專利名稱：一種新的生長因子和編碼這種生長因子的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及具有類血管內(nèi)皮生長因子性質(zhì)之分離的分子和編碼這種分子的基因序列。此分子在治療學(xué)和診斷學(xué)的開發(fā)領(lǐng)域中是有用的，并且在治療、預(yù)防和/或診斷需要提高或縮小脈管系統(tǒng)和/或血管滲透性的病癥方面也是有用的。本發(fā)明的分子也是初級(jí)和中樞神經(jīng)元有用的效應(yīng)物并能夠誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖。
在本說明書中作者所指出的出版物的文獻(xiàn)細(xì)節(jié)收錄在此說明書的結(jié)尾處。在此說明書中所指的核苷酸和氨基酸序列識(shí)別號(hào)(SEQ ID NO:)在文獻(xiàn)之后限定。
在整個(gè)說明書中，除非上下文的含義有特殊要求，詞匯“包含”應(yīng)該理解為包括所述的要素或整體或要素與整體組，但不排除任何其它的要素或整體或要素與整體組。
血管內(nèi)皮生長因子(下文稱為“VEGF”)，也是作用于血管的滲透因子，是一種特異激活內(nèi)皮組織的分泌性的、共價(jià)連接的同型二聚體糖蛋白(Senger等1993)。功能范圍歸于VIGF，例如和正常的血管生成有關(guān)，包括黃體的形成(Yau等，1993)、胎盤發(fā)育(Sharkey等，1993)、血管滲透性的調(diào)節(jié)(Senger等，1993)、炎癥血管形成(Sunderkotter等，1994)、自體移植(Dissen等，1994)和人類疾病(如腫瘤促進(jìn)的血管形成(Follunan和Shing,1992)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Koch等，1994)以及和糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜病(Folkman和Shing,1992))。
因此，VEGF是一種重要的分子，在研究基于VEGF或其活性的治療劑、預(yù)防劑和診斷劑方面是具有潛在的價(jià)值的目標(biāo)。也有必要鑒定用于VEGF替代物或/和VEGF結(jié)合的同系化合物或其它相關(guān)的分子。
在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，發(fā)明人尋找多重的內(nèi)分泌瘤形成Ⅰ型敏感基因(MEN1)。令人驚奇地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種非MEN1候選基因的基因序列，然而是一種和VEGF具有一些相似性的新生長因子。并且，本發(fā)明的生長因子是初級(jí)和中樞神經(jīng)元的效應(yīng)物分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面包括生物學(xué)上分離的蛋白質(zhì)分子，其包含下列氨基酸序列(ⅰ)和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少15％的相似性(similarity)；和(ⅱ)和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少5％的不相似性(dissimilarity)；本發(fā)明的另一方面提供了生物學(xué)上的分離蛋白質(zhì)分子，其具有下列特征(ⅰ)包含一種和SEQ ID NO:2所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)的方面涉及具有下列特征的生物學(xué)上分離的蛋白質(zhì)分子(ⅰ)包含一種和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)至少具有下列性質(zhì)之一(a)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(b)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；(c)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力。
“生物學(xué)上分離的”的意思是此分子至少經(jīng)歷一步生物源純化。優(yōu)選的是此分子是生物學(xué)上純化的，即相對(duì)于此組合物中的其它化合物而言，這種組合物中含有至少大約20％，更優(yōu)選的是至少大約40％，進(jìn)一步優(yōu)選的是至少大約65％，再優(yōu)選的甚至是大約80-90％或更多的此種分子(以重量、活性或其它的方便手段測(cè)定)。最優(yōu)選的是此種分子是序列純化的。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面提供了重組形式的分子。
因此，本發(fā)明的這個(gè)方面提供了包含下列氨基酸序列的重組分子(ⅰ)和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少15％的相似性；和(ⅱ)和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少5％的不相似性；
本發(fā)明的一個(gè)方面直接針對(duì)于具有下列特征的重組分子(ⅰ)包含一種和SEQ ID NO:2所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)的方面涉及具有下列特征的重組分子(ⅰ)包含一種和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)至少具有下列性質(zhì)之一(a)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(b)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；(c)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力。
本發(fā)明也涉及編碼和SEQ ID NO:1具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性之蛋白質(zhì)分子的基因組或部分基因組克隆。SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相應(yīng)于人類VEGF(本文稱為“VEGF165”)。因此，本發(fā)明的分子是類VEGF或是VEGF的同系物，但是包括和VEGF的氨基序列相似但不同的氨基酸序列。盡管本發(fā)明用人類的類VEGF分子舉例，但這是為了理解本發(fā)明涉及其它哺乳動(dòng)物的同源分子和編碼序列，例如家畜動(dòng)物(如羊、豬、馬和母牛)、伴侶動(dòng)物(如狗和貓)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔和豚鼠)以及非哺乳動(dòng)物(例如如家禽鳥的鳥類)、魚和爬蟲類動(dòng)物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，VEGF分子是人類起源的，并且由定位在染色體11q13上的一個(gè)基因編碼。并且，本發(fā)明延伸到編碼目標(biāo)VEGF分子的基因組序列或其部分。
優(yōu)選的是和SEQ ID NO:2所示的全部或部分氨基酸序列的相似百分比至少是大約30％，更優(yōu)選的至少是大約40％，還優(yōu)選的至少是大約50％，再優(yōu)選的至少是大約60-70％，最優(yōu)選的甚至是80-95％。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明的VEGF分子包含SEQ ID NO:4氨基酸序列或其部分、片斷、衍生物或類似物。特別優(yōu)選的相似性包括大約19-20％和29-30％。本文參照的衍生物也包含剪接(splice)變體。因此，本發(fā)明擴(kuò)展到SOM175的剪接變體。本發(fā)明涉及的剪接變體之例子包括但不限于實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:10至少之一所示的氨基酸序列的變體或其突變體或衍生物或進(jìn)一步的剪接變體。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有一種實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或與其全部或部分具有至少大約15％的相似性(假如所說的氨基酸序列和SEQ ID NO:2中所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約5％的不相似性)的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF相同的生物學(xué)性質(zhì)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有一種實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或與其全部或部分具有至少大約15％的相似性(假如所說的氨基酸序列和SEQ ID NO:2中所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約5％的不相似性)的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF相同的生物學(xué)性質(zhì)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有一種實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或與其全部或部分具有至少大約15％的相似性(假如所說的氨基酸序列和SEQ ID NO:2中所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約5％的不相似性)的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF相同的生物學(xué)性質(zhì)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有一種實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或與其全部或部分具有至少大約15％的相似性(假如所說的氨基酸序列和SEQ ID NO:2中所示的全部或部分氨基酸序列具有至少大約5％的不相似性)的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF相同的生物學(xué)性質(zhì)。
VEGF的這些性質(zhì)至少包括下列之一(a)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(b)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；(c)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力。
按照本發(fā)明的優(yōu)選的相似性至少是大約40％，更優(yōu)選的至少是大約50％，再更優(yōu)選的至少是大約65％的相似性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及相當(dāng)于SEQ ID NO:4所示之氨基酸序列的一部分或其剪接變體(如SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示)或其化學(xué)相等物的肽片段。本發(fā)明的生物學(xué)上分離的或重組分子可以是天然葡基化的，或可以包含一種根據(jù)其分離或合成的細(xì)胞而改變的糖基化模式。如果此分子是在原核有機(jī)體中通過重組手段產(chǎn)生的，則其將是非葡基化的。此分子可以是全長天然產(chǎn)生的形式或縮短了的或其它的衍生形式。
本發(fā)明的另一個(gè)方面直接針對(duì)編碼本文所述的類VEGF分子的核酸分子。更具體地說本發(fā)明提供了一種核酸分子，其包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、或與其全部或部分具有至少15％的相似性的核苷酸序列、或在核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少15％的相似性但至少30％的不相似性時(shí)在較低嚴(yán)格條件下能和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列文本也稱為“SOM175”。優(yōu)選的不相似性百分比是大約35％，更優(yōu)選的是大約39％，更加優(yōu)選的是大約40-50％或更大。
為了限定嚴(yán)格性水平，可以參照Sambrook等(1989)9.47-9.51頁，其內(nèi)容本文一并參考，其中公開的洗滌步驟被認(rèn)為是高嚴(yán)格水平的。本文限定的較低嚴(yán)格水平如37-45℃下在4-6X SSC/0.1-0.5％W/V SDS中洗滌2-3小時(shí)。根據(jù)雜交所涉及的核酸的來源和濃度，可以使用其它嚴(yán)格條件，如介質(zhì)嚴(yán)格條件，本文認(rèn)為這種條件是45℃或以上的溫度下在1-4XSSC/0.25-0.5％W/V SDS中洗滌2-3小時(shí)，或本文認(rèn)為高度嚴(yán)格的條件是60℃下在0.1-1％SSC/0.1％w/vSDS中洗滌1-3小時(shí)。
本發(fā)明還涉及編碼上文所描述的類VEGF分子的核酸分子，其和SEQ IDNO:3具有至少15％的同源性。優(yōu)選的同源性水平至少是大約40％，更優(yōu)選的是大約60-70％。
本發(fā)明還直接針對(duì)人類VEGF的鼠化合物(本文稱為“mVRF”)。和人類VEGF相比，在整個(gè)編碼區(qū)mVRF具有大約85％的等同性和92％的保守氨基酸殘基。mVRF由包含實(shí)質(zhì)上如圖9所示的核苷酸序列的核酸分子編碼。
本發(fā)明的類VEGF分子可以單獨(dú)或與其它的分子(如VEGF)在治療和/或診斷應(yīng)用的開發(fā)領(lǐng)域中起作用。因此，本發(fā)明延伸到包含這種類VEGF分子或其部分、片斷、衍生物、化合物或類似物以及一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑的藥物組合物。并且，本發(fā)明延伸到載體和包含這些載體的宿主細(xì)胞，這種載體包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列或與其具有至少大約15％，更優(yōu)選的是大約40％，更加優(yōu)選的是大約60-70％的相似性，但具有至少大約30％，更優(yōu)選的是大約39％的的不相似性的核苷酸序列。此外，本發(fā)明延伸到核酶和基于SEQ ID NO:3的反義分子以及類VEGF分子的中和抗體。這種分子在改善效果(例如，在導(dǎo)致血管形成或腫瘤血管形成的類VEGF基因表達(dá)過程中的效果)方面可以是有用的，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的方法，所說的方法包括對(duì)所說的哺乳動(dòng)物施用具有下列特征的有效量的重組蛋白質(zhì)分子(ⅰ)包括和SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)表現(xiàn)出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)，所說的施用是在適于誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的時(shí)間和條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選的是這種重組蛋白質(zhì)分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在哺乳動(dòng)物中促進(jìn)神經(jīng)存活和/或增殖的方法，所說的方法包括對(duì)所說的哺乳動(dòng)物施用具有下列特征的有效量的重組蛋白質(zhì)分子(ⅰ)包括和SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)表現(xiàn)出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)，所說的施用生物是在適于誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的時(shí)間和條件下。
優(yōu)選的是這種重組蛋白質(zhì)分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本發(fā)明也涉及類VEGF分子的抗體或編碼類VEGF分子的基因的核酸探針，它們作為診斷劑是有用的。
參照下列非限制性圖和/或?qū)嵤├?，進(jìn)一步描述本發(fā)明。
在附圖中

圖1VEGF165的核苷酸序列[SEQ ID NO:1]和相應(yīng)的氨基酸序列[SEQ IDNO:2]。
圖2SOM175的核苷酸序列[SEQ ID NO:3]和相應(yīng)的氨基酸序列[SEQ IDNO:4]。
圖3用SOM175蛋白質(zhì)序列進(jìn)行的BLAST檢索結(jié)果。
圖4VEGF cDNA和SOM175 cDNA的BESTFIT序列對(duì)比。
圖5VEGF165和SOM175及其剪接變體在核苷酸水平上的多重序列對(duì)比。
圖6VEGF165和SOM175及其剪接變體在氨基酸水平上的多重序列對(duì)比。
圖7SOM175和其剪接變體的圖解表示。
圖8(a)人類SOM175的基因組結(jié)構(gòu)，顯示外顯子/內(nèi)含子圖譜。
圖8(b)人類SOM175的基因組結(jié)構(gòu)，顯示外顯子/內(nèi)含子邊界。
圖9衍生于mVRF cDNA克隆的核苷酸和推定的肽序列。在左側(cè)給出核苷酸編號(hào)，從起始密碼子開始。在右側(cè)對(duì)氨基酸進(jìn)行編號(hào)，從除去推定的信號(hào)肽后的推定的成熟蛋白質(zhì)的第一個(gè)殘基開始。雙劃線為可變剪接區(qū)并包含每一個(gè)mRNA產(chǎn)生的肽序列。以黑體字表示聚腺苷酸化信號(hào)。下劃線為mVRF167和mVRF186的起始和終止密碼子并由方框表示3 UTR的多形AC重復(fù)。箭頭表示內(nèi)含子/外顯子的邊界位置。
圖10人類和鼠VRF蛋白質(zhì)同種型的BESTFIT序列對(duì)比。A:mVRF167和hVRF167。B:mVRF186和hVRF186，此點(diǎn)是該序列不同于167氨基酸同種型的分歧點(diǎn)。氨基酸的等同以垂直線表示，保守氨基酸序列由冒號(hào)表示。箭頭表示推定的人類和小鼠VRF的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。
圖11VRF167和mVEGF188(Breier等，1992)肽序列的BESTFIT序列對(duì)比。箭頭表示mVEGF的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。垂直線表明相同的氨基酸，冒號(hào)表示保守取代。氨基酸的編號(hào)如圖9之圖例所描述。
圖12VRF(既然小鼠和人類化合物的內(nèi)含子/外顯子組織幾乎相同，所示的為屬VRF基因)和其它人類VEGF/PIGF/PDG的基因家族的成員間的基因結(jié)構(gòu)對(duì)比。方框代表外顯子。填充和開放的區(qū)域分別表示蛋白質(zhì)編碼區(qū)和非翻譯區(qū)。VRF的hatched區(qū)表明由VRF186同種型的可變剪接形成的附加的3UTR序列。顯示了潛在的可變剪接產(chǎn)物。
圖13和mVRF cDNA克隆雜交的各種成年小鼠組織(如圖所示)總RNA的Northern印跡放射自顯影圖。在所有的樣品中檢測(cè)到了一個(gè)1.3kb的主要轉(zhuǎn)錄物。
圖14小鼠中mVRF和mRNA表達(dá)模式的薄膜放射自顯影圖(A-C)和暗視野顯微圖(D-E)。在E14小鼠胚(A)的發(fā)育心臟(Ha)和大腦皮層(Cx)中存在陽性信號(hào)。在該部分的其它組織中也存在較低的背景信號(hào)。在E17中由于較強(qiáng)的雜交信號(hào)，胚(B)和心臟(Ha)清晰可見。在背部和胸部支架的脂肪組織(Fa)中存在同樣的強(qiáng)信號(hào)。在脊髓(SC)和舌(T)中存在適中的雜交信號(hào)。和E14胚相比，背景信號(hào)減弱。在年青的成年小鼠(C-D)中，在心臟和胸部支架周圍的脂肪組織中存在陽性信號(hào)，而，例如，肺(Lu)是非標(biāo)記的。心臟雜交信號(hào)分配在整個(gè)左心室中，包括乳頭狀肌肉(D)。在E17中，心臟和過量的冷探針雜交，沒有陽性信號(hào)(E)。刻度線=0.5mm(A),1.2mm(B),1mm(C),0.3mm(D),0.1mm(E)。
圖15暗視野(A和C)和明視野(B和D)顯微圖顯示小鼠中脂肪組織(A-B)和脊髓(C-D)的mVRF mRNA表達(dá)。在脂肪(A)中存在強(qiáng)雜交信號(hào)，如蘇丹黑染色區(qū)的強(qiáng)標(biāo)記所示。在骨骼肌(A-B中的M)中也存在較弱的信號(hào)。在成年脊髓中(C)mVRF探針在灰質(zhì)中給出了一種神經(jīng)元染色模式。Toloudine復(fù)染色顯示腹角中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(D)、具有mVRF mRNA較強(qiáng)陽性的灰質(zhì)后角和中央管周圍(沒有顯示)較深部分的中間神經(jīng)元?？潭染€=0.1mm(A),0.1mm(B),0.25mm(C),0.015mm(D)。
圖16VEGF對(duì)8天的胚雞(E8)感覺神經(jīng)元的作用，由％存活率、％軸突過生長率和軸突平均長度(μm)指標(biāo)測(cè)定。
圖17VEGF和SOM17S對(duì)小雞神經(jīng)膠質(zhì)的作用。試驗(yàn)了CNS神經(jīng)膠質(zhì)、外圍神經(jīng)膠質(zhì)和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
圖18各種SOM175蛋白質(zhì)對(duì)小鼠星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用?！?H(cpm)1．FGF-2(10ng/ml)陽性對(duì)照2．SOMΔX6*1ng/ml3．SOMΔX6 10ng/ml4．SOMΔX6 100ng/ml
5．SOMΔX6 1000ng/ml6．SOMΔX6 1000ng/ml，沒有肝素7．SOMX6**1ng/ml8．SOMX6 10ng/ml9．SOMX6 100ng/ml10．SOMX6 1000ng/ml11．SOMX6 1000ng/ml，沒有肝素*指沒有外顯子6的SOM175；**指SOM175。圖19各種SOM175蛋白質(zhì)對(duì)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用?！?H(cpm)1．FGF-2(10ng/ml)陽性對(duì)照2．SOMΔX6*1ng/ml3．SOMΔX6 10ng/ml4．SOMΔX6 100ng/ml5．SOMΔX6 1000ng/ml6．SOMΔX6 1000ng/ml，沒有肝素7．SOMX6**1ng/ml8．SOMX6 10ng/ml9．SOMX6 100ng/ml10．SOMX6 1000ng/ml11．SOMX6 1000ng/ml，沒有肝素*指沒有外顯子6的SOM175；**指SOM175。圖20各種SOM175蛋白質(zhì)對(duì)小鼠前腦神經(jīng)元的作用。←％存活率1．FGF-2(10ng/ml)陽性對(duì)照2．SOMΔX6*1ng/ml3．SOMΔX6 10ng/ml4．SOMΔX6 100ng/ml5．SOMΔX6 1000ng/ml6．SOMΔX6 1000ng/ml，沒有肝素
7．SOMX6**1ng/ml8．SOMX6 10ng/ml9．SOMX6 100ng/ml10．SOMX6 1000ng/ml11．SOMX6 1000ng/ml，沒有肝素*指沒有外顯子6的SOM175；**指SOM175。
表1序列識(shí)別號(hào)概述SEQ ID NO:1 VEGF165的核苷酸序列SEQ ID NO:2 VEGF165的氨基酸序列SEQ ID NO:3 SOM175(類VEGF分子)的核苷酸序列SEQ ID NO:4 SOM175的氨基酸序列SEQ ID NO:5沒有外顯子6的SOM175的核苷酸序列SEQ ID NO:6沒有外顯子6的SOM175的氨基酸序列SEQ ID NO:7沒有外顯子6和外顯子7的SOM175的核苷酸序列SEQ ID NO:8沒有外顯子6和外顯子7的SOM175的氨基酸序列SEQ ID NO:9沒有外顯子4的SOM175的核苷酸序列SEQ ID NO:10沒有外顯子4的SOM175的氨基酸序列SEQ ID NO:11寡核苷酸SEQ ID NO:12寡核苷酸SEQ ID NO:13寡核苷酸SEQ ID NO:14寡核苷酸實(shí)施例1人類cDNA克隆通過粘粒D11S750(Larsson等，1992)篩選人類胎腦文庫(λzapⅡ,Stratagene)而分離原SOM175 cDNA。將質(zhì)粒在體外切除并獲得1.1kb的單一cDNA。用上文描述的SOM175插入片斷作為探針，從人類胎脾文庫(Strategane,Unizap)中分離三個(gè)獨(dú)立的SOM175 cDNA克隆。得到的三個(gè)克隆是SOM175-4A、-5A和-6A。SOM175-5A是一個(gè)沒有外顯子4形式(SOM175-e4)的可變剪切克隆。利用文庫(Stratagene)生產(chǎn)者推薦的雜交條件和SOM175的隨機(jī)引物插入物進(jìn)行雜交篩選。
從λGT11人類黑素瘤細(xì)胞株A2058文庫(Clontech)中分離兩部分的人類SOM175 cDNA。利用Church和Gilbsn描述的雜交條件(1984)進(jìn)行cDNA篩選。在每一種情況下，通過衍生于SOM175的PCR產(chǎn)物的隨機(jī)引物產(chǎn)生探針。
小鼠cDNA克隆利用人類SOM175篩選小鼠新生全腦cDNA文庫(Unizap,Stratagene)。分離了四個(gè)非嵌合的克隆M175-A、B、C、D。所有的克隆都是部分cDNA并且M175-C包含幾個(gè)內(nèi)含子。三個(gè)cDNA都沒有外顯子6。
對(duì)另一個(gè)稱為M1的克隆進(jìn)行了完全測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)其包含附加5utr和3utr部分的完全開放讀框。
實(shí)施例2DNA序列分析編輯了cDNA克隆(SOM175)的整個(gè)序列和其相應(yīng)的氨基酸序列，如圖2所示。利用MAP(GCG，威斯康星大學(xué))方法篩選序列的開放讀框。觀察到了一個(gè)單一的672bp開放讀框(參見圖2)?？磥硭坪踔挥泻苌俚?非翻譯序列(2bp)。由于3非翻譯區(qū)包含多聚腺苷酸信號(hào)和多聚A尾部，所以其似乎是完整的。
利用BLAST算法(在美國NCBI進(jìn)行)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫同源檢索。分析表明對(duì)幾種哺乳動(dòng)物的VEGF形式具有同源性(參見圖3)。利用BESTFIT方法(GCG,威斯康星的大學(xué)；見圖4和5)測(cè)定SOM175和人類VEGF165間的同源量。利用BESTFIT分析估計(jì)核苷酸同源性為69.7％和蛋白質(zhì)同源性估計(jì)為至少33.3％等同和52.5％的保守。核苷酸序列的BLAST分析表明和人類表達(dá)序列尾端EST06302(Adams等，1993)幾乎完全相配。
這些數(shù)據(jù)表明SOM175編碼和VEGF具有相似結(jié)構(gòu)的生長因子。兩個(gè)基因在同一位置具有起始和終止密碼子并共有不連續(xù)的同源模塊。所有的8個(gè)半胱氨酸以及認(rèn)為和二聚作用有關(guān)的許多其它VEGF殘基是保守的。這些殘基是半胱氨酸-7(Cysteine)、脯氨酸-70(Proline)、半胱氨酸-72、纈氨酸-74(Valine)、精氨酸-77(Arginine)、半胱氨酸-78、半胱氨酸-80、半胱氨酸-81、半胱氨酸-82、半胱氨酸-89、脯氨酸-91、半胱氨酸-122、半胱氨酸-124，如圖6所示。如果給出VEGF和SOM175基因產(chǎn)物間的結(jié)構(gòu)保守性，它們可能共有相似的功能。認(rèn)為SOM175編碼和VEGF共有一些特性但又具有其獨(dú)有性質(zhì)的類VEGF分子。圖1顯示VEGF165的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。
實(shí)施例3利用Clustal方法(MegAlign軟件，DNASTAR，威斯康星)分析VEGF165家族和SOM175家族(蛋白)間的相似百分比和差異百分比。結(jié)果如圖2.1和2.2所示。將另一種的SOM175剪接形式簡(jiǎn)寫為SOM715-e6，其缺失所有的外顯子6；SOM715-e6和7缺失所有的外顯子6和7；而SOM175-e4缺失所有的外顯子4。圖7顯示SOM175的剪接顯示。圖8a和8b顯示內(nèi)含子/外顯子邊界的SOM175基因組圖。
表2.1A SOM175剪接變體和人類VEGF165間的核苷酸相似百分比VEGF165SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6和SOM175-e47VEGF165*** 34.939.741.4 37.0SOM175 ***98.995.1 99.2SOM175-e6 *** 98.8 84.0SOM175-e6和 *** 80.37SOM175-e4 ***B SOM175剪接變體和人類VEGF165間的核苷酸不同百分比VEGF165SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6和7SOM175-e4VEGF165***41.7 41.6 41.741.8SOM175 *** 0.20.2 0.0SOM175-e6 *** 0.00.2SOM175-e6和 ***0.37SOM175-e4***表2.2A SOM175剪接變體和人類VEGF165間的氨基酸相同百分比VEGF165SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6和7SOM175-e4VEGF165***31.442.3 33.540.6SOM175 *** 74.7 73.799.1SOM175-e6 ***76.899.1SOM175-e6和 *** 99.17SOM175-e4 ***B SOM175剪接變體和人類VEGF165間的氨基酸不同百分比EGF165SOM175 SOM175-e6 SOM175-e6和7SOM175-e4VEGF165*** 65.7 55.4 54.6 57.4SOM175 *** 19.9 4.20.0SOM175-e6***0.00.0SOM175-e6和 ***0.07SOM175-e4 ***實(shí)施例4生物分析確定SOM175的功能分析評(píng)價(jià)SOM175是否和VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞功能、血管形成和創(chuàng)傷愈合方面具有相似活性。以受體結(jié)合分布研究結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行其它分析。
內(nèi)皮細(xì)胞功能分析內(nèi)皮細(xì)胞增殖如Ferrara和Henzel及Gospodarowicz等(1989)中的描述進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞生長測(cè)定。
血管滲透性分析如Miles和Miles(1952)中所描述進(jìn)行此種在豚鼠中利用Miles實(shí)驗(yàn)的分析。
細(xì)胞粘著性分析分析了SOM175對(duì)多形核白細(xì)胞粘著在內(nèi)皮細(xì)胞上的影響。
趨化性 利用標(biāo)準(zhǔn)的Boyden室趨化性分析方法進(jìn)行了這種分析。
血纖維蛋白溶酶原激活劑分析在加入SOM175后測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞的血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑的產(chǎn)生(Pepper等(1991))。
內(nèi)皮細(xì)胞遷移測(cè)定如Montesano等(1986)所描述測(cè)定SOM175刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形成管的能力。
血管生成測(cè)定如Leung等(1989)所描述評(píng)價(jià)SOM175在小雞絨毛膜尿囊膜中誘導(dǎo)血管形成的反應(yīng)。
利用下列測(cè)定方法評(píng)估了SOM175可能的神經(jīng)營養(yǎng)行為軸突過度生長測(cè)定和基因誘導(dǎo)(PC12細(xì)胞)PC12細(xì)胞(嗜鉻細(xì)胞瘤株)通過發(fā)展交感神經(jīng)元的特征對(duì)NGF和其它的神經(jīng)營養(yǎng)性因素發(fā)生反應(yīng)，包括早期和晚期基因的誘導(dǎo)及軸突的擴(kuò)展。將這些細(xì)胞暴露在SOM175中并檢測(cè)其反應(yīng)(Drinkwater等(1991)；和Drinkwater等(1993))。
由周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)培養(yǎng)的神經(jīng)元將下列PNS的初始培養(yǎng)物暴露在SOM175中并檢測(cè)其任何反應(yīng)-神經(jīng)脊和背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元-交感干神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)元-瘤形神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元衍生的基板-脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元如Suter等(1992)和Marinou等(1992)的描述進(jìn)行測(cè)定。
只要觀察到體外反應(yīng)，就如Hendry等(1992)的描述進(jìn)行性質(zhì)(如攝取和逆行運(yùn)輸)測(cè)定。
神經(jīng)再生(PNS)
只要觀察到SOM175的神經(jīng)營養(yǎng)作用，就通過Otto等(1989)、Yip等(1984)和Hendry等(1976)的方法分析其在axotomised感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生方面的可能作用。
SOM175對(duì)CNS神經(jīng)元的作用如Hagg等(1992)、Williams等(1986)、Hefti(1986)和Kromer(1987)的描述測(cè)定SOM175促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元生存能力。
創(chuàng)傷愈合如Schilling等(1959)描述的和Hunt等(1967)利用的方法在能得到的臨床最相關(guān)的模型中測(cè)定SOM175支持創(chuàng)傷愈合的能力。
生血系統(tǒng)在生血系統(tǒng)的特定細(xì)胞群體中進(jìn)行了各種體內(nèi)和體外測(cè)定并列于下文莖干細(xì)胞鼠利用FACS純化的細(xì)胞發(fā)展各種體外鼠莖干細(xì)胞的測(cè)定(a)重新定居的莖干細(xì)胞這些是有能力重新定居致死照射小鼠骨髓之細(xì)胞，并具有Lin-、Rhhi、Ly-6A/E、C-kit表型。在這些細(xì)胞中單獨(dú)或通過和多種因子共培養(yǎng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)，之后通過3H胸腺嘧啶核甙結(jié)合測(cè)量細(xì)胞增殖。
(b)晚期莖干細(xì)胞這些是具有相對(duì)很少骨髓重新定居能力的細(xì)胞，但能產(chǎn)生D13CFU-S。這些細(xì)胞具有Lin-、Rhhi、Ly-6A/E、C-kit表型。將實(shí)驗(yàn)物質(zhì)和這些細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，并將其注射到致死照射受者中，然后計(jì)算D13脾克隆數(shù)。
(c)祖代豐富細(xì)胞這些是在體外對(duì)單一生長因子反應(yīng)的細(xì)胞，并具有Lin-、Rhhi、Ly-6A/E、C-kit表型。此分析將表明SOM175是否能直接充當(dāng)生血祖先細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)物質(zhì)和這些細(xì)胞在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7-14天之后計(jì)算克隆數(shù)。
動(dòng)脈粥樣硬化平滑肌在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展或發(fā)生中起重要作用，需要其表型由收縮狀態(tài)變成合成狀態(tài)。嗜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、TB-淋巴細(xì)胞和血小板通過影響平滑肌細(xì)胞的生長和表型調(diào)節(jié)在動(dòng)脈粥樣硬化噬斑的發(fā)展過程中起作用。利用在多細(xì)胞環(huán)境中測(cè)定平滑肌細(xì)胞的增值率和表型調(diào)節(jié)的體外分析評(píng)價(jià)SOM175對(duì)平滑肌細(xì)胞的作用。此系統(tǒng)利用了改良的Rose室，其將不同類型的細(xì)胞接種在相反的蓋玻片上。SOM175對(duì)骨的作用如Lowe等(1991)描述的方法測(cè)定SOM175調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖的能力。如Lowe等(1991)描述的方法測(cè)定任何對(duì)骨吸收的影響。如Didy等(1994)描述的方法分析在胞內(nèi)分子間對(duì)成骨細(xì)胞遷移和變化的作用(如cAMP的積累和堿性磷酸酶水平)。
對(duì)骨骼肌細(xì)胞的作用可以如Ewton等(1980)和Gospodarowicz等(1976)的描述測(cè)定SOM175對(duì)成肌細(xì)胞增殖和肌管發(fā)育的作用。888實(shí)施例5鼠VRF克隆cDNA分離由λZap新生全腦的cDNA文庫(Stratagene)中篩選鼠VRF(mVRF)克隆。從高密度濾膜中通過和32P標(biāo)記的682bp探針(探針如上文所述的方法通過PCR由hVRF cDNA(pSOM175)產(chǎn)生)雜交鑒定原發(fā)噬菌體。在65℃Church和Gilber(1984)描述的條件下進(jìn)行雜交和尼龍膜(Hybond-N)的嚴(yán)格洗滌。挑出陽性噬斑，并將其純化，在體外切割以產(chǎn)生含有pBluescript SK-中的cDNA克隆的細(xì)菌菌落。
基因組克隆的分離由在λFixⅡ載體(Stratagene)中克隆的小鼠SV/129株文庫中分離基因組克隆。利用mVRF cDNA的233-798核苷酸區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的32P標(biāo)記的563bp探針篩選高密度濾膜(5×104pfu/濾膜)(參見圖9)。塞住(plug)陽性克隆并用含有400-800pfu的濾膜重新篩選。利用QIAGEN試劑盒或ZnCl2純化(Santos,1991)制備大規(guī)模噬菌體制劑。
核苷酸測(cè)序和分析根據(jù)制造者的說明，利用帶有應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的(ABI)染色末端測(cè)序試劑盒的各種以載體為基礎(chǔ)的內(nèi)部引物對(duì)cDNA的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序。在ABI型373A自動(dòng)DNA測(cè)序儀上分析序列。利用BESTFIT方法(GCG，威斯康星)進(jìn)行肽同源比較。
內(nèi)含子/外顯子邊界確定以小鼠基因組DNA或mVRF基因組λ克隆作為模板，利用PCR進(jìn)行外顯子邊界和側(cè)翼區(qū)鑒定。在PCR中所用的鑒定內(nèi)含子的引物來源于hVRF序列，為了使?jié)撛诘娜祟?小鼠序列錯(cuò)配退火，使用估計(jì)的Tm之下的溫度(5-10℃)。通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定所有的PCR產(chǎn)物的大小，利用QIAquick旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen)純化凝膠，并由這些產(chǎn)物直接對(duì)內(nèi)含子/外顯子邊界測(cè)序。此外，由MVRF亞克隆基因組片段對(duì)一些剪接接合區(qū)進(jìn)行測(cè)序。通過比較cDNA和基因組DNA序列鑒定內(nèi)含子/外顯子邊界。
Northern分析由一系列新鮮的正常成年小鼠組織(人腦、腎、肝臟、肌肉)利用Chomczynski和Sacchi(1987)的方法制備細(xì)胞總RNA。將20μg總RNA電穿孔，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond N,Amersham)中，并在標(biāo)準(zhǔn)的條件下雜交(Church和Gilnrty,1984)。在65℃下0.1 xSSC9(20xSSC是3M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)、0.1％SDS中洗滌，并將其在70℃下暴露在帶有增感屏的X射線膠卷中1-3天。
mVRF cDNA的描述利用hVRF cDNA克隆通過篩選鼠cDNA文庫分離鼠VRF化合物。回收和測(cè)序了0.8-1.5kb的5種大小的克隆。編輯cDNA序列，給出了覆蓋整個(gè)開放讀框(根據(jù)剪接形式為621bp或564bp，見下文)、3 UTR(379bp)以及5UTR的163bp的全長1041bp的cDNA序列(圖9)。
推定的起始密碼子與hVRF中的起始密碼子位置匹配。一個(gè)非框架ATG的其它起始密碼子定位在47位上，在上游觀察到了兩個(gè)終止密碼子(分別是位9和33)，并和推斷的起始密碼子同在框內(nèi)。
hVRF推定的N-末端信號(hào)肽似乎存在于具有81％等同性(17/21種氨基酸)的mVRF中。預(yù)計(jì)mVRF中的肽斷裂發(fā)生在第21個(gè)殘基后(圖10)。這些數(shù)據(jù)表明成熟mVRF是分泌的，因此可能肯定起生長因子的作用。
關(guān)于hVRF，在通過文庫篩選分離的cDNA中檢測(cè)到了兩種開放讀框(0RFs)。發(fā)現(xiàn)5個(gè)克隆的4個(gè)是另外剪接的，并缺乏和hVRF外顯子6同源的101bp片段。測(cè)定了mVRF兩種同種型推定的肽系列，并和相應(yīng)的人類同種型進(jìn)行了比較(圖10)。
編碼mVRF186的信息包含621bp ORF，編碼序列在+622位上終止，接近外顯子7的末端(圖9)。由于101bp的外顯子6被剪接掉所引起的移碼和在外顯子8起點(diǎn)附近的+666位上引入了終止密碼子(TGA)，編碼mVRF167的較小信息實(shí)際上在+622位TAG的下游終止(圖9)。
mVRF186蛋白質(zhì)與VEGF的氨基與中央部分具有較強(qiáng)的同源性，而富含丙氨酸的羧基末端則完全不同。mVRF167具有這些相似性并也保留了對(duì)mVEGF直到C末端的同源性。(圖11)。mVRF167對(duì)hVRF167的全部同源性分別是85％的等同性和92％的相似性(圖10)。同樣，mVRF167和VEGF之間的同源性(Breier等，1992)分別是49％等同性和71％的保守氨基酸取代(圖11)。
在mVRF cDNA中不存在典型脊椎動(dòng)物的多聚腺苷酸信號(hào)(AATAAA)(Birnstiel，等1986)，而在小鼠和人類VRF cDNA的相似位置上存在密切匹配的序列GATAAA(圖9)。和hVRF相比，發(fā)現(xiàn)mVRF在3UTR最遠(yuǎn)3末端含有AC二核苷酸重復(fù)(核苷酸位置從998到1011，圖9)。在一些mVRF cDNA之間觀察到了這種重復(fù)區(qū)的多形性，二核苷酸數(shù)目在7-11間變化。mVRF基因組描述利用位于和相應(yīng)的hVRF邊界同源之序列兩側(cè)的引物，對(duì)內(nèi)含子/外顯子邊界進(jìn)行作圖(表3)。mVRF的內(nèi)含子Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ(表3，圖12)小于hVRF的間插序列。通過對(duì)擴(kuò)增的內(nèi)含子和mVRF克隆的基因組部分測(cè)序，從mVRF的5UTR直到內(nèi)含子Ⅵ(最大的間插區(qū)，2.2kb)對(duì)完整的基因組序列進(jìn)行了編輯。在mVRF和hVRF的基因組結(jié)構(gòu)間只有一個(gè)主要的區(qū)別，即關(guān)于這個(gè)cDNA序列，外顯子7/內(nèi)含子Ⅵ邊界定位在10bp的再下游，因此，mVRF的外顯子7為10bp，較hVRF中相應(yīng)的外顯子長。
在mVRF中外顯子6和7鄰接，這一點(diǎn)在人類化合物中也已發(fā)現(xiàn)。在mVRF和hVRF外顯子6之間的較強(qiáng)同源性表明此序列不含有內(nèi)含子序列，但編碼VRF186同種型的功能部分。
在VEGF基因家族的各種成員之間(VEGF、PIGF、hVRF)，內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)是保守的，因此mVRF的全部基因組結(jié)構(gòu)和這些基因是非常相似的(圖12)。
前面的比較圖譜研究表明染色體11q13上的人類多種內(nèi)分泌瘤形成類型1疾病基因座的周圍區(qū)域和小鼠染色體19上的近接片斷是同線的(Rochelle等，1992)。既然發(fā)明人已將hVRF基因作圖到1kb人類MENI基因座上(參見上文)，非常可能鼠VRF基因應(yīng)作圖在染色體19的著絲粒附近。
mVRF的表達(dá)研究成年小鼠組織(肌肉、心臟、肺臟和肝臟)RNA的Northern分析，顯示表達(dá)似乎是普遍存在的，并主要以大小約為1.3kb的主帶發(fā)生(圖14)。這和hVRF中所觀察的模式有些不同，其在所有檢測(cè)的組織中都鑒定到了兩個(gè)2.0kb和5.5kb的主帶。1.3kb鼠信息很可能相當(dāng)于人類較小的轉(zhuǎn)錄物，其大小的變化很可能是由于各自5UTRs長度的不同。
實(shí)施例6鼠VEGF在出生前和出生后小鼠中的表達(dá)動(dòng)物利用二氧化碳將懷孕期(n=4)和年輕的成年(n=2)小鼠(C57近親交配株，ALAB，瑞典)殺死，并將有關(guān)的組織取出，冷凍成塊。使用前，將組織保存在-70℃下。在此項(xiàng)研究中使用兩種妊娠年齡胚胎期8天(E8)、14和E17。
原位雜交組織化學(xué)如原來的描述進(jìn)行原位雜交(Dagerlind等，1992)。簡(jiǎn)言之，在低溫控制器(Microm，德國)中切出橫切面(14μm)，在含有探針的載物片上解凍(Fisher科學(xué)的，美國)，使用前保存在黑色密封的盒子中。合成的和編碼mVRF的mRNA互補(bǔ)的42部分寡核苷酸的序列是ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGTGGCACGTGCATAAACG[SEQ ID NO:11](和nt120-161互補(bǔ))和AGTTGTTGACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC[SEQ ID NO:12](和nt162-203互補(bǔ))。為了檢測(cè)另外兩種剪接形式，使用了寡核苷酸GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG[SEQ ID NO:13](和nt xxx-xxx互補(bǔ))和GCGGGCAGAGGATCCTGGGG CTGTCTGGCCTCACAGCACT[SEQ ID NO:14]。利用比活性為7-10×108cpm/μg的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(IBI，美國)將探針在3末端用脫氧腺苷-α[硫代]三膦酯(triphosphate)[35S](NEN，美國)標(biāo)記，并和沒有預(yù)處理的區(qū)段(section)在42℃下雜交16-18小時(shí)。雜交混合物含有50％v/v甲酰胺、4×SSC(1×SSC=0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉)、1×Denhardt溶液(聚乙烯吡咯烷酮、BSA和Ficoll各0.02％)、1％v/v sarcosyl(N-月桂酰肌氨酸；Sigma)、0.02M磷酸緩沖液(pH值7.0)、10％w/v葡聚糖硫酸鹽(Pharmacia，瑞典)、250Clg ml酵母tRNA(Sigma)、500μg/ml共用的熱變性鮭魚精子DNA(Sigma)和200mM二硫蘇糖醇(DTT；LKB，瑞典)。在對(duì)照區(qū)段中，通過向雜交混合物中加入20倍的過量未標(biāo)記探針，檢測(cè)了兩種探針的特異性。此外，利用和本研究無關(guān)的探針雜交了鄰近區(qū)段，其具有一種不同的表達(dá)模式。雜交后，將此區(qū)段在1×SSC中洗滌幾次，在乙醇中脫水，然后浸在NTB2核徑跡(nucleartrack)乳膠中(Kodak，美國)。3至5周后，將此區(qū)段在D-19顯影液中顯影(Kodak，美國)并放在蓋玻片上(cover-slipped)。在某些情況下，此區(qū)段在浸入乳膠之前，在放射自顯影膠片不顯影(β-max放射自顯影膠片Amersham公司，英國)。
四種不同的探針在所檢查的組織中表現(xiàn)相同的雜交模式。已在E8胚中檢測(cè)到了小鼠VRF的表達(dá)，在這種組織中，記錄了遍布結(jié)構(gòu)(最有可能相當(dāng)于神經(jīng)元管)的陽性信號(hào)。在E14小鼠胚的矢狀(sagittal)部分中，在整個(gè)心臟和神經(jīng)系統(tǒng)(特別是大腦皮層)(圖14A)中存在最強(qiáng)的雜交信號(hào)。在所有其它的組織中存在較低水平的表達(dá)。在后一種妊娠年齡E17，高水平的mVRFmRNA信號(hào)局限在心臟和背部及頸部周圍的棕色脂肪組織中(圖14B)。在脊髓灰質(zhì)和舌中存在清晰的陽性雜交信號(hào)(圖14B)。相對(duì)于14天的胚，大腦皮層中的表達(dá)明顯減少。在E14胚(如在肌中)中所見到的弱背景表達(dá)，在此妊娠年齡已明顯降低。強(qiáng)mVRF mRNA雜交信號(hào)單獨(dú)存在于年青成年小鼠的整個(gè)心臟和棕色脂肪中(圖14C)。在整個(gè)心臟中的信號(hào)平均分配在整個(gè)心室壁上，包括乳頭狀肌肉(圖14D)。在和過量冷探針雜交的心臟組織部分，在整個(gè)背景中沒有記錄到特異標(biāo)記的信號(hào)(圖14E)。
除了心臟，在胸部支架外側(cè)的一些組織中存在mVRF mRNA，這些組織在形態(tài)上類似棕色脂肪。蘇丹黑復(fù)染色證實(shí)了這一點(diǎn)，在相同的區(qū)域中顯示很強(qiáng)的染色(圖15A和15B)。在成年小鼠脊髓的橫切面上，在整個(gè)灰質(zhì)中，mVRF探針表現(xiàn)為神經(jīng)元染色模式(圖15C)。利用甲苯胺復(fù)染表明運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在灰質(zhì)腹側(cè)(圖15C和15D)，中間神經(jīng)元(圖15C)在灰質(zhì)背側(cè)和中央管周圍，在很大程度上mVRF mRNA的陽性信號(hào)存在此處。
實(shí)施例7VEGF和SOM175蛋白對(duì)小雞感覺神經(jīng)元的作用利用了Nurcombe等(1992)的方法測(cè)定了VEGF和SOM175蛋白質(zhì)對(duì)8天胚雞感覺神經(jīng)元的作用。利用每個(gè)測(cè)定孔的2000個(gè)細(xì)胞在48小時(shí)后記錄神經(jīng)元測(cè)定結(jié)果。利用3H胸腺嘧啶核甙計(jì)數(shù)獲得結(jié)果。利用NGF作為陽性對(duì)照和各種濃度的VEGF、具有肝素的VEGF和具有肝素及5μM 5-氟尿嘧啶(5FU)的VEGF，測(cè)定神經(jīng)元的百分比、軸突過生長和軸突平均長度。5FU能殺死神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
結(jié)果如圖16所示。結(jié)果表明VEGF在促進(jìn)神經(jīng)元存活方面是有效的，但需要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存在。圖17表示VEGF和SOM175對(duì)三種類型的小雞神經(jīng)膠質(zhì)的作用結(jié)果。實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)膠質(zhì)是CNS神經(jīng)膠質(zhì)、外圍神經(jīng)膠質(zhì)和CNS少突神經(jīng)肢質(zhì)細(xì)胞。在所有培養(yǎng)中，肝素的濃度是10μg/ml并在24小時(shí)記錄測(cè)定結(jié)果。利用每孔2000個(gè)細(xì)胞以3H-胸腺嘧啶核甙測(cè)量結(jié)果。
結(jié)果表明在肝素存在的情況下，SOM175明顯刺激小雞的中央和周圍神經(jīng)元及星形神經(jīng)膠質(zhì)的增值，但小雞的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在分裂速率上表現(xiàn)負(fù)增加。
實(shí)施例8SOM175蛋白對(duì)小鼠初級(jí)和中央神經(jīng)元的作用圖7結(jié)果表明VEGF同種型通過星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞媒介，影響小雞的初級(jí)和中央神經(jīng)元。在小鼠細(xì)胞中重復(fù)了類似的實(shí)驗(yàn)。
培養(yǎng)條件按照“神經(jīng)科學(xué)方法(vol.2)細(xì)胞培養(yǎng)”(P.M.Conn編輯，學(xué)院出版社，San Diego,1990,33-46頁用于星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，56-74頁用于少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，87-102頁用于中央神經(jīng)元)所描述的方法，體外制備和培養(yǎng)所有實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
將細(xì)胞以2,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在用多聚L-鳥氨酸涂抹的24-孔培養(yǎng)群(Nunc)。在反相光線下，利用成熟的技術(shù)(Maruta等，1993)計(jì)算孔中的神經(jīng)元，通過[3H]胸腺嘧啶核甙的吸收評(píng)價(jià)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以便下文監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂速率。除了特別注明，任何時(shí)候培養(yǎng)基中都含有肝素(10μg/ml,低分子量組分，Sigma化學(xué)公司)。將5-氟-2-脫氧尿苷(Sigma)添加到神經(jīng)元培養(yǎng)物中，以抑制背景神經(jīng)膠質(zhì)的生長。
通過3H胸腺嘧啶核甙的摻入分析神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增值在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中將細(xì)胞用3H胸腺嘧啶核甙(比活性為103μ Ci/μg，由0.1mCi/ml貯備濃度獲得)脈沖14小時(shí)，使最終培養(yǎng)體積為20μl/孔。收獲孔中的成分，并在硝酸纖維素紙上吸收(Titertek,Flow)。通過和typsin/versene(限制的CSL，維多利亞，澳大利亞)一起培養(yǎng)5分鐘，除去仍然粘著的細(xì)胞。此過程進(jìn)行兩次。在標(biāo)準(zhǔn)的Titertek收獲器(Flow)先用蒸餾水，然后用甲醇洗滌硝化纖維素盤。將硝化纖維素盤干燥，加入閃爍液體(包含5％v/vTriton-X)，并在閃爍計(jì)數(shù)器上對(duì)盤計(jì)數(shù)。
在小鼠星形神經(jīng)肢質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中，利用沒有外顯子6的SOM175制劑(SOM1X6)，可以見到最大活性，此時(shí)，當(dāng)和肝素一起使用時(shí)，對(duì)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的刺激作用(圖16)。對(duì)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖只有很少的刺激作用(圖17)，對(duì)分離的前腦神經(jīng)元的存活反應(yīng)潛力則難以察覺(圖18)。在三個(gè)圖中每一點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)差少于8％。
通過促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增值，可以保存神經(jīng)元的生存能力。并且，SOM1X6是一個(gè)很好的星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的誘導(dǎo)劑，并可以協(xié)同星形神經(jīng)膠質(zhì)末梢(endfeet)的形成而表達(dá)。
表3鼠VRF基因的剪接接合處5 UTR*…… 外顯子 CCCAGgtacgtgcgt 內(nèi)含子Ⅰ495bp1＞223bpttccccacagGCCCC 外顯子 2GAAAGgtaataatag內(nèi)含子Ⅱ288bp43bpctgcccacagTGGTG 外顯子 3TGCAGgtaccagggc內(nèi)含子196bp197bp ⅢctgagcacagATCCT 外顯子 4TGCAGgtgccagccc內(nèi)含子Ⅳ182bp74bpctcttttcagACCTA 外顯子 5GACAGattcttggtg內(nèi)含子Ⅴ191bp36bpctcctcctagGGTTG 外顯子 (沒有內(nèi)含6101bp 子)CCCACTCCAGCCCCA 外顯子 7TGTAGgtaaggagtc內(nèi)含子Ⅵ～2300b135bp PcactccccagGTGCC 外顯子 8AGAGATGGAGACACT394bp大寫字母和小寫字母分別表示外顯子和內(nèi)含子序列。
*表示外顯子1的5末端還沒有測(cè)定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚本文所描述的發(fā)明可以有一些變化和修改，而不僅僅是本文特定描述的這些。應(yīng)該理解本發(fā)明包括這些變化和修改。本發(fā)明也包括此說明書中指出或表明的單獨(dú)的或集合的所有步驟、特征、組合物和化合物，也包括所說的兩個(gè)或多個(gè)步驟或特性的任何或全部組合。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(美國外的國家)AMRAD OPERATIONS PTY有限公司，(僅美國)Hayward,N和Weber,G。
(ⅱ)發(fā)明名稱一種新的生長因子和編碼這種生長因子的基因序列(ⅲ)序列數(shù)14(ⅳ)通訊地址(A)收信人DAVIES COLLISON CAVE(B)街道LITTLE COLLINS STREET(C)城市MELBOURNE(D)州VICTORIA(E)國家澳大利亞(F)ZIP:3000(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)枃HPCT(B)申請(qǐng)日1996-2-22(ⅶ)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朅U PN1457(B)申請(qǐng)日1995-3-02(A)申請(qǐng)?zhí)朅U PN6647(B)申請(qǐng)日1995-11-20(A)申請(qǐng)?zhí)朅U PN7274(B)申請(qǐng)日1995-12-22(ⅷ)律師/代理人信息
(A)姓名HUGHES DR,E JOHN L(C)證書號(hào)EJH/EK(ⅸ)電信信息(A)電話+61 3 9254 2777(B)傳真+61 3 9254 2770(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度649個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置17...589(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TCGGGCCTCC GAAACC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC49Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser1 5 10CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA 97Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala15 20 25CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG TTC 145Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe30 35 40ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG 193Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val45 50 55GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA 241Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro60 65 70 75TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC 289Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly80 85 90CTG GAG TGT GTG CCC ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG 337Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met95 100 105CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA 385Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu110 115 120CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA 433Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln125 130 135GAA AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT GTA 481Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val140 145 150 155CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA GAC TCG CGT 529Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg160 165 170TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AGA TGT GAC 577Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp175 180 185AAG CCG AGG CGG TGAGCCGGGC AGGAGGAAGG AGCCTCCCTC AGCGTTTCGG 629Lys Pro Arg Arg190GAACCAGATC TCTCACCAGG 649(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度191個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly20 25 30Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln35 40 45Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu50 55 60Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu65 70 75 80Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro85 90 95Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His100 105 110Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys115 120 125Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly130 135 140Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr145 150 155 160Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln165 170 175Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg180 185 190(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度1094個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..624(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG47Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln1 5 10 15CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95Leu Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His20 25 30CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys35 40 45CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr50 55 60GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly65 70 75GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His80 85 90 95CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu100 105 110GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys115 120 125AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAC AGG GCT GCC ACT CCC CAC CAC 431Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His130 135 140CGT CCC CAG CCC CGT TCT GTT CCG GGC TGG GAC TCT GCC CCC GGA GCA 479Arg Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala145 150 155CCC TCC CCA GCT GAC ATC ACC CAT CCC ACT CCA GCC CCA GGC CCC TCT 527Pro Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser160 165 170 175GCC CAC GCT GCA CCC AGC ACC ACC AGC GCC CTG ACC CCC GGA CCT GCC 575Ala His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala180 185 190GCT GCC GCT GCC GAC GCC GCA GCT TCC TCC GTT GCC AAG GGC GGG GCT T624Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala195 200 205AGAGCTCAAC CCAGACACCT GCAGGTGCCG GAAGCTGCGA AGGTGACACA TGGCTTTTCA 684GACTCAGCAG GGTGACTTGC CTCAGAGGCT ATATCCCAGT GGGGGAACAA AGGGGAGCCT 744GGTAAAAAAC AGCCAAGCCC CCAAGACCTC AGCCCAGGCA GAAGCTGCTC TAGGACCTGG 804GCCTCTCAGA GGGCTCTTCT GCCATCCCTT GTCTCCCTGA GGCCATCATC AAACAGGACA 864GAGTTGGAAG AGGAGACTGG GAGGCAGCAA GAGGGGTCAC ATACCAGCTC AGGGGAGAAT 924GGAGTACTGT CTCAGTTTCT AACCACTCTG TGCAAGTAAG CATCTTACAA CTGGCTCTTC 984CTCCCCTCAC TAAGAAGACC CAAACCTCTG CATAATGGGA TTTGGGCTTT GGTACAAGAA 1044CTGTGACCCC CAACCCTGAT AAAAGAGATG GAAGGAAAAA AAAAAAAAAA1094(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度207個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln20 25 30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln35 40 45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val50 55 60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65 70 75 80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln85 90 95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly100 105 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys115 120 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg130 135 140Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro145 150 155 160Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala165 170 175His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala180 185 190Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala195 200 205(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度993個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..566(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 4Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln1 5 10 15CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95Leu Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His20 25 30CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys35 40 45CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr50 55 60GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly65 70 75GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His80 85 90 95CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu100 105 110GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys115 120 125AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGC CCC AGG CCC CTC TGC CCA 431Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro130 135 140CGC TGC ACC CAG CAC CAC CAG CGC CCT GAC CCC CGG ACC TGC CGC TGC 479Arg Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys145 150 155CGC TGC CGA CGC CGC AGC TTC CTC CGT TGC CAA GGG cGG GGC TTA GAG 527Arg Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu160 165 170 175CTC AAC CCA GAC ACC TGC AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG TGACACATGG 576Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg180 185CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG GGAACAAAGG 636GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA GCTGCTCTAG 696GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC CATCATCAAA 756CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA CCAGCTCAGG 816GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT CTTACAACTG 876GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT GGGCTTTGGT 936ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA AAAAAAA 993(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度188個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln20 25 30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln35 40 45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val50 55 60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65 70 75 80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln85 90 95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly100 105 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys115 120 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg130 135 140Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145 150 155 160Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu165 170 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg180 185(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度858個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..431(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG47Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln1 5 10 15CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC95Leu Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His20 25 30CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC 143Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys35 40 45CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC 191Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr50 55 60GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT 239Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly65 70 75GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC 287Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His80 85 90 95CAA GTC CGG ATG CAG ATC CTC ATG ATC CGG TAC CCG AGC AGT CAG CTG 335Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu100 105 110GGG GAG ATG TCC CTG GAA GAA CAC AGC CAG TGT GAA TGC AGA CCT AAA 383Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys115 120 125AAA AAG GAC AGT GCT GTG AAG CCA GAT AGG TGC CGG AAG CTG CGA AGG431Lys Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg130 135 140TGACACATGG CTTTTCAGAC TCAGCAGGGT GACTTGCCTC AGAGGCTATA TCCCAGTGGG 491GGAACAAAGG GGAGCCTGGT AAAAAACAGC CAAGCCCCCA AGACCTCAGC CCAGGCAGAA 551GCTGCTCTAG GACCTGGGCC TCTCAGAGGG CTCTTCTGCC ATCCCTTGTC TCCCTGAGGC 611CATCATCAAA CAGGACAGAG TTGGAAGAGG AGACTGGGAG GCAGCAAGAG GGGTCACATA 671CCAGCTCAGG GGAGAATGGA GTACTGTCTC AGTTTCTAAC CACTCTGTGC AAGTAAGCAT 731CTTACAACTG GCTCTTCCTC CCCTCACTAA GAAGACCCAA ACCTCTGCAT AATGGGATTT 791GGGCTTTGGT ACAAGAACTG TGACCCCCAA CCCTGATAAA AGAGATGGAA GGAAAAAAAA 851AAAAAAA858(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長度143個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln20 25 30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln35 40 45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val50 55 60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65 70 75 80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln85 90 95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly100 105 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys115 120 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg130 135 140(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長度910個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ )分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..305(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CC ATG AGC CCT CTG CTC CGC CGC CTG CTG CTC GCC GCA CTC CTG CAG 4Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln1 5 10 15CTG GCC CCC GCC CAG GCC CCT GTC TCC CAG CCT GAT GCC CCT GGC CAC 95Leu Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His20 25 30CAG AGG AAA GTG GTG TCA TGG ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT ACC TGC143Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys35 40 45CAG CCC CGG GAG GTG GTG GTG CCC TTG ACT GTG GAG CTC ATG GGC ACC191Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr50 55 60GTG GCC AAA CAG CTG GTG CCC AGC TGC GTG ACT GTG CAG CGC TGT GGT239Val Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly65 70 75GGC TGC TGC CCT GAC GAT GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GGG CAG CAC287Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His80 85 90 95CAA GTC CGG ATG CAG ACC TAAAAAAAAG GACAGTGCTG TGAAGCCAGA 335Gln Val Arg Met Gln Thr100CAGGGCTGCC ACTCCCCACC ACCGTCCCCA GCCCCGTTCT GTTCCGGGCT GGGACTCTGC 395CCCCGGAGCA CCCTCCCCAG CTGACATCAC CCATCCCACT CCAGCCCCAG GCCCCTCTGC 455CCACGCTGCA CCCAGCACCA CCAGCGCCCT GACCCCCGGA CCTGCCGCTG CCGCTGCCGA 515CGCCGCAGCT TCCTCCGTTG CCAAGGGCGG GGCTTAGAGC TCAACCCAGA CACCTGCAGG 575TGCCGGAAGC TGCGAAGGTG ACACATGGCT TTTCAGACTC AGCAGGGTGA CTTGCCTCAG 635AGGCTATATC CCAGTGGGGA ACAAAGAGGA GCCTGGTAAA AAACAGCCAA GCCCCCAAGA 695CCTCAGCCCA GGCAGAAGCT GCTCTAGGAC CTGGGCCTCT CAGAGGGCTC TTCTGCCATC 755CCTTGTCTCC CTGAGGCCAT CATCAAACAG GACAGAGTTG GAAGAGGAGA CTGGGAGGCA 815GCAAGAGGGG TCACATACCA GCTCAGGGGA GAATGGAGTA CTGTCTCAGT TTCTAACCAC 875TCTGTGCAAG TAAGCATCTT ACAACTGGCT CTTCC 910(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度101個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln20 25 30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln35 40 45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr val50 55 60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65 70 75 80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln85 90 95Val Arg Met Gln Thr100(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:ACCACCACCT CCCTGGGCTG GCATGTGGCA CGTGCATAAA CG(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:AGTTGTTTGA CCACATTGCC CATGAGTTCC ATGCTCAGAG GC(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅱ)序列描述SEQ ID NO:13:GATCCTGGGG CTGGAGTGGG ATGGATGATG TCAGCTGG(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GCGGGCAGAG GATCCTGGGG CTGTCTGGCC TCACAGCACT
權(quán)利要求
1．一種生物學(xué)上分離的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子具有下列特性(ⅰ)包含一種氨基酸序列，這種氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性；(ⅱ)顯示出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)。
2．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子具有至少下列性質(zhì)之一(ⅰ)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(ⅱ)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；和/或(ⅲ)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力。
3．按照權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子具有誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的能力。
4．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子是人類起源的。
5．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子是非人類起源的。
6．按照權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子是家畜動(dòng)物、伴侶動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、鳥、魚或爬蟲類動(dòng)物起源的。
7．按照權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)分子，其中所說的分子由定位在染色體11q13上的一個(gè)基因編碼。
8．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的和SEQ ID NO:2之相似性百分比是至少大約30％。
9．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的和SEQ ID NO:2之相似性百分比是至少大約40％。
10．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所說的和SEQ lD NO:2之相似性百分比是至少大約60-70％。
11．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子包含如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或其部分、片斷、衍生物或類似物。
12．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQID NO:6中所示的氨基酸序列或其部分、片斷、衍生物或類似物。
13．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQID NO:8中所示的氨基酸序列或其部分、片斷、衍生物或類似物。
14．按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQID NO:10中所示的氨基酸序列或其部分、片斷、衍生物或類似物。
15．一種具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
16．一種具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
17．一種具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少大約1 5％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
18．一種具有下列特征的重組分子(ⅰ)具有實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少大約15％的相似性但具有至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與VEGF共同的性質(zhì)。
19．按照權(quán)利要求15或16或17或18的重組分子，這種重組分子具有下列特性之一(a)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(b)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；和/或(c)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力。
20．一種按照權(quán)利要求15或16或17或18的重組分子，這種重組分子具有誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的能力。
21．一種按照權(quán)利要求20的重組分子，其中所說的分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
22．一種相當(dāng)于SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽片斷或其衍生物或化學(xué)上的相等物。
23．按照權(quán)利要求22的肽片段，這種肽片斷具有SEQ ID NO:6所示的序列或其化學(xué)相等物。
24．按照權(quán)利要求22的肽片段，這種肽片斷具有SEQ ID NO:8所示的序列或其化學(xué)相等物。
25．按照權(quán)利要求22的肽片段，這種肽片斷具有SEQ ID NO:10所示的序列或其化學(xué)相等物。
26．一種核酸分子，這種核酸分子包含編碼具有下列特征之蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列或與這種核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列(ⅰ)包含與SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)。
27．按照權(quán)利要求26的核酸分子，其中所說的蛋白質(zhì)分子具有至少下列性質(zhì)之一(ⅰ)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力；(ⅱ)和flt-1/flk-1受體家族相互作用的能力；和/或(ⅲ)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存和/或增加胞內(nèi)堿性磷酸酶水平的能力；
28．按照權(quán)利要求27的核酸分子，其中所說的蛋白質(zhì)分子具有誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的能力。
29．按照權(quán)利要求28的核酸分子，其中所說的分子編碼實(shí)質(zhì)上如SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
30．按照權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的分子是人類起源的。
31．按照權(quán)利要求1的核酸分子，其中所說的和SEQ ID NO:2之相似百分比是至少大約30％。
32．按照權(quán)利要求26的核酸分子，這種核酸分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列、或與其具有至少15％的相似性的核苷酸序列、或在核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少15％的相似性但至少30％的不相似性時(shí)在較低嚴(yán)格條件下能和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
33．按照權(quán)利要求26的核酸分子，這種核酸分子編碼人類VEGF的鼠同系物并包含實(shí)質(zhì)上如圖9所示的核苷酸序列。
34．一種藥物組合物，這種組合物包含按照權(quán)利要求1或2或3或11的蛋白質(zhì)分子和一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋液。
35．一種制備具有下列特征之重組分子的方法(ⅰ)包含和SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)。所說的方法包括使生長在有效合成所說的重組分子之條件下的合適宿主表達(dá)編碼所說的重組分子之核酸分子并分離所說的重組分子。
36．一種按照權(quán)利要求35的方法，其中所說的核酸分子包括如SEQ IDNO:3所示的序列、或與其具有至少15％的相似性的核苷酸序列、或在核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少15％的相似性但至少30％的不相似性時(shí)在較低嚴(yán)格條件下能和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
37．一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物星形神經(jīng)肢質(zhì)增殖的方法，所說的方法包括對(duì)所說的哺乳動(dòng)物施用具有下列特征之有效量的重組蛋白質(zhì)分子(ⅰ)包含和SEQ ID NO:2所示的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)。所說的施用是在適于誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的時(shí)間和條件下進(jìn)行的。
38．一種按照權(quán)利要求37的方法，其中所說的重組蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或是其衍生物。
39．一種按照權(quán)利要求37的方法，其中所說的重組蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或是其衍生物。
40．一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物神經(jīng)元生存和/或增殖的方法，所說的方法包括對(duì)所說的哺乳動(dòng)物施用具有下列特征之有效量的重組蛋白質(zhì)分子(ⅰ)包含和SEQ ID NO:2的序列具有至少大約15％的相似性但至少大約5％的不相似性的氨基酸序列；(ⅱ)顯示出至少一種與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同的性質(zhì)。所說的施用是在適于誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖的時(shí)間和條件下進(jìn)行的。
41．按照權(quán)利要求40的方法，其中所說的重組蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或是其衍生物。
41．按照權(quán)利要求37的方法，其中所說的重組蛋白質(zhì)分子包含實(shí)質(zhì)上如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或是其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明總的來說涉及具有類血管內(nèi)皮生長因子性質(zhì)之分離的分子和編碼這種分子的基因序列。此分子在治療學(xué)和診斷學(xué)的開發(fā)領(lǐng)域中是有用的,并且在治療、預(yù)防和/或診斷需要提高或縮小脈管系統(tǒng)和/或血管滲透性的病癥方面也是有用的。本發(fā)明的分子也是初級(jí)和中樞神經(jīng)元有用的效應(yīng)物并能夠誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)增殖。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1224464SQ96193035
公開日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1996年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月2日
發(fā)明者N·K·哈瓦德, G·威伯, S·格里穆德, M·諾登斯闊德, C·拉森 申請(qǐng)人:阿穆拉德業(yè)務(wù)有限公司