA ACG AAG ATC GCC ACA CCG CGG GGA GCA GCC CCT CCA 480Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro145 150 155 160GGC CAG AAG GGC CAG GCC AAC GCC ACC AGG ATT CCA GCA AAA ACC CCG 528Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro165 170 175CCC GCT CCA AAG ACA CCA CCC AGC TCT GGT GAA CCT CCA AAA TCA GGG 576Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Glyl80 185 190GAT CGC AGC GGC TAC AGC AGC CCC GGC TCC CCA GGC ACT CCC GGC AGC 624Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser195 200 205CGC TCC CGC ACC CCG TCC CTT CCA ACC CCA CCC ACC CGG GAG CCC AAG 672Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys210 215 220AAG GTG GCA GTG GTC CGT ACT CCA CCC AAG TCG CTG TCT TCC GCC AAG 720Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys225 230 235 240AGC CGC CTG CAG ACA GCC CCC GTG CCC ATG CCA GAC CTG AAG AAT GGC 768Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Gly245 250 255AAG TCC AAG ATC GGC TCC ACT GAG AAC CTG AAG CAC CAG CCG GGA GGC 816Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly260 265 270GGG AAG GTG CAG ATA ATT AAT AAG AAG CTG GAT CTT AGC AAC GTC CAG 864Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln275 280 285
TCC AAG TGT GGC TCA AAG GAT AAT ATC AAA CAG GTC CCG GGA GGC GGC 912Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly290 295 300AGT GTG CAA ATA GTC TAC AAA CCA GTT GAC CTG AGC AAG GTG ACC TCC 960Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser305 310 315 320AAG TGT GGC TCA TTA GGC AAC ATC CAT CAT AAA CCA GGA GGT GGC CAG 1008Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln325 330 335GTG GAA GTA AAA TCT GAG AAG CTT GAC TTC AAG GAC AGA GTC CAG TCG 1056Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser340 345 350AAG ATT GGG TCC CTG GAC AAT ATC ACC CAC GTC CCT GGC GGA GGA AAT 1104Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn355 360 365AAA AAG ATT GAA ACC CAC AAG CTG ACC GTC CGC GAG AAC GCC AAA GCC 1152Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala370 375 380AAG ACA GAC CAC GGG GCG GAG ATC GTG TAC AAG TCG CCA GTG GTG TCT 1200Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser385 390 395 400GGG GAC ACG TCT CCA CGG CAT CTC AGC AAT GTC TCC TCC ACC GGC AGC 1248Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser405 410 415ATT GAC ATG GTA GAC TCG CCC CAG CTC GCC ACG CTA GCT GAC GAG GGG 1296Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly420 425 430TCT GCC TCC CTG GCC AAG CAG GGT TTG TGA 1326Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu *435 440(2)SEQ ID NO5的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度442個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly1 5 10 15Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His20 25 30Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu35 40 45Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser50 55 60Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val65 70 75 80Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu85 90 95Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro100 105 110Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val115 120 125Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly130 135 140Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro145 150 155 160Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro165 170 175Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly180 185 190Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser195 200 205Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys210 215 220Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Leu Ser Ser Ala Lys225 230 235 240Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Lau Lys Asn Gly245 250 255Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly260 265 270Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln275 280 285Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys Gln Val Pro Gly Gly Gly290 295 300Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser305 310 315 320Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln325 330 335Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser340 345 350Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Val Arg Glu Asn Ala Lys Ala370 375 380Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser385 390 395 400Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser405 410 415Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Gly420 425 430Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu435 440(2)SEQ ID NO6的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度291個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6ATCAAACACG TCCCGGGAGG CGGCAGTGTG CAAATAGTCT ACAAACCAGT TGACCTGAGC 60AAGGTGACCT CCAAGTGTGG CTCATTAGGC AACATCCATA AACCAGGAGG TGGCCAGGTG 120GAAGTAAAAT CTGAGAAGCT TGACTTCAAG GACAGAGTCC AGTCGAAGAT TGGGTCCCTG 180GACAATATCA CCCACGTCCC TGGCGGAGGA AATAAAAAGA TTGAAACCCA CAAGCTGACC 240TTCCGCGAGA ACGCCAAAGC CAAGACAGAC CACGGGGCGG AGTGAGAATT C 291(2)SEQ ID NO7的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCCGGGCCC CATAGATCAA ACACGTCCCG GGAGGCGGCA GTGTGCAA 48(2)SEQ ID NO8的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8AGATTACAGA ATTCTCACTC CGCCCCGTGG TCTGTCTTGG CTTTGGC 47(2)SEQ ID NO9的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys1 5 10 15His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp20 25 30Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu50 55 60Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val100 105 110Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg115 120 125Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu130 135 140(2)SEQ ID NO10的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股形(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Asp Asn Ile Lys1 5 10 15Tyr Gln Pro Lys Gly Gly Gln Val Arg Ile Leu Asn Lys Lys Ile Asp20 25 30Phe Ser Lys Val Gln Ser Arg Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His35 40 45Ser Ala Gly Gly Gly Asn Val Gln Ile Val Thr Lys Lys Ile Asp Leu50 55 60Ser His Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Lys Asn Ile Arg His Arg65 70 75 80Pro Gly Gly Gly Arg Val Lys Ile Glu Ser Val Lys Leu Asp Phe Lys85 90 95Glu Lys Val Gln Ala Lys Val Gly Ser Leu Asp Asn Ala His His Val100 105 110Pro Gly Gly Gly Asn Val Lys Ile Asp Ser Gln Lys Leu Asn Phe Arg115 120 125Glu His Ala Lys Ala Arg Val Asp His Gly Ala Glu130 135 140(2)SEQ ID NO11的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述序列號(hào)11CGCGACGCGT ATGATCAAAC ACGTCCCGGG AGGC 34(2)SEQ ID NO12的序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股形單股(D)拓樸結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CGGCTTTGTC TGGTGCCCCG CCTCACTCCT AGGGCGC3權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)或抑制tau-tau蛋白結(jié)合制劑的篩選方法，包括a)一種tau蛋白或其含有tau核心片段的衍生物與b)一種推測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合的制劑和c)一種能結(jié)合tau蛋白的標(biāo)記的tau蛋白或其標(biāo)記的衍生物接觸，或與一種有別于a)中tau蛋白的并能結(jié)合tau蛋白的tau蛋白或其衍生物進(jìn)行接觸，以及d)檢測(cè)tau-tau結(jié)合
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過(guò)將一種解聚的微管蛋白制劑或微管蛋白制劑與b)和c)中定義的化合物接觸，然后檢測(cè)tau-微管蛋白的結(jié)合情況，以確定tau與微管蛋白的結(jié)合。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于步驟a)的蛋白是結(jié)合到固相的。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于與固相的結(jié)合是在一種pH值為9-10的堿性緩沖液中進(jìn)行。
5.權(quán)利要求3的方法，其特征在于tau蛋白或其片段結(jié)合后剩余的結(jié)合位點(diǎn)由一阻斷劑阻斷。
6.權(quán)利要求1-2中的方法，其特征在于步驟b)中的制劑和c)中的tau蛋白在液相中與步驟a)中的蛋白一起孵育。
7.權(quán)利要求1-6中的方法，其特征在于tau-tau結(jié)合是在50-400mM氯化鈉或有類似的離子強(qiáng)度的一種鹽或鹽的混合物中和在pH值4-10范圍內(nèi)進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1-7中的方法，其特征在于步驟c)中的tau蛋白的免疫反應(yīng)性不同于a)中的tau蛋白。
9.權(quán)利要求8中的方法，其特征在于tau蛋白結(jié)合用抗體檢測(cè)。
10.權(quán)利要求1-7中的方法，其特征在于步驟c)中的tau蛋白用放射性或酶檢測(cè)標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，包括一種用來(lái)檢測(cè)tau-tau結(jié)合和tau-微管蛋白結(jié)合的ELISA測(cè)定，其特征在于a)將一種對(duì)應(yīng)于核心片段并具Ala-390的截形tau蛋白，在不利于tau-tau結(jié)合的緩沖液條件下，涂在固相上，b)在相同緩沖液條件下將微管蛋白涂在固相上，c)將一種全長(zhǎng)tau蛋白與一種推測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制病理性tau-tau結(jié)合而不干擾tau-微管蛋白結(jié)合的制劑一起加到液相中，以及d)用一種能識(shí)別全長(zhǎng)tau蛋白N-末端片段的抗體按免疫化學(xué)法檢測(cè)tau-tau結(jié)合。
12.一種能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合制劑的篩選方法，包括將a)用一種tau蛋白或其含有tau核心片段的一種衍生物或一種能表達(dá)tau蛋白或其含有核心片段衍生物的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，與b)一種推測(cè)能調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合的制劑進(jìn)行接觸，以及c)檢測(cè)該細(xì)胞株活性和/或細(xì)胞株形態(tài)。
13.權(quán)利要求12方法，其中所述的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞株或神經(jīng)元細(xì)胞株。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞3T3、PC-12或NIE-115細(xì)胞株。
15.權(quán)利要求12-14的方法，其中所述的tau蛋白是一種截形tau蛋白。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該截形tau蛋白是核心tau單位。
17.權(quán)利要求12-16的方法，其中該tau蛋白的表達(dá)是在結(jié)構(gòu)調(diào)控下進(jìn)行的。
18.權(quán)利要求12至16的方法，其中該tau蛋白的表達(dá)是在可誘導(dǎo)調(diào)控下進(jìn)行的。
19.調(diào)節(jié)或抑制tau-tau結(jié)合的化合物，可根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法獲得。
20.下式酚噻嗪及其藥用鹽的應(yīng)用
其中R1、R3、R4、R6、R7和R9各自選自氫、鹵素、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基或烷氧基；R2和R8各自選自氫或
R5選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵；R10和R11各自選自氫、羥基、羧基、取代或未取代的烷基、鹵烷基、烷氧基或單鍵用于制備一種預(yù)防和治療病理性tau-tau結(jié)合或病理性神經(jīng)纖絲聚集的藥物組合物。
21.權(quán)利要求20中酚噻嗪的應(yīng)用，其中所述酚噻嗪選自以下這組其中R1，R3，R4，R6，R7和R9各自選自-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；R2和R8各自選自
其中R10和R11各自選自單鍵，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；和R5為一單鍵，-H、-CH3、-C2H5或-C3H7；以及它們的藥用鹽。
22.權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述的酚噻嗪選自甲苯胺藍(lán)O，硫堇、天藍(lán)A，天藍(lán)B或1，9-二甲胺亞甲蘭。
23.權(quán)利要求20-22中所定義的酚噻嗪在制備用于預(yù)防或治療阿耳茨海默氏病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、雷縫小體病、皮克病以及進(jìn)行性神經(jīng)核麻痹的藥物組合物中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求20中所定義的化合物在制備用于阻斷病理性tau-tau結(jié)合制劑中的應(yīng)用，其特征在于該化合物的結(jié)合系數(shù)小于0.4，在其與tau摩爾濃度的摩爾比為1000∶1時(shí)不能抑制tau-微管蛋白的結(jié)合。
25.用于治療病理性tau-tau結(jié)合的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求20中所定義的化合物和治療上惰性的載體物質(zhì)。
26.一種治療病理性tau-tau結(jié)合的方法，其包括服用權(quán)利要求20中定義的酚噻嗪。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)能夠調(diào)節(jié)或抑制病理性tau－tau蛋白結(jié)合和病理性神經(jīng)纖絲聚集的藥物的新方法。本發(fā)明的方法特別用于篩選那些預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病、雷維小體病、皮克病以及進(jìn)行性神經(jīng)核上麻痹的藥物。另外,也對(duì)在保持正常細(xì)胞骨架功能的同時(shí)能選擇性地抑制病理性聚集的藥物作了說(shuō)明。
文檔編號(hào)A61K31/54GK1179829SQ96192870
公開(kāi)日1998年4月22日 申請(qǐng)日期1996年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月27日
發(fā)明者克勞德·M·維?？? 帕特里夏·C·愛(ài)德華茲, 查爾斯·R·哈林頓, 馬丁·羅思, 阿倫·克盧格 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司