專利名稱：生長(zhǎng)因子樣活性的肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及生長(zhǎng)因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，特別地涉及一個(gè)具有(或者模擬)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活性的合成的小肽，基質(zhì)以及含有該小肽的組合物。
生長(zhǎng)因子是一類諸如多肽激素的物質(zhì)，能夠在體內(nèi)或體外影響動(dòng)物細(xì)胞確定種群的生長(zhǎng)，但又不是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。與組織生長(zhǎng)和組織分化有關(guān)的蛋白質(zhì)可能促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)，可能促進(jìn)或抑制分化，因而普通術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”包括細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子。
典型的生長(zhǎng)因子是分子量介于5000-50,000道爾頓的多肽。根據(jù)結(jié)構(gòu)上的相似性，生長(zhǎng)因子分為以下幾類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGFs)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)，表皮生長(zhǎng)因子(EGFs)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFs)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β型(TGF-βs)。
TGF-βs最初是由于其能夠轉(zhuǎn)化正常成纖維細(xì)胞，使其具有錨地-非依賴性生長(zhǎng)能力而得名的。然而，不論它的名字，TGF-βs是多種上皮，內(nèi)皮及間充質(zhì)細(xì)胞正常發(fā)育、生長(zhǎng)和分化所需的多功能生長(zhǎng)因子。與其它細(xì)胞因子相似，TGF-βs的特殊效應(yīng)依賴于特定的細(xì)胞類型和它周圍的環(huán)境。
TGF-βs對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)一般分為增殖性的和非增殖性的。正如最初通過(guò)第一個(gè)對(duì)成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的，TGF-βs是真實(shí)的生長(zhǎng)因子。TGF-βs能增強(qiáng)其增殖的兩種重要細(xì)胞類型是成骨細(xì)胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的施旺細(xì)胞。然而，對(duì)許多細(xì)胞而言，TGF-βs是有效的細(xì)胞增殖抑制劑。這種負(fù)生長(zhǎng)控制可能是用于檢驗(yàn)特定組織再生的調(diào)節(jié)機(jī)制，并可能在癌變的起始中起作用。
TGF-βs最重要的非增殖功能是增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的形成。雖然這最初主要是通過(guò)增加膠原和纖連蛋白的轉(zhuǎn)錄獲得的，但抑制蛋白酶對(duì)基質(zhì)的降解也對(duì)基質(zhì)的穩(wěn)定作出了貢獻(xiàn)。通過(guò)減少蛋白酶的分泌，同時(shí)增加蛋白酶抑制劑的水平，抑制了胞外基質(zhì)的降解。TGF-βs對(duì)胞外基質(zhì)顯著的和一般的效應(yīng)是很可能在組織修復(fù)過(guò)程及某些纖維組織疾病發(fā)病中起著重要作用。
Lin等人在1993年5月13日公布的PCT申請(qǐng)書WO 93/09228中描述了DNA編碼的一些不同的TGF-β受體。TGF-β受體的存在將會(huì)便于對(duì)TGF-β功能的進(jìn)一步評(píng)估。
TGF-β總家族的許多成員都有了特征性記述。例如，Basler等用圖表闡明了TGF-β總家族成員間的序列關(guān)系。細(xì)胞(Cell)，73，PP.687-702(1993)。Massague，細(xì)胞生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.Cell.Biol.)，6，pp.599-641(1990)也綜述了TGF-β家族，包括對(duì)TGF-β作用機(jī)制的討論。Daopin等報(bào)道了TGF-β1二級(jí)結(jié)構(gòu)的核磁共振特征，并描述了TGF-β2的精確三維晶體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)(Proteins)，17，PP.176-192(1993)。TGF-β2單體采納了類似輕微彎曲的左手的折疊，兩對(duì)反平行β折疊形成四根手指。這些四指區(qū)和保守的二硫鍵確定了TGF-β總家族的折疊。
在TGF-β成員還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。BMPs曾被指出有益于傷口愈合，組織修復(fù)及誘導(dǎo)軟骨和/或骨的生長(zhǎng)。例如，在1993年5月13日公布的PCT申請(qǐng)書9,309,229中，發(fā)明人Israel和Wolfman描述了具有骨刺激活性蛋白的應(yīng)用，比如用于骨折愈合或可能用于牙周病治療及其它牙修復(fù)過(guò)程。最近，在C&EN，Hubbell和Langer所寫的一篇特別的文獻(xiàn)中，(PP.42-54，1995年5月13日)，報(bào)道了把BMP摻入到聚合物顆粒中，以使當(dāng)聚合物降解時(shí)，蛋白質(zhì)緩慢釋放到周圍組織，刺激細(xì)胞遷移到多孔基質(zhì)中，并最后實(shí)現(xiàn)了新骨的合成。文獻(xiàn)同時(shí)指出，通過(guò)緩慢釋放TGF-β也可產(chǎn)生骨。
由于TGF-βs在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，它已成為許多方面研究的焦點(diǎn)。雖然多數(shù)研究工作涉及體外應(yīng)用，最近的體內(nèi)研究已證實(shí)了一些更有前景的體外效應(yīng)。因此，TGF-βs的一些可能的臨床應(yīng)用包括刺激血管生長(zhǎng)，與傷口愈合有關(guān)的肉芽組織的形成，以及骨和軟骨的形成。
發(fā)明人Derynk和Goeddel在1994年2月8日公布的美國(guó)專利5284763中描述了核酸編碼TGF-β及TGF-β的多種用途。發(fā)明人Chu等在1993年11月2日公布的美國(guó)專利5258029中描述了移植后出現(xiàn)骨向內(nèi)生長(zhǎng)的承壓修補(bǔ)物制劑，該修補(bǔ)物包含以膠原組合物或陶瓷為載體的TGF-β。發(fā)明人Hunziker在1994年11月29日公布的美國(guó)專利5,368,858中描述了生物可降解基質(zhì)制劑，其中含有TGF-βs作為增殖劑，趨化劑和轉(zhuǎn)化因子。
發(fā)明人Palladino等在1991年10月8日公布的美國(guó)專利5,055,447中描述了用于治療和預(yù)防菌血感染造成的膿毒性休克的方法和組合物。從而，例如，這個(gè)專利提供了通過(guò)服用TGF-β治療遭受或具有膿毒性休克危險(xiǎn)病人的方法。近來(lái)，人們更多地認(rèn)為“膿毒癥”是一種炎性狀態(tài)，并有一批研究人員建議命名“全身發(fā)炎反應(yīng)綜合癥”來(lái)描述“膿毒癥”(血流中存在細(xì)菌造成的感染)和其它(非膿毒癥性)發(fā)炎狀態(tài)。胸(Chest)，101，PP.1644-1655(1992)。
因此，生長(zhǎng)因子在多種治療，臨床，科研、診斷及藥物設(shè)計(jì)應(yīng)用中作用。但是，前已述及，典型的生長(zhǎng)因子一般較大。TGF-β家族的天然成員分子量可高至25千道爾頓。生長(zhǎng)因子的臨床應(yīng)用(包括TGF-βs)可能由于它們的大小會(huì)導(dǎo)致諸如免疫反應(yīng)等而受到局限。例如，人的TGF-β1是一個(gè)25,000道爾頓的同型二聚體蛋白質(zhì)。除了可能有害的免疫反應(yīng)，大的蛋白質(zhì)也因?yàn)榻o藥和釋放中的困難而通常不是最好的藥物候選物。
所以，在使用或建議使用TGF-β的應(yīng)用中需要能夠避免大多數(shù)這些問(wèn)題的模擬天然生長(zhǎng)因子的小肽。利用小肽模擬大的天然成員的生物活性有其優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榛谀栙|(zhì)量，施藥時(shí)需要的小肽的凈量少得多，局部用藥也更為可行。同時(shí)，很小的肽趨向于只有很小的或沒(méi)有不良的免疫反應(yīng)，而且能夠用簡(jiǎn)單的肽化學(xué)工藝容易地進(jìn)行合成。
本發(fā)明描述了一種名為“細(xì)胞調(diào)節(jié)素”的新肽的特征、性質(zhì)和應(yīng)用。細(xì)胞調(diào)節(jié)素能夠在多種細(xì)胞類型中模擬TGF-β1的廣泛的活性。另外，用人成骨瘤(HOS)細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的原始結(jié)果表明細(xì)胞調(diào)節(jié)素也可能是TGF-β總家族其它成員的模擬物，例如可以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(HMPS)和成骨蛋白(OPS)，證據(jù)是它能特異性刺激的成骨細(xì)胞表型特征標(biāo)示物(堿性磷酸酶和骨粘連蛋白)。
這種我們稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)素的新化合物具有以下氨基酸順序丙氨酸-天門冬酰胺-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天門冬酰胺-丙氨酸(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)(序列1)，它能夠很容易地根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)合成。因而，本明一方面提供了一種生物活性肽，它具有序列1所顯示的氨基酸順序。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于組織修復(fù)的組合物，該組合物包含有生物相容性基質(zhì)及其結(jié)合的本質(zhì)上具有序列1同樣氨基酸順序的肽(生長(zhǎng)因子)。生物相容性基質(zhì)可能是生物可降解性的或非生物可降解性的。肽以能有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的用量摻入基質(zhì)或以基質(zhì)為載體。這些基質(zhì)可用于在修復(fù)軟和硬組織中，快速替換丟失組織中，以及重塑和整形手術(shù)中構(gòu)建模板。這些組合物保證和支持細(xì)胞再生，并且可與其它生長(zhǎng)因子聯(lián)合使用，盡管如此，令人驚奇的是，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)例的肽在沒(méi)有諸如表皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子等其它生長(zhǎng)因子存在的情況下，可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞集落形成。
本發(fā)明再一方面提供了一個(gè)藥物配方，其中包含實(shí)際上等同于序列1的化合物(可能以鹽的形式)及一個(gè)生理相容性載體。
我們稱之為細(xì)胞調(diào)節(jié)素的序列1化合物至少可以模擬TGF-βs的一類生物活性，例如抑制貂肺上皮細(xì)胞Mv-1-Lu的DNA合成，促進(jìn)NRK-49F成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落形成，誘導(dǎo)I型膠原蛋白的增量表達(dá)，和/或誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1圖解表示了細(xì)胞調(diào)節(jié)素對(duì)貂肺上皮細(xì)胞Mv-1-Lu DNA合成的抑制作用。
圖2是顯微照片(放大500倍)，其中圖A是對(duì)照，圖B是有100nM細(xì)胞調(diào)節(jié)素的，圖C是有100nM細(xì)胞調(diào)節(jié)素加上EGF和PDGF的。所有試驗(yàn)組都含有正常大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK-49F，并在軟瓊脂中培養(yǎng)5天。
圖3圖解表示了細(xì)胞調(diào)節(jié)素對(duì)HOS細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，其中圖A、B和D表明了增量表達(dá)而圖C中調(diào)節(jié)活性依賴于濃度，這是細(xì)胞中TGF-β的典型特征。
圖4中圖A到D是分別對(duì)應(yīng)于圖3A到D數(shù)據(jù)的Northern印跡。
表5給出了本發(fā)明中細(xì)胞調(diào)節(jié)素實(shí)施例的1-101位原子的原子坐標(biāo)。
本發(fā)明中的肽在生理?xiàng)l件下含有一個(gè)由-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)形成的穩(wěn)定β-彎曲。這個(gè)穩(wěn)定β-彎曲通過(guò)至少一個(gè)貼近的帶電氨基酸殘基而穩(wěn)定化。我們已命名這個(gè)新化合物為“細(xì)胞調(diào)節(jié)素”(cytomodulin)。這個(gè)我們稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)素的新化合物的氨基酸順序是丙氨酸-天門冬酰胺-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天門冬酰胺-丙氨酸(序列1)，(Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala)，它很易于用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行合成。
該肽可由多種合適的方法合成，優(yōu)選方法是手動(dòng)或自動(dòng)固相合成，該方法最早由R.B.Merrifield發(fā)展起來(lái)并由J.M.Stewart和J.D.Young在“肽的固相合成”(“Solid Phase Peptide Synthesis”)(1984)中記述?；瘜W(xué)合成從C末端開始按預(yù)定順序連接氨基酸。基本的固相合成方法需要把C末端保護(hù)的α-氨基酸偶聯(lián)到合適的不溶性樹脂載體上。用于合成的氨基酸需要保護(hù)α-氨基基團(tuán)以保證與前面的殘基(或樹脂載體)形成正確的肽鍵。接下來(lái)是完成羧基端的縮合反應(yīng)，去除α-氨基的保護(hù)基團(tuán)以允許下一個(gè)殘基的加成。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”(1984)中描述了幾類α保護(hù)基團(tuán)，其中包括歷史上優(yōu)選的，酸活潑的，氨基甲酸乙酯為基的叔丁氧羰基(Boc)。還可以使用其它的保護(hù)基團(tuán)及其相關(guān)化學(xué)方案，其中包括堿活潑的9-芴甲氧羰基(FMOC)。同時(shí)，反應(yīng)性的氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)需要封閉直至合成結(jié)束。J.M.Stewart和J.D.Young在“肽固相合成”中綜述了官能封閉基團(tuán)復(fù)合體系列及其應(yīng)用中的策略和局限。
固相合成從前述C-末端α-保護(hù)的氨基酸殘基的偶聯(lián)開始。偶聯(lián)需要活化劑，例如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)同時(shí)加入或不加1-羥基苯并三唑(HOBT)，二異丙基碳二亞胺(DIIPC)或乙基二甲氨丙基碳二亞胺(EDC)。C末端殘基偶聯(lián)后，如果α-氨基保護(hù)基團(tuán)是酸活潑叔丁氧羰基，則用溶于二氯甲烷的三氟乙酸(25％或更高濃度)去保護(hù)。用溶于二氯甲烷的三乙胺(10％)的中和步驟恢復(fù)了自由胺基(與鹽形式相對(duì)應(yīng))。C末端殘基加到樹脂上以后，將去保護(hù)，中和，偶聯(lián)及中間的洗脫步驟循環(huán)過(guò)程重復(fù)進(jìn)行，以擴(kuò)展保護(hù)的肽鏈。在合適的溶劑中，每一被保護(hù)的氨基酸均與等摩爾的偶聯(lián)劑一起過(guò)量(3至5倍)引入。最后，完全封閉的肽在樹脂載體上裝配好后，使用試劑把肽從樹脂上切下來(lái)并去除側(cè)鏈封閉基團(tuán)。無(wú)水氟化氫用于切下酸活潑的叔丁氧羰基(Boc)化學(xué)基團(tuán)。也有使用一些諸如甲硫醚和苯甲醚等親核清除劑的，以避免副反應(yīng)特別是側(cè)鏈官能團(tuán)的反應(yīng)。
我們制備的細(xì)胞調(diào)節(jié)素，當(dāng)以109-10-6M(1.4pg/mil到1400pg/mil)濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，能引發(fā)若干不同細(xì)胞類型產(chǎn)生確定的高特異性效應(yīng)，從而為生長(zhǎng)因子模擬特性提供了證據(jù)。例如，這些觀察到的效應(yīng)中包括貂肺上皮細(xì)胞Mv-1-LuDNA合成的抑制，成纖維細(xì)胞NRK-49F在軟瓊脂上的生長(zhǎng)和集落形成，在新生兒表皮成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)物和HOS(人成骨瘤)細(xì)胞系中誘導(dǎo)I型膠原的增量表達(dá)，以及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的表達(dá)等。
含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽肯定能作為媒劑用于提高神經(jīng)和肌肉細(xì)胞的存活率或誘導(dǎo)生長(zhǎng)。細(xì)胞調(diào)節(jié)素當(dāng)然可作為一個(gè)新的培養(yǎng)基成分用于體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。這個(gè)肽還可作為天然細(xì)胞因子的替代物應(yīng)用到許多領(lǐng)域在外科手術(shù)中用作促進(jìn)傷口愈合再生的藥劑；在矯形術(shù)中用作促進(jìn)骨修復(fù)和移植整合的藥劑；在牙科中用于骨損傷修復(fù)和移植整合；在癌癥化療和放射性治療中作為細(xì)胞穩(wěn)定劑保護(hù)正常干細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞周期特異性過(guò)程；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療；眼科學(xué)中用于修復(fù)斑點(diǎn)損傷，眼科學(xué)中用于眼色素層炎的治療；作為內(nèi)臟動(dòng)脈閉鎖癥倒灌損傷的保護(hù)劑，以及在生物學(xué)上作為研究生長(zhǎng)因子的試劑。
本發(fā)明中的治療組合物將包括含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽，使用濃度取決于所需的有效劑量及所用的給藥方式。很容易想到關(guān)于細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物的多種治療適應(yīng)癥。第一個(gè)適應(yīng)癥是割傷和暴露組織的局部敷用以促進(jìn)傷口愈合。傷口或其它可被治療的創(chuàng)傷類型包括(但不僅限于)一、二、三度燒傷(特別是二、三度燒傷)；表皮及內(nèi)部手術(shù)割傷，包括美容手術(shù)；傷口，包括撕裂傷，割傷及刺傷；表皮潰瘍包括褥瘡，糖尿病，牙病，血友病，靜脈曲張。
使用方式多種多樣，例如全身給藥，局部施用，靜脈施藥，皮下施藥，腹膜內(nèi)注射，骨膜下注射，氣管內(nèi)施藥，多聚體或泵釋放，移植物，或脂質(zhì)體釋放。合適的移植物(如果使用移植器械)包括諸如以凝膠泡沫，蠟或微粒為基的移植物。使用劑量應(yīng)當(dāng)足以使循環(huán)血漿中的有效成分濃度達(dá)到有效水平。有效劑量可以從體外或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中得到的劑量—響應(yīng)曲線中推出。
新的細(xì)胞調(diào)節(jié)素也可用于誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)。所以，可以在藥學(xué)可接受載體或賦形劑中施用成骨有效劑量的新肽，以引導(dǎo)骨在原位沉積和成熟。另外，細(xì)胞調(diào)節(jié)素能摻入生物材料或以生物材料為載體，例如羥基磷灰石，以應(yīng)用于骨再生或修復(fù)，使用方法例如見(jiàn)于1992年10月27日公布的美國(guó)專利5,158,934和1993年5月4日公布的美國(guó)專利5,208,219中的描述，細(xì)胞調(diào)節(jié)素可用組合物形式，例如1993年1月12日公布的美國(guó)專利5178845所述，以上專利的公開內(nèi)容以參考文獻(xiàn)的形式并入本發(fā)明。
這些骨修復(fù)組合物特征性含有多種磷酸鈣礦物成分材料，例如，命名為Synthograft，Tricalcium Phosphate或Periogras的商品化羥基磷灰石。羥基磷灰石(或磷酸三鈣)可由已知方法制備而無(wú)須購(gòu)買，例如Termine等在生物化學(xué)和生物物理文獻(xiàn)(Arch.Biochem.Biophys.)，140，TP307-325(1970)中公開的方法。這種材料可以粉狀提供，優(yōu)選顆粒大小一般在100-2,000微米范圍。
本發(fā)明的細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物的另一個(gè)治療適應(yīng)癥是與基質(zhì)形成材料結(jié)合。優(yōu)選的配方包括能提供發(fā)育的骨和軟骨構(gòu)架的基質(zhì)。潛在的基質(zhì)可能是生物可降解性的或非生物降解性的，可進(jìn)行化學(xué)性或生物性定義。
試舉一例，基質(zhì)可以是惰性的，固體的和不含孔的，例如已知目前作為細(xì)胞培養(yǎng)容器的物質(zhì)。
本發(fā)明基質(zhì)可采取的另一種形式是可溶性多聚物。
本發(fā)明其它合適的實(shí)用基質(zhì)包括多種多聚物和水凝膠。這些組合物可用于在軟組織修復(fù)，損失組織的快速替代以及重塑和整形手術(shù)模板構(gòu)造。
因而，本發(fā)明的組合物能用多類可再吸收的多聚物制造，載有肽或把肽移植入多聚物材料網(wǎng)格中。當(dāng)然，在重吸收特性上有局限性的多聚物載體，例如異丁烯酸羥乙酯，聚甲基丙烯酸甲酯，以及N-乙烯基吡咯烷酮甲基丙烯酸甲酯等也是適用的。然后，組合物就可植入組織損傷。
已知合適的可再吸收水凝膠中包括聚乳酸鹽和聚乙醇酸鹽的復(fù)合物。本發(fā)明的化合物能在多聚物合成中共價(jià)連接于這類物質(zhì)，或可水解多聚物以便通過(guò)光照或化學(xué)活化多聚物產(chǎn)生自由基團(tuán)以暴露接合位點(diǎn)。隨后使用常規(guī)技術(shù)把肽移植或固定到多聚物載體，制備發(fā)明的組合物。這樣制備的可重吸收水凝膠或多聚物尤其適用于軟組織重建。對(duì)硬組織的重建或修復(fù)(例如骨修復(fù))，需要聯(lián)合那些水溶性的或可重吸收的多聚物種類與生物陶瓷，例如生物玻璃，氧化鋁，鋁酸鈣，磷酸三鈣和羥基磷灰石等。
當(dāng)把細(xì)胞調(diào)節(jié)素混合于生理可接受的載體，即在使用劑量和濃度下對(duì)受體無(wú)毒的載體，制備成藥物時(shí)，通常需要把細(xì)胞調(diào)節(jié)素與緩沖液，抗氧化劑例如抗壞血酸，低分子量(小于10個(gè)殘基)多肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖和糊精，螯合劑例如EDTA，及其它賦形劑聯(lián)合起來(lái)。用于治療給藥的細(xì)胞調(diào)節(jié)素必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)無(wú)菌濾膜(0.22微米)過(guò)濾很容易地完成。
含纈氨酸-丙氨酸β-彎曲的新肽可通過(guò)任何藥學(xué)可接受載體施用，這取決于所需的給藥方式。其可與液相載體一起配制成脂質(zhì)體，微囊，多聚體或蠟為基礎(chǔ)的可控釋放制劑，或配制成片劑，丸劑，或膠囊形式。
肽與有機(jī)和無(wú)機(jī)酸形成藥學(xué)可接受鹽，以鹽的形式給藥或者酰胺化新肽。形成藥學(xué)可接受鹽合適的酸的例子是鹽酸，硫酸，磷酸，醋酸，苯甲酸，檸檬酸，丙二酸，水楊酸，蘋果酸，延胡索酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，葡糖酸，抗壞血酸，馬來(lái)酸，苯磺酸，甲基磺酸和乙基磺酸，羥甲基磺酸和羥乙基磺酸。
鹽也可由合適的藥學(xué)可接受有機(jī)堿的加成而形成。這些有機(jī)堿形成這樣的一類，他們的局限性對(duì)那些本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)講易于理解。僅為了舉例說(shuō)明，這一類可包括單，雙，或三烷基胺，例如甲胺，雙甲胺，和三乙胺；單，雙，或三羥基烷胺，例如單，雙，和三乙醇胺；氨基酸例如精氨酸和賴氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲還原葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；嗎啉；乙二胺；N-芐基苯乙胺；三(羥甲基)氨基甲烷；及以上類似物。(例如，可參看“藥用鹽”(“Pharmaceutical Salts”)，藥學(xué)雜志(J.Pharm.Sci.)，66(1)，1-19(1977))。
治療用細(xì)胞調(diào)節(jié)素制劑，例如用于促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)，可以把具所需純度的新肽與可選擇性的生理可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備成用于貯存的劑型，可采取凍干餅或水溶液形式。可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在施藥時(shí)使用的劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，它們包括諸如磷酸，檸檬酸和其它有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白。
其它成分包括甘氨酸，丁胺(blutamine)，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，雙糖，和其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的平衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如TWEEN，PLURONICS或PEG。另外，其它需要包含于細(xì)胞調(diào)節(jié)素治療制劑的有用成分是一種或多種其它生長(zhǎng)因子，例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)。
局部敷用于例如用于傷口愈合時(shí)使用細(xì)胞調(diào)節(jié)素的最初劑量應(yīng)當(dāng)使釋放到治療部位的濃度在大約50到500納克/毫升范圍，然后根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物不但提供而且支持細(xì)胞再生，意味著連續(xù)使用或定期重敷該組合物。期望臨床醫(yī)生按照臨床經(jīng)驗(yàn)修改使用劑量。
細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物可用無(wú)菌灌注形式使用，優(yōu)選地與生理鹽水聯(lián)用，或以油膏或懸浮液形式，優(yōu)選地與其它上文已述及的生長(zhǎng)因子聯(lián)用，并可進(jìn)一步與膠原，膠原類似物，或膠原模擬物聯(lián)用，例如發(fā)明人Bhatnagar在1994年10月11日公布的美國(guó)專利5,354,736中所述，其公開內(nèi)容以參考文獻(xiàn)形式并入本發(fā)明。組合物也可滲入穿皮補(bǔ)片，石膏或繃帶，優(yōu)選的形式是液體或半液體。這類物品或組合物還應(yīng)當(dāng)包括磺胺嘧啶銀等自體微生物制劑。
細(xì)胞調(diào)節(jié)素也可經(jīng)全身給藥治療傷口和類似的創(chuàng)傷。全身給藥可用于不存在或極少有不希望的副反應(yīng)的情況下，例如刺激癌癥病人瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。用于全身給藥的細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物優(yōu)選地配制成無(wú)菌，等滲腸胃外注射劑或輸注劑。
細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物，如前所述，或單獨(dú)使用細(xì)胞調(diào)節(jié)素，或聯(lián)合使用其它生長(zhǎng)因子，膠原，前述的生理可接受載體，賦形劑或穩(wěn)定劑，均可以生物相容性基質(zhì)作為載體(或摻入生物相容性基質(zhì))。發(fā)明的基質(zhì)可是多孔珠狀顆?；蚴抢w維狀。建議用例如磷酸鈣材料，諸如磷灰石為基礎(chǔ)的陶瓷來(lái)生產(chǎn)多孔組織移植物或假體材料，上有足夠的微孔允許組織附著。從而，本發(fā)明細(xì)胞調(diào)節(jié)素組合物一種治療應(yīng)用是用于基質(zhì)形成材料是生物可降解性的地方，并可用于例如軟骨修復(fù)。
用于填充或其它修整軟骨損傷的基質(zhì)材料包括，例如，纖維蛋白原(在損傷或損壞時(shí)由凝血酶活化形成纖維蛋白)，膠原，明膠或任何其它生物可降解材料，這些材料形成的基質(zhì)具足夠大的孔允許修復(fù)細(xì)胞填入和在其內(nèi)增殖，并能在修復(fù)過(guò)程中降解和由軟骨替代。
本發(fā)明的組合物和方法中有用的基質(zhì)可以預(yù)制成或在原位形成，例如通過(guò)多聚化合物和組合物，諸如纖維蛋白原以形成纖維蛋白基質(zhì)?？梢灶A(yù)制的基質(zhì)包括膠原，膠原類似物或膠原模擬物(例如膠原海綿和膠原羊毛)，化學(xué)修飾膠原，明膠珠或海綿，凝膠形成物質(zhì)，任何其它由生物可降解基質(zhì)材料組成，能填充組織或骨損傷并允許修復(fù)細(xì)胞填入其中的凝膠形成和組成物質(zhì)，或者以上物質(zhì)的混合物。
細(xì)胞調(diào)節(jié)素的生物活性現(xiàn)在將由下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例是為了說(shuō)明而不是其限制。
實(shí)施例1貂肺上皮細(xì)胞Mv-l-Lu DNA合成的抑制TGF-β和細(xì)胞調(diào)節(jié)素的效應(yīng)是通過(guò)測(cè)定[1H]胸苷摻入總酸不溶DNA的比率和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。通常可參照Sampath等，生物化學(xué)雜志(Joumal ofBiological Chemistry)，267，PP.20352-20362(1992)。DNA合成速率在三平行培養(yǎng)基中測(cè)定，培養(yǎng)物用不同濃度(10-9M至10-6M)的TGF-β或細(xì)胞調(diào)節(jié)素(用Merrifield方法合成)處理24小時(shí)，培養(yǎng)終止前6小時(shí)加入[甲基-3H]胸苷(μCi/ml，80Ci/mmol)。通過(guò)培養(yǎng)基抽吸終止摻入，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次后，三氯乙酸(10％)沉淀放射性DNA，用1.0％(W/V)十二烷基磺酸鈉，0.1M氫氧化鈉抽提，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)定量。測(cè)定細(xì)胞數(shù)，將1×105個(gè)細(xì)胞在含10％FBS的MEM培養(yǎng)基燒瓶中鋪平板，培養(yǎng)24小時(shí)后，以含不同種類TGF-β和細(xì)胞調(diào)節(jié)素的無(wú)血清培養(yǎng)基替代生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每24小時(shí)收集三平行培養(yǎng)物，連續(xù)7天，通過(guò)固定容積血球計(jì)數(shù)計(jì)中胰蛋白酶消化釋放的細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞數(shù)。
細(xì)胞調(diào)節(jié)素的生長(zhǎng)抑制曲線類似于在相同濃度范圍的TGF-β所觀察到的生長(zhǎng)抑制曲線。
實(shí)施例2成纖維細(xì)胞NRK-49F在軟瓊脂上的生長(zhǎng)和集落形成最初對(duì)TGF-β檢測(cè)其促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞不依賴于貼壁生長(zhǎng)的能力仍然是TGF-β活性的一個(gè)標(biāo)志。NRK-49F成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在37℃的補(bǔ)充有10％胎牛血清的DEM培養(yǎng)基上。實(shí)驗(yàn)使用培養(yǎng)基，10ng/mg表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和10ng/ml血小板衍生生長(zhǎng)因子(DDGF)；然而，同TGF-β不同，它缺少這些生長(zhǎng)因子時(shí)不能誘導(dǎo)集落形成(參看例如，Massagu，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，259，PP.9756-9761(1984))，細(xì)胞調(diào)節(jié)素確實(shí)在不存在上述兩種生長(zhǎng)因子的情況下能誘導(dǎo)集落形成。在這里，或者加入100nM TGF-β(陽(yáng)性對(duì)照)或者加入100nM細(xì)胞調(diào)節(jié)素。NRK-49F成纖維細(xì)胞(5×104細(xì)胞/毫升)混于0.3％瓊脂中在35毫米培養(yǎng)皿中鋪平板。第三天開始觀察到培養(yǎng)基中形成集落。
同預(yù)期一致，在基本培養(yǎng)基上沒(méi)有集落形成。也同預(yù)期一致，含TGF-β的克隆長(zhǎng)成集落。令人驚奇的是，細(xì)胞調(diào)節(jié)素培養(yǎng)物也形成接近于TGF-β培養(yǎng)物同等程度的集落。TGF-β和細(xì)胞調(diào)節(jié)素培養(yǎng)物集落生長(zhǎng)特征在生長(zhǎng)期間相似。
參照?qǐng)D2，展示的顯微照片攝于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的第5天。實(shí)際上第三天的培養(yǎng)物上已能觀察到集落形成。如圖2(A)所見(jiàn)，沒(méi)有任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)物中極少有細(xì)胞存活下來(lái)，圖2(B)和(C)展示了在細(xì)胞調(diào)節(jié)素存在下小集落(箭頭)的形成，(C)中還包括EGF和PDGF，誘導(dǎo)了更大的集落(箭頭)。這些類似于TGF-β誘導(dǎo)的集落形成，只是TGF-β需要同時(shí)存在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；然而，如(B)中所見(jiàn)，細(xì)胞調(diào)節(jié)素的確能單獨(dú)誘導(dǎo)集落形成。
實(shí)施例3RNA分離和Northern檢測(cè)細(xì)胞總RNA基本上按Maniatis描述的方法分離。Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第二版(1989)。細(xì)胞用0.5％十二烷基磺酸鈉和0.1醋酸鉀裂解。用酚提取裂解液并在500rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘。水相在0.1M Tris，pH8.0和0.2M NaCl中用2倍體積乙醇沉淀。沉淀重新懸浮并通過(guò)測(cè)量260nm紫外吸收定量。RNA純度通過(guò)比較260m和280nm的紫外吸收進(jìn)行鑒定。
RNA(10微克/泳道)在3到4伏/厘米條件下用0.7％瓊脂糖，2.2M甲醛變性凝膠電泳。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移RNA至尼龍膜。RNA完整性，凝膠荷載和轉(zhuǎn)移效率通過(guò)亞甲藍(lán)染色的28S和18S帶進(jìn)行鑒定。濾膜在80℃烘干2小時(shí)以固定RNA。烘干后，濾膜在65℃下于0.5M磷酸鈉緩沖液中雜交，該緩沖液pH值為7.0，且含有1mM EDTA，7％十二烷基磺酸鈉和1％牛血清白蛋白。cDNA探針使用Klenow酶按隨機(jī)引物方法標(biāo)記上dDIG(熒光探針)。雜交在65℃進(jìn)行18小時(shí)，然后沖洗。
按照制造商的步驟通過(guò)掃描地高辛-dVTP分析數(shù)據(jù)。(BoehringerMannheim Biochemica，DIG DNA標(biāo)記試劑盒，Cat.No.1175033)。
表5給出了細(xì)胞調(diào)節(jié)素生物活性結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)(原子1-101)。從而，表5描述了本發(fā)明肽的生物活性表面。我們相信可以合成出類似物，它呈現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜受體來(lái)講相同的或?qū)嵸|(zhì)上相同的表面，從而等價(jià)于本發(fā)明的細(xì)胞調(diào)節(jié)素。另一方面，通過(guò)利用別構(gòu)結(jié)合機(jī)理，可以合成對(duì)于細(xì)胞調(diào)節(jié)素來(lái)講增加了或減少了活性的復(fù)合物。因而，本發(fā)明的實(shí)施例，例如用于組合修復(fù)的組合物，包含一種生物相容性基質(zhì)和一個(gè)由于是細(xì)胞調(diào)節(jié)素本身或是它的類似物而實(shí)質(zhì)上與細(xì)胞調(diào)節(jié)素氨基酸序列相同的肽，該肽當(dāng)摻入基質(zhì)或以基質(zhì)為載體并以能有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的量存在時(shí)，可以表現(xiàn)相同于或本質(zhì)上相同于圖5所示的生物活性表面。
當(dāng)然，結(jié)合上述優(yōu)選的具體實(shí)施例描述了本發(fā)明，該描述和實(shí)施例都是為了說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍，它由附加的權(quán)利要求的范圍而確定。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)(ii)發(fā)明名稱生長(zhǎng)因子樣活性的肽組合物(iii)序列數(shù)目1(iv)通信地址(A)收信人Robbins，Berliner&Carson(B)街道201 N.Figueroa Street，5th Floor(C)城市洛杉磯(D)洲加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編90012-2628(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)填表日期(C)類別(viii)律師/代理人資料(A)姓名Berliner，Robert(B)登記號(hào)20121(C)目錄號(hào)(ix)電信資料(A)電話213-977-1001(B)傳真213-977-1003(2)序列1資料(i)系列特征
(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述序列1Ala Asn Val Ala Glu Asn Ala
權(quán)利要求
1.一個(gè)氨基酸序列為Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的生物活性肽。
2.一種有助于組織修復(fù)的組合物，其中含有一種生物相容性基質(zhì)；以及一個(gè)實(shí)質(zhì)上具有氨基酸序列Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的肽以有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的量摻入基質(zhì)或以基質(zhì)為載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其中的氨基酸序列基本上由-Val-Ala-組成，它在生理?xiàng)l件下形成一個(gè)穩(wěn)定的β-彎曲。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中的生物相容性基質(zhì)是生物可降解的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中的基質(zhì)包括一種可再吸收的多聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中的生物相容性基質(zhì)是非生物可降解的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中的基質(zhì)是多孔的。
8.一種藥物配方，其中含有一種含有氨基酸序列Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala(序列1)的化合物和它的鹽；一種生理可接受載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的配方，其中的化合物具有至少一種實(shí)質(zhì)上類似于TGF-β的生物特性。
全文摘要
本發(fā)明合成了一個(gè)序列為丙氨酸－天門冬酰胺－纈氨酸－丙氨酸－谷氨酸－天門冬酰胺－丙氨酸(ANVAENA)(序列1)的肽。該肽被命名為“細(xì)胞調(diào)節(jié)素”(cytomodulin)”,它能夠在多種細(xì)胞類型中模擬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1的多種活性。本發(fā)明提供了用于諸如組織修復(fù)等用途的組合物。該組合物包括一種生物相容性基質(zhì),而細(xì)胞調(diào)節(jié)素和其混合或者以該基質(zhì)作為載體。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1183103SQ96193633
公開日1998年5月27日 申請(qǐng)日期1996年4月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月1日
發(fā)明者拉金卓·S·博塔納哥, 錢菁菁 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)