專(zhuān)利名稱(chēng)：：用作活性成分載體的多聚氨基酸基顆粒和其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的領(lǐng)域是可用于活性成分(AP)透過(guò)細(xì)胞膜給藥的輸送載體。這些輸送載體使得活性成分在被保護(hù)下體內(nèi)運(yùn)送至其作用位點(diǎn)?；钚猿煞謨?yōu)選是通過(guò)口、鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、腸胃外等途徑給予動(dòng)物或人體的藥品或營(yíng)養(yǎng)物，但也可以是用于處理農(nóng)作物作為作物保護(hù)劑的除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺真菌劑等。所有這些應(yīng)用中，活性成分輸送載體旨在提高活性成分的生物利用度。這些輸送載體例如可以是提供活性成分緩釋的系統(tǒng)。本發(fā)明特別涉及的活性成分例如為蛋白、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖、寡核苷酸和多核苷酸，但不限于這些。本發(fā)明更具體涉及基于多聚氨基酸用作活性成分(特別是藥物活性成分)輸送載體的顆粒，最好是亞微米級(jí)和/或微米級(jí)的顆粒。它們因而為輸送顆粒(DP)，其中，按本發(fā)明特有的命名法(如下文所定義)本說(shuō)明書(shū)以下區(qū)分納米輸送顆粒(NDP)和微米輸送顆粒(MDP)。本發(fā)明涉及裸顆粒本身，以及由載有目標(biāo)活性成分的顆粒組成的活性成分輸送載體系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及所述顆粒的制備方法。遺傳工程和生物技術(shù)的進(jìn)步，以及與其相關(guān)的遺傳工具、蛋白和生物活性肽的發(fā)現(xiàn)，使得高選擇性和內(nèi)在活性的新藥物活性成分不斷涌現(xiàn)。但這些活性成分在到達(dá)其治療作用位點(diǎn)之前在體內(nèi)易于降解，其生物利用度因而很低?？诜o藥時(shí)，胃腸道構(gòu)成活性成分的強(qiáng)大物理化學(xué)屏障，活性成分一方面必須耐受消化系統(tǒng)的降解，另一方面要通過(guò)胃腸表皮膜。關(guān)于這一點(diǎn)可參見(jiàn)M.J.HUMPHREY的綜述(“肽藥物的輸送系統(tǒng)”，S.DAVIS和L.ILLUM編，Plenum出版社，紐約，1986)，其中提到了口服肽的低生物利用度。當(dāng)然，這些體內(nèi)輸送和定位的不利并不只限于蛋白，還涉及由能用于基因治療技術(shù)的遺傳工具(寡核苷酸、多核苷酸、質(zhì)粒)組成的活性成分。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，已有人提出將活性成分包入輸送顆粒中。這些包囊技術(shù)的價(jià)值是為了提高活性成分的生物利用度，通過(guò)保證其不受體內(nèi)損壞而保護(hù)和/或轉(zhuǎn)運(yùn)活性成分到達(dá)其治療位點(diǎn)。在所有可設(shè)想用于包囊活性成分的材料中，考慮到其內(nèi)在特性現(xiàn)越來(lái)越多地使用聚合物。對(duì)這種輸送顆粒所希望達(dá)到的一系列要求是苛刻的，特別包括以下條件1.應(yīng)該可能、最好能夠得到平均直徑在一到幾微米級(jí)且粒徑分布窄的輸送顆粒，以便能使輸送顆粒的粒度適于所選的給藥方法和/或預(yù)期的治療位點(diǎn)。例如，如果要經(jīng)口服途徑進(jìn)行粘膜免疫，輸送顆粒的粒度應(yīng)在0.5～10μm，以便輸送顆粒能進(jìn)入派伊爾結(jié)并達(dá)到淋巴組織。皮下給藥時(shí)，具有粒度大于10μm的輸送顆粒有利，以使這種顆粒不再進(jìn)入大循環(huán)，迅速被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)在化，但從其注射位點(diǎn)逐漸擴(kuò)散。這一條件涉及輸送顆粒的大小控制，既要控制輸送顆粒的粒度分布還要控制其平均直徑，這從工藝角度看是很復(fù)雜的操作。2.希望輸送顆粒對(duì)活性成分提供的保護(hù)直到釋放位點(diǎn)。例如，疫苗組成的活性成分口服給藥時(shí)，疫苗在整個(gè)胃腸道中受到保護(hù)。3.構(gòu)成輸送顆粒的聚合物最好是生物相容性和可生物降解的，還希望它能被代謝為對(duì)身體無(wú)毒的物質(zhì)。4.構(gòu)成輸送顆粒的聚合物最好不誘發(fā)免疫應(yīng)答(不具有免疫原性)。5.最后，還希望能通過(guò)不使活性成分變性的方法獲得輸送顆粒，因此不能使用有機(jī)溶劑和/或高溫。有大量的現(xiàn)有技術(shù)徒勞地試圖滿(mǎn)足這些所有條件，但其所用途徑僅部分滿(mǎn)足了上述要求。這些不成功的提議方案中，可提及專(zhuān)利US-A-5286495，它涉及在水相中用由藻酸鹽和聚賴(lài)氨酸組成的材料包囊蛋白的方法?？紤]到該方法沒(méi)有使用有機(jī)溶劑、破壞性化學(xué)試劑或高溫，它對(duì)含蛋白的活性成分是非致變性的。但所用的輸送顆粒制備技術(shù)(蒸發(fā))不能使顆粒小于35μm，它們從而不能被身體細(xì)胞內(nèi)在化。另外，乳液技術(shù)一般用于制備幾微米大小的微粒。例如，專(zhuān)利申請(qǐng)WO91/06286和WO91/06287描述了在乳液中形成顆粒的方法，其中-選自膠原、酪蛋白、角蛋白和優(yōu)選的谷醇溶蛋白的疏水蛋白，-或生物相容性和生物可降解的聚合物，如聚乳酸或聚原酸酯，用作聚合物。活性成分可是疏水性的或親水性的，但對(duì)后者推薦用雙乳液技術(shù)。微粒的大小為約100μm，優(yōu)選為50nm到100μm。專(zhuān)利申請(qǐng)WO89/08449也涉及乳液包囊法，以將活性成分引入小于100μm的聚乳酸微粒中。該文獻(xiàn)特地提及這一大小是通過(guò)粘膜的淋巴組織吸收的最大限(口服、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)和眼科給藥)。乳液技術(shù)在理論上是很吸引人的，因?yàn)樗苁勾蟛糠只钚猿煞钟糜谖⒘Ｖ?，其粒徑可控制?μm的水平。但在這些技術(shù)中使用了有機(jī)溶劑，以溶解構(gòu)成顆粒的聚合物。這些溶劑為例如酮、醇、酰胺或其混合物。不幸的是證明這些溶劑可以是致變性的，特別是對(duì)肽或多肽活性成分。還已知在不太高的溫度下水溶液中形成的生物相性輸送顆粒，稱(chēng)為類(lèi)蛋白。這些輸送顆粒從1970年以來(lái)被W.FOX和K.DOSE所描述，“分子演變和生命起源”，MarcelDEKKER公司出版(1977)。在此工作的基礎(chǔ)上，專(zhuān)利申請(qǐng)WO88/01213提出了一種基于類(lèi)蛋白的活性成分輸送系統(tǒng)。所用聚合物是合成的或天然氨基酸和/或小肽鏈經(jīng)熱縮合獲得的人工多肽的混合物。所選的縮合方式導(dǎo)致支鏈寡聚物，因而它僅微溶于水。然后對(duì)這些支鏈寡聚物進(jìn)行過(guò)濾篩選以獲得水溶性成分。這一成分必然由很小分子量的支鏈交聯(lián)產(chǎn)物組成。該發(fā)明的微粒是通過(guò)改變pH而得到的，pH改變使支鏈寡聚物作為類(lèi)蛋白沉淀出來(lái)。當(dāng)發(fā)生沉淀的溶液中含有活性成分時(shí)，它們的一部分在類(lèi)蛋白形成過(guò)程中被帶入其中。這一系統(tǒng)的缺點(diǎn)是-包囊率低，-純化方法復(fù)雜，-由于合成方法的原因使氨基酸的連接不規(guī)則(非α-肽)，這使得不能斷言其酶降解反應(yīng)與α-多聚氨基酸的相同，最后，使用大量不同氨基酸單體，這可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/25589涉及氨基酸熱縮合合成類(lèi)蛋白的改進(jìn)方法。此例中的類(lèi)蛋白也是從低分子量支鏈寡聚物形成的，氨基酸連接不規(guī)則。這些支鏈寡聚物的水溶性特征是這樣達(dá)到的-一方面使用很低的分子量(250-2400)，相當(dāng)于2-20個(gè)氨基酸的很短連接，-另一方面選擇起始氨基酸。如前述，降低水溶性支鏈寡聚物的pH，引發(fā)沉淀而形成類(lèi)蛋白。當(dāng)沉淀發(fā)生時(shí)存在水溶性活性成分，則在類(lèi)蛋白形成過(guò)程中一部分活性成分被帶入其中。包囊率仍不高20-40％。另外，降低pH可能對(duì)某些活性成分有害。另外，必須在一特異pH下進(jìn)行包囊這一事實(shí)，構(gòu)成一種麻煩的工藝限制，將這些微粒的應(yīng)用限制在類(lèi)蛋白沉淀的pH下，而這必然與生理pH不符。例如，在胃腸道中pH變化在2-7.5之間。還要提及美國(guó)專(zhuān)利4351337，它與本發(fā)明涉及的活性成分輸送屬于不同的領(lǐng)域。該專(zhuān)利公開(kāi)了置于體內(nèi)相當(dāng)固定位置中的固定化植入物。因而這種植入物與所給藥(如口服或注射)的形式無(wú)關(guān)。所述植入物特別為400-800μm大小的基質(zhì)或包衣類(lèi)型的球形微膠囊(圖8-9)，因而它們比被體細(xì)胞內(nèi)在化微粒要求的0.5-10μm粒徑要大得多。這些植入物從多聚氨基酸類(lèi)(特別是Leu/Glu)聚合物材料制成。這些植入物例如用聚氨基酸的二噁烷溶液進(jìn)行成形，最后蒸去二噁烷。在此現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)下，本發(fā)明的基本目的之一是提供能夠用作給人或動(dòng)物體給藥的活性成分(特別是藥物和/或營(yíng)養(yǎng)活性成分)輸送載體的、基于多聚氨基酸的輸送顆粒，特別是亞微米級(jí)和微米級(jí)輸送顆粒，這些輸送顆粒完全滿(mǎn)足上文詳述并重復(fù)如下的一系列要求1.應(yīng)該可能、最好能夠得到平均直徑在一到幾微米級(jí)且粒徑分布窄的輸送顆粒，以便能使輸送顆粒的粒度適于所選的給藥方法和/或預(yù)期的治療位點(diǎn)。例如，如果要經(jīng)口服途徑進(jìn)行粘膜免疫，輸送顆粒的粒度應(yīng)在0.5～10μm，以便輸送顆粒能進(jìn)入派伊爾結(jié)并達(dá)到淋巴組織。皮下給藥時(shí)，具有粒度大于10μm的輸送顆粒有利，以使這種顆粒不再進(jìn)入大循環(huán)，迅速被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)在化，但從其注射位點(diǎn)逐漸擴(kuò)散。這一條件涉及輸送顆粒的大小控制，既要控制輸送顆粒的粒度分布還要控制其平均直徑，這從工藝角度看是很復(fù)雜的操作。2.希望輸送顆粒對(duì)活性成分提供的保護(hù)直到釋放位點(diǎn)。例如，疫苗組成的活性成分口服給藥時(shí)，疫苗在整個(gè)胃腸道中受到保護(hù)。3.構(gòu)成輸送顆粒的聚合物最好是生物相容性和可生物降解的，還希望它能被代謝為對(duì)身體無(wú)毒的物質(zhì)。4.構(gòu)成輸送顆粒的聚合物最好不誘發(fā)免疫應(yīng)答(不具有免疫原性)。5.最后，還希望能通過(guò)不使活性成分變性的方法獲得輸送顆粒，因此不能使用有機(jī)溶劑和/或高溫。本發(fā)明的另一基本目的是提供具有可控制并可調(diào)節(jié)的平均粒度的多聚氨基酸基輸送顆粒，粒度在200μm(MDP)到幾納米(NDP)范圍內(nèi)變化。本發(fā)明的另一個(gè)基本目的是提供易于制備(非破壞性pH)、在4-13的任何pH下穩(wěn)定且為非免疫原性的輸送顆粒。本發(fā)明的另一基本目的是提供在工業(yè)上易行且經(jīng)濟(jì)能夠以高負(fù)載度負(fù)載活性成分的基于多聚氨基酸的輸送顆粒。本發(fā)明的另一基本目的是提供能用作活性成分輸送載體的多聚氨基酸基MDP和/或NDP的制備方法，所述方法具有耗資小、操作簡(jiǎn)單且對(duì)活性成分無(wú)致變性的優(yōu)點(diǎn)，而且能精確控制所得顆粒的平均粒度(最大200μm)。本發(fā)明的另一基本目的是上述顆粒在制備藥品(如疫苗)和/或營(yíng)養(yǎng)品中的用途，特別是用于活性成分如蛋白、糖蛋白、肽、多糖、脂多糖、寡核苷酸和多核苷酸的口、鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)或腸胃外給藥。本發(fā)明的另一基本目的是提供一種含活性成分緩釋系統(tǒng)的藥品，它具有生物相容性且產(chǎn)生活性成分的高生物利用度。本發(fā)明的另一基本目的是一種疫苗的輸送系統(tǒng)，它是內(nèi)在非免疫原性的，并與一種或多種抗原結(jié)合。本發(fā)明特別涉及本發(fā)明獲得的產(chǎn)物，即平均粒度小于200μm的多聚氨基酸基活性成分輸送顆粒，其特征在于其構(gòu)成性多聚氨基酸含有至少兩類(lèi)重復(fù)氨基酸，AAN和AAI◆AAN型相當(dāng)于疏水性中性氨基酸，◆AAI型相當(dāng)于帶有可離子化側(cè)鏈的氨基酸，AAI型重復(fù)氨基酸的至少一部分為電離形式，AAN和AAI中每類(lèi)重復(fù)氨基酸相互相同或不同，-還在于多聚氨基酸的重均摩爾質(zhì)量Mw不低于4000D，優(yōu)選不低于5000D。申請(qǐng)人被認(rèn)為已從多聚氨基酸進(jìn)行了篩選，以致僅使用具有非水溶性、在寬pH范圍內(nèi)形成穩(wěn)定的膠態(tài)懸液并與預(yù)期應(yīng)用的生理介質(zhì)pH值相兼容特性的那些，其含有由疏水的中性氨基酸組成的第一類(lèi)AAN單體和至少一種由AAI氨基酸組成的第二類(lèi)單體，AAI氨基酸的特征是帶羧基官能團(tuán)的側(cè)鏈(Glu，Asp)，在生理pH下可離子化，并對(duì)蛋白是非致變性的。本發(fā)明的特征之一是，這些多聚氨基酸(PAA)為線(xiàn)性，更優(yōu)選它們具有α-肽鍵。最好，選擇作為本發(fā)明輸送顆粒構(gòu)成元件的PAA可以是“嵌段”P(pán)AA和/或“統(tǒng)計(jì)學(xué)”P(pán)AA。“嵌段”P(pán)AA是具有交替排列結(jié)構(gòu)的那些，其中氨基酸沿聚合物鏈以嵌段分布?！敖y(tǒng)計(jì)學(xué)”P(pán)AA是具有隨機(jī)無(wú)序結(jié)構(gòu)的那些，其中氨基酸隨聚合物鏈以無(wú)規(guī)方式分布。至于AAN/AAI+AAN摩爾比，它取決于PAA的“嵌段”或“統(tǒng)計(jì)學(xué)”結(jié)構(gòu)。該摩爾比為-對(duì)“嵌段”P(pán)AA，≥6％，優(yōu)選≥15％，-對(duì)“統(tǒng)計(jì)學(xué)”P(pán)AA，≥20％，優(yōu)選≥25％。本發(fā)明的另一特征是所選多聚氨基酸的質(zhì)量高。對(duì)此應(yīng)指出的是本發(fā)明所用多聚氨基酸的優(yōu)選重均摩爾質(zhì)量(Mw)根據(jù)所用聚氨基酸的類(lèi)型而不同。例如，對(duì)如上定義的“嵌段”多聚氨基酸，Mw≥5500D，優(yōu)選6500D-200000D，更優(yōu)選8000-20000D。而對(duì)“統(tǒng)計(jì)學(xué)”多聚氨基酸，Mw≥10000D，優(yōu)選20000D-500000D，更優(yōu)選20000D-150000D。這些多聚氨基酸形成能夠與疏水物質(zhì)和親水物質(zhì)相作用的兩性聚合物，這賦予它們以有價(jià)值的表面活性劑或分散劑的特性。但除其兩性特征外，這些多聚氨基酸顯示出出人意外的新特性這些多聚氨基酸鏈在水溶液中自動(dòng)結(jié)合并形成能與蛋白質(zhì)結(jié)合的顆粒。實(shí)際上，這些顆粒最好形成活性成分分散于其中的基質(zhì)。優(yōu)選的α-肽鍵線(xiàn)性結(jié)構(gòu)和高摩爾質(zhì)量也是這些多聚氨基酸的重要特征。這些非水溶性PAA顯示出出人意外的新特性。當(dāng)與水溶液接觸時(shí)，它們?cè)谄渲凶詣?dòng)形成納米顆粒(NDP)的膠態(tài)懸液，這些納米輸送顆粒能夠聚集成微米顆粒。另外，溶液中的蛋白質(zhì)能夠與這些顆粒自動(dòng)結(jié)合，形成載有活性成分的顆粒。這一發(fā)現(xiàn)在考慮到專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/25583的教導(dǎo)時(shí)就更加令人驚異了，后者似鼓勵(lì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將其尋求蛋白包囊理想材料的研究朝向多聚氨基酸之外的物質(zhì)。實(shí)際上，專(zhuān)利申請(qǐng)WO93/25583中給出的已進(jìn)行過(guò)的大量試驗(yàn)提示在所有受試多聚氨基酸中，只有該申請(qǐng)所選擇并要求的那些適用。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)了創(chuàng)造性的勞動(dòng)才證明事實(shí)并非如此，申請(qǐng)人提出了與WO93/25583中那些聚氨基酸行為不同的另一類(lèi)選擇的聚氨基酸，這些PAA特別為高摩爾質(zhì)量的線(xiàn)性PAA(4000D以上)，而不是小的支寡聚物，-不溶性PAA，而且令人驚異的是這些不溶性PAA自動(dòng)形成NDP膠狀懸液，蛋白質(zhì)自發(fā)與NDP結(jié)合。優(yōu)選的聚氨基酸是最好由經(jīng)肽鍵連接的α-氨基酸組成的線(xiàn)性合成聚合物。有大量的合成技術(shù)可形成嵌段或統(tǒng)計(jì)學(xué)聚合物、含多條鏈的聚合物及含特定氨基酸序列的聚合物(見(jiàn)“聚合物科學(xué)和工程大全”(EncyclopediaofPolymerScienceandEngineering)，第12卷，786頁(yè)；JohnWiley&amp;Sons)。為合成多聚氨基酸使用了大量氨基酸和肽衍生物。但最常用的單體是N-羧基-α-氨基酸酐，后者的制備例如見(jiàn)《生物聚合物》(Biopolymers)，15，1869(1976)。這些單體的聚合是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在H.R.KRICHELDORF的著作“α-氨基酸N-羧基酸酐及相關(guān)雜環(huán)”SpringerVerlag(1987)中有詳細(xì)描述。這種合成技術(shù)一般涉及對(duì)帶可離子化側(cè)鏈的氨基酸中的反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，以使其不參與聚合步驟。聚合后有必要進(jìn)行脫保護(hù)步驟，以重建聚合物可離子化側(cè)鏈的官能團(tuán)。例如可提及甲酯皂化的脫保護(hù)方法〔STAHMAN等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，197，771(1952)；KYOWAHAKKO，F(xiàn)R2152582)或脫芐基化〔BLOUT等，美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志(J.Amer.Chem.Soc.〕，80，4631(1858)〕。最好，輸送顆粒的平均聚氨基酸濃度為0.01％-25％(干重)，優(yōu)選0.05-10％(干重)。按本發(fā)明顆粒的一種優(yōu)選實(shí)施方案，AAN選自下列即Leu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe和其混合物，而AAI由Glu和/或Asp組成。更優(yōu)選，本發(fā)明的顆粒以其組成性多聚氨基酸含單一類(lèi)型AAI單體為特征，優(yōu)選相應(yīng)于Glu，而單一類(lèi)型AAN單體優(yōu)選相應(yīng)于Leu。將共聚單體限制到兩種，即一種AAN和一種AAI，使得顆粒的免疫原性最小。這是這一優(yōu)選實(shí)施方案的顯著優(yōu)點(diǎn)。選擇的聚氨基酸顆粒大小構(gòu)成本發(fā)明的基本要素。最好，這些顆粒的平均粒度為0.01-200μm間，而且粒度分布窄。本發(fā)明的最大價(jià)值之一是非常成功地控制顆粒的平均粒度和其粒度分布。這種控制來(lái)自極小顆粒的獲得，這種顆粒大小在幾個(gè)納米的級(jí)別并且有很低的多分散性，已知這種納米顆粒的大小可能經(jīng)聚集而增大。雖無(wú)意對(duì)此施加任何限制，但根據(jù)其大小可能區(qū)分兩個(gè)組群的顆粒。第一個(gè)組群是納米顆粒型NDP的集合，平均粒度在0.01μm到0.5μm之間，優(yōu)選在0.03-0.4μm間。第二組群包括MDP型顆粒，平均粒度大于0.5μm，優(yōu)選不超過(guò)20μm。為本發(fā)明目的，平均粒度應(yīng)理解為對(duì)MDP，為通過(guò)激光衍射測(cè)定的直徑算術(shù)平均值(體積)(D4.3)，對(duì)NDP，為通過(guò)光的彈性散射測(cè)定的回轉(zhuǎn)直徑。微米粒MDP最好從納米粒NDP如通過(guò)聚集而獲得。一種變異方案中，微米粒包含至少一種聚集劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征是，顆粒包含至少一種活性成分。另外，通過(guò)聚氨基酸的組成、對(duì)相同組成還通過(guò)有序結(jié)構(gòu)(交替序列，即嵌段S1)或無(wú)序結(jié)構(gòu)(隨機(jī)序列，即統(tǒng)計(jì)的S2)來(lái)達(dá)到MDP和NDP粒度的控制。本說(shuō)明書(shū)中將使用的聚氨基酸的命名方法如下聚AAN1/AAN2/…/AAI1/AAI2/…-A/B/C/D…，A、B、C、D…為氨基酸的摩爾百分0率。另外，加上述語(yǔ)“嵌段”來(lái)區(qū)別有序嵌段結(jié)構(gòu)和無(wú)序或統(tǒng)計(jì)結(jié)構(gòu)。例如，由30％亮氨酸和70％谷氨酸組成的統(tǒng)計(jì)共聚物為聚Leu/Glu-30/70，具有相同組成和嵌段結(jié)構(gòu)(Leu)n-(Glu)m的共聚物為聚Leu/Glu(嵌段)-30/70。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該顆粒的特征在于AAI＝Glu，AAN＝Leu。除本身為新物質(zhì)的上述顆粒外，本發(fā)明還涉及能用作活性成分輸送載體的聚氨基酸基顆粒的制備方法，其特征-在于使用聚氨基酸(PAA)◆含有至少兩類(lèi)重復(fù)氨基酸，AAN和AAI·AAN型相當(dāng)于疏水中性氨基酸，·AAI型相當(dāng)于具有可離子化側(cè)鏈的氨基酸，AAN和AAI中每類(lèi)重復(fù)氨基酸相互相同或不同，◆AAN/AAI+AAN摩爾比≥3％，優(yōu)選≥5％，◆聚氨基酸的重均摩爾質(zhì)量不低于4000D，優(yōu)選不低于5000D，-還在于這些聚氨基酸在液體、優(yōu)選在鹽水溶液中進(jìn)行分散，液體pH調(diào)節(jié)在一個(gè)選定的值，此時(shí)至少部分AAI型氨基酸為電離形式，還在于收集顆粒的膠體溶液。以上在介紹顆粒的部分給出的PAA特征的描述可以整個(gè)轉(zhuǎn)至這里關(guān)于方法的描述部分。該方法是獲得上述NDP的方法之一。因而這些顆粒是其中AAN選自下列即Leu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe和其混合物的那些，和其中AAI由Glu和/或Asp組成的那些。NDP的形成方式很簡(jiǎn)單，在鹽水溶液(例如)中，在使至少部分AAI單體(相互間性質(zhì)相同或不同)呈離子化形式的選定pH下，共聚氨基酸在鹽水介質(zhì)中分散自動(dòng)形成納米粒，這使其具有值得注意的簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和工業(yè)上易行的特點(diǎn)。另外，利用該方法可能避開(kāi)有機(jī)溶劑，后者一般用于此類(lèi)顆粒的制備且已知造成蛋白變性。獲得這些NDP的條件易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握。NDP的形成一方面依賴(lài)于水分散溶液的性質(zhì)，另一方面依賴(lài)于聚氨基酸的特征。用于聚氨基酸分散的水溶液必須滿(mǎn)足pH和離子強(qiáng)度的一定條件。實(shí)際上很容易理解，含離子化基團(tuán)的聚合物納米粒的穩(wěn)定性取決于離子強(qiáng)度。至于pH，它當(dāng)然取決于可離子化基團(tuán)的性質(zhì)，根據(jù)它確定電離份數(shù)f。例如，對(duì)于羧基，f隨著pH升高而增大。總之，本發(fā)明方法最明確的優(yōu)點(diǎn)是允許在3-13的寬pH范圍內(nèi)不依賴(lài)于pH而自動(dòng)形成NDP，從而充分覆蓋了生物pH值范圍，開(kāi)辟了廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。聚合氨基酸的NDP形成膠體溶液。就這些聚氨基酸，NDP形成的區(qū)別性特征是1)摩爾質(zhì)量，2i)氨基酸的性質(zhì)，3i)氨基酸的比例，4i)存在線(xiàn)性連接，優(yōu)選α-肽連接，5i)沿聚合物鏈的氨基酸分布，根據(jù)“嵌段”或“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)，分別為規(guī)則或隨機(jī)分布。這些特征討論如下關(guān)于摩爾質(zhì)量的影響，可注意到NDP形成是由聚氨基酸鏈間氨基酸的結(jié)合，這種結(jié)合行為根據(jù)聚合物的結(jié)構(gòu)和摩爾質(zhì)量而不同。對(duì)“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)的聚氨基酸，摩爾質(zhì)量不低于10000D，優(yōu)選在20000D-500000D間，更優(yōu)選在20000D-150000D間的聚合物，易于分散在水溶液中并形成穩(wěn)定的NDP膠態(tài)懸液。在相同條件下，較低摩爾質(zhì)量的聚合物不能形成穩(wěn)定的膠態(tài)懸液；部分顆粒沉淀，NDP保持在分散液中，擴(kuò)散傾向很小。因而，較高摩爾質(zhì)量的聚氨基酸更有利于聚合物鏈結(jié)合成NDP。對(duì)于“嵌段”結(jié)構(gòu)的聚氨基酸，有利于相同氨基酸嵌段間的鏈間結(jié)合，從而允許使用比“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)聚氨基酸摩爾質(zhì)量小的聚合物。摩爾質(zhì)量不低于5000D，優(yōu)選6500-200000D，更優(yōu)選8000D-20000D的聚合物易于分散在水溶液中，形成穩(wěn)定的NDP膠態(tài)懸液。關(guān)于氨基酸性質(zhì)和其比例的影響，可指出對(duì)于亮氨酸和谷氨酸的PAA，亮氨酸的份數(shù)必須足夠高以防止聚合物完全可溶，并提供使聚合物鏈結(jié)合成NDP的足夠疏水作用?！扒抖巍本郯被釋?duì)這種鏈間作用有利，“嵌段”聚合物形成NDP所需最小亮氨酸份數(shù)低于“統(tǒng)計(jì)”聚合物所需的。例如，已可能證明亮氨酸和谷氨酸“統(tǒng)計(jì)”聚合物中的臨界濃度(低于此濃度則聚合物可溶)為20-30％。為制備本發(fā)明的NDP，最好將鹽水溶液的摩爾濃度設(shè)在10-4-1M，優(yōu)選10-2M到最高0.5M。本發(fā)明的另一實(shí)用細(xì)節(jié)是，選擇溶液中聚合物濃度(用重量/體積百分?jǐn)?shù)表示)不低于10-2，優(yōu)選0.05-30，更優(yōu)選0.05-5。因?yàn)楸景l(fā)明顆粒和其制備方法的最令人注目的應(yīng)用之一是保護(hù)下在人或動(dòng)物體內(nèi)輸送活性成分，為此目的，最好設(shè)計(jì)使至少一種活性成分溶解在形成顆粒的液態(tài)介質(zhì)中。活性成分的溶解，尤其對(duì)于蛋白性和肽活性成分，優(yōu)選在向介質(zhì)引入聚氨基酸之前進(jìn)行，以在引入后得到載有活性成分的顆粒的膠態(tài)溶液。雖不希望拘于理論，但可以假定活性成分與聚氨基酸之間的作用是疏水結(jié)合和靜電結(jié)合的結(jié)果。綜上所述，本發(fā)明的包囊構(gòu)成如下-使活性成分包囊到水溶液中，將聚氨基酸分散在水溶液中，然后將所形成的納米粒的膠態(tài)懸液與活性成分溶液混合，或者優(yōu)選地將聚氨基酸直接分散在活性成分溶液中，以自動(dòng)得到載有活性成分的納米粒。本發(fā)明的主要基本特征之一是活性成分與顆粒的結(jié)合行為不依賴(lài)于pH。從上文已看到，將共聚氨基酸分散在液態(tài)介質(zhì)(優(yōu)選鹽水)中，構(gòu)成本發(fā)明適當(dāng)載有活性成分之顆粒制備方法的一個(gè)關(guān)鍵步驟。本發(fā)明方法的特征還在于它還包括至少一個(gè)將納米粒(NDP)聚集成微米粒(MDP)的步驟，優(yōu)選借助于鹽和/或酸和/或聚合物(最好用聚電解質(zhì))。由于本發(fā)明方法的這一特征，可以將0.01-0.05μm大小的NDP聚集成0.05-200μm大小的MDP，優(yōu)選0.05-20μm，更理想為0.05-10μm大小。這種聚集必須在對(duì)活性成分非致變性的條件下進(jìn)行，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)加入鹽或酸或陽(yáng)離子聚合物尤其能造成NDP聚集成MDP。加入鹽使介質(zhì)離子強(qiáng)度升高，掩蔽顆粒間的靜電排斥而造成NDP聚集。另外，該鹽還可作為顆粒表面聚氨基酸羧基官能團(tuán)的交聯(lián)劑，幾個(gè)羧酸與鹽的陽(yáng)離子配合從而造成聚集。此時(shí)優(yōu)先選擇那些與羧酸形成配合物的多陽(yáng)離子鹽，如Fe2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Al2+、Al3+和Cu2+鹽。加入酸則中和聚氨基酸的羧基官能團(tuán)從而降低電離份數(shù)f，造成NDP聚合成MDP。能發(fā)生聚集的電離份數(shù)取決于聚氨基酸的組成AAN/(AAN+AAI)。AAI比例越高，該份數(shù)越小。加入的酸最好是pKa低于聚氨基酸羧基官能團(tuán)的強(qiáng)酸。陽(yáng)離子聚合物通過(guò)結(jié)合NDP而作為聚集劑，它們?cè)陬w粒表面的羧酸官能團(tuán)之間形成配合物，從而通過(guò)陽(yáng)離子聚合物分子將其相互連接。NDP聚集成MDP的條件在實(shí)施例給出。本方法最后是按本身已知的適當(dāng)方法回收有或無(wú)活性成分包囊的(納米)和(微米)顆粒。實(shí)踐中，例如可使用離心和冷凍干燥。能包含或引入(優(yōu)選按一基質(zhì)型設(shè)置)本發(fā)明顆粒(無(wú)論是否按上述方法獲得)中的活性成分，是藥物和/或營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選選自◆蛋白和/或肽，其中優(yōu)選選自血紅蛋白，細(xì)胞色素，白蛋白，干擾素，抗原，抗體，calatonin，促紅細(xì)胞生成素，胰島素，生長(zhǎng)激素，第IX因子，白細(xì)胞介素或其混合物，◆多糖，尤其選擇肝素，◆核酸，優(yōu)選RNA和/或DNA的寡核苷酸，◆和它們的混合物。一種可歸入藥品類(lèi)適于用本發(fā)明顆粒輸送的活性成分是疫苗。作為營(yíng)養(yǎng)物的例子可提及維生素、氨基酸和微量元素。本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及載有活性成分的NDP和MDP在制備含活性成分控釋系統(tǒng)的藥品中的用途。最后，本發(fā)明涉及含有如上所定義載有活性成分的輸送顆粒的藥品或藥物制劑或營(yíng)養(yǎng)制劑。對(duì)于藥品，它們例如可以是優(yōu)選經(jīng)口、鼻、陰道、眼、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)或腸胃外途徑給藥的那些。本發(fā)明的應(yīng)用不限于藥物或營(yíng)養(yǎng)物類(lèi)活性成分的輸送或轉(zhuǎn)遠(yuǎn)。實(shí)際上，能包含在或引入輸送顆粒的活性成分為至少一種化妝產(chǎn)品或植物保護(hù)劑是完全可以想像的?？梢栽O(shè)想化妝品應(yīng)用為例如可透皮施用的組合物。所述植物保護(hù)劑例如可為除草劑、殺蟲(chóng)劑、殺昆蟲(chóng)劑、殺真菌劑等。本發(fā)明的主題還包括含如上指出的載有活性成分的輸送顆粒的植物保護(hù)組合物和化妝品組合物。下列實(shí)施例將使人從其產(chǎn)品/方法/應(yīng)用的不同方面更好地理解本發(fā)明。這些實(shí)施例說(shuō)明載有或以其他方式帶有活性成分的聚氨基酸顆粒的制備，還給出了這些顆粒的結(jié)構(gòu)特征和特性。實(shí)施例I.所測(cè)試聚氨基酸的制備實(shí)施例中所用聚合物具有嵌段或統(tǒng)計(jì)結(jié)構(gòu)的基于亮氨酸和谷氨酸的線(xiàn)性合成共聚物。這些聚氨基酸通過(guò)在三氟乙酸溶劑中用光彈性散射測(cè)定，重均摩爾質(zhì)量Mw為50000D到150000D。這些聚合物從亮氨酸和谷氨酸甲酯的共聚物獲得，用例如STAHMAN等，“生物化學(xué)雜志”，197，771(1952)或KYOWAHAKKO專(zhuān)利FR2152582中所述已知的甲酯脫保護(hù)方法，重建谷氨酸鈉的可離子化側(cè)鏈官能團(tuán)。亮氨酸和谷氨酸甲酯的共聚物從亮氨酸和谷氨酸甲酯的N-羧基-α-氨基酸酐(NCA)獲得，后者的制備方法例如見(jiàn)“生物聚合物”，15，1869(1970)。NCA聚合成具有嵌段或統(tǒng)計(jì)結(jié)構(gòu)的聚合物所用的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在H.R.KRICHELDORF的著作“α-氨基酸N-羧基酸酐及相關(guān)雜環(huán)”(SpringerVerlag，1987)中有詳細(xì)描述。實(shí)施例1“統(tǒng)計(jì)”聚氨基酸聚(Leu/Glu)50/50的合成步驟1)NCA-Leu和NCA-Glu(OMe)的共聚化聚(Leu-CO-Glu(OMe))50/50向一裝有玻璃攪拌器、氮?dú)馊肟诤统隹诓⑴c一鼓泡裝置相接的1升反應(yīng)器中，在氮?dú)饬飨录尤?5.0g谷氨酸甲酯N-羧基酸酐(NCAGlu(OMe)，0.08mol)和12.5g亮氨酸N-羧基酸酐(NCA-Leu，0.08mol)。加入381ml二噁烷，加熱反應(yīng)介質(zhì)至40℃。NCA溶解后，加入24ml水，然后加入0.22ml三乙胺(相對(duì)NCA，相當(dāng)于1mol％)。在IR中觀(guān)察1860和1790cm-1處羰基鍵的消失來(lái)監(jiān)視聚合過(guò)程。根據(jù)單體的組成聚合時(shí)間在1.5小時(shí)到3小時(shí)。兩個(gè)帶完全消失以后，用380ml二噁烷烯釋反應(yīng)介質(zhì)，然后在室溫下均質(zhì)化3小時(shí)。在5升水中充分?jǐn)嚢柘鲁恋硪曰厥展簿畚铩＿^(guò)濾產(chǎn)物并在55℃下真空干燥12小時(shí)。共聚物重18.4g，相當(dāng)于90％的重量收率。1HNMR(三氟乙酸-d)0.85ppm(CH3-Leu，6H*0.5)；1.58(CH2和CHMe2Leu，3H*0.5)；2.10和2.22(CH2-Glu，2H*0.5)；2.58(CH2-Glu；2H*0.5)；3.75(CH3-Glu，3H*0.5)；4.62(NCHCO-Leu，1H*0.5)；4.70(NCHCO-Glu，111*0.5)比濃粘度(三氟乙酸中0.5g/dl，25℃)＝2.2dl/g。步驟2)聚(Leu-CO-Glu(OMe)50/50的甲酯水解將上述所得共聚物(17.7g)置于一反應(yīng)器中，向其中加入354nl三氟乙酸。攪拌下加熱反應(yīng)介質(zhì)至40℃。當(dāng)共聚物完全溶解時(shí)，每次少量加入354ml水。反應(yīng)介質(zhì)保持?jǐn)嚢?8小時(shí)。在5升水中沉淀來(lái)回收共聚物。過(guò)濾后再次懸浮于水中并攪拌0.5小時(shí)，然后過(guò)濾，排水。對(duì)水透析進(jìn)行純化。收率15.9g(95％)。1HNMR(三氟乙酸-d)與起始共聚物相同，只是3.75處的單峰(CH3-Glu)大大降低或消失。本例中相對(duì)谷氨酸酯單體，殘余酯含量小于1％。比濃粘度(三氟乙酸中0.5g/dl，25℃)＝0.95dl/g。實(shí)施例2“嵌段”聚氨基酸聚(Leu/Glu)50/50二嵌段共聚物的合成將15.0gNCA-Glu(OMe)(0.08mol)和180mol二噁烷在攪拌下引入1升反應(yīng)器中。溶解后，加入180ml甲苯，加熱混合物至60℃。記錄溶液的IR光譜，然后加入0.156g芐胺(1.58mol％/NCA)。反應(yīng)介質(zhì)迅速變混濁，40分鐘后1860和1790cm-1處的特征峰消失。1小時(shí)后，加入12.5gNCA-Leu(0.08mol)在二噁烷/甲苯混合物(各15ml)中的溶液。繼續(xù)攪拌18小時(shí)(這是最優(yōu)化時(shí)間)。羰基帶已消失。加入100ml二噁烷，將反應(yīng)介質(zhì)均質(zhì)化1小時(shí)。在3升絕對(duì)乙醇中劇烈攪拌下共聚物沉淀出來(lái)。用1升乙醇洗滌，過(guò)濾，排水，最后50℃下干燥過(guò)夜。所得產(chǎn)物重19.5g(收率＝95％)。1HNMR(三氟乙酸-d)0.85ppm(CH3-Leu，6H*0.5)；1.58(CH2和CHMe2Leu，3H*0.5)，2.10和2.22(CH2-Glu，2H*0.5)；2.58(CH2-Glu，2H*0.5)；3.75(CH3-Glu，3H*0.5)；4.62(NCHCO-Leu，1H*0.5)；4.70(NCHCO-Glu1H*0.5)比濃粘度(三氟乙酸中0.5g/dl，25℃)＝0.62dl/g。第二步甲酯的水解與實(shí)施例1步驟2中描述的相同。收率＝95％，1HNMR(三氟乙酸)與起始聚合物相同，但是3.75的單峰(CH3-Glu)大大降低或消失。在本例中，殘余酯含量相對(duì)谷氨酸酯單體小于1％。25℃下的還原粘度(三氟乙酸中0.5g/dl)＝0.55dl/g。實(shí)施例3“嵌段”聚氨基酸聚(Glu/Leu/Glu)29/57/14三嵌段共聚物的合成將7.5gNCA-Glu(OMe)(0.04mol)和180ml二噁烷攪拌下加入下1升反應(yīng)器中。溶解后，加入180ml甲苯，加熱混合物至60℃。記錄溶液的IR光譜，然后加入0.156g芐胺。單體完全消后，加入二噁烷/甲苯混合物(各15ml)中的12.5gNCA-Leu(0.08ml)。繼續(xù)攪拌18小時(shí)。然后再加入7.5gNCA-Glu(OMe)(0.04mol)，讓反應(yīng)進(jìn)行12小時(shí)。加入100ml二噁烷，均化反應(yīng)介質(zhì)1小時(shí)。該共聚物在3升絕對(duì)乙醇中劇烈攪拌下沉淀。用1升乙醇洗滌，過(guò)濾，排水，最后在50℃真空干燥過(guò)夜。所得產(chǎn)物重為19.4g(收率＝95％)。1HNMR(三氟乙酸)0.85ppm(CH3-Leu，6H*0.5)，1.58(CH2和CHMe2Leu，3H*0.5)；2.10和2.22(CH2-Glu，2H*0.37)；2.58(CH2-Glu；2H*0.37)；3.75(CH3-Glu，3H*0.37)；4.62(NCHCO-Leu，1H*0.5)；4.70(NCHCO-Glu，1H*0.37)比濃粘度(三氟乙酸中0.5g/dl，25℃)＝0.58dl/g。第二步甲酯水解與實(shí)施例1步驟2所述相同。1HNMR(三氟乙酸-d)與起始聚合物相同，只是3.75處的信號(hào)(CH3-Glu)大大降低或消失。在本例中，殘余酯的含量相對(duì)谷氨酸酯單體小于1％。比濃粘度(三氟乙酸中0.5g/dl，25℃)＝0.38dl/g。II.含或不含活性成分的聚氨基酸納米粒(NDP)的形成II-1.AAN濃度對(duì)顆粒形成的影響實(shí)施例4形成具有“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)30/70，50/50和75/25的納米粒。組成為L(zhǎng)eu/Glu＝30/70、摩爾質(zhì)量Mw＝36000D的亮氨酸和谷氨酸鈉的統(tǒng)計(jì)共聚氨基酸100mg，分散在摩爾濃度為10-2mol/l的氯化鈉溶液100ml中。加入鹽酸或氫氧化鈉可調(diào)節(jié)pH，在4.5-12間的任何溶液pH下，該聚合物自動(dòng)形成納米粒膠態(tài)分散體。在低于pH4.5的酸性介質(zhì)中(這相當(dāng)于電離份數(shù)等于0.05)，冷凍干燥的聚合物不能分散在該溶液中，保持不溶。在相同分散條件下試驗(yàn)了組成為L(zhǎng)eu/Glu＝50/50及75/25、摩爾質(zhì)量Mw分別為60000D和34000D的亮氨酸和谷氨酸鈉統(tǒng)計(jì)共聚氨基酸，觀(guān)察結(jié)果整理在下表1中。表1</tables>實(shí)施例5形成具有“嵌段”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)20/8040/60和50/50的納米粒組成為L(zhǎng)eu/Glu＝50/50、摩爾質(zhì)量Mw＝14600的亮氨酸和谷氨酸鈉的嵌段共聚氨基酸100mg，分散在摩爾濃度為10-2mol/l的氯化鈉溶液100ml中。加入鹽酸或氫氧化鈉可調(diào)節(jié)pH，在3-12間的任何溶液pH下，該聚合物自動(dòng)形成納米粒膠態(tài)分散體，這些顆粒散射光并使溶液高度混濁。該溶液在15-20℃室溫下靜置幾小時(shí)，聚合物的納米粒不沉淀。在低于pH3的酸性介質(zhì)中，該聚合物不分散在溶液中，保持不溶。在pH3-12的相同條件下，具有“嵌段”結(jié)構(gòu)，摩爾質(zhì)量分別為11000D和15000D的聚(Leu/Glu)20/80和40/60分散并形成膠態(tài)懸浮液。聚合物中亮氨酸比例越高，這些膠態(tài)懸浮液散射光越強(qiáng)。在低于3的pH下，與聚(Leu/Glu)50/50一樣，觀(guān)察到這些聚合物不分散，保持不溶。實(shí)施例6具有“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)18/82的溶解度該實(shí)施例表明，組成為L(zhǎng)eu/Glu＝18/82的亮氨酸和谷氨酸鈉共聚物不能形成納米粒，因?yàn)闊o(wú)論pH≤4.5，它們完全溶于水。將10mg凍干的聚(Leu/Glu)18/82分散在摩爾濃度為10-2mol/l的氯化鈉溶液0.5ml中。該聚合物完全溶解，溶液清澈。該聚合物不能形成納米粒。實(shí)施例7不同聚(Leu/Glu)聚合物膠態(tài)懸液的穩(wěn)定性將組成為L(zhǎng)eu/Glu＝30/70、50/50和75/25、摩爾質(zhì)量MW＝36000D、60000D和34000D的亮氨酸谷氨酸鈉統(tǒng)計(jì)共聚氨基酸100mg分別分散在10ml、5ml和2ml10-2mol/l氫氧化鈉溶液中，從而形成濃度為1％、2％和5％w/v的各種聚氨基酸的溶液。然后在室溫(15-25℃)下放置4個(gè)月測(cè)定其穩(wěn)定性。測(cè)試期結(jié)束時(shí)納米粒沒(méi)有沉淀出來(lái)，溶液的擴(kuò)散系數(shù)沒(méi)有變化。實(shí)施例8具有“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)和具有“嵌段”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)50/50在等滲磷酸鹽緩沖液中形成納米粒將具有“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)，摩爾質(zhì)量Mw等于60000D的聚(Leu/Glu)50/50聚氨基酸100mg分散在含有0.01mol/l磷酸鹽緩沖液、0.138mol/l氯化鈉和0.0027mol/l氯化鉀的pH7.4等滲溶液(PBS，見(jiàn)SIGMA分類(lèi)號(hào)P4417)中。該聚合物自動(dòng)形成納米粒的膠態(tài)分散液，其散射光線(xiàn)。該溶液在15-20℃的室溫下放置數(shù)小時(shí)，聚合物的納米粒沒(méi)有沉淀。在相同條件下，當(dāng)將100mg摩爾質(zhì)量Mw＝14600D的聚(Leu/Glu)50/50嵌段聚氨基酸分散在PBS緩沖液中時(shí)，獲得納米粒懸液，其在室溫下穩(wěn)定，以高濁度散射光線(xiàn)。II.2-“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)或“嵌段”結(jié)構(gòu)聚(Leu/Glu)納米粒的大小和結(jié)構(gòu)聚氨基酸的納米粒形成膠態(tài)溶液。靜態(tài)或準(zhǔn)彈性光散射使得能測(cè)定納米粒的大小和聚合物密度。表2中綜合了對(duì)組成為L(zhǎng)eu/Glu＝30/70和50/50、摩爾質(zhì)量Mw為46000D-21000D的統(tǒng)計(jì)聚氨基酸、以及組成為L(zhǎng)eu/Glu20/80和50/50、摩爾質(zhì)量為11000D-16300D的“嵌段”聚氨基酸進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。為了進(jìn)行這些測(cè)定，將聚氨基酸分散在含0.01mol/l磷酸鹽緩沖液、0.138mol/l氯化鈉和0.0027mol/l氯化鉀的pH7.4等滲溶液中(見(jiàn)SIGMA分類(lèi)號(hào)P4417)。表2納米粒的大小隨著聚氨基酸的組成而變化。對(duì)于相同的組成，則取決于聚氨基酸鏈的二嵌段或無(wú)序結(jié)構(gòu)。另外，基于準(zhǔn)彈性光散射分析，聚氨基酸納米粒的直徑分布為正態(tài)分布，集中在其平均值周?chē)?。所得分布寬度與多分散性為1.2的聚苯乙烯的相當(dāng)或較小。納米粒中聚合物濃度很低，總低于6％w/v。這取決于聚氨基酸的組成和二嵌段或無(wú)序結(jié)構(gòu)。而且，電子顯微鏡觀(guān)察(TEM負(fù)染)顯示納米粒為球形或略偏長(zhǎng)。II.3-納米粒的免疫原性實(shí)施例9聚(Leu/Glu)40/60、50/50和60/40(嵌段)納米粒的致免疫能力將摩爾質(zhì)量等于約12000D的聚(Leu/Glu)40/60、50/50和60/40(嵌段)分散在含有0.01mol/l磷酸鹽緩沖液、0.138mol/l氯化鈉和0.0027mol/l氯化鉀的pH7.4等滲溶液(見(jiàn)SIGMA分類(lèi)號(hào)P4417)中。聚合物濃度等于2.5mg/ml。該懸液渾濁，將其通過(guò)0.2μm孔度的聚砜膜過(guò)濾以滅菌沒(méi)有特別困難。所用動(dòng)物為無(wú)血親OF1種系小鼠(每種試驗(yàn)聚合物用5只小鼠為一組)。每次注射皮下注射100μl聚合物懸液(250μg聚合物)。在D0時(shí)間進(jìn)行第一次注射，在D35時(shí)間進(jìn)行加強(qiáng)注射。在D42時(shí)間取樣，即在第二次注射后第7天。將血樣在室溫放24小時(shí)，然后3000rpm離心10分鐘。用ELISA實(shí)驗(yàn)分析血清。在血清中，包括低血清稀釋液(1/10)中，沒(méi)有檢測(cè)到抗聚合物的抗體。該實(shí)施例顯示聚(Leu/Glu)40/60、50/50和60/40(嵌段)的納米粒不能誘導(dǎo)特異的免疫應(yīng)答。II.4-納米粒與有色模型蛋白的結(jié)合用血紅蛋白和馬心及釀酒糖酵母的細(xì)胞色素c作為模型蛋白描述包囊方法。用分析型超速離心法證明聚合物納米粒與蛋白之間的結(jié)合。高速離心聚合物和蛋白的溶液，在250nm和410nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度來(lái)監(jiān)視聚合物和蛋白的沉降前峰的進(jìn)展。蛋白與膠體顆粒的結(jié)合以存在單一沉降前峰為特征，該單一前峰相當(dāng)于在兩波長(zhǎng)下沉降前峰的重疊。反之，若沒(méi)有結(jié)合，蛋白和膠體顆粒的沉降前峰是分開(kāi)的，沒(méi)有重疊。實(shí)施例10聚(Leu/Glu)30/70與細(xì)胞色素c的結(jié)合將10mg細(xì)胞色素C溶解在100mlpH7.2摩爾濃度0.01mol/l的磷酸鈉緩沖溶液中。然后將100mg摩爾質(zhì)量Mw＝36000D的聚(Leu/Glu)30/70直接分散在該溶液中。離心過(guò)程中，大部分細(xì)胞色素c與聚合物的膠體顆粒沉積。沉降前峰的光密度分析表明80％的細(xì)胞色素與膠體顆粒結(jié)合。實(shí)施例11聚(Leu/Glu)30/70與細(xì)胞色素c的結(jié)合將10mg細(xì)胞色素c溶解在100mlpH7.2摩爾濃度0.01mol/l的磷酸鈉緩沖溶液中。然后將200mg摩爾質(zhì)量Mw＝60000D的聚(Leu/Glu)50/50直接分散在該溶液中。離心過(guò)程中，大部分細(xì)胞色素c與聚合物的膠體顆粒沉積。沉降前峰的光密度分析表明80％的細(xì)胞色素與膠體顆粒結(jié)合。實(shí)施例12聚(Leu/Glu)30/70與血紅蛋白結(jié)合在本實(shí)施例中，按兩種不同的方式從實(shí)施例4中的相同溶液制備聚氨基酸和蛋白的膠體懸液，但溶解順序有變1.按實(shí)施例4中的相同條件下將摩爾質(zhì)量Mw＝90000D的聚(Leu/Glu)30/70分散在血紅蛋白溶液中。膠體懸液的超速離心分析表明血紅蛋白與納米粒中的聚氨基酸結(jié)合。2.將摩爾質(zhì)量Mw＝40000D的聚(Leu/Glu)30/70分散在不含血紅蛋白的緩沖溶液中。然后所形成的膠體懸液與血紅蛋白溶液混合。這種情況下，大部分血紅蛋白(估計(jì)80％)不與聚氨基酸的納米粒結(jié)合，超速離心分析顯示兩個(gè)分別相應(yīng)于聚合物納米粒和血紅蛋白的沉降前峰。聚氨基酸分散前蛋白溶解的第一步對(duì)于血紅蛋白來(lái)說(shuō)提供了更好的包囊收率。II.5-納米粒與蛋白的結(jié)合實(shí)施例13卵清蛋白存在下聚(Leu/Glu)30/70的結(jié)合在實(shí)施例4或5的相同條件下，將摩爾質(zhì)量Mw＝90000D的聚(Leu/Glu)30/70分散在另外含有卵清蛋白的氯化鈉溶液中。光散射分析的膠體顆粒特征與無(wú)蛋白時(shí)所形成顆粒的相同。因而，蛋白并不阻止聚氨基酸結(jié)合成為納米粒，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)聚氨基酸的濃度達(dá)20％w/v時(shí)仍如此。實(shí)施例14聚(Leu/Glu)50/50(嵌段)與胰島素的結(jié)合從含有0.01mol/l磷酸鹽緩沖液、0.138mol/l氯化鈉和0.0027mol/l氯化鉀的pH7.4的等滲溶液制備1mg/ml濃度的重組胰島素(SIGMA，編號(hào)10259)溶液。將50mg摩爾質(zhì)量為12400D的聚(Leu/Glu)50/50(嵌段)分散在5ml該胰島素溶液中。得到了一種非?；鞚岬€(wěn)定的懸液。通過(guò)閾值為300000D的膜(Millipore，Ultrafree-CI，filter)超濾，將溶液中的游離胰島素與跟納米粒結(jié)合的胰島素分離，并用HPLC色譜分析濾液中的游離胰島素。這樣，用與游離胰島素量之差測(cè)得與納米粒結(jié)合的胰島素量為0.65mg/ml。實(shí)施例15具有“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)50/50與胰島素的結(jié)合在與實(shí)施例14中相同的條件下操作，用“統(tǒng)計(jì)”結(jié)構(gòu)的聚(Leu/Glu)50/50代替聚(Leu/Glu)50/50(嵌段)。與納米粒結(jié)合的胰島素量為0.60mg/ml。III.納米粒的聚集III.1-加鹽聚集實(shí)施例16加硫酸銨聚集將100mg摩爾質(zhì)量Mw＝36000D的聚(Leu/Glu)30/70分散在pH5的0.05mol/l檸檬酸/磷酸鈉緩沖液中。向此分散液中慢慢加入濃硫酸銨溶液。加入體積比分散溶液體積足夠小，直到NDP聚集為MDP。這樣得到的MDP平均直徑等于8μm。III.2-降低pH而聚集納米粒中聚氨基酸的側(cè)鏈羧基官能團(tuán)是部分電離的。加入酸將其中和引起納米粒的聚集。用解離常數(shù)(活性成分)小于聚氨基酸側(cè)鏈羧基官能團(tuán)的酸可進(jìn)行這種聚集。實(shí)施例17加鹽酸聚集將摩爾質(zhì)量Mw分別等于36000D、60000D和34000D的組成為L(zhǎng)eu/Glu＝30/70、50/50和75/25的統(tǒng)計(jì)聚氨基酸分散在摩爾濃度為0.05mol/lpH等于5的檸檬酸/磷酸鈉緩沖液中。Leu/Glu30/70和50/50組成的聚氨基酸的濃度為0.01％w/v，Leu/Glu75/25組成的聚氨酸濃度為0.005w/v。逐漸加入0.1mol/l鹽酸溶液進(jìn)行膠體懸液中納米粒的聚集，直到NDP聚集為MDP。MDP大小的測(cè)定結(jié)果列于下表3中。表3III.3-與陽(yáng)離子聚合物配合而聚集實(shí)施例18聚(Leu/Glu)50/50的納米粒通過(guò)與聚-DL-賴(lài)氨酸配合而聚集納米粒中聚氨基酸的側(cè)鏈羧基官能團(tuán)是部分電離的。它們與諸如聚賴(lài)氨酸的陽(yáng)離子聚合物配合，引起納米粒的聚集。將10mg摩爾質(zhì)量Mw＝60000D的聚(Leu/Glu)50/50分散在100ml摩爾濃度為0.01mol/l、pH等于6的磷酸鈉緩沖液中。加入15mg摩爾質(zhì)量Mw＝15000D的聚-DL-賴(lài)氯酸氫溴酸鹽，能使聚合物的納米粒聚集成微米粒。這種微米粒的平均直徑為10到20μm之間，隨著加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)的pH在2-9間的變化而變化。III.4-通過(guò)納米粒的聚集進(jìn)行蛋白包囊實(shí)施例19通過(guò)與聚-DL-賴(lài)氨酸配合進(jìn)行細(xì)胞色素c的包囊。將10mg摩爾質(zhì)量Mw＝60000D的聚(Leu/Glu)50/50分散在100ml摩爾濃度為0.01mol/l、pH等于6、含有10mg馬心細(xì)胞色素c的磷酸鹽緩沖溶液中。加入15mg摩爾質(zhì)量Mw＝15000D的聚-DL-賴(lài)氨酸氫溴酸鹽，能使聚合物的納米粒聚集為微米粒。離心沉降微米粒；離心沉淀的紅色表明基本上所有細(xì)胞色素已與納米粒沉積，表明細(xì)胞色素被包囊在微米粒中。權(quán)利要求1.基于平均粒度小于200μm的聚氨基酸的活性成分輸送顆粒，其特征在于-在于其構(gòu)成性多聚氨基酸(PAA)含有至少兩類(lèi)重復(fù)氨基酸，AAN和AAI◆AAN型相當(dāng)于疏水性中性氨基酸，◆AAI型相當(dāng)于帶有可離子化側(cè)鏈的氨基酸，AAI型重復(fù)氨基酸的至少一部分為電離形式，AAN和AAI中每類(lèi)重復(fù)氨基酸相同或不同，-還在于多聚氨基酸的重均摩爾質(zhì)量Mw不低于4000D，優(yōu)選不低于5000D。2.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征-在于其組成性PAA是“嵌段”P(pán)AA和/或“統(tǒng)計(jì)”P(pán)AA，-還在于◆對(duì)“嵌段”P(pán)AA·AAN/AAN+AAI摩爾比≥6％，優(yōu)選≥15％，·Mw≥5500D，優(yōu)選6500D≤Mw≤200000D，更優(yōu)選8000D≤Mw≤200000D，◆對(duì)“統(tǒng)計(jì)”P(pán)AA·AAN/AAN+AAI摩爾比≥20％，優(yōu)選≥25％，·Mw≥10000D，優(yōu)選20000D≤Mw≤500000D，更優(yōu)選200000D≤Mw≤150000D。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的顆粒，其特征在于AAN選自L(fǎng)eu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe和其混合物，-還在于AAI由Glu和/或Asp組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征在于聚氨基酸的平均濃度在0.01-25％(干重)之間，優(yōu)選在0.05-10％(干重)之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征在于它們是平均粒度為0.01-0.5μm，優(yōu)選0.03-0.4μm的納米輸送顆粒(NDP)。6.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征在于它們是平均粒度大于0.5μm，優(yōu)選不超過(guò)20μm的微米輸送顆粒(MDP)。7.根據(jù)權(quán)利要求6的顆粒，其特征在于它們是從權(quán)利要求1的顆粒獲得的，還在于它們優(yōu)選含有至少一種聚集劑。8.根據(jù)權(quán)利要求1的顆粒，其特征在于它們包含至少一種活性成分。9.能用作活性成分輸送載體的聚氨基酸基顆粒的制備方法，其特征在于使用聚氨基酸(PAA)◆含有至少兩類(lèi)重復(fù)氨基酸，AAN和AAI·AAN型相當(dāng)于疏水中性氨基酸，·AAI型相當(dāng)于具有可離子化側(cè)鏈的氨基酸，AAN和AAI中每類(lèi)重復(fù)氨基酸相同或不同，◆AAN/AAI+AAN摩爾比≥3％，優(yōu)選≥5％，◆聚氨基酸的重均摩爾質(zhì)量不低于4000D，優(yōu)選不低于5000D，-還在于這些聚氨基酸在液體、優(yōu)選在鹽水溶液中進(jìn)行分散，液體pH調(diào)節(jié)在一個(gè)選定的值，此時(shí)至少部分AAI型氨基酸為電離形式，-還在于收集顆粒的膠體溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征-在于AAN選自L(fǎng)eu、Ile、Val、Ala、Pro、Phe和其混合物，-還在于AAI由Glu和/或Asp組成。11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于優(yōu)選在將聚氨基酸引入介質(zhì)之前，將至少一種活性成分溶解在液體中，使得在引入聚氨基酸后能獲得一種載活性成分的顆粒的膠體溶液。12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于其包括至少一個(gè)用至少一種聚集劑聚集顆粒的附加步驟，所述聚集劑優(yōu)選由鹽和/或酸和/或堿和/或適當(dāng)時(shí)為離子性的聚合物組成。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于選擇聚合物的濃度不低于10-2％，優(yōu)選0.05-30％，更優(yōu)選0.05-5％w/v。14.權(quán)利要求1的顆粒和/或由權(quán)利要求9的方法獲得的顆粒，其特征在于活性成分為優(yōu)先選自下列物質(zhì)的藥物◆蛋白和/或肽，其中優(yōu)選選自血紅蛋白，細(xì)胞色素，白蛋白，干擾素，抗原，抗體，calatonin，促紅細(xì)胞生成素，胰島素，生長(zhǎng)激素，第IX因子，白細(xì)胞介素或其混合物，◆多糖，尤其選擇肝素，◆核酸，優(yōu)選RNA和/或DNA的寡核苷酸，◆和它們的混合物。15.權(quán)利要求1的顆粒和/或由權(quán)利要求9的方法獲得的顆粒，其特征在于活性成分由至少一種疫苗組成。16.權(quán)利要求1的顆粒和/或由權(quán)利要求9的方法獲得的顆粒，其特征在于活性成分由至少一種植物保護(hù)劑或化妝產(chǎn)品組成。17.藥物、營(yíng)養(yǎng)品、植物保護(hù)劑或化妝品，其特征在于它含有權(quán)利要求1的和/或按權(quán)利要求9的方法獲得的顆粒。全文摘要本發(fā)明涉及可用于活性成分(AP)給藥、特別是通過(guò)口服或非腸胃途徑給予藥物或營(yíng)養(yǎng)活性成分的輸送載體。本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了對(duì)活性成分惰性、粒度可控、堅(jiān)固而不昂貴的由聚氨基酸基(納米)或(微米)顆粒組成的輸送載體。根據(jù)本發(fā)明,顆粒的平均粒度小于200μm,由Leu/Glu型聚氨基酸組成,其中Leu/Glu+Leu≥3%,Mw≥4000D。文檔編號(hào)A61K8/04GK1183040SQ96193659公開(kāi)日1998年5月27日申請(qǐng)日期1996年3月28日優(yōu)先權(quán)日1995年3月28日發(fā)明者S·胡爾,A·萊莫希爾,G·索拉申請(qǐng)人:弗拉梅技術(shù)公司