專(zhuān)利名稱(chēng)：：旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性抑制劑的制作方法相關(guān)的申請(qǐng)本申請(qǐng)是1995年6月7日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?8/474,072的部分延續(xù)。
背景技術(shù)：
：1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用2-哌啶酸衍生的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性化合物作為與免疫親和蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的酶活性抑制劑，特別是作為肽酰-脯氨酰異構(gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶酶活性抑制劑的方法。2、先有技術(shù)的說(shuō)明術(shù)語(yǔ)免疫親和蛋白指大量作為免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A(CsA)，F(xiàn)K506和雷帕霉素受體的蛋白質(zhì)。已知的免疫親和蛋白為親環(huán)蛋白，和FK506結(jié)合蛋白，如FKBP。環(huán)孢菌素A與親環(huán)蛋白結(jié)合，而FK506和雷帕霉素與FKBP結(jié)合。這些免疫親和蛋白-藥物復(fù)合物干擾各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，特別是在免疫系統(tǒng)中和在神經(jīng)系統(tǒng)中。已知，免疫親和蛋白具有肽酰-脯氨酰異構(gòu)酶(PPI酶)或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶酶活性。已確定，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性在免疫親和蛋白蛋白質(zhì)順式和反式并構(gòu)體互變過(guò)程中具有催化作用。免疫親和蛋白最先在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行研究。最初，本領(lǐng)域技術(shù)人員假定，抑制免疫親和蛋白旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性導(dǎo)致抑制T細(xì)胞增殖，因此引起免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A，F(xiàn)K506，和雷帕霉素表現(xiàn)出的免疫抑制作用。進(jìn)一步研究表明，就免疫抑制劑活性而言，僅僅抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性是不夠的。見(jiàn)Schreiber等人，科學(xué)1990，250，556-559。但看來(lái)免疫抑制是由于免疫抑制藥物和免疫親和蛋白間復(fù)合物的形成。已表明，免疫親和蛋白-藥物復(fù)合物與三元蛋白質(zhì)靶的相互作用是其作用方式。見(jiàn)Schreiber等人，細(xì)胞，1991，66，807-815。就FKBP-FK506和FKBP-CsA來(lái)說(shuō)，藥物-免疫親和蛋白復(fù)合物與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合，抑制T細(xì)胞發(fā)出的使T細(xì)胞增殖的信號(hào)。類(lèi)似地，雷帕霉素-FKBP復(fù)合物與RAFT1/FRAP相互作用并抑制從IL-2受體發(fā)出信號(hào)。已發(fā)現(xiàn)，在腦神經(jīng)系統(tǒng)中，存在著高濃度的免疫親和蛋白。腦神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫親和蛋白較免疫系統(tǒng)中高出10-50倍。在神經(jīng)組織中，免疫親和蛋白似乎影響一氧化一氮的合成，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元突起的延伸。在體內(nèi)，一氧化一氮可發(fā)揮幾種作用。在腦中，一氧化一氮似乎是遞質(zhì)。它是由精氨酸形成的，即通過(guò)一氧化一氮合成酶，將精氨酸上的胍基氧化形成一氧化一氮和瓜氨酸。刺激N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受體迅速和明顯地激活一氧化一氮合成酶并刺激cGMP形成。用精氨酸衍生物如硝基精氨酸抑制一氧化一氮合成酶阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的cGMP水平升高。一氧化一氮合成酶是鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白所需要的酶并且激活N-甲基-d-天冬氨酸受體可刺激一氧化一氮合成酶活性，因?yàn)镹-甲基-d-天冬氨酸受體具有鈣通道，它通過(guò)谷氨酸刺激打開(kāi)，使得鈣進(jìn)入細(xì)胞中并激活一氧化一氮合成酶。谷氨酸是生理性神經(jīng)遞質(zhì)。然而，當(dāng)釋放過(guò)量時(shí)，谷氨酸通過(guò)N-甲基-d-天冬氨酸受體引起神經(jīng)毒性。用谷氨酸或N-d-天冬氨酸處理大腦皮層神經(jīng)培養(yǎng)物可殺死90％神經(jīng)元并且這些作用可被N-甲基-d-天冬氧酸拮抗劑阻斷。認(rèn)為，N-甲基d-天冬氨酸神經(jīng)毒性是血管意外后引起神經(jīng)損傷的主要原因。一氧化一氮合成酶的磷酸化作用抑制其催化活性。通過(guò)促進(jìn)一氧化一氮合成酶的來(lái)說(shuō)，F(xiàn)K506可在功能上抑制一氧化一氮的形成并且阻斷谷氨酸的神經(jīng)毒性。事實(shí)上，在大腦皮層培養(yǎng)物中，低濃度的FK506和環(huán)孢菌素A都可以阻斷N-甲基-d-天冬氨酸的神經(jīng)毒性。當(dāng)雷帕霉素逆轉(zhuǎn)FK506的治療作用時(shí)，F(xiàn)KBP的調(diào)節(jié)作用是明顯的。據(jù)推測(cè)，幾乎可明顯地作為免疫抑制劑的FK506在臨床上可用于治療中風(fēng)病人。FK506也可以加強(qiáng)與生長(zhǎng)有關(guān)的蛋白質(zhì)-43(GAP43)的磷酸化作用。在神經(jīng)元突出延伸中涉及GAP43并且其磷酸化作用似乎加強(qiáng)該活性.因此，已經(jīng)使用PCI2細(xì)胞核實(shí)了FK506，雷帕霉素和環(huán)孢菌素A在神經(jīng)元突出延伸中的作用。PCI2細(xì)胞是一系列類(lèi)似神經(jīng)元的細(xì)胞，當(dāng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)刺激時(shí)，它們使軸突延伸。意外地發(fā)現(xiàn)，皮摩爾(10-12摩爾)濃度的免疫抑制劑如FK506和雷帕霉素刺激軸突在PCI2細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)，即脊根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(DRGs)中長(zhǎng)出。見(jiàn)Lyons等人，Proc.Natl.AcadSci.USA，1994，91，3191-3195。在所有動(dòng)物試驗(yàn)中，F(xiàn)K506可在面神經(jīng)損傷后，刺激神經(jīng)再生并可恢復(fù)坐骨神經(jīng)損傷動(dòng)物的功能。更具體地發(fā)現(xiàn)，對(duì)FKBP具有高度親和力的藥物是有效的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制劑并且表現(xiàn)出極好的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。Snyder等人，“免疫親和蛋白和神經(jīng)系統(tǒng)”，自然醫(yī)學(xué)(NatureMedicine)，第一卷，第一期，1995年1月，32-37。這些發(fā)現(xiàn)提示，利用免疫抑制劑治療各種外周神經(jīng)病和促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元的再生。研究表明，由于對(duì)感染疾病的特定神經(jīng)群體具有特異性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少或生物利用度降低，可導(dǎo)致神經(jīng)退變性疾病，如早老性癡呆，帕金森病和肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)發(fā)生。幾種在腦神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)特定神經(jīng)群體發(fā)揮作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已經(jīng)識(shí)別出來(lái)。例如，已假定早老性癡呆是由于神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的減少或喪失引起的。因此提出，用外原性神經(jīng)生長(zhǎng)因子或其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，如腦生長(zhǎng)因子，膠質(zhì)來(lái)源生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3來(lái)治療早老性癡呆的病人，由此增加變性神經(jīng)群體的存活率。這些蛋白質(zhì)在各種神經(jīng)病學(xué)疾病中的應(yīng)用受大量蛋白質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)靶釋放和生物利用度困難的限制。相反，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的免疫抑制劑相對(duì)比較小并且表現(xiàn)出極好的生物利用度和特異性。然而，當(dāng)長(zhǎng)期給藥時(shí)，免疫抑制劑表現(xiàn)出大量潛在的副作用，包括腎毒性，如腎小球?yàn)V過(guò)的損傷和不可逆轉(zhuǎn)的間質(zhì)纖維化(Kopp等人，1991，美國(guó)腎病學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Soc.Nephrol.)1162)；神經(jīng)病性缺損，如非意向性震顫，或非特異性腦絞痛，如不確定性頭痛(DeGroen等人，1987，N.Engl.J.Med.317861)；和高血壓及由此產(chǎn)生的并發(fā)癥(Kahan等人，1989，N.Engl.J.Med.3211725)。本發(fā)明提供2-哌啶酸衍生的、包含小分子FKBP旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制劑的、非免疫抑制性及免疫抑制性化合物，該化合物在促進(jìn)軸突生長(zhǎng)方面是相當(dāng)有效的，并用于在各種神經(jīng)元修復(fù)容易的神經(jīng)病學(xué)疾病中，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)和再生，所述疾病包括由物理性損傷或疾病如糖尿病引起的外周神經(jīng)損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(脊髓和腦)的物理性損傷，與中風(fēng)有關(guān)的腦損傷，和治療與神經(jīng)退變有關(guān)的神經(jīng)病學(xué)疾病，所述疾病包括帕金森病，早老性癡呆和肌萎縮性側(cè)索硬化。發(fā)明概述本發(fā)明涉及利用2-哌啶酸衍生的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性化合物作為與免疫親和蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的酶活性抑制劑，特別是作為肽酰-脯氨酰異構(gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶酶活性抑制劑的方法。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例為治療動(dòng)物神經(jīng)病學(xué)疾病的方法，它包括給予所述動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激受損外周神經(jīng)的生長(zhǎng)或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為治療動(dòng)物神經(jīng)病學(xué)疾病的方法，它包括聯(lián)合給予所述動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物和有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子，所述因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子，腦來(lái)源的生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3來(lái)刺激受損外周神經(jīng)的生長(zhǎng)或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)的方法，它包括給予受損外周神經(jīng)有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激或促進(jìn)受損外周神經(jīng)的生長(zhǎng)，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)的方法，它包括給予受損外周神經(jīng)有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激受損外周神經(jīng)的生長(zhǎng)，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為促進(jìn)動(dòng)物神經(jīng)元再生和生長(zhǎng)的方法，它包括給予所述動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案為抑制動(dòng)物神經(jīng)退變的方法，它包括給予所述動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)抑制神經(jīng)退變，其中FKBP型免疫親和蛋白表現(xiàn)出旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。附圖簡(jiǎn)述圖1神經(jīng)破碎后，F(xiàn)KBP-12和GAP-43在面核中的表達(dá)。通過(guò)原位雜交比較FKBP-12(左)和GAP-43(右)在面核中mRNA表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。右面核與破碎的神經(jīng)是同側(cè)的，左側(cè)為未破碎神經(jīng)的對(duì)照(圖1)。對(duì)FKBP-12在未處理的對(duì)照側(cè)進(jìn)行原位雜交(左側(cè))，對(duì)鈣調(diào)磷酸酶Aα，β在面神經(jīng)破碎后7天，在神經(jīng)破碎側(cè)進(jìn)行雜交(右側(cè))。將試驗(yàn)至少重復(fù)3次，得到類(lèi)似的結(jié)果。圖2在神經(jīng)破碎后，F(xiàn)KBP-12在面運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的定位。圖2顯示的是在神經(jīng)破碎7天后，F(xiàn)KBP-12在面核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(圖2A)，和在對(duì)照面核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(圖2B)原位雜交的明視野顯微照片。圖3坐骨神經(jīng)破碎后，在腰椎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，F(xiàn)KBP-12mRNA上調(diào)。在右坐骨神經(jīng)破碎后7天進(jìn)行FKBP-12原位雜交。上圖顯示的是在下腰椎前角(ventralhorn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的反應(yīng)(由箭頭指示)。下圖顯示的是相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的明視野顯微照片(圖3B)為與破碎神經(jīng)相對(duì)的左側(cè)，(圖3C)為與破碎神經(jīng)同側(cè)的右側(cè)。將該試驗(yàn)重復(fù)3次，得到類(lèi)似的結(jié)果。圖4坐骨神經(jīng)破碎后1和6周時(shí)，在脊根神經(jīng)節(jié)中FKBP和FKBP-12mRNA的誘導(dǎo)。左圖顯示的是與破碎神經(jīng)同側(cè)的、通過(guò)L4脊根神經(jīng)節(jié)的切片進(jìn)行FKBP雜交的暗視野顯微照片，右圖顯示的是[3H]FK506放射放射自顯影照片。這些結(jié)果中的每一時(shí)間點(diǎn)都重復(fù)3次。圖5右側(cè)面神經(jīng)的蓖麻毒蛋白損傷。Nissl染色(下圖，圖5A)表明，在向面神經(jīng)中注射蓖麻毒蛋白后7天，右面核中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元大量變性，同時(shí)伴隨神經(jīng)膠質(zhì)增殖。上圖(圖5B)顯示的是蓖麻毒蛋白損傷面神經(jīng)/核后7天，進(jìn)行FKBPmRNA原位雜交。將該試驗(yàn)重復(fù)3次，得到類(lèi)似的結(jié)果。圖6神經(jīng)破碎后7天，[3H]FK506結(jié)合在坐骨神經(jīng)節(jié)段上。圖解解釋了所得到的3mm神經(jīng)片斷如方法中所描述的，狹窄是指在破碎的第7天，收集6小時(shí)的結(jié)扎部位。遠(yuǎn)端結(jié)扎部位距離最初破碎部位10mm。FKBP的順行轉(zhuǎn)運(yùn)速度為124mm/天。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.(n＝3)。圖7FKBP在坐骨神經(jīng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)對(duì)照(未處理)坐骨神經(jīng)的切片和7天后坐骨神經(jīng)破碎部位進(jìn)行FKBP-12原位雜交的暗視野顯微照片(圖7A，7B)和[3H]FK-506放射放射自顯影照片(圖7C，7D)。箭頭是指所觀(guān)測(cè)到的神經(jīng)破碎情景。將該試驗(yàn)重復(fù)3次，得到類(lèi)似的結(jié)果。圖8在PC-12細(xì)胞中所結(jié)合的[3H]FK506的含量，其中所述PC-12細(xì)胞在存在或不存在NGF(50ng/ml)下保存。對(duì)于每一時(shí)間點(diǎn)來(lái)說(shuō)，n＝3。棒表示S.E.M.。圖9免疫抑制劑介導(dǎo)的、在PC-12細(xì)胞中軸突長(zhǎng)出的增強(qiáng)。在NGF存在下，在加入或不加入FK506或雷帕霉素下，生長(zhǎng)48小時(shí)的培養(yǎng)物的Hoffman相差顯微照片。圖9A在1.0ng/mlNGF中生長(zhǎng)的PC-12細(xì)胞。圖9B50ng/mlNGF。9C1.0ng/mlNGF和100nMFK506。圖9D1.0ng/mlNGF和100nM雷帕霉素。放大200倍。圖10FK506對(duì)PC-12細(xì)胞中軸突長(zhǎng)出的作用。在存在或不存在100nMFK506下，用各種濃度的NGF處理培養(yǎng)物，在48小時(shí)后測(cè)定軸突生長(zhǎng)。如方法中所描述的，通過(guò)用大于5um的神經(jīng)元突起計(jì)算細(xì)胞的數(shù)目來(lái)測(cè)定長(zhǎng)出情況。對(duì)于各試驗(yàn)的每一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，n＝4并且誤差棒代表SEM。圖11FK506加強(qiáng)在PC-12細(xì)胞中軸突長(zhǎng)出的濃度-反應(yīng)關(guān)系。將細(xì)胞用1ng/mlNGF和各種濃度的FK506處理48小時(shí)。如圖10和方法中所描述的，測(cè)定軸突長(zhǎng)出反應(yīng)。對(duì)于各試驗(yàn)的每一數(shù)據(jù)點(diǎn)來(lái)說(shuō)，n＝4，Studentst檢驗(yàn)表明*p＜.001。圖13在不同的物質(zhì)中生長(zhǎng)的脊根神經(jīng)節(jié)的相差顯微照片。圖13ANGF100ng/ml，圖13BFK5061uM，圖13CFK5061uM和抗NGF抗體，圖13D未加入生長(zhǎng)因子，圖13EFK5061pM，圖13FFK5061uM和雷帕霉素1uM?？潭染€(xiàn)為205uM。NGF引起大量軸突增生(圖13A)，1uMFK506也同樣(圖13B)。通過(guò)將濃度減少到1pM來(lái)降低FK506的作用(圖13E)。然而，1pMFK506所引起的軸突生長(zhǎng)比不含F(xiàn)K506時(shí)大(圖13D)。通過(guò)加入抗NGF抗體來(lái)消除由培養(yǎng)物中非神經(jīng)元細(xì)胞所產(chǎn)生的NGF作用，也可以降低FK506的作用。大量大束軸突對(duì)NGF(100ng/ml)(圖13A)或1uMFK506(圖13B)的反應(yīng)顯示白色，同時(shí)，小束或單個(gè)的軸突顯示黑色。非神經(jīng)元細(xì)胞，Shwann細(xì)胞和某些成纖維細(xì)胞在1pMFK506(圖13E)或抗NGF抗體(圖13C)中比在1uMFK506(圖13B)中更明顯。在培養(yǎng)物中，由非神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生的NGF引起在未加入生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)物中可見(jiàn)的、有限的軸突生長(zhǎng)(圖13D)。大量顯示白色的、可折射的非神經(jīng)元細(xì)胞遮蓋住少數(shù)軸突(圖13D)。在FK506存在下，雷帕霉素完全抑制軸突的生長(zhǎng)(圖13F)。顯微照片代表來(lái)自各試驗(yàn)條件下的12-30神經(jīng)節(jié)。各試驗(yàn)組的差異是高度重現(xiàn)的。圖14FK506和雷帕霉素對(duì)NGF介導(dǎo)的軸突在PC-12細(xì)胞中延伸的作用。單獨(dú)或在100nMFK506，100nM雷帕霉素或100nMWAY-124,466存在下，用各種濃度的NGF處理PC12(培育60代)。96小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生的突起比陽(yáng)性細(xì)胞的直徑長(zhǎng)時(shí)，測(cè)定軸突生長(zhǎng)。對(duì)于各試驗(yàn)的每一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，n＝3并且誤差棒代表S.E.M.。圖15皮摩爾濃度的(A)FK506，(B)雷帕霉素和WAY-124,466即可促進(jìn)由NGF(0.5ng/ml)引起的軸突在PC12細(xì)胞中生長(zhǎng)。在各種濃度的FK506(□)，雷帕霉素()或WAY-124,466()存在下，用0.5ng/mlNGF將傳代低的PC12細(xì)胞處理4天。如上圖14中所描述的，測(cè)定軸突的生長(zhǎng)。將在0.5ng/mlNGF(稱(chēng)作L)和50ng/mlNGF(稱(chēng)作H)存在下產(chǎn)生的軸突含量進(jìn)行比較。圖16用免疫親和蛋白配體+0.5ng/mlNGF或50ng/mlNGF來(lái)處理PC12細(xì)胞的顯微照片。圖17免疫親和蛋白配體使得小雞感覺(jué)神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生最大軸突延伸所需要的NGF的量減少。將完整的脊根神經(jīng)節(jié)外植塊從9-10天大的小雞胚胎中分離出來(lái)并37℃和5％CO2環(huán)境下，在Matrigel涂布的12孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其中，所述培養(yǎng)皿中包含L15培養(yǎng)基和高濃度葡萄糖，和10％胎牛血清(補(bǔ)充10umArcC青霉素和鏈霉素)。將感覺(jué)神經(jīng)節(jié)用1ng/mlNGF，1ng/mlNGF加100nMFK506或100ng/mlNGF處理48小時(shí)，并計(jì)數(shù)和拍攝神經(jīng)元突出。圖18FK506，雷帕霉素和WAY-124,466促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生NGF依賴(lài)性軸突。如上圖17所述，將小雞DRG外植塊在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將FK506，雷帕霉素和WAY-124,466(各100nM加或減0.1ng/mlNGF)加到DRGG外植塊培養(yǎng)基中。48小時(shí)后，測(cè)定軸突生長(zhǎng)情況并將培養(yǎng)物拍攝照片。圖19實(shí)施例111促進(jìn)雞脊根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物中軸突生長(zhǎng)的顯微照片。三個(gè)圖顯示的是在1pM濃度(左圖)，100pM濃度(中圖)和100nM濃度(右圖)濃度實(shí)施例111下的軸突生長(zhǎng)情況。圖20實(shí)施例17促進(jìn)雞脊根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物中軸突生長(zhǎng)的顯微照片。三個(gè)圖顯示的是在1pM濃度(左圖)，100pM濃度(中圖)和100nM濃度(右圖)濃度實(shí)施例17下的軸突生長(zhǎng)情況。圖21實(shí)施例102促進(jìn)雞脊根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物中軸突生長(zhǎng)的顯微照片。三個(gè)圖顯示的是在1pM濃度(左圖)，100pM濃度(中圖)和100nM濃度(右圖)濃度實(shí)施例102下的軸突生長(zhǎng)情況。發(fā)明詳述本發(fā)明新的、2-哌啶酸衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性化合物具有對(duì)FK506結(jié)合蛋白，如FKBP-12的親和力。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性化合物與FKBP結(jié)合時(shí)，它們抑制肽酰-脯氨酰順-反異構(gòu)酶活性，或結(jié)合蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且意外地刺激軸突生長(zhǎng)。可以以無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和堿衍生的鹽的形式來(lái)使用本發(fā)明化合物。所述酸的鹽包括乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，枸櫞酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，富馬酸鹽，葡庚酸鹽，甘油磷酸鹽，hemissulfate，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來(lái)酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，pamoate，果膠酯酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。堿鹽包括銨鹽，堿金屬鹽如鈉和鉀鹽，堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽，與有機(jī)堿的鹽如二環(huán)己基胺鹽，N-甲基-D-葡糖胺鹽，和與氨基酸如精氨酸，賴(lài)氨酸的鹽等等。也可以用試劑如低級(jí)烷基鹵，如甲基，乙基，丙基和丁基氯，溴和碘；二烷基硫酸鹽如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸鹽，長(zhǎng)鏈鹵如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂酰基氯，溴和碘，芳烷基鹵如芐基和苯乙基溴等等。由此得到水或油可溶性或可分散性產(chǎn)物。本發(fā)明適用于性化合物可定期給予病人，所述病人患神經(jīng)病學(xué)疾病或其它需要刺激神經(jīng)元再生和生長(zhǎng)的疾病，如各種與神經(jīng)退變有關(guān)的外周神經(jīng)病和神經(jīng)病學(xué)疾病。本發(fā)明化合物也可以給予人以外的其它哺乳動(dòng)物，用于治療哺乳動(dòng)物的各種神經(jīng)病學(xué)疾病。本發(fā)明新的化合物是有效的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性抑制劑并且具有極好的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。該活性在刺激受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生，抑制神經(jīng)退變和治療幾種已知與神經(jīng)元變性和外周神經(jīng)病有關(guān)的神經(jīng)病學(xué)疾病中是有用的。可治療的神經(jīng)病學(xué)疾病包括但不限制于三叉神經(jīng)痛，舌咽神經(jīng)痛，貝爾麻痹，重癥肌無(wú)力，肌營(yíng)養(yǎng)不良，肌萎縮性側(cè)索硬化，進(jìn)行性肌萎縮，進(jìn)行性延髓遺傳性肌萎縮，成疝的、破裂的或脫垂的無(wú)脊椎動(dòng)物盤(pán)綜合癥，頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)硬，叢疾病，胸廓出口缺損綜合癥，外周神經(jīng)病如由鉛，氨苯砜，壁虱引起的疾病，卟啉癥，或急性熱病性多神經(jīng)炎，早老性癡呆，和帕金森病。因此，本發(fā)明化合物可如下給予通過(guò)口服，非腸道，吸入噴霧，表皮，直腸，鼻，頰，陰道給予或通過(guò)植入含常規(guī)無(wú)毒可藥用載體，佐劑和賦形劑的、劑量確定的制劑給予。本文所使用的術(shù)語(yǔ)非腸道給藥包括皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。作為有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶治療劑，當(dāng)通過(guò)外周給藥時(shí)，免疫親和蛋白-藥物復(fù)合物應(yīng)該容易穿透血-腦屏障。不能穿透血-腦屏障的本發(fā)明藥物可通過(guò)心室內(nèi)給藥途徑有效地給予。藥物組合物的形式可以為滅菌注射制劑，如滅菌注射水溶液或油狀懸浮液。該懸浮液可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)，通過(guò)使用適宜的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑來(lái)配制。滅菌注射制劑也可以是在無(wú)毒、非腸道給藥適宜的稀釋劑或溶劑中的滅菌注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中溶液?？墒褂玫?、適宜的賦形劑和溶劑為水，林格溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的固定油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。因此，任何可使用的、刺激性少的固定油包括甘油一酯或二酯。在可注射橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯化形式的制劑中，可使用脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物。這些油溶液或懸浮液中也可以包含長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑。例如，化合物可以以膠囊劑或片劑的形式，或者以水性懸浮液或溶液的形式口服給予。在口服使用的片劑情況下，通常使用的載體包括乳糖或玉米淀粉。典型地，也可以加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。對(duì)于口服給藥的膠囊劑來(lái)說(shuō)，所使用的稀釋劑包括乳糖和無(wú)水玉米淀粉。當(dāng)使用水性懸浮液口服給藥時(shí)，將活性組分與乳化劑和懸浮劑混合。如果需要，可以使用某些增甜劑和/或矯味劑和/或著色劑。本發(fā)明化合物也可以以用于直腸給藥的栓劑形式給予?？赏ㄟ^(guò)將藥物與無(wú)刺激性的賦形劑混合來(lái)制備這些組合物，其中，所述賦形劑在室溫下為固體，但在直腸溫度下為液體，并因此在直腸中熔化后釋放藥物。該賦形劑包括可可脂，蜂蠟和聚乙二醇。本發(fā)明化合物也可以通過(guò)表皮(optically)給予，特別是當(dāng)準(zhǔn)備治療的疾病涉及容易受表皮用藥影響的區(qū)域或器官時(shí)，所述疾病包括眼、皮膚或下腸道的神經(jīng)病學(xué)疾病。適于這些區(qū)域使用的表皮給藥制劑是容易制備的。對(duì)于眼部應(yīng)用來(lái)說(shuō)，可將化合物配制成在等滲、PH調(diào)節(jié)的滅菌鹽水中的微?；瘧腋∫?，或者優(yōu)選地，配制成等滲、PH調(diào)節(jié)的滅菌鹽水溶液，其中包含或不包含防腐劑，如氯芐烷胺?；蛘?，對(duì)于眼部應(yīng)用來(lái)說(shuō)，可將化合物配制在軟膏如凡士林中。對(duì)于通過(guò)表皮給藥的應(yīng)用來(lái)說(shuō)，可將化合物配制成適宜的軟膏劑，其中所述化合物懸浮或溶解在由一種或多種下列物質(zhì)組成的混合物中礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯混合物，乳化蠟和水?；蛘?，可將化合物配制成適宜的洗液或霜?jiǎng)渲兴龌衔飸腋』蛉芙庠谟梢环N或多種下列物質(zhì)組成的混合物中礦物油，脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，吐溫60，十六烷基酯蠟，cetearyl醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。下腸道的表皮應(yīng)用可通過(guò)栓劑(如上)或灌腸劑進(jìn)行。相當(dāng)于大約0.1mg-10,000mg活性組分化合物的劑量水平適用于治療上述疾病，優(yōu)選的劑量水平大約為0.1mg-1,000mg?？梢耘c載體物質(zhì)合并，產(chǎn)生單一劑量形式的活性組分的量可根據(jù)所治療的宿主和特定的給藥方式改變。然而已知，對(duì)于任何特定病人來(lái)說(shuō)，特定的劑量水平依賴(lài)于各種因素，包括所使用特定化合物的活性，年齡，體重，一般健康狀況，性別，飲食，給藥時(shí)間，排泄速度，聯(lián)合用藥，所治療特定疾病的嚴(yán)重性和給藥方式?；衔锟梢耘c其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性藥物一起給予，所述藥物如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(NGF)，神經(jīng)膠質(zhì)產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，腦產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3。其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性藥物的劑量水平依賴(lài)于上述因子和聯(lián)合用藥的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效率。方法和步驟坐骨神經(jīng)破碎該實(shí)施例證明在正常外周神經(jīng)中含有高濃度的FKBP并且在神經(jīng)破碎后，F(xiàn)KBP濃度增加。如果FKBP在GAP-43的作用中與神經(jīng)突起延伸有生理關(guān)系，那么可以預(yù)期外周神經(jīng)中FKBP的基本濃度。因此，我們測(cè)量了大鼠坐骨羧基以及從2天齡大鼠pups中分離的生長(zhǎng)錐中結(jié)合的〔3H〕FK-506，并且與大腦皮層和一些外周組織的值進(jìn)行比較。在未固定的切片上進(jìn)行〔3H〕FK-506放射放射自顯影，其中先進(jìn)行解凍并且干燥，然后在緩沖液中予培養(yǎng)1小時(shí)，緩沖液由50mMHepes，2mg/ml牛血清白蛋白，5％乙醇和0.02％吐溫20組成，PH7.4。然后在室溫下在予培養(yǎng)緩沖液中，將切片暴露于1nM〔3H〕FK-506(86.5Ci/mMol；Dupont-NEN，Boston,MA)1小時(shí)。通過(guò)加入1μMFK-506來(lái)確定非特異結(jié)合。培養(yǎng)之后，在冰冷的予培養(yǎng)緩沖液中洗滌載玻片4×5分鐘并且空氣干燥。然后將放射標(biāo)記的切片并置于氚敏感的膜上或用KodakNTB-2乳劑包裹的蓋玻片上。表1與坐骨神經(jīng)和生長(zhǎng)錐結(jié)合的〔3H〕FK-506(A)與坐骨神經(jīng)結(jié)合的〔3H〕FK-506組織Bmax(pmol/mg蛋白質(zhì))成年大鼠坐骨神經(jīng)22.1大腦皮層38.0胸腺9.5脾8.0新生大鼠前腦25.5生長(zhǎng)錐10.2(B)坐骨神經(jīng)破碎后結(jié)合的〔3H〕FK-506蛋白質(zhì)Bmax(fmol/5mm切片)Bmax(pmol/mg)未處理的31.8±2.121.2±1.4破碎7天136.5±15.7＊40.1±2.0＊按方法中描述的過(guò)程測(cè)定結(jié)合的〔3H〕FK-506。在表1A中，實(shí)驗(yàn)以小于10％的變化重復(fù)3次。表1B中的值以平均值±S.E.M(n＝3)來(lái)表示。＊P≤0.05獨(dú)立方式的t測(cè)驗(yàn)。在所有檢測(cè)的組織中，坐骨神經(jīng)的結(jié)合水平最高，略高于大腦皮層且大約高于胸腺和脾的10倍，含有與淋巴細(xì)胞相聯(lián)的FKBP。見(jiàn)表1A。FKBP在神經(jīng)再生中所起作用的證據(jù)來(lái)自下列實(shí)驗(yàn)我們破碎成年大鼠的坐骨神經(jīng)并在7天后測(cè)量接近于神經(jīng)碎片的5mm片斷結(jié)合的〔3H〕FK-506用鹽酸二甲拉嗪(12mg/kg)、氯胺酮(30mg/kg)的混合物麻醉Sprague-Dawley大鼠(175-200g)。使用無(wú)菌技術(shù)，用寶石鉗從莖突乳突孔出口向遠(yuǎn)端將面神經(jīng)破碎成2×30sec2mm。使用相同的方法破碎大腿中部上的坐骨神經(jīng)。接近的碎片的片斷中結(jié)合的總值是對(duì)照值的四倍。盡管在接近的片斷中蛋白總量有大量增加，但接近的片斷中每mg蛋白結(jié)合的〔3H〕FK-506僅為兩倍。面神經(jīng)破碎該實(shí)例證明面神經(jīng)受損促進(jìn)FKBP和GAP-43的同時(shí)表達(dá)。在面神經(jīng)核中，當(dāng)面神經(jīng)壓碎后，GAP-43mRNA含量增加。利用雜交，我們來(lái)測(cè)定在面神經(jīng)壓碎后，F(xiàn)KBP，GAP-43和鈣調(diào)磷酸酶mRNA的含量。通過(guò)賁門(mén)，將150-200ml冰冷卻的、磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)(0.1M，PH7.4)灌注到鼠體內(nèi)。將組織切除并立即冷凍在異戊烷中(-80℃)。用低溫冷凍機(jī)切片(18μm厚)并固定在涂布明膠的載玻片上解凍。利用末端用〔35S〕dATP標(biāo)記的抗過(guò)敏低聚核苷酸探針，如上所述進(jìn)行雜交。對(duì)于FKBP來(lái)說(shuō)，利用三個(gè)獨(dú)立的低聚核苷酸來(lái)與下列區(qū)域的克隆cDNA互補(bǔ)，所述cDNA為70-114，214-258，441-485，由Maki等人在(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，5440-5443，和Standaert等人在(1990)Nature346,671-674中公開(kāi)并引入本文供參考。對(duì)于GAP-43來(lái)說(shuō)，利用三個(gè)獨(dú)立的抗過(guò)敏低聚核苷酸來(lái)與克隆cDNA，即核苷酸961-1008，1081-1128，1201-1248互補(bǔ)，所述cDNA由Rosenthal，A.等人在(1987)EMBOJ.6,3641-3646中公開(kāi)并引入本文供參考。對(duì)于鈣調(diào)磷酸酶Aα來(lái)說(shuō)，利用抗過(guò)敏核苷酸來(lái)與核苷酸1363-1410和1711-1758互補(bǔ)，所述核苷酸由Ito等人在(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.163，1492-1497中公開(kāi)并引入本文供參考，對(duì)于鈣調(diào)磷酸酶Aβ來(lái)說(shuō)，與核苷酸1339-1386和1569-1616互補(bǔ)，所述核苷酸由Kuno，T.等人在(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.165，1352-1358中公開(kāi)并引入本文供參考。將切片解凍并放干，然后在4％新鮮解聚的多聚甲醛/PBS中固定5分鐘。在PBS中沖洗兩次后，將切片用0.25％乙酸酐/0.1M三乙醇胺和0.5％NaCl(PH8.0)乙?；?，然后在梯度酒精中脫水，在氯仿中脫脂5分鐘，再水化到95％乙醇中并空氣干燥。在37℃下，在含50％去離子甲酰胺，10％硫酸右旋糖酐，4×SSC，1×Denhardt’s溶液，20mM磷酸鹽緩沖液，0.1mg/m1鮭精DNA，0.1mg/ml酵母菌轉(zhuǎn)移RNA，10mM二硫蘇糖醇，2.0％β巰基乙醇(BMD)，1.0mMEDTA和標(biāo)記探針(2,000,000dpm/切片)的緩沖液中雜交過(guò)夜。雜交后，在室溫下，將切片在1×SSC，1.0％BME中沖洗15分鐘，然后在55℃下沖洗兩次10分鐘，空氣干燥并分鐘在膜上或浸泡在KodakNTB-2乳膠中。可見(jiàn)明顯促進(jìn)FKBP和GAP-43表達(dá)，同時(shí)鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)無(wú)明顯變化。在腦神經(jīng)壓碎后24小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)KBP表達(dá)增加，在1-2周時(shí)，峰值是明顯的，而在第3周時(shí)，mRNA濃度減小。在高度放大下測(cè)定的結(jié)果表明，對(duì)于FKBPmRNA來(lái)說(shuō)，增加的銀粒集中到神經(jīng)元細(xì)胞體中(圖2)。對(duì)解剖片斷面核的Northern印跡分析證明FKBP特異的mRNA的濃度增加。此后，GAP-43mRNA非常類(lèi)似于FKBP的情況。相反地，在檢測(cè)的任何時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)磷酸酶的表達(dá)的改變。從解剖的面核中分離總的細(xì)胞RNA。10或20ug總的RNA樣品經(jīng)1％瓊脂糖、2.0％甲醛凝膠電泳并且轉(zhuǎn)移到10nM氫氧化鈉的尼龍膜上。在由50％甲酰胺、2×SSPE、7％SDS、0.5％Blotto和100ug/ml鮭精子DNA組成的緩沖液中于42℃下，通過(guò)隨機(jī)引導(dǎo)將cDNA探針與FKBP雜交，所述FKBP是用具有1×109cpm/ug特定活性的〔35〕dCTP標(biāo)記的。在0.15×SSC、0.15％SDS中，將斑點(diǎn)于室溫洗滌20分鐘并于65℃洗滌2×15分鐘，然后，暴露于膠片下48096小時(shí)。在未受損的一面，觀(guān)測(cè)到與對(duì)照切片相比銀粒有少量增加。這與對(duì)側(cè)神經(jīng)對(duì)軸突切除(axotomy)也有反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)是一致的。面神經(jīng)破碎后，大鼠發(fā)展為面神經(jīng)麻痹，很明顯的是須運(yùn)動(dòng)缺乏，在3周時(shí)功能恢復(fù)，與神經(jīng)再生完成是一致的。在我們的大鼠中，我們也觀(guān)測(cè)了神經(jīng)破碎后須運(yùn)動(dòng)喪失并在3周時(shí)恢復(fù)功能。因此，GAP-43和FKBP增加表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程和神經(jīng)再生的過(guò)程相關(guān)。坐骨神經(jīng)再生本實(shí)施例證明FKBP和GAP-43的改變與坐骨神經(jīng)再生有關(guān)。坐骨神經(jīng)損傷后，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和脊根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞中的GAP-43mRNA的濃度都有所增加。在遭受坐骨神經(jīng)破碎的大鼠中，我們觀(guān)測(cè)到L-4，5的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和脊根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞中的FKAPmRNA水平顯著增加(圖3)，與GAP表達(dá)增加的報(bào)道是一致的(圖4)。在高的放大率時(shí)，我們觀(guān)測(cè)了位于神經(jīng)細(xì)胞體的FKMBmRNA銀粒(圖3)。在選擇性結(jié)合FKBP的條件下，我們通過(guò)〔3H〕FK-506結(jié)合的放射自顯影檢測(cè)了FKBP蛋白的水平(圖4)。盡管坐骨神經(jīng)破碎后在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞中沒(méi)有證明FKBP增加，但在脊根神經(jīng)節(jié)的主要感覺(jué)神經(jīng)中檢測(cè)到FKBP增加。FKBP報(bào)道增加與再生選擇性的關(guān)系進(jìn)一步通過(guò)蓖麻毒蛋白實(shí)驗(yàn)來(lái)支持，當(dāng)將蓖麻毒蛋白注射進(jìn)入外周神經(jīng)時(shí)，蓖麻毒蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞體中，使細(xì)胞體破壞而使神經(jīng)不能再生。在其它按照Streit和Kretzbnerg所述方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)使神經(jīng)破碎的相同位置，我們注射0.5ug在0.5ulPBS和0.1％固綠中的蓖麻毒蛋白(RCA60，Sigma，st.Louis，MO)。Streit等，(1988)J.Comp.Neurol.268，248-263。在蓖麻毒蛋白處理后的2、4和7天，我們進(jìn)行FKBPmRNA原位雜交定位研究(圖5)。蓖麻毒蛋白處理后，沒(méi)有觀(guān)測(cè)到FKBPmRNA增加，在蓖麻毒蛋白處理和神經(jīng)破碎之后均發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)增加。蓖麻毒蛋白處理之后FKBPmRNA未增加符合面核中FKBPmRNA的選擇性定位。FKBP在坐骨神經(jīng)中的運(yùn)輸本實(shí)施例證明FKBP在坐骨神經(jīng)中快速轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管FKBPmRNA的增加暗示蛋白質(zhì)從細(xì)胞體快速轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)突起中，但坐骨神經(jīng)破碎之后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)中的FKBP蛋白沒(méi)有增加。這符合早期觀(guān)測(cè)到的FKBPmRNA集中在含有低水平FKBP蛋白的小腦粒細(xì)胞中，同時(shí)FKBP蛋白水平高度集中在與來(lái)自粒細(xì)胞的平行纖維相關(guān)的小腦中的分子層中。為了檢測(cè)FKBP轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性，我們破碎了坐骨神經(jīng)并且7天后結(jié)扎破碎近端的10-20mm處。結(jié)扎6小時(shí)后，我們檢測(cè)跨越結(jié)扎區(qū)3mm片斷中〔3H〕FK-506的結(jié)合(圖6)。為了進(jìn)行軸突轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，按照Tetzlaff等的方法使用經(jīng)典的結(jié)扎技術(shù)。坐骨神經(jīng)破碎后一周，將兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)(510號(hào)結(jié)扎線(xiàn))置于神經(jīng)中距離最遠(yuǎn)端結(jié)扎處的大約10mm處和位于近端開(kāi)始破碎部位10mm處。6小時(shí)后，從如圖5所述的近端區(qū)、遠(yuǎn)端區(qū)和兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間取出5-3mm的神經(jīng)片斷。通過(guò)在10體積50mMTris-HCl，pH7.4中勻漿來(lái)制備〔3H〕FK-506勻漿測(cè)定的神經(jīng)片斷。在4℃下將勻漿以15000×g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，并且收集上清液，然后使用Coomassie藍(lán)色染料結(jié)合測(cè)定(Pearce)測(cè)定其總蛋白濃度。按(4)描述的方法測(cè)定含有2ug總?cè)芙獾鞍椎牡确衷嚇又薪Y(jié)合的〔3H〕FK-506，總?cè)芙獾鞍资窃谧罱K體積為0.4ml由50mMTris-HCl，PH7.4，2mg/ml牛血清白蛋白，250pM〔3H〕FK-506和不同濃度的未標(biāo)記的FK506組成的測(cè)定緩沖液中。在25℃下培養(yǎng)60分鐘之后，將0.35ml樣品在0.8ml的LH-20交聯(lián)的葡聚糖凝膠柱(PharmaciaLKB)中分層并用0.4ml測(cè)定緩沖液洗滌。收集洗脫液并在閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示在圖5中。〔3H〕FK-506結(jié)合水平在剛好距離破碎處20cm的近端結(jié)扎處的片斷處最高，幾乎為其它片斷的四倍?；贏-D片斷中〔3H〕FK-506的結(jié)合水平，我們計(jì)算了FKBP的順行轉(zhuǎn)運(yùn)速度。每天240mm的速度基本上與GAP-43代表的神經(jīng)蛋白最快轉(zhuǎn)運(yùn)速度的轉(zhuǎn)運(yùn)速度相同。為了顯示神經(jīng)破碎之后FKBP的積累，我們采用松的結(jié)扎來(lái)標(biāo)記坐骨神經(jīng)破碎的部位并且進(jìn)行FKBPmRNA原位雜交以及〔3H〕FK-506結(jié)合的放射自顯影(圖7)。大多數(shù)FKBPmRNA和結(jié)合的〔3H〕FK-506立即積累在破碎神經(jīng)的近端。這些水平顯著高于對(duì)照未破碎的坐骨神經(jīng)。在原位雜交檢測(cè)中，高放大率時(shí)的放射自顯影標(biāo)本揭示銀粒與神經(jīng)纖維相關(guān)。也有銀粒位于我們不能確定其特性的細(xì)胞中，因此它們可能是許旺細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。PC12中的FKBP本實(shí)施例證明PC12細(xì)胞中含有FKBP，并且FKBP水平通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子來(lái)增加。我們?cè)诨A(chǔ)條件下和在用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)處理之后檢測(cè)〔3H〕FK-506與的細(xì)胞結(jié)合來(lái)檢查PC12細(xì)胞中存在的FKBP。由〔3H〕FK-506結(jié)合的Scatchard分析曲線(xiàn)上獲得PC-12細(xì)胞中FKBP的濃度。從培養(yǎng)孔中剮下培養(yǎng)物并在10體積的50mMTris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，100ug/ml苯甲基磺酰氟中勻漿化，在4℃下以40,000×g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)Coomassie藍(lán)色染料結(jié)合測(cè)定來(lái)確定蛋白質(zhì)。評(píng)價(jià)含有5ug溶解蛋白的在最終體積為0.4ml的由50mMTris-HCl，pH7.4，2mg/ml牛血清白蛋白和各種濃度的未標(biāo)記的FK506組成的測(cè)定緩沖液中的結(jié)合的250pM〔3H〕二氫FK506(86.5Ci/mmol，Dupont/NEN)。在25℃下培養(yǎng)60分鐘之后，將0.35ml樣品在0.8ml的用測(cè)定緩沖液平衡的LH-20交聯(lián)的葡聚糖凝膠柱(PharmaciaLKB)中分層。用0.4ml測(cè)定緩沖液進(jìn)一步洗滌柱子，收集洗脫液與Formula963(Dupont/NEN)混合并在Beckman閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。由結(jié)合的〔3H〕FK-506總量減去在1μm未標(biāo)記的FK506存在下獲得的結(jié)合量來(lái)確定特異結(jié)合情況。結(jié)果顯示在圖8中?！?H〕FK-506與未處理的PC-12細(xì)胞勻漿物進(jìn)行飽和地結(jié)合。在通常實(shí)驗(yàn)中，在1umFK506存在下非特異結(jié)合大約150cpm的同時(shí)，大約結(jié)合1000cpm。用1-2nMFK506產(chǎn)生50％的〔3H〕FK-506結(jié)合抑制作用，表明結(jié)合部位與可靠的FKBP-致。NFG處理之后使結(jié)合的〔3H〕FK-506明顯增加。就10-15小時(shí)來(lái)說(shuō)，有效的增加是明顯的。20小時(shí)時(shí)結(jié)合增至3倍而在100小時(shí)時(shí)明顯略有進(jìn)一步的增加。PC12細(xì)胞中軸突延伸增加本實(shí)施例證明FK506和雷帕霉素使PC-12細(xì)胞的軸突延伸增加。將PC-12細(xì)胞在補(bǔ)充有5％熱滅活的馬血清和5％熱滅活的胎牛血清的Dubecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中于37℃、5％CO2下維持。為了在NGF中分化，將細(xì)胞以1×105的量置于35mm培養(yǎng)孔中，該孔已用5ug/cm2大鼠尾膠原涂鋪，并且允許在用補(bǔ)充有2％胎馬血清、NGF和/或FK506或雷帕霉素的Dubecco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)置換前附著。為了對(duì)軸突的生長(zhǎng)進(jìn)行定量，拍攝了隨機(jī)照片(每孔3-4張)，并且記錄生長(zhǎng)超過(guò)5um的軸突突起。攝影者和細(xì)胞記錄者不知道實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的條件。以每個(gè)有代表性的數(shù)據(jù)點(diǎn)重復(fù)兩次來(lái)進(jìn)行四個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)。由每張照片大約進(jìn)行100個(gè)細(xì)胞鑒定和記錄軸突。因此，1200-1600個(gè)細(xì)胞的軸突被記錄在每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)上。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，NGF強(qiáng)烈刺激軸突生長(zhǎng)，在lng/ml時(shí)具有最大刺激作用的一半，在大約50-100ng/ml產(chǎn)生最大的增強(qiáng)作用(圖9、10)。FK506(100nM)通過(guò)增加NGF的敏感性而明顯增加NGF的作用。因此，F(xiàn)K506使需要刺激最大生長(zhǎng)的NGF濃度減少20-50倍。在不存在FK506時(shí)，于5ng/mlNGF產(chǎn)生一半的最大生長(zhǎng)作用而在FK506存在時(shí)，于0.1ng/mlNGF產(chǎn)生一半的最大生長(zhǎng)作用。在NGF最大濃度(10-100ng/ml)時(shí)，F(xiàn)K506不產(chǎn)生附加的軸突生長(zhǎng)作用。FK506的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用是極強(qiáng)的。在低于最大濃度的NGF(1ng/ml)存在時(shí)，1nM的FK506與50ng/ml的NGF產(chǎn)生相同的生長(zhǎng)作用(圖11)。FK506在大約100pM時(shí)產(chǎn)生半數(shù)的最大作用。NGF不存在時(shí)，F(xiàn)K506不產(chǎn)生軸突生長(zhǎng)作用(圖10)。雷帕霉素是強(qiáng)的免疫抑制劑，不認(rèn)為它通過(guò)鈣調(diào)磷酸酶起作用但可影響其它磷酸化級(jí)聯(lián)。雷帕霉素通過(guò)FKBP和鈣調(diào)磷酸酶產(chǎn)生對(duì)FK506的強(qiáng)的阻斷作用，這種作用可能是通過(guò)在FKBP水平作為FK506拮抗劑而產(chǎn)生的。雷帕霉素(1uM)不阻斷FK506的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。然而，雷帕霉素本身是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的，在1nM時(shí)產(chǎn)生巨大的軸突生長(zhǎng)作用。雷帕霉素和FK506似乎通過(guò)不同的機(jī)制起作用。因此，雷帕霉素增加生長(zhǎng)的數(shù)量及其長(zhǎng)度，而FK506主要增加軸突的長(zhǎng)度。而且，F(xiàn)K506和雷帕霉素作用似乎是加和的。脊根神經(jīng)節(jié)本實(shí)施例證明FK506對(duì)感覺(jué)神經(jīng)節(jié)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的。我們檢查FK506對(duì)來(lái)自大鼠16天胚胎脊根神經(jīng)節(jié)主要培養(yǎng)物的作用。從懷孕的Sprague-Dawley大鼠取出E16時(shí)期的胚胎并且解剖脊根神經(jīng)節(jié)。在膠原涂鋪的35mm培養(yǎng)皿(Falcon)中，用N2培養(yǎng)基(1∶1混合的Dubcco′s改良的Eagle′s培養(yǎng)基和Ham’sF12培養(yǎng)基并且補(bǔ)充有黃體酮、硒、胰島素、丁二胺、葡萄糖和青霉素-鏈霉素)于37℃、15％CO2環(huán)境中培養(yǎng)所有神經(jīng)節(jié)外植塊。用各種濃度的NGF和/或FK506或雷帕霉素或抗-NGF抗體處理感覺(jué)神經(jīng)節(jié)。在相差下使用OlympusIMT-2倒置顯微鏡每2-3天觀(guān)察神經(jīng)節(jié)，并且測(cè)量產(chǎn)生的軸突長(zhǎng)度。將各個(gè)神經(jīng)節(jié)的軸突區(qū)域分為四個(gè)扇形，使用目鏡測(cè)微尺以微米測(cè)量各個(gè)扇形中最長(zhǎng)的軸突長(zhǎng)度。這些測(cè)量的平均值作為神經(jīng)節(jié)的軸突長(zhǎng)度。為了進(jìn)行〔3H〕FK-506放射自顯影，將脊根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)物在用膠原(5ug/cm2)涂鋪的室載片(chamberslides)上進(jìn)行生長(zhǎng)。用冰冷卻的4.0％在0.1M磷酸鈉緩沖液(PH7.4)中的新鮮解聚的多聚甲醛將培養(yǎng)物在載片上固定1小時(shí)，然后用磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌兩次。通過(guò)在由50mMHepes、2mg/ml牛血清白蛋白、0.025吐溫-20pH7.4組成的緩沖液中預(yù)培養(yǎng)載片來(lái)用〔3H〕FK-506標(biāo)記固定的培養(yǎng)物。然后在含有1nM〔3H〕FK-506的相同測(cè)定緩沖液進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)加入1uM未標(biāo)記的FK506來(lái)測(cè)定非特異的結(jié)合。然后在干燥前漂洗載片4×5分鐘，并且與氚敏感的膠片并置10天?！?H〕FK-506結(jié)合部位的放射自顯影揭示在這些神經(jīng)節(jié)中與銀粒相關(guān)的FKBP的基本水平(圖12)。在1uM的未標(biāo)記的FK506中，放射自顯影顆粒被消除，表明結(jié)合的特異性。如上所述，NGF(100ng/ml)顯著增加神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)的數(shù)量和長(zhǎng)度(圖13)。FK506(1uM)單獨(dú)產(chǎn)生類(lèi)似的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)1nMFK506就使生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的增加。起FK506拮抗劑作用的雷帕霉素(1uM)完全阻斷FK506(1uM)的作用，因此FK506的作用對(duì)FKBP顯示藥物特異性特點(diǎn)。然而FK506在不加NGF時(shí)不刺激PC-12細(xì)胞中軸突的生長(zhǎng)，在感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中，F(xiàn)K506單獨(dú)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的。神經(jīng)節(jié)中的Schwann細(xì)胞可產(chǎn)生NGF，并且蛋白磷酸化作用調(diào)節(jié)Schwann細(xì)胞產(chǎn)生NGF。為了確定FK506的作用單獨(dú)涉及內(nèi)源的NGF的增強(qiáng)作用，我們檢查了抗體對(duì)NGF的影響(圖13)?？?NGF顯著減小FK506(1uM)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用?？筃GF不以毒性放射起作用，因?yàn)槲覀冊(cè)诩尤氲腘GF存在或不存在下將細(xì)胞暴露于抗-NGF未觀(guān)察到形態(tài)學(xué)毒性。FK506刺激軸突生長(zhǎng)作用極強(qiáng)。1pM時(shí)就產(chǎn)生易發(fā)現(xiàn)的增加。從0.1到10nM的FK506，其生長(zhǎng)作用逐漸增大(數(shù)據(jù)未顯示)，而達(dá)到最大生長(zhǎng)作用需1uMFK506。NGF和FK506在所有濃度時(shí)的軸突生長(zhǎng)過(guò)程都是類(lèi)似的。1天時(shí)的某些生長(zhǎng)是明顯的，而在大約5-6天時(shí)生長(zhǎng)開(kāi)始達(dá)到平臺(tái)。FK506神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用涉及感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中的FKBP(FK506結(jié)合蛋白)，因?yàn)榈蜐舛鹊睦着撩顾?一種FKBP水平的已知的FK506拮抗劑)逆轉(zhuǎn)FK506的作用。雷帕霉素不阻斷PC-12細(xì)胞中的FK506的作用可能反映雷帕霉素特異的刺激作用。雷帕霉素對(duì)PC-12細(xì)胞中的軸突生長(zhǎng)的刺激作用的機(jī)制不是一下子就能夠明白的。認(rèn)為其免疫抑制作用涉及與FK506不同的機(jī)制。雷帕霉素可抑制磷酸化S6核糖體亞單位的S6激酶。雷帕霉素也抑制磷脂酰肌醇-3-激酶。蛋白激酶C(PKC)介導(dǎo)的磷酸化和神經(jīng)再生時(shí)的軸突生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)。其它證據(jù)暗示PKC在神經(jīng)延伸過(guò)程中的抑制作用。GAP43是一種重要的在軸突中高度濃縮的鈣調(diào)磷酸酶底物，并且通過(guò)FKBP調(diào)節(jié)其磷酸化。GAP43可能不直接參與軸突延伸，因?yàn)榫哂械蜐舛菺AP43的PC-12細(xì)胞系顯示正常的軸突生長(zhǎng)。然而，GAP43及其磷酸化作用可能涉及靶軸突，因?yàn)楫?dāng)軸突到達(dá)其靶位時(shí)，磷酸化的GAP43的濃度增加。GAP43的磷酸化也可影響Ca2的流動(dòng)，以調(diào)節(jié)軸突延伸。磷酸化的GAP43抑制磷脂酰肌醇二磷酸酯的形成，減小肌醇1，4，5-三磷酸酯的濃度并且與Ca2+釋放有關(guān)。另外，GAP43的磷酸化減小與鈣調(diào)蛋白的親和力，而產(chǎn)生游離的能與Ca2+結(jié)合的鈣調(diào)蛋白。除了影響Ca2+的鈣調(diào)磷酸酶之外，免疫親和蛋白可在位點(diǎn)上起作用，調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)。FKBP結(jié)合ryanodine受體，它是Ca2+釋放通道。在骨骼肌肌漿網(wǎng)中，F(xiàn)K506從ryanodine受體分離FKBP來(lái)促進(jìn)誘導(dǎo)Ca2+釋放機(jī)制的Ca2+。另外，F(xiàn)K506在其它部位起作用，包括FKBP25甾體受體和其它未鑒定的靶位如與FKBP13有關(guān)的。因此，其它潛在的機(jī)制可在軸突延伸中起某些作用。免疫親和蛋白的非免疫抑制的和免疫抑制的配體刺激PC-12細(xì)胞中軸突生長(zhǎng)在本研究中，我們檢查了免疫親和蛋白對(duì)PC-12細(xì)胞和未受損小雞感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中軸突延伸的多種配體的詳細(xì)影響。我們報(bào)告非免疫抑制的和免疫抑制的配體在PC-12細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)的軸突生長(zhǎng)中具有極強(qiáng)的增加作用。在我們的較早研究中，我們發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑通過(guò)增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)10倍來(lái)刺激PC-12軸突生長(zhǎng)(Lyonset.al.，1994)。在不加NGF時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。在本研究中，我們?cè)u(píng)價(jià)免疫抑制劑藥物FK506和雷帕霉素在0.1-100ng/mlNGF存在下對(duì)PC-12軸突生長(zhǎng)的影響。在不加NGF時(shí)，沒(méi)有藥物刺激軸突生長(zhǎng)。單獨(dú)加入0.1ng/mlNGF，在軸突延伸上產(chǎn)生小量增加，僅為50ng/ml明顯最大作用的15％(圖14)。雷帕霉素刺激軸突生長(zhǎng)的程度比其它藥物大，為0.1-0.5ng/mlNGF的刺激作用的3-4倍。由雷帕霉素產(chǎn)生的增加程度被高濃度的NGF減小并且在5-50ng/mlNGF時(shí)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義。FK506也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的，其作用在較低的NGF時(shí)最顯著并且在0.5ng/mlNGF時(shí)產(chǎn)生最大2.5倍的軸突生長(zhǎng)增加作用。有三個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的免疫抑制劑藥物的基本結(jié)構(gòu)分類(lèi)，環(huán)孢菌素A、FK506和雷帕霉素。盡管FK506和環(huán)孢菌素與獨(dú)特的免疫親和蛋白蛋白結(jié)合，但它們都通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶來(lái)起免疫抑制劑的作用。雷帕霉素以非常高的親和性與FKBP-12結(jié)合但藥物-免疫親和蛋白復(fù)合物不依次與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合。然而，由雷帕霉素-FKBP-12復(fù)合物與近來(lái)鑒定并克隆的定名為RAFT-1(雷帕霉素和FK506靶向物)也被定名為FRAP的蛋白結(jié)合產(chǎn)生免疫抑制劑的作用(Sabatini和Snyder，1994；Brown等，1994；Chen等，1994)。因?yàn)槔着撩顾嘏cFKBP-12強(qiáng)烈結(jié)合但不抑制鈣調(diào)磷酸酶，所以可作為FK506的拮抗劑。雷帕霉素存在有非免疫抑制的衍生物。其中之一為WAY-124466，一種雷帕霉素的三烯衍生物，它以高的親和性與FKBP-12結(jié)合并且抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性，但沒(méi)有免疫抑制劑的活性。環(huán)孢菌素A是大環(huán)十一肽。僅在6位丙氨酸上加入甲基產(chǎn)生一個(gè)不抑制鈣調(diào)磷酸酶且缺乏免疫抑制作用的試劑，盡管它將親環(huán)蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性抑制到環(huán)孢子菌素A的類(lèi)似程度(參考MeCsA)。為了確定免疫抑制劑活性是否需要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，我們比較FK506、雷帕霉素和環(huán)孢子菌素A與非免疫抑制劑WAY-124466的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，評(píng)價(jià)在PC-12細(xì)胞上以寬的濃度范圍進(jìn)行(圖15、16)。所有研究都有0.5ng/ml的NGF。如上所述，F(xiàn)K506非常強(qiáng)烈地刺激軸突延伸，在0.5nM時(shí)具有最大刺激作用的一半并且在5-100nM時(shí)具有最大的作用。雷帕霉素是檢查中最強(qiáng)的試劑，產(chǎn)生最大的軸突生長(zhǎng)水平。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，大約0.2-0.4nM產(chǎn)生50％的最大延伸而在大約10-100nM時(shí)產(chǎn)生最大的作用。雷帕霉素的最大軸突延伸作用類(lèi)似于50ng/mlNGF的最大作用。WAY-124466也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的，但作用是較弱的，比雷帕霉素產(chǎn)生低的最大作用。大約10nM的WAY-124466產(chǎn)生最大刺激一半的作用并且在100-1000nM時(shí)產(chǎn)生最大的作用。因此，雷帕霉素比WAY-124466強(qiáng)100倍，類(lèi)似地，在與FKBP-12結(jié)合能力上強(qiáng)40倍(表II)。環(huán)孢菌素A在刺激軸突生長(zhǎng)作用上基本上低于FK506或雷帕霉素，相應(yīng)地，抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性上也較低。在50nM時(shí)產(chǎn)生環(huán)孢菌素軸突生長(zhǎng)最大刺激50％的作用而在100nM時(shí)產(chǎn)生最大的作用，并且在環(huán)孢菌素A濃度較高時(shí)軸突生長(zhǎng)作用減小。環(huán)孢菌素A的最大刺激作用大約是50ng/mlNGF作用的60％。延伸過(guò)程的一般模式與各種免疫親和蛋白配體和NGF是類(lèi)似的。在產(chǎn)生50％最大作用的濃度NGF(1-5ng/ml)時(shí)，細(xì)胞至少延伸細(xì)胞體的40-50％，同時(shí)寬度生長(zhǎng)15％，直到細(xì)胞體長(zhǎng)度的3-5倍。模式與各種檢查的藥物非常類(lèi)似。雷帕霉素和WAY-124466在每個(gè)細(xì)胞中比FK506產(chǎn)生更多的突起。環(huán)孢菌素A在突起的數(shù)量上處于中間水平。在小雞脊根神經(jīng)節(jié)中由免疫親和蛋白的非免疫抑制的和免疫抑制的配體產(chǎn)生的神經(jīng)延伸在我們的前面研究中，我們觀(guān)察了在用1皮摩爾濃度的FK506觀(guān)察的神經(jīng)生長(zhǎng)中具有明顯增加的大鼠脊根神經(jīng)節(jié)的外植塊中的免疫抑制劑藥物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(Lyons等，1994)。在大鼠神經(jīng)節(jié)中，用FK506甚至在沒(méi)有NGF的情況下觀(guān)察神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。在本研究中，我們使用小雞脊根神經(jīng)節(jié)，在神經(jīng)生長(zhǎng)研究中小雞脊根神經(jīng)節(jié)更容易使用。在不加入NGF時(shí)，我們觀(guān)察了免疫親和蛋白配體藥物的最小作用。小雞細(xì)胞比PC-12細(xì)胞對(duì)NGF更敏感，因此我們使用0.1ng/mlNGF來(lái)產(chǎn)生最小軸突生長(zhǎng)并且證明免疫親和蛋白配體的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(圖17、18)。從十天懷孕的小雞胚胎中解剖脊根神經(jīng)節(jié)。所有神經(jīng)節(jié)外植塊都在涂鋪有薄層Matrigel的12孔板上于37℃下含有5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，所述板上具有補(bǔ)充2mM谷胺酰胺和10％胎牛血清并含有10uM胞嘧啶β-D阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)(AraC)的LiebovitzL15加高葡萄糖培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用各種濃度的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、免疫親和蛋白胚胎或者NGF和藥物的組合物處理DRG。藥物處理48小時(shí)之后，在相差或Hoffman調(diào)制相差ZeissAxiovert倒置顯微鏡觀(guān)察神經(jīng)節(jié)。進(jìn)行外植塊顯微照相，定量軸突生長(zhǎng)。將軸突比DRG直徑長(zhǎng)的記作陽(yáng)性，記錄每次實(shí)驗(yàn)條件下定量的軸突總數(shù)。每孔培養(yǎng)3-4個(gè)DRG，將每次處理重復(fù)兩次。各種免疫親和蛋白胚胎的刺激神經(jīng)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)的相對(duì)能力類(lèi)似于它們?cè)赑C-12細(xì)胞上的能力。因此，雷帕霉素是最強(qiáng)試劑，EC50為1nM，比WAY-124466強(qiáng)10倍，而FK506的EC50為1-2nM。免疫親和蛋白胚胎和NGF的最大有效濃度(100ng/ml)對(duì)突出的數(shù)量、它們的長(zhǎng)度和分支上的最大增加是十分類(lèi)似的。逐漸增加各種藥物的濃度，觀(guān)察到較大數(shù)量的軸突、延伸更長(zhǎng)的分支和更長(zhǎng)的各個(gè)突出。通過(guò)檢查結(jié)合的3H-FK506對(duì)重組FKBP的抑制作用，我們?cè)u(píng)價(jià)藥物與FKBP-12結(jié)合的能力。在藥物與FKBP-12的親和性及其刺激軸突生長(zhǎng)的能力和抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性之間存在有驚人的平行。神經(jīng)生長(zhǎng)刺激作用顯然與鈣調(diào)磷酸酶的抑制作用無(wú)關(guān)。鈣調(diào)磷酸酶抑制作用與免疫抑制劑作用非常吻合，WAY-124466不是免疫抑制的，并且不抑制鈣調(diào)磷酸酶。雷帕霉素是強(qiáng)的免疫抑制劑，但雷帕霉素-FKBP-12復(fù)合物與RAFT-1結(jié)合來(lái)啟動(dòng)免疫抑制過(guò)程(Sabatini和Snyder，1994；Snyder和Sabatini，1995)。結(jié)果顯示在表2中。表2免疫親和蛋白配體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用與旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶，而不是鈣調(diào)磷酸酶的抑制作用平行藥物〔3H〕-鈣調(diào)磷酸旋轉(zhuǎn)異構(gòu)軸突生長(zhǎng)FK506-酶酶(K1)(ED50)FKBP12抑制作用(IC50)FK5060.6nM是0.4nM0.5nM雷帕霉素0.5nM非0.2nM0.5nMWAY-12446610.0nM非12.0nM10nM環(huán)孢菌素(C、A)無(wú)是20nM50nM我們比較了非免疫抑制的免疫親和蛋白配體促進(jìn)小雞脊根神經(jīng)節(jié)外植塊培養(yǎng)物軸突生長(zhǎng)的能力(表3)。這些化合物均不能抑制鈣調(diào)磷酸酶，但與免疫親和蛋白FKBP-12相互作用并以表3中所列的各種抑制常數(shù)抑制其旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。這些化合物促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)的能力與它們抑制FKBP-12的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的能力之間有非常好的相關(guān)性。表3免疫親和蛋白配體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用與旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶，而不是鈣調(diào)磷酸酶的抑制作用平行藥物〔3H〕-FK506-鈣調(diào)磷酸酶旋轉(zhuǎn)異構(gòu)軸突生長(zhǎng)FKBP12(IC50)抑制作用酶(K1)(ED50)實(shí)施例128uM非250nM300nM實(shí)施例134uM非25nM80nM藥物在免疫親和蛋白結(jié)合、抑制其旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性和刺激軸突生長(zhǎng)能力之間的非常密切的關(guān)系暗示抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性引起藥物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。藥物刺激軸突生長(zhǎng)和與免疫親和蛋白結(jié)合的非常高的能力使得幾乎不可能由任何其它靶物引起親神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。可以想象免疫親和蛋白而不是旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶的生物活性可受藥物介導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的影響。然而，仍沒(méi)有報(bào)道這種活性。因?yàn)樗幬锏姆浅?qiáng)的能力和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的密切關(guān)系，我們推斷旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制作用似乎涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。已經(jīng)報(bào)告許多蛋白作為免疫親和蛋白包括膠原(Steinmann等，1991)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Lodish和King，1991)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的底物。最近，已經(jīng)報(bào)道ryanodine受體和IP-3受體(重要的細(xì)胞內(nèi)鈣通道)的高純度制劑以FKBP-12復(fù)合物形式存在。FKBP-12從這些復(fù)合物中分離引起鈣通道“滲漏”(Cameron等，1995)，在軸突延伸中涉及鈣流，因此在藥物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用中可涉及IP-3受體和ryanodine受體。因?yàn)?，藥物與IP-3受體或Ryanodine受體的FKBP-12上的相同部位結(jié)合，藥物必然置換FKBP-12通道。已經(jīng)報(bào)道親環(huán)蛋白中的這些鈣通道之間沒(méi)有相互作用，因此這些模型不能解釋環(huán)孢菌素A的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。這里研究的藥物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用是在極低的濃度下產(chǎn)生的，表明那些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白如大腦來(lái)源的生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的能力是相似的。下面實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案并且不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。所有聚合物分子重量是平均分子重量。所有百分含量都是最終釋放體系或制劑的重量的百分比，除非另有表示，并且總量等于100％(重量比)。可用于本發(fā)明目的的2-2-哌啶酸衍生物化合物的實(shí)施例包括實(shí)施例1該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Ocain等人在生物化學(xué)與生物物理研究通訊，Vol.192，No.3，1993中公開(kāi)。在Wyeth-Ayerst中，Dr.PhilHughes等人通過(guò)將4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮與雷帕霉素反應(yīng)合成該化合物。實(shí)施例2該2-哌啶酸衍生的化合物由Chakraborty等人在化學(xué)和生物學(xué)，1995.3，2157-161中公開(kāi)。實(shí)施例3-5該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Ikeda等人在美國(guó)化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志1994，116，4143-4144中公開(kāi)，并且引入本文供參考。實(shí)施例6-9該2-哌啶酸衍生的化合物由Wang等人在生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)快報(bào)，Vol.4，No.8，pp.1161-1166，1994中公開(kāi)，尤其是化合物2a-2d，并且引入本文供參考。實(shí)施例10該2-哌啶酸衍生的化合物10實(shí)例由Birkenshaw等人在生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)快報(bào)，Vol.4，No.21，pp.2507-2510，1994中公開(kāi)并且引入本文供參考。實(shí)施例11-21該2-哌啶酸的衍生化合物的實(shí)例由Holt等在美國(guó)化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志1993，115，9925-9938，特別是化合物4-14公開(kāi)，并在此引入作為參考。實(shí)施例22-30該2-哌啶酸衍生化合物的實(shí)例由Caffery等在生物有機(jī)和醫(yī)學(xué)化學(xué)快報(bào)，Vol.4，No.21，pp.2507-2510，1994公開(kāi)并在此引入作為參考。實(shí)施例31該2-哌啶酸衍生的實(shí)例化合物31，由Teahue等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.3，No.10，pp.1947-1950，1993中公開(kāi)并且引入本文供參考。實(shí)施例32-34該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Yamashita等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.4，No.2，pp.325-328，1994中公開(kāi)，尤其是化合物11，12，和19，并且引入本文供參考。實(shí)施例35-55該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Holt等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.4，No.2，pp.315-320，1994中公開(kāi)，尤其是化合物3-21，和23-24，并且引入本文供參考。實(shí)施例56-68該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Holt等人在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，Vol.3，No.10，pp.1977-1980，1993中公開(kāi)，尤其是化合物3-15，并且引入本文供參考。實(shí)施例69-83本發(fā)明化合物實(shí)例由Hauske等人在醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志1992，35，4284-4296中公開(kāi)，尤其是化合物6，9-10，21-24，26，28，31-32，和52-55，并且引入本文供參考。實(shí)施例84該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Teague等人在Bioorganic&Med.Chem.Letters，Vol.4，No.13，pp.1581-1584，1994中公開(kāi)并且引入本文供參考。實(shí)施例85-88該2-哌啶酸衍生的化合物實(shí)例由Stocks等人在Bioorganic&Med.Chem.Letters，Vol.4，No.12，pp.1457-1460，1994中公開(kāi)，尤其是化合物2，15-17，并且引入本文供參考。實(shí)施例90-111該2-哌啶酸衍生的其它化合物實(shí)例在方案10，表1-5中描述。方案01</tables>方案2實(shí)施例/化合物編號(hào)R2方案3實(shí)施例/化合物號(hào)結(jié)構(gòu)式方案4表1表2表3</tables>方案5實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式32R＝苯基33R＝N(丙烯基)2方案6表1實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式表2實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式方案7表156X＝OH57X＝OMe58X＝OiPr59X＝OBn60X＝OCHMePh61X＝OCH2CHCHPh62X＝OCH2CH2CH2(3，4-OMe2)Ph63X＝NHBn64X＝NHCH2CH2CH2Ph表265R＝Me66R＝Bn表3方案8表1實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式R2＝Phe-o-叔丁基70式R2＝Phe-o-叔丁基表271R1＝m-OCH3Ph；R31＝Val-o-叔丁基72R1＝m-OCH3Ph；R31＝Leu-o-叔丁基73R1＝m-OCH3Ph；R31＝Ileu-o-叔丁基74R1＝m-OCH3Ph；R31＝六氫-Phe-o-叔丁基75R1＝m-OCH3Ph；R31＝烯丙基丙氨酸-o-叔丁76基R1＝B-萘基；R31＝Val-o-叔丁基表3實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式77R1＝CH2(CO)-m-OCH3PHR41＝CH2PhR51＝OCH378R1＝CH2(CO)-3-萘基R41＝CH2PhR51＝OCH3表4實(shí)施例/化合物編號(hào)結(jié)構(gòu)式79R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR41＝HY＝OC(o)Ph80R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR42＝HY＝OC(o)CF381R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHIR41＝-Y＝-82R1＝m-OCH3PhX＝trans-CH＝CHR41＝HY＝OCH2CH＝CH283R1＝m-OCH3PhX＝C＝OR41＝HY＝Ph方案9表185表286R1＝H，R2＝OMeR3＝CH2OMe87R1＝H，R2＝R3＝H88R1＝Me，R2＝R3＝H方案10表1實(shí)施例R＝903，4-二氯913，4，5-三甲氧基92H933-(2，5-二甲氧基)-苯基丙基943-(3，4-亞甲基-二氧)苯基丙基表2實(shí)施例R＝954-(p-甲氧基)-丁基963-苯基丙基973-(3-吡啶基)-丙基表3實(shí)施例R＝983-吡啶基丙基991，7-二苯基-4-庚基1004-(4-甲氧基)丁基1011-苯基-6-(4-甲氧基苯基)-4-己基1023-(2，5-二甲氧基)苯基-丙基1033-(3，4-亞甲基二氧)-苯基丙基1041，5-二苯基戊基表4實(shí)施例R＝1054-(4-甲氧基)丁基1063-環(huán)己基丙基1073-苯基丙基表5實(shí)施例R＝1083-環(huán)己基丙基1093-苯基丙基1104-(4-甲氧基)丁基1111，7-二苯基-4-庚基旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制劑的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用如上所述，表I中列出了大量權(quán)利要求實(shí)施例及其在所培養(yǎng)的感覺(jué)神經(jīng)元中產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)作用的功效。圖19和20表明實(shí)施例111和實(shí)施例17在脊根神經(jīng)節(jié)中促進(jìn)軸突長(zhǎng)出的顯微照片。表I試驗(yàn)實(shí)施例的體外功效實(shí)施例旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶抑制作用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)ED50Ki，nM雞DRGs，nM6140259130.0301117011225030013258015170.3019120.01736＞10,000＞10,000411300500050＞10,000＞10,0009018002500912820092399093753594708951655-109674010-20977251509813075993051006043101150.17102122.5103120310420.016105103610676011072100.82108320.2910920.08110240.00211150.08實(shí)施例化合物在體內(nèi)神經(jīng)再生模型中的活性坐骨神經(jīng)軸突切除(Axotomy)將6周齡的雄性Sprague-Dawiey大鼠麻醉，并在髖部，用鑷子將坐骨神經(jīng)暴露并弄碎。在損傷前，皮下給予試驗(yàn)化合物或載體并且每天一次，共給予18天。用Holmes銀染料將坐骨神經(jīng)部分染色以便確定軸突的數(shù)目，并用Luxol堅(jiān)牢藍(lán)來(lái)確定髓鞘形成的含量。損傷18天后，在用載體治療的動(dòng)物中，軸突數(shù)目(與未受損對(duì)照組相比減少50％)和髓鞘形成含量(與未受損對(duì)照組相比減少90％)明顯減少。在損傷前，給予實(shí)施例12(30mg/kg皮下)，或?qū)嵤├?3(mg/kg皮下)并在受損后每天一次，共給予18天，與載體治療的動(dòng)物相比，軸突數(shù)目(與未受損的對(duì)照組相比，分別減少25％和5％)和髓鞘形成含量(與對(duì)照組相比，分別減少65％和50％)明顯再生。實(shí)施例12和實(shí)施例13的顯著功效與其抑制旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性和在雞DRGs中刺激軸突長(zhǎng)出的活性是一致的，并且其體內(nèi)功效與其相應(yīng)的體外功效是相同的(表I)。這些結(jié)果顯示于圖21?！癝ham”指接受載體但未受損的對(duì)照組動(dòng)物；“Vehicle”指受損并且只接受載體(即，沒(méi)有藥物)的動(dòng)物。對(duì)于假性治療的動(dòng)物，實(shí)施例12和實(shí)施例13驚人地相似，這證明了這些化合物在體內(nèi)較強(qiáng)的神經(jīng)再生作用。這些數(shù)據(jù)顯示于表II。表II治療軸突數(shù)目髓鞘質(zhì)含量(％對(duì)照)假性治療100100損傷5010+載體(皮下)+實(shí)施例127535(30mg/kg皮下)+實(shí)施例1310050(30mg/kg皮下)顯然，本發(fā)明可以在很多方面修改。這些修改并不違背本發(fā)明精神和范圍并且所有這些修改包括在下列權(quán)利要求范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.治療動(dòng)物神經(jīng)病學(xué)疾病的方法，它包括給予動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白類(lèi)具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述神經(jīng)病學(xué)疾病選自由物理性損傷或疾病狀態(tài)引起的外周神經(jīng)病，對(duì)腦的物理性損傷，對(duì)脊髓的物理性損傷，由腦損傷引起的中風(fēng)，與神經(jīng)退變有關(guān)的神經(jīng)病學(xué)疾病。3.權(quán)利要求2的方法，其中，所述神經(jīng)病學(xué)疾病選自早老性癡呆，帕金森病，和肌萎縮性側(cè)索硬化。4.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。5.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124，666。6.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。7.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。8.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。9.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。10.權(quán)利要求1的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。11.治療動(dòng)物神經(jīng)病學(xué)疾病的方法，它包括給予動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白具有親和力的2-哌啶酸衍生物和有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，腦來(lái)源的生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3，來(lái)刺激受損外周神經(jīng)的生長(zhǎng)或促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。12.權(quán)利要求11的方法，其中，所述神經(jīng)病學(xué)疾病選自由物理性損傷或疾病狀態(tài)引起的外周神經(jīng)病，對(duì)腦的物理性損傷，對(duì)脊髓的物理性損傷，由腦損傷引起的中風(fēng)，與神經(jīng)退變有關(guān)的神經(jīng)病學(xué)疾病。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述神經(jīng)病學(xué)疾病選自早老性癡呆，帕金森病，和肌萎縮性側(cè)索硬化。14.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。15.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124,666。16.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。17.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。18.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。19.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。20.權(quán)利要求11的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。21.刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)的方法，它包括給予受損外周神經(jīng)有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白類(lèi)具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激或促進(jìn)受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白類(lèi)顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。22.權(quán)利要求21的方法，它進(jìn)一步包括給予神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)刺激或促進(jìn)受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，腦來(lái)源的生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3。23.權(quán)利要求23的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。24.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124,666。25.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。26.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。27.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。28.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。29.權(quán)利要求21的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。30.刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)的方法，它包括給予受損外周神經(jīng)有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白類(lèi)具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。31.權(quán)利要求30的方法，它進(jìn)一步包括給予有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)刺激受損外周神經(jīng)生長(zhǎng)，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，腦生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3。32.權(quán)利要求30的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。33.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124,666。34.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。35.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。36.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。37.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。38.權(quán)利要求30的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。39.促進(jìn)動(dòng)物神經(jīng)元再生和生長(zhǎng)的方法，它包括給予動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白類(lèi)具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元再生，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。40.權(quán)利要求39的方法，它進(jìn)一步包括給予有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元再生，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，腦生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3。41.權(quán)利要求39的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。42.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124,666。43.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。44.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。45.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。46.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。47.權(quán)利要求39的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。48.抑制動(dòng)物神經(jīng)退變的方法，它包括給予動(dòng)物有效量的、對(duì)FKBP-型免疫親和蛋白類(lèi)具有親和力的2-哌啶酸衍生物來(lái)抑制神經(jīng)退變，其中，F(xiàn)KBP-型免疫親和蛋白顯示旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性并且2-哌啶酸衍生物抑制所述免疫親和蛋白的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性。49.權(quán)利要求48的方法，它進(jìn)一步包括給予有效量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)抑制神經(jīng)退變，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，腦生長(zhǎng)因子，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子，睫神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3。50.權(quán)利要求48的方法，其中2-哌啶酸衍生的化合物為免疫抑制性的或非免疫抑制性的。51.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Way-124,666。52.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為雷帕霉素。53.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為FK506。54.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為Rap-Pa。55.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物為SLB-506。56.權(quán)利要求48的方法，其中，2-哌啶酸衍生物選自化合物3-84，和86-88。全文摘要本發(fā)明涉及利用2－哌啶酸衍生的、對(duì)FKBP型免疫親和蛋白具有親和力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性化合物作為與免疫親和蛋白蛋白質(zhì)相關(guān)的酶活性抑制劑,特別是作為肽?！滨．悩?gòu)酶或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶酶活性抑制劑來(lái)刺激或促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)或再生的方法。文檔編號(hào)A61K31/50GK1187127SQ9619455公開(kāi)日1998年7月8日申請(qǐng)日期1996年6月5日優(yōu)先權(quán)日1996年6月5日發(fā)明者J·P·斯特內(nèi)爾,S·斯尼德?tīng)?G·S·哈米爾頓申請(qǐng)人:吉爾福特藥品有限公司,約翰斯霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院