專利名稱：雷帕霉素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雷帕霉素(rapamycin)衍生物，其生產(chǎn)方法，及其作為藥物的應(yīng)用，和含該衍生物的藥物組合物。
雷帕霉素是由吸濕鏈霉菌(streptomyces hygroscopicus)產(chǎn)生的已知大環(huán)內(nèi)酯抗生素，其結(jié)構(gòu)如式A所示
參見McAlpine，J.B.等人，J.Antibiotics(抗菌素雜志)(1991)44688；Schreiber，S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.(美國化學(xué)會(huì)會(huì)志)(1991)1137433；US 3929992等文獻(xiàn)(對(duì)雷帕霉素曾提出過各種不同的編號(hào)方式，為避免混淆，本文中對(duì)具體雷帕霉素衍生物命名時(shí)，該名以使用式A編號(hào)方式的雷帕霉素為參考給定)。雷帕霉素是一種有效的免疫抑制劑，同時(shí)還表現(xiàn)出抗腫瘤活性及殺真菌活性。但是，它作為藥物的應(yīng)用，卻因其很低而又多變的生物利用度而受到限制。而且雷帕霉素不溶解且穩(wěn)定性差，使其很難配制成穩(wěn)定的蓋倫制劑組合物。
很多雷帕霉素衍生物是已知的，某些40-O-取代的雷帕霉素在US 5258389和WO 94/09010(O-烷基雷帕霉素)；WO 92/05179(羧酸酯)；US 5118677(酰胺酯)；US 5118678(氨基甲酸酯)；US 5100883(氟化酯)；US 5151413(乙縮醛)，及US 5120842(甲硅烷基醚)中介紹過。
目前令人驚異地發(fā)現(xiàn)某些新型的雷帕霉素衍生物，具有超過雷帕霉素的，得到改善的藥理學(xué)特性，并顯示出更大的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，提供式I化合物，
其中R1是烷基、鏈烯基、鏈炔基、羥烷基、羥鏈烯基、羥鏈炔基、芐基、烷氧芐基、或氯芐基；R2選自式II或式III
其中R3選自H、烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、硫代烷基、芳烷基、羥芳烷基、羥芳基、羥烷基、二羥烷基、羥烷氧烷基、羥烷芳烷基、二羥烷芳烷基、烷氧烷基、烷基羰基氧烷基、氨烷基、烷氨烷基、烷氧羰基氨烷基、烷基羰基氨烷基、芳基亞磺酰氨烷基、烯丙基、二羥烷基烯丙基、二氧戊環(huán)烯丙基、烷酯烷基、和烷基甲硅烷基；R4是氫、甲基，或者R4和R3連在一起形成C2-6亞烷基；R5是R6O-CH2-(其中R6選自H、烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、羥烷羰基、氨烷羰基、甲?；?、硫代烷基、芳烷基、羥芳烷基、羥芳基、羥烷基、二羥烷基、羥烷氧烷基、羥烷基芳烷基、二羥烷基芳烷基、烷氧烷基、烷基羰基氧烷基、氨烷基、烷氨烷基、烷氧羰基氨烷基、烷羰基氨烷基、芳基亞磺酰氨烷基、烯丙基、二羥烷基烯丙基、二氧戊環(huán)基烯丙基、和烷酯烷基)，R7CO(其中R7選自H、烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、氨基、烷氨基、氨基酸殘基、或N，N-二取代氨基，其中所述取代基(a)選自烷基、芳基、或芳烷基，或(b)形成雜環(huán)結(jié)構(gòu))，R8NCH-(其中R8是烷基、芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、羥基、烷氧基或芳磺酰氨基)，-O-CH-O-，或者取代的二氧次甲基；Y選自O(shè)、(H、OH)和(H、OR9)，其中R9選自C1-4烷基、烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、羥烷基羰基、氨基烷羰基、甲?；蚍蓟徊⑶襒是OH或H；其中“alk”(本文中譯為“鏈”或“烷”)或“alkyl”(本文中譯為“烷基”)均指任意由氧鏈隔斷或不隔斷的C1-10脂族取代基；“ar”或“aryl”(本文中均譯為“芳基”)均指單環(huán)、任選雜環(huán)，任意被取代(或未被取代)的C4-14芳香取代基，其先決條件是，若X是OH，R1是烷基、且R2是式II殘基時(shí)，R3不是H。
上面提到的任何“alk”部份(本文中譯為“鏈”或“烷”)或“alkyl”(本文譯為“烷基”)，可以是支鏈、直鏈或環(huán)狀的，優(yōu)選任意由氧鍵隔斷或不隔斷的C1-6脂族取代基，更優(yōu)選不被氧鍵隔斷者。
上面提到的“ar”或“aryl”(本文均譯為“芳基”)及任意被取代的芳基可包括，例如苯基、芐基、甲苯基和吡啶基等等。
若R1是氯芐基或烷氧芐基，該取代基優(yōu)選位于鄰位。
若R7CO-是N，N-二取代氨基甲?；梢允抢鏝-甲基-N-(2-吡啶-2-基-乙基)-氨基甲?；?、(4-甲基-哌嗪-1-基)-羰基或(嗎啉-4-基)-羰基。
若R5是被取代的二氧次甲基，則可以是例如O，O-(亞烷基)-二氧-次甲基，即此處2個(gè)氧由一個(gè)亞烷基連接。
式I化合物中，下面各情況或者單獨(dú)的、或者任何結(jié)合、次結(jié)合情況均屬優(yōu)選
1.X是OH，并且R1是C3-10鏈炔基或C3-10羥鏈炔基，優(yōu)選C3-10鏈-2-炔基，或C3-10羥基鏈-2-炔基，更優(yōu)選C3-6鏈-2-炔基；2.X是H、并且R1是C1-10烷基、C3-10鏈-2-烯基、C3-10羥基鏈-2-烯基、C3-10鏈-2-炔基、C3-10羥基鏈-2-炔基，或C1-10烷氧基C1-10烷基，優(yōu)選C1-6烷基或C3-6鏈-2-炔基，更優(yōu)選C1-4烷基，最優(yōu)選甲基；3.作為R1的C3-6鏈炔基是2-丙炔基或戊-2炔基，優(yōu)選戊-2-炔基；4.Y是O，(H，OH)或(H，C1-4烷氧基)，優(yōu)選O；5.R2是式II殘基；6.式II殘基中，R3是H、C1-6羥烷基、羥基-C1-6烷氧基-C1-6烷基、(C1-6烷基)-羰基-氨基-C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷氧基或氨基-C1-6烷基、優(yōu)選H、羥乙基、羥丙基、羥乙氧乙基、甲氧乙基、或乙酰氨乙基；特別是當(dāng)X是H、或當(dāng)X是OH且R1是鏈炔基時(shí)，R3為H；7.式II殘基中，R4是甲基；8.R2是式III殘基，其中R5是R6OCH2-，其中R6選自H、C1-6烷基、C3-6鏈-2-烯基、C3-6鏈-2-炔基、芳基、C1-6烷基-羰基、芳羰基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基或氨基C1-6烷基；或R5為R7CO-，其中R7選自H、羥基、C1-6烷氧基、氨基、C1-6烷氨基、氨基酸殘基，或N，N-二取代氨基，其中所述取代基(a)選自C1-6烷基或芳基，或(b)形成雜環(huán)結(jié)構(gòu)；或R5是R8NCH-，其中R8是烷基、芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、羥基、烷氧基或芳磺酰氨基；或R5是-O-CH-O-，或者取代的二氧次甲基。
優(yōu)選化合物是式Ia化合物和式Ib化合物
其中R1、R2和Y定義同上，優(yōu)選上述第1和第3-8項(xiàng)所給定的優(yōu)選含義；
其中R1、R2和Y定義同上，優(yōu)選上述第2-8項(xiàng)給定的優(yōu)選含義。
特別優(yōu)選的化合物包括(i)32-脫氧-雷帕霉素；(ii)16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-雷帕霉素；(iii)16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕霉素；(iv)16-O-戊-2-炔基-32(S)-二氫-雷帕霉素；(v)16-O-戊-2-炔基-32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素；(vi)32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素；
(vii)32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素。
式I化合物表現(xiàn)出異構(gòu)現(xiàn)象，因此將存在異構(gòu)形式。應(yīng)當(dāng)明確，本發(fā)明包括式I化合物，式I′的單個(gè)異構(gòu)體，以及其異構(gòu)體混合物；
其中R1、R2、Y和X定義同上。
單個(gè)異構(gòu)體可以用與本領(lǐng)域已知方法類似的方法加以分離。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)式I化合物的方法，該方法包括a)為生產(chǎn)X是H的式I化合物，通過還原，消除式IVa化合物32位的羰基，
其中R1、R2和Y定義同上，式IVa化合物是被保護(hù)的、或未被保護(hù)的，并且，如果需要，除去帶有的保護(hù)基；或者b)為生產(chǎn)X是OH的式I化合物，立體有擇性地還原上面定義的式IVa化合物32位的羰基；c)將R1是烷基的式I化合物加以轉(zhuǎn)化，提供R1是烷基以外其它基團(tuán)的式I化合物。
方法a)中，優(yōu)選式IVa化合物是加以保護(hù)的，即它可以在不參與該反應(yīng)的官能團(tuán)上包含保護(hù)基團(tuán)，所述官能團(tuán)是例如，28位上的OH，和若R2是式II殘基時(shí)，任意在40位上的OH、或者R2是式III殘基時(shí)39位上的OH。
為得到式I的32-脫氧化合物的還原反應(yīng)a)，可以很方便地以二步完成i)將優(yōu)選保護(hù)形式的式IVa化合物與氫化物(例如氫化二異丁基鋁，或優(yōu)選氫化鋰三叔丁氧基鋁)反應(yīng)，得到相應(yīng)的32-二氫化合物，還可以使用本領(lǐng)域還原酮的其它已知方法和試劑，來從相應(yīng)酮生產(chǎn)32-二氫化合物。這些方法包括，例如加氫化、用金屬還原、金屬氫化物還原、如Comprehensive Organic Transformations(綜合有機(jī)轉(zhuǎn)化)(R.C.Larock，VCH Publishers Inc，New York，1989，pp.527-535，Sections 7.1.1-7.1.4)一書所述，以及采用酮不對(duì)稱還原法，如該書540-547頁第7.1.15節(jié)所述。該步驟后接著進(jìn)行第ii)步，ii)將該32-二氫化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的32-鹵代衍生物，例如32-溴代，或優(yōu)選32-碘代衍生物，然后將其用例如氫化物還原成所需的32-脫氧衍生物，并在需要時(shí)將所得化合物去保護(hù)基。還可以使用還原鹵化物常采用的其它試劑，例如包括低價(jià)金屬(即鋰、鈉、鎂和鋅)和金屬氫化物(氫化鋁、硼氫化物、硅烷、氫化銅)參見ComprehensiveOrgamc Transformations，R.C.Larock，VCH Publishers Inc.，New York，1989，pp.18-20，Sections 1.5.1和1.5.2。另外，鹵化物還原反應(yīng)還可在存在適當(dāng)金屬催化劑(即阮內(nèi)鎳、金屬鈀或其配合物、銠或釕的配合物)的條件下，用氫或氫源(即甲酸或其鹽)來進(jìn)行鹵化物還原，參見上述書第20-24頁，第1.5.3節(jié)。而且還可采用將醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)脫氧化合物所用的已知方法。這些方法，包括例如直接還原法，或中間體磷化合物、磺化物、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、或黃原酸酯的還原法，如該書第27-31頁，第1.9.1-1.9.4節(jié)所述。
適當(dāng)?shù)牧u基保護(hù)基及其形成和除去的方法均屬本領(lǐng)域已知，參見Protective Groups in Organic Synthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基)，Second ed.T.W.Greene和P.G.M.Wuts，John Wiley & Sons，New York，1991，Chapter 2(本文列為參考文獻(xiàn))。優(yōu)選的OH保護(hù)基是例如三有機(jī)甲硅烷基，如三(C1-6)烷基甲硅烷基(如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基)、三異丙基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三芳基甲硅烷基(如三苯基甲硅烷基)或三芳烷基甲硅烷基(如三芐基甲硅烷基)。去保護(hù)基反應(yīng)可以在溫和酸性條件下進(jìn)行。
該還原反應(yīng)第i)步可在低溫下，例如-10至-80℃下進(jìn)行。
第ii)步中，將任意加以保護(hù)的32-二氫化合物，優(yōu)選32(R)-非對(duì)映異構(gòu)體，轉(zhuǎn)化成酯，優(yōu)選磺酸酯，例如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、nosylate或triflate，接著用適當(dāng)?shù)柠u化物，如碘化鈉、或溴化鈉、碘化四丁基銨、或溴化四丁基銨置換，該反應(yīng)優(yōu)選在堿例如胺存在下進(jìn)行。采用已知分離技術(shù)例如色譜，可從混合物中分離出32(R)-非對(duì)映異構(gòu)體。
還原32-鹵代化合物的適當(dāng)氫化物包括，例如氫化三丁基錫或三-(三甲基甲硅烷基)硅烷之類的自由基氫化物。還原反應(yīng)也可以在存在或不存在自由基引發(fā)劑，例如2，2′-偶氮二異丁腈，或優(yōu)選Et3B下，一般在0°-80℃溫度下進(jìn)行。
假如需要，在i)或ii)步還原反應(yīng)之后，可以加入氧化劑如乙酸銅，使不希望的還原副反應(yīng)(例如出現(xiàn)在9位的)部位，選擇性地再氧化成羰基。
或者，通過本領(lǐng)域已知方法，例如使用與N-溴或N-碘代琥珀酰亞胺、四溴化碳或四碘化碳、1，2-二溴四氯乙烷、2，4，5-三溴或三碘咪唑、碘、1，2-二碘乙烷結(jié)合的三苯基磷，或使用亞硫酰溴，或者碘化甲基三苯氧基鏻，也可以將32-二氫衍生物直接轉(zhuǎn)化成鹵化物。
也可以通過形成甲苯磺酰腙，然后再用甲硼烷，例如兒茶酚甲硼烷處理，或通過形成二噻烷，然后進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪€原反應(yīng)，例如用阮內(nèi)鎳或氫化物如氫化三丁基錫還原，來實(shí)現(xiàn)使32位上的羰基還原成32-脫氧衍生物的轉(zhuǎn)化。還可以采用其它已知的使酮轉(zhuǎn)化成相應(yīng)烷烴的方法，例如包括直接還原法(參見Comprehensive Organic Transformations一書pp 35-37，Section 1.12.1，該參考書前后已列舉過)，或通過腙還原(參見該書pp 37-38，Section 1.12.2)以及通過硫和硒衍生物還原(參見該書pp34-35，Section 1.10和1.11)。
生成式I 32(S)-二氫化合物的還原步驟b)是在選擇條件下進(jìn)行的。優(yōu)選使用明顯有利于還原成32(S)的還原劑，例如三乙基硼氫化鈉。在低溫下例如-50至-80℃，在惰性溶劑例如THF、乙醚、甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚或甲基叔丁基醚中，該還原反應(yīng)很容易進(jìn)行。可以采用本領(lǐng)域已知的方法，例如柱色譜、逆相色譜使32(S)-二氫化合物從所產(chǎn)生的少量32(R)-二氫化合物中分離出來。
如果需要，28位上的羥基及40位上任意出現(xiàn)的羥基可以在還原反應(yīng)前加以保護(hù)，并隨后去除保護(hù)基，例如前面討論過的。優(yōu)選還原法b)是在無羥基保護(hù)的條件下進(jìn)行的。
轉(zhuǎn)化步驟c)可以按照本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，例如，可將R1是烷基(優(yōu)選甲基)的式I化合物與Rx是鏈炔基或羥基鏈炔基的Rx-OH化合物反應(yīng)，得到R1是鏈炔基或羥基鏈炔基的式I化合物，該反應(yīng)可以在非質(zhì)子傳遞溶劑例如二氯甲烷、甲苯、乙腈或IHF中，在酸性條件下進(jìn)行。
優(yōu)選32位上的還原反應(yīng)(特別是還原步驟b))在R1已經(jīng)是所需基團(tuán)(例如R1是鏈炔基)的式IVa化合物上進(jìn)行，由此避免還原后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用作原料的其中R1是鏈炔基或羥基鏈炔基的式IVa化合物，可如上所述使用化合物Rx-OH來制備。
用作原料的化合物，可以采用本領(lǐng)域已知和已實(shí)施的類似方法來制備，如USP 5258389、WO 94/09010、WO 95/16691、USP 5120842等所公開的方法。
下面的實(shí)施例是本發(fā)明的舉例說明，所有溫度是℃，并使用下述簡(jiǎn)寫THF＝四氫呋喃TES＝三乙基甲硅烷基實(shí)施例132-脫氧雷帕霉素(R1＝CH3；R2＝II，其中R3＝H且R4＝CH3；X＝H；Y＝O)在攪拌下向冷卻(-78°)的26.1g(22.85mmol)28，40-雙-O-TES雷帕霉素于260ml THF中的溶液里，加入50.3ml(50.3mmol)氫化鋰三叔丁氧基鋁的1M THF溶液。所得混合物用2小時(shí)升溫至-15°。然后用冰浴代替冷卻浴，使溫度達(dá)0°，此溫度下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入含750ml乙酸乙酯和400ml冰冷卻的2N檸檬酸水溶液的分液漏斗中，并短暫振搖。分離出水層并用冷乙酸乙酯萃取二次。將有機(jī)溶液合并，用冰冷卻的2N檸檬酸水溶液、水、飽和碳酸氫鈉水溶液依次洗滌，并用飽和鹽水再洗二次，然后用無水碳酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮，將由32(R)-二氫-28，40-雙-O-TES雷帕霉素和32(R)9，32-雙-二氫-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素混合物組成的殘?jiān)?，不進(jìn)一步提純，溶解于260ml甲醇中。將該溶液冷至0°，用6.85g(34.31mmol)乙酸銅處理。攪拌1小時(shí)之后，用甲基叔丁基醚稀釋所得懸浮液，用水和飽和鹽水依次洗兩次。用甲基叔丁基醚反萃取水層。合并有機(jī)溶液，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并減壓濃縮。用硅膠色譜(60∶40己烷/甲基叔丁基醚)提純殘?jiān)玫郊兊?2(R)-二氫-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素，為白色固體。
1H NMR(CDCl3)4∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移指含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.72(1H，dd，H-38ax)，1.63(1.60)(3H，s，C17-CH3)，1.66(1.69)(3H，s，C29-CH3)，1.77 and 1.81(H-33)，2.46(1H，m，H-31)，2.82(2.91)(1H，m，H-25)，2.91(1H，m，H-39)，3.13(3H，s，C16-OCH3)，3.26(3H，s，C27-OCH3)，3.41(1H，m，H-40)，3.43(3H，s，C39-OCH3)，3.62(1H，m，H-32)，3.75(3.57)(1H，d，H-27)，4.10(1H，d，H-28)，4.81(1H，broad s，C10-OH)，5.05(1H，d，H-34)，5.27(1H，d，H-30)，5.36(1H，d，H-2)，5.69(1H，dd，H-22)，6.03(5.96)(1H，d，H-18)，6.15(1H，dd，H-21)，6.33(1H，dd，H-20)，6.40(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matrix)m/z 1150([M+Li]+)(rel.intensity 100)攪拌下向冷卻的(-15°)20.69g(18.10mmol)32(R)-二氫-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素和7.55ml(54.27mmol)三乙胺的200ml二氯甲烷溶液中，加入2.10ml(27.02mmol)甲磺酰氯。將該混合物攪拌20分鐘，然后用乙酸乙酯稀釋，并加入飽和碳酸氫鈉水溶液。分離各層，用乙酸乙酯萃取水層三次。合并有機(jī)相，用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥、過濾并減壓濃縮。用硅膠柱色譜(80∶20己烷/乙酸乙酯)提純殘?jiān)?，得到純?2(R)-二氫-32-O-甲磺酰基-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素，為白色固體。但按常規(guī)，不需進(jìn)一步提純，粗產(chǎn)物即可用于下步反應(yīng)。1H NMR(CDCl3)δ0.77(1H，dd，H-38ax)，1.67(3H，s，C17-CH3)，1.72(3H，s，C29-CH3)，2.77(1H，M，H-25)，2.92(1H，m，H-39)，3.03(3H，s，C16-OCH3)，3.17(3H，s，C27-OCH3)，3.21(3H，s，C39-OCH3)，3.42(1H，m，H-40)，3.45(3H，s，CH3SO3)，3.91(1H，d，H-27)，4.10(1H，d，H-28)，4.72(1H，m，H-32)，4.94(1H，s，C10-OH)，5.12(1H，m，H-34)，5.25(1H，d，H-30)，5.43(1H，d，H-2)，5.88(1H，dd，H-22)，6.03(1H，d，H-18)，6.18(1H，dd，H-21)，6.37(1H，dd，H-20)，6.44(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matnx)m/z 1228([M+Li]+)(rel.intensity 68)，1132([(M-CH3SO3H)+Li]+)(rel.intensity 100)將22.35g(18.30mmol)32(R)-二氫-32-O-甲磺?；?28，40-雙-O-TES-雷帕霉素，27.50g(183.33mmol)碘化鈉，及6.3ml(36.68mmol)二異丙基乙胺在400ml THF中的混合物加熱回流6小時(shí)，然后冷卻至室溫。用乙酸乙酯稀釋所得混合物，并用38.4％亞硫酸氫鈉處理。分離各層，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗三次，再用飽和鹽水洗1次，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮。用硅膠柱色譜(83∶17己烷/乙酸乙酯)提純殘?jiān)玫郊兊?2(S)-脫氧-32-碘-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素。
1H NMR(CDCl3)1.5∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移指含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.73(1H，dd，H-38ax)，1.68(1.66)(6H，s，C17-CH3and C29-CH3)，2.72(1H，m，H-25)，2.91(2H，m，H-32 and H-39)，3.15(3H，s，C16-OCH3)，3.30(3.31)(3H，s，C27-OCH3)，3.43(3.41)(3H，s，C39-OCH3)，3.77(3.91)(1H，d，H-27)，4.21(4.25)(1H，d，H-28)，4.51(1H，s，C10-OH)，5.45(5.48)(1H，d，H-30)，5.60(5.79)(1H，dd，H-22)，6.02(5.85)(1H，d，H-18)MS(FAB，LiI matrix)m/z 1260([M+Li]+)(rel.intensity 100)攪拌下向冷卻(0°)的16.79g(13.19mmol)32(S)-脫氧-32-碘-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素的190ml甲苯溶液中加入7ml(26.38mmol)氫化三丁基錫，接著再加入1.3ml(1.30mmol)1M三乙基甲硼烷的己烷溶液。將該混合物攪拌30分鐘，用飽和氯化銨水溶液使反應(yīng)驟停。分離各層，用乙酸乙酯提取水層兩次，合并有機(jī)相，依次用水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水洗滌，再用飽和鹽水洗3次，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮。用硅膠柱色譜(75∶25己烷/甲基叔丁基醚)提純殘?jiān)?，得到純?2-脫氧-28，40-雙-O-TES-雷帕霉素，為白色固體。
1H NMR(CDCl3)2.5∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移代表含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.73(1H，dd，H-38ax)，1.62(1.57)(3H，s，C17-CH3)，1.68(1.72)(3H，s，C29-CH3)，2.77(2.91)(1H，m，H-25)，2.91(1H，m，H-39)，3.15(3H，s，C16-OCH3)，3.27(3.25)(3H，s，C27-OCH3)，3.43(3.45)(3H，s，C39-OCH3)，3.70(3.67)(1H，d，H-27)，4.11(4.07)(1H，d，H-28)，4.57(1H，broad s，C10-OH)，4.87(4.67)(1H，d，H-34)，5.19(5.08)(1H，d，H-30)，5.32(1H，d，H-2)，5.60(5.66)(1H，dd，H-22)，6.01(5.92)(1H，d，H-18)，6.17(1H，dd，H-21)，6.30(1H，dd，H-20)，6.40(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matrix)m/z 1134([M+Li]+)(rel.intensity 100)攪拌下向冷卻(-15°)的10.73g(9.52mmol)32-脫氧-28，40-雙-O-TES雷帕霉素的85ml甲醇溶液中，滴加入9.5ml 2N硫酸水溶液。加完之后，使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?°，并攪拌1.5小時(shí)，然后用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液使反應(yīng)驟停。分離各層，用三份乙酸乙酯提取水層。合并有機(jī)相，用飽和碳酸氫鈉溶液洗三次，再用鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮。將殘?jiān)苡谝颐阎?，隨后所需的32-脫氧-雷帕霉素結(jié)晶出來(無色晶體)。
1H NMR(CDCl3)3∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移代表含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.70(1H，dd，H-38ax)，1.14 and 1.32(H-32)，1.56(H-33)，1.65(1.62)(3H，s，C17-CH3)，1.68(1.70)(3H，s，C29-CH3)，2.31(2H，m，H-23 and H-31)，2.82(2.95)(1H，m，H-25)，2.95(1H，m，H-39)，3.14(3H，s，C16-OCH3)，3.32(3H，s，C27-OCH3)，3.38(1H，m，H-40)，3.43(3.41)(3H，s，C39-OCH3)，3.61(1H，d，H-27)，4.12(1H，d，H-28)，4.80(4.71)(1H，d，H-34)，5.22(1H，d，H-30)，5.31(1H，d，H-2)，5.56(1H，dd，H-22)，5.95(5.87)(1H，d，H-18)，6.16(1H，dd，H-21)，6.36(1H，dd，H-20)，6.41(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matnx)m/z 906([M+Li]+)(rel.intensty 100)實(shí)施例216-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫雷帕霉素(R1＝戊-2-炔基；R2＝II，其中R3＝H，R4＝CH3；X＝OH；Y＝O)
攪拌下向冷卻(0°)的970mg(1.06mmol)32(S)-二氫雷帕霉素和1.39ml(15.00mmol)2-戊炔-l-醇的20ml二氯甲烷溶液中加入0.50ml(6.50mmol)三氟乙酸。該混合物于0°下攪拌3小時(shí)，再用飽和碳酸氫鈉水溶液使反應(yīng)驟停。分離各層，用三份乙酸乙酯萃取水層。合并有機(jī)溶液，用飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮。用硅膠柱色譜(20∶80己烷-乙酸乙酯)提純粗產(chǎn)物混合物，然后經(jīng)逆相HPLC(RPl8，8l∶19甲醇-水)提純，得到標(biāo)題化合物，為白色無定形固體。
1H NMR(CDCl3)2.5∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移代表含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.71(1H，dd，H-38 ax)，1.13(1.05)(3H，t，CH3CH2CCCH2O)，1.67(3H，s，17-CH3)，1.69(3H，s，29-CH3)，2.21(2H，qt，CH3CH2CCCH2O)，2.96(1H，m，H-39)，3.33(3.37)(3H，s，27-OCH3)，3.41(3.39)(3H，s，39-OCH3)，3.78(1H，dt，CH3CH2CCCHHO)，4.0(1H，dt，CH3CH2CCCHHO)，5.52(5.71)(1H，dd，H-22)，5.98(5.83)(1H，d，H-18)，6.15(1H，m，H-21)，6.30(1H，dd，H-20)，6.40(1H，dd，H-19)MS(FAB)m/z 974([M+Li]+)實(shí)施例316-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫雷帕霉素(另一種合成路線)用與實(shí)施例2類似方法使雷帕霉素與2-戊炔-1-醇反應(yīng)，得到16-戊-2-炔氧基-雷帕霉素。
攪拌下向冷卻(-77°)的17.5g(18.1mmol)16-脫甲氧基-16-戊-2-炔氧基-雷帕霉素的180ml THF溶液中，加入21.7ml(21.7mmol)1M三乙基硼氫化鈉的THF溶液。于-77°1小時(shí)之后，用10％檸檬酸水溶液使該反應(yīng)驟停并中和。然后使該反應(yīng)混合物回復(fù)到室溫，減壓蒸發(fā)除去大部份THF。用乙酸乙酯提取所得溶液二次，合并有機(jī)相，用硫酸鈉干燥。蒸出溶劑后，用硅膠色譜，以己烷/丙酮7/3洗脫，提純粗產(chǎn)物。用制備HPLC(RP-18，76∶24甲醇∶水)完成最后純化步驟，得到標(biāo)題化合物，為白色無定形固體。
光譜數(shù)據(jù)與用其它反應(yīng)路線所得產(chǎn)物之?dāng)?shù)據(jù)相同。
實(shí)施例432(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素(R1＝CH3；R2＝II，其中R3＝2-甲氧基-乙基，且R4＝CH3；X＝OH；Y＝O)攪拌下向冷卻(0°)的2.17g(2.00mmol)40-O-(2-甲氧基)乙基-28-O-TES-雷帕霉素的20ml THF溶液中，滴加入4.4ml(4.4mmol)1M L-Selectride的THF溶液。于0°將所得黃色溶液攪拌3小時(shí)，加入2ml MeOH使過剩的氫化物試劑驟停反應(yīng)。用甲基叔丁基醚稀釋該溶液，加入飽和Rochelle氏鹽水溶液。使該混合物升至室溫，繼續(xù)攪拌15分鐘。分離各層，用冷1N HCl、飽和鹽水、1N碳酸氫鈉依次洗滌有機(jī)溶液，再用鹽水洗滌。用甲基叔丁基醚反萃取含水洗液。合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并減壓濃縮，得到32-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-28-O-TES-雷帕霉素的32S和32R異構(gòu)體的粗產(chǎn)物混合物。
將上述粗產(chǎn)物溶于20ml乙腈中，并冷卻至0°。向所得溶液中加入2ml HF·吡啶復(fù)合物，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，加入1N碳酸氫鈉。用甲基叔丁基醚提取該混合物三次。合并有機(jī)相，用1N碳酸氫鈉和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，并減壓濃縮。用逆相HPLC(RP18，5μm，50∶50-100∶0乙腈-水60分鐘洗脫)提純，得到32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素，及32(R)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素副產(chǎn)物。
32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕霉素1HNMR(CDCl3)2∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移代表含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ 0.77(1H，dd，H-38 ax)，1.67(6H，s，C17-CH3and C29-CH3)，2.50(1H，m，H-31)，3.01(1H，m，H-25)，3.12(2H，m，H-39 and H-40)，3.14(3.15)(3H，s，OCH3)，3.28(1H，m，H-32)，3.36(3.34)(3H，s，OCH3)，3.39(3.38)(3H，s，OCH3)，3.48(3.46)(3H，s，OCH3)，3.55 and 3.75(4H，2m，OCH2CH2O)，3.84(1H，m，H-14)，4.12(4.16)(1H，d，H-28)，4.73(1H，s，C10-OH)，5.03(1H，m，H-34)MS(FAB)m/z 980([M+Li]+)
實(shí)施例532(S)-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕霉素(R1＝CH3；R2＝II，其中R3＝-CH2CH2OH，且R4＝CH3；X＝OH；Y＝O)按照實(shí)施例4的方法，但使用適當(dāng)?shù)脑?，獲得標(biāo)題化合物。
32(S)-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕霉素1H NMR(CDCl3)1.7∶1旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，括號(hào)內(nèi)的化學(xué)位移代表含量少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，δ0.76(1H，dd，H-38ax)，2.50(1H，m，H-31)，3.10(1H，m，H-39)，3.13(3.14)(3H，s，C16-OCH3)，3.20(1H，m，H-40)，3.28(1H，m，H-32)，3.36(3.38)(3H，s，C27-OCH3)，3.45(3.43)(3.41)(3H，s，C39-OCH3)，3.50(1H，d，H-27)，3.58 and 3.70(4H，m，OCH2CH2OH)，4.12(4.16)(1H，d，H-28)，5.06(1H，m，H-34)，5.60(1H，dd，H-22)，5.99(1H，d，H-18)，6.17(1H，dd，H-21)，6.33(1H，dd，H-20)，6.42(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matnx)m/z 966([M+Li]+)(rel.mtensity 100)實(shí)施例616-戊-2-炔氧基-32-脫氧-雷帕霉素(R1＝戊-2-炔基；R2＝II，其中R3＝H，且R4＝CH3；X＝H；Y＝O)按照實(shí)施例1和2或3的方法，但使用適當(dāng)原料，獲得標(biāo)題化合物。1H NMR(CDCl3)δ0.70(1H，dd，H-38ax)，1.23(3H，t，CH3CH2CCCH2O)，2.21(2H，ddq，CH3CH2CCCH2O)，2.78(1H，m，H-25)，2.94(1H，m，H-39)，3.31(3H，s，C27-OCH3)，3.42(3H，s，C39-OCH3)，3.62(1H，d，H-27)，3.78(1H，ddd，CH3CH2CCCH2O)，4.02(1H，ddd，CH3CH2CCCH2O)，4.12(1H，d，H-28)，4.79(1H，m，H-34)，5.20(1H，d，H-30)，5.28(1H，broad d，H-2)，5.50(1H，dd，H-22)，5.97(1H，d，H-18)，6.14(1H，dd，H-21)，6.30(1H，dd，H-20)，6.38(1H，dd，H-19)MS(FAB，LiI matrix)m/z 958([M+Li]+)(rel.intensity 100)式I化合物顯示出藥學(xué)活性，因此適于用作藥物。
具體地說，式I化合物具有免疫抑制和抗增生活性，正如下面的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)法所顯示的1.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)最初與同種移植術(shù)相連系而得以創(chuàng)立，用于評(píng)估可能的器官供體和受體之間的組織相容性，并且是已建立的體外免疫反應(yīng)最佳模型之一。例如，由T.Meo在“Immunological Methods(免疫學(xué)方法)”(L.Lefkovits和B.Pernis，Eds.，Academic Press，N.Y.pp.227-239(1979))一書中所述的鼠模型MLR，被用來證明式I化合物的免疫抑制效果。將來自Bal b/c小鼠(雌性，8-10周齡)的脾細(xì)胞(2×105/孔)與來自CBA小鼠(雌性，8-10周齡)經(jīng)0.5×106照射(2000rads)或經(jīng)自力霉素C處理的脾細(xì)胞，在微滴板上共保溫5天。該照射過的同種細(xì)胞對(duì)Bal b/c脾細(xì)胞誘導(dǎo)出增生反應(yīng)，該被誘導(dǎo)細(xì)胞可通過標(biāo)記前體摻入DNA來加以測(cè)定。因?yàn)榇碳の锛?xì)胞被照射過(或用自力霉素處理過)，它們不對(duì)Bal b/c細(xì)胞有應(yīng)答而引起增生，但確實(shí)保留其抗原性。在不同稀釋度條件下測(cè)定式I化合物對(duì)Bal b/c細(xì)胞的抗增生效果，并計(jì)算使細(xì)胞增生得到50％抑制時(shí)的濃度(IC50)。該試驗(yàn)樣品的抑制能力可與雷帕霉素相比較，以相對(duì)IC50表示(即IC50試驗(yàn)化合物/IC50雷帕霉素)。發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1和2化合物在該試驗(yàn)中的相對(duì)IC50分別為0.3和0.08。
2.IL-6介導(dǎo)的增生(IL-6 PROL)使用白細(xì)胞介素-6(IL-6)依賴性小鼠雜交瘤細(xì)胞系，來評(píng)估式I化合物影響與信號(hào)通道相聯(lián)系的生成因子的能力。該試驗(yàn)在96孔微滴板上進(jìn)行。在補(bǔ)充有1ng重組體IL-6/ml的無血清培養(yǎng)基中(如M.HSchreier和R.Tees在Immunological Methods(免疫學(xué)方法)，I.Lefkovits和B.Pernis，Eds.，Academic Press 1981，Vol.II，pp.263-275中所述)培養(yǎng)5000細(xì)胞/孔。在存在或不存在試驗(yàn)樣品的條件下，經(jīng)66小時(shí)保溫之后，再用1μCi(3-H)胸苷/孔搏動(dòng)這些細(xì)胞6小時(shí)，收集細(xì)胞并用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。(3-H)胸苷對(duì)DNA的摻入與細(xì)胞數(shù)量增加相關(guān)，因此是一種細(xì)胞增生的測(cè)量法。檢測(cè)試驗(yàn)樣品的一系列稀釋液，可計(jì)算出對(duì)細(xì)胞增生產(chǎn)生50％抑制作用的濃度(IC50)。試驗(yàn)樣品的此種抑制能力可與雷帕霉素相比較，以相對(duì)IC50表示(即IC50試驗(yàn)樣品/IC50雷帕霉素)。發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1和2的化合物在該試驗(yàn)中相對(duì)IC50分別為0.2和0.09。
3.Macrophilin結(jié)合試驗(yàn)(MBA)雷帕霉素及結(jié)構(gòu)上相關(guān)的免疫抑制劑FK-506，在體內(nèi)與Macrophilin-12(也稱為FK-506結(jié)合蛋白或FKBP-12)結(jié)合都是已知的，并且認(rèn)為此種結(jié)合與這些化合物的免疫抑制活性有關(guān)。式I化合物與Macrophilin也很強(qiáng)地結(jié)合，正如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)所證明的一樣。該試驗(yàn)中，用與BSA偶聯(lián)的FK-506包涂微滴孔。使生物素化重組人Macrophilin-12(biot-MAP)，在存在或不存在試驗(yàn)樣品的條件下，與該固定的FK-506結(jié)合。洗滌后(除去非特異性結(jié)合的Macrophilin)，將其與抗生蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶結(jié)合物一起保溫，評(píng)估結(jié)合的biot-MAP。接著洗滌并隨后加入磷酸對(duì)硝基苯酯作為底物。于405nm波長(zhǎng)處讀出OD，試驗(yàn)樣品與biot-MAP的結(jié)合引起biot-MAP與FK-506的結(jié)合量降低，因此OD 405便降低。試驗(yàn)一系列試驗(yàn)樣品稀釋液，測(cè)定出對(duì)biot-MAP與固定的FK-506結(jié)合產(chǎn)生50％抑制作用時(shí)的濃度(IC50)。將該試驗(yàn)樣品的抑制能力，與作為標(biāo)準(zhǔn)的游離FK-506的IC50相比較，以相對(duì)IC50表示(即IC50試驗(yàn)樣品/IC50游離FK 506)。該試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1、2和5的化合物的相對(duì)IC50分別為1、2.8和2.5。
4.局部的移植物對(duì)抗宿主(GvH)反應(yīng)以一種適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，證明式I化合物的體內(nèi)效力，如Ford等人在Transplantation(移植)10(1970)258中所述。將來自6周齡雌性Wistar/Furth(WF)鼠的脾細(xì)胞(1×107)經(jīng)皮下注射入體重約100g的雌性(F 344×WF)F1大鼠的左后爪，此時(shí)定為0天。該動(dòng)物被連續(xù)處理4天，在第7天取出腘淋巴結(jié)，并稱重。兩淋巴節(jié)重量之差作為評(píng)價(jià)該反應(yīng)的參數(shù)。
5.鼠的腎同種移植反應(yīng)采用末端對(duì)末端吻合術(shù)，將DA(RT1a)或Brown-Norway(BN)(RT1n)供體鼠的一只腎移植入單側(cè)(左側(cè))腎切除的(Lewis RT11)受體鼠的腎管上。輸尿管吻合也是末端對(duì)末端。移植之日起開始治療，并連接治療14天。移植7天以后實(shí)行對(duì)側(cè)腎切除，受體便只能依賴供體腎運(yùn)作。移植物受體的存活，作為移植物功能的參數(shù)。
6.實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)大鼠的過敏性腦脊髓炎(EAE)采用Levine & Wenk AMER J.PATH(美國病理學(xué)雜志)47(1965)61；McFarlin等人，J.IMMUNOL(免疫學(xué)雜志)113(1974)712；Borel，TRANSPLANT & CLIN IMMUNOL(移植物與臨床免疫)13(1981)3等文獻(xiàn)所述方法，測(cè)定式I化合物對(duì)EAE的效力。EAE對(duì)多發(fā)性硬化癥來說是廣泛被接受的模型。將牛脊髓和完全弗氏佐劑的混合物注射入雄性Wistar鼠的后爪中。通常在16天內(nèi)出現(xiàn)發(fā)病癥狀(尾和兩后腿麻痹)。記錄發(fā)病動(dòng)物數(shù)及發(fā)病時(shí)間。
7.弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎采用Wmter & Nuss，ARTHRITIS & RHE UMATISM(關(guān)節(jié)炎與風(fēng)濕病)9(1966)394；Billingham & Davies，HANDBOOK OFEXPERIMENTAL PHARMACOL(實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè))(Vane &Ferreira Eds.，Sprmger-Verlag，Berlin)50/II(1979)108-144等文獻(xiàn)所述方法，證明對(duì)抗實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎效力。將含0.6mg凍干的熱殺死分支桿菌屬Smegmatis的0.1ml礦物油，經(jīng)皮內(nèi)注射入OFA和Wistar大鼠(雄性或雌性，150g體重)的尾根部或后爪中。在發(fā)生關(guān)節(jié)炎模型中，注射佐劑之后立即開始治療(第1-18天)，而在建立關(guān)節(jié)炎模型中，治療于第14天開始，此時(shí)繼發(fā)性炎癥確實(shí)發(fā)生(第14-20天)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用微卡尺測(cè)量關(guān)節(jié)的腫脹程度。ED50是質(zhì)腫脹(原發(fā)或繼發(fā)性)縮小到對(duì)照物的一半所需的口服劑量，以mg/kg表示。
8.抗腫瘤及MDR活性在體外給多藥抗性細(xì)胞和藥物敏感細(xì)胞，或給患有多藥抗性或藥物過敏性腫瘤或感染的動(dòng)物，施用抗癌劑，例如秋水仙素或鬼臼乙叉甙，分別共服或不共服欲試驗(yàn)的式I化合物，并單獨(dú)施用式I化合物，由此來證明式I化合物的抗腫瘤活性，以及其通過減弱多藥抗性來提高抗腫瘤藥劑效能的能力。
體外試驗(yàn)中，采用適當(dāng)?shù)乃幬锟剐约?xì)胞系和對(duì)照(親本)細(xì)胞系，例如按Ling等人，J.Cell.Physiol(細(xì)胞生理學(xué)雜志)83，103-116(1974)和Bech-Hansen等人，J.Cell.Physiol(細(xì)胞生理學(xué)雜志)88，23-32(1976)等文獻(xiàn)所述產(chǎn)生的細(xì)胞。挑選的具體克隆是多藥物抗性(如秋水仙素抗性)系CHR(亞克隆C5S3.2)和親本，敏感系A(chǔ)UX B1(亞克隆AB1 S11)。
以注射多藥抗性和藥物敏感性癌細(xì)胞的小鼠來證明體內(nèi)抗腫瘤和抗MDR活性。
按照Slater等人在J.Clin.Invest.(臨床檢查雜志)，70，1131(1982)中所述方法，通過連續(xù)轉(zhuǎn)移EA細(xì)胞給BALb/c宿主小鼠的后代，而產(chǎn)生對(duì)藥物DR、VC、AM、ET、TE或CC有抗性的Ehrlich腹水癌細(xì)胞亞系。
在設(shè)計(jì)相仿的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，采用式I化合物可獲同樣的結(jié)果，例如在體外進(jìn)行，或利用以抗藥性和藥物敏感性病毒株感染，以抗生素(如青霉素)抗性和敏感性細(xì)菌菌株感染，以抗真菌抗性和敏感性真菌菌株感染，以及用藥物抗性原生動(dòng)物株(抗瘧疾藥物抗性的瘧原蟲株等，如天然出現(xiàn)的瘧原蟲屬falciparum的亞株，顯示獲得過化學(xué)療法)感染的試驗(yàn)動(dòng)物來進(jìn)行。
9.Mip和類Mip因子抑制作用此外，式I化合物結(jié)合并阻隔各種Mip(巨噬細(xì)胞傳染性增效劑)和類Mip因子，該因子結(jié)構(gòu)上與Macrophilin相似。Mip和類Mip因子是很廣泛圍內(nèi)各種病原菌產(chǎn)生的毒性因子，包括Chlamidia屬(如Chlamidia trachomatis)、Neisseria屬(如Neisseria meningitidis)、和Legionella屬(如Legionella pneumophilia)產(chǎn)生的此種因子，以及立克次體目的專性寄生體所產(chǎn)生的此種因子，這些因子對(duì)引起胞內(nèi)感染起關(guān)鍵作用。式I化合物對(duì)降低產(chǎn)生Mip或類Mip因子的病原菌傳染性之效力，可通過分別在存在或不存在該大環(huán)內(nèi)酯的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將兩種情況下病原菌的傳染性加以比較，來得到證實(shí)，例如使用Lundemose等人，在Mol.Microbiol(分子微生物學(xué))(1993)7777中所述方法。
10.慢性同種移植排斥作用將雄性DA(RT1a)大鼠的腎常位移植進(jìn)雄性Lewis(RT11)受體。總共24只動(dòng)物被移植。移植開始14天中以7.5mg/kg/天的劑量，口服環(huán)孢素A(cyclosporine A)治療所有動(dòng)物，預(yù)防急性細(xì)胞排斥。不進(jìn)行對(duì)側(cè)腎切除。用不同劑量式I化合物治療、或用安慰劑治療的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包括6只動(dòng)物。
移植后的第53-64天開始，用式I化合物或者用安慰劑口服治療受體動(dòng)物69-72天。移植后的14天，以腎灌注測(cè)定法，借助磁共振成像(MRI)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行移植物評(píng)估(將移植腎與對(duì)側(cè)自己的腎進(jìn)行比較)。該評(píng)估在移植后第53-64天，和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)再重復(fù)進(jìn)行。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行尸檢。測(cè)定排斥參數(shù)，例如MRI記分、移植腎的相對(duì)灌注速度、以及腎同種移植物對(duì)細(xì)胞排斥和腎管改變的組織學(xué)記分，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該鼠腎同種移植模型中，以0.5-2.5mg/kg劑量施用式I化合物，例如實(shí)施例1或2的化合物，使所有上述排斥參數(shù)均降低。
11.血管成形術(shù)基本上按Powell等人(1989)所述，進(jìn)行充氣導(dǎo)管插入術(shù)，訂為第0天，在異氟烷麻醉下，將Fogarty 2F導(dǎo)管通過外部頸動(dòng)脈插入左頸總動(dòng)脈，并充氣膨脹(擴(kuò)張約10μl H2O體積)。充氣氣球沿頸總動(dòng)脈長(zhǎng)度撤出三次，后兩次同時(shí)還輕輕扭曲，以便均勻地去除皮內(nèi)愈合作用。然后除掉該導(dǎo)管，圍繞外部頸動(dòng)脈用結(jié)扎線結(jié)扎，防止出血，使動(dòng)物康復(fù)。
此實(shí)驗(yàn)使用2組12只RoRo大鼠(400g，約24周齡)一組是對(duì)照組，一組施用欲試驗(yàn)化合物。所有操作、實(shí)驗(yàn)程序和分析中，這些大鼠是完全隨機(jī)的。
在充氣切口前3天(第-3天)開始，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，即充氣切口后14天(第+14天)均口服(管飼法)欲試驗(yàn)化合物。這些大鼠于籠內(nèi)獨(dú)處，隨意喂給食物和水。然后將鼠用異氟烷麻醉，將灌注導(dǎo)管通過左心室插入，并固定在主動(dòng)脈弓，而將抽吸套管插入右心室。在150mmHg灌注壓力下，一開始給動(dòng)物灌注0.1M磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS，pH7.4)1分鐘，然后灌注2.5％戊二醛的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)15分鐘。套管頂端處灌注壓力為150mmHg(頸動(dòng)脈中是約100mmHg，將連有壓力傳感器的套管插入外頸動(dòng)脈作預(yù)備實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出該壓力)。然后切下頸動(dòng)脈，與周圍組織分開，浸入含7％蔗糖的0.1M二甲基胂酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，并于4℃保溫過夜。下一天將該頸動(dòng)脈浸入0.05％KMnO4在0.1M二甲基胂酸鹽的溶液中并于室溫下振蕩1小時(shí)。然后將該組織在一系列分級(jí)乙醇液中脫水在75％乙醇中2×10分鐘、85％乙醇中2×10分鐘、95％乙醇中3×10分鐘、100％乙醇中3×10分鐘。然后根據(jù)廠商的推薦將該脫水頸動(dòng)脈嵌入Technovit 7100中，將該嵌埋介質(zhì)置于通氬氣的保干器中使其聚合過夜，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)氧能抑制該聚合塊適當(dāng)硬化。
用硬金屬刀在旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上，將各頸動(dòng)脈從中部切成厚1-2μm的切片，并用Giemse染劑染色。由此從各頸動(dòng)脈制備約5個(gè)切片，借助影像分析系統(tǒng)(MCID，Toronto，Canada)，對(duì)該介質(zhì)的橫截面，新內(nèi)膜及腔體等進(jìn)行形態(tài)測(cè)量學(xué)評(píng)估。該試驗(yàn)中，當(dāng)口服日劑量0.5-2.5mg/kg式I化合物時(shí)，例如實(shí)施例1或2化合物，便能抑制肌內(nèi)膜增生。
式I化合物還可用于檢測(cè)Macrophilin結(jié)合化合物是否存在，或其存在量的試驗(yàn)中，例如用于為診斷或篩選之目的的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中。因此，另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式I化合物作為篩選工具，測(cè)定實(shí)驗(yàn)溶液中(例如欲篩選的血液、血清、或試驗(yàn)液體培養(yǎng)基)是否存在結(jié)合macrophilin的化合物之應(yīng)用。優(yōu)選將式I化合物固定于微滴孔中，然后在存在或不存在試驗(yàn)溶液的條件下，使其與經(jīng)標(biāo)記的macrophilin-12(FKBP-12)結(jié)合。另外，還可將FKBP-12固定于微滴孔中，在存在或不存在試驗(yàn)溶液的條件下，使其與被標(biāo)記過(例如經(jīng)氟標(biāo)記、酶標(biāo)記、或放射性標(biāo)記，比如R1含有標(biāo)記基團(tuán)的式I化合物)的式I化合物結(jié)合。洗滌平板，測(cè)定結(jié)合標(biāo)記化合物之量。試驗(yàn)溶液中macrophilin結(jié)合物的量大致與結(jié)合標(biāo)記化合物之量成反比。為進(jìn)行定量分析，使用一系列macrophilin結(jié)合化合物已知濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線。
因此，在下述情況下使用式I化合物a)治療和預(yù)防急性或慢性器官或組織移植排斥，例如治療心臟、肺、心臟-肺結(jié)合、肝、腎、胰、皮膚、或角膜等移植的受體。它們也能預(yù)防移植物對(duì)抗宿主癥，例如骨髓移植后引起的疾病。
b)治療和預(yù)防移植血管病變，例如動(dòng)脈硬化癥。
c)治療和預(yù)防平滑肌細(xì)胞增生和遷移引起的血管內(nèi)膜增厚、血管阻塞、栓塞性冠狀動(dòng)脈硬化、心瓣再狹窄等疾病。
d)治療和預(yù)防自身免疫癥，及炎性病癥特別是伴有包括關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎慢性進(jìn)行癥、及關(guān)節(jié)炎變形癥等)和風(fēng)濕癥等在內(nèi)的自身免疫成份病原學(xué)的炎性癥狀?？梢圆捎檬絀化合物治療的具體自身免疫癥，包括自身免疫血液學(xué)失調(diào)癥(如溶血性貧血、再生障礙貧血、純紅細(xì)胞貧血和特發(fā)性血小板減少癥等)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多軟骨炎、硬皮病、Wegener肉芽腫、皮膚肌炎、慢性自身肝炎、重癥肌無力、牛皮癬、Steven-Johnson綜合癥、特發(fā)口炎性腹瀉、自身免疫炎性腸病(包括潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn氏癥等)、內(nèi)分泌眼病、Graves癥、肉樣瘤、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性膽囊肝硬變、青少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素層炎(前層和后層)、干性角膜結(jié)膜炎、春季角膜結(jié)膜炎、間質(zhì)性肺纖維化、牛皮癬患者關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎(并發(fā)或不并發(fā)腎病綜合癥，例如特發(fā)性腎病綜合癥或最小變化腎病等)，以及青少年皮膚肌炎。
e)治療和預(yù)防哮喘病。
f)治療多藥抗性(MDR)，式I化合物抑制P-糖蛋白(Pgp)，所述糖蛋白是與MDR關(guān)聯(lián)的膜轉(zhuǎn)移分子。MDR對(duì)于用常規(guī)化學(xué)療法不起作用的癌癥患者及愛滋病患者是特別嚴(yán)重的問題，因?yàn)樵谶@些病人中，藥物會(huì)使Pgp排出細(xì)胞外。因此，式I化合物被用于治療和控制多藥抗性癥狀，例如多藥性抗癌癥或多藥抗性愛滋病，從而提高其它化療藥劑的效力。
g)治療增生性失調(diào)癥，例如腫瘤、高增生皮膚失調(diào)癥等等。
h)治療真菌感染。
i)治療和預(yù)防炎癥，特別是能起類固醇的作用。
j)治療和預(yù)防感染，特別是帶有Mip或類Mip因子的病原菌感染。
對(duì)于上述適應(yīng)癥，當(dāng)然，其所需劑量會(huì)隨所治疾病的癥狀(例如病的類型、或抗性性質(zhì)等)、所期望的效果、及施用方式等而有所不同。但一般來說，口服劑量在0.05-5，或高至10mg/kg/天數(shù)量級(jí)，例如0.1-2，或直至7.5mg/kg/天，服用一次、分劑量每天2-4次、或者腸道外給藥，例如靜脈滴注或灌注劑量在0.01-2.5，直至5mg/kg/天數(shù)量級(jí)，具體如0.05-0.1，直至1.0mg/kg/天數(shù)量級(jí)，均能達(dá)到滿意效果。因此對(duì)病人適宜日劑量為口服500mg數(shù)量級(jí)，具體如5-100mg數(shù)量級(jí)、靜脈注射0.5-125mg，直至250mg數(shù)量級(jí)，具體如2.5-50mg數(shù)量級(jí)。
此外更為優(yōu)選的是以提供預(yù)定的槽型血液水平(如由RIA技術(shù)決定的)的特定方式來安排患者的劑量。由此可以調(diào)節(jié)患者劑量，以便成功地調(diào)節(jié)保持槽型血液水平，正如由RIA測(cè)定為50-150，直至500，或1000ng/ml，即類似目前由Ciclosporin免疫抑制治療所采用的劑量法。
式I化合物可以作為唯一活性成份給藥，也可與其它藥物一起給藥。例如在預(yù)防和治療移植物對(duì)抗宿主癥、移植排斥、或自身免疫疾病之類的免疫抑制應(yīng)用，該式I化合物可以與環(huán)孢素(cyclosporin)或子囊霉素(或其免疫抑制類似物，例如環(huán)孢素A、環(huán)孢素G、FK-506等)、皮質(zhì)甾類、環(huán)磷酰胺、咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤、brequinar、來氟米特、咪唑立賓、霉酚酸、mycophenolate mofetil、免疫抑制單克隆抗體(例如對(duì)MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、CTLA4、B7、CD45或CD58之類的白細(xì)胞受體或其配位體的單克隆抗體)，或其它免疫調(diào)節(jié)化合物結(jié)合使用。對(duì)于抗炎癥應(yīng)用，式I化合物可與消炎劑如皮質(zhì)甾族化合物一起作用。對(duì)于抗感染應(yīng)用，式I化合物可以與抗感染劑如抗病毒藥或抗生素一起使用。
式I化合物采用常規(guī)途徑給藥，特別是經(jīng)胃腸道給藥，例如口服，可以以溶液形式飲用，或制成片劑或膠囊，或者腸道外給藥，比如配成可注射的溶液或懸浮液?？诜眠m宜的單位劑量形式，例如含1-50mg式I化合物，通常1-10mg。含式I化合物的藥物組合物可由常規(guī)方式制備，例如用類似于配制雷帕霉素藥物組合物的方法，如EPA 0041795所介紹的。
優(yōu)選藥物組合物含式I化合物及載體介質(zhì)，所述介質(zhì)包含親水相，親油相和表面活性劑?？蓪⑵渑涑扇橐海⑷橐侯A(yù)濃縮物，如UK專利申請(qǐng)2278780A所公開的。優(yōu)選親油相含載體介質(zhì)重量的10-85％，表面活性劑含載體介質(zhì)重量的5-80％，而親水相含載體介質(zhì)重量的10-50％。式I化合物優(yōu)選占2-15％重量。
特別優(yōu)選的藥物組合物包含下面所述的微乳化狀濃縮液載體介質(zhì)i)蓖麻油和環(huán)氧乙烷的反應(yīng)產(chǎn)物，ii)植物油和甘油的酯基轉(zhuǎn)移產(chǎn)物，主要包括亞油酸或油酸、單、二、或三甘油酯，或多氧烷基化植物油，iii)1，2-丙二醇，和iv)乙醇。
根據(jù)前面的介紹，本發(fā)明還提供A.用作藥物的式I化合物，例如用于預(yù)防和治療上面所述疾病。
B.含式I化合物及藥物學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物。
C.針對(duì)需要此種治療的個(gè)體預(yù)防和治療上面所述疾病的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用有效量的式I化合物。
D.用于上面所述免疫抑制、炎癥或感染的藥盒或藥包，包括含有式I化合物的藥物組合物，及包括含有免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)藥劑，或者含抗炎劑或抗感染劑的藥物組合物。
令人驚異地發(fā)現(xiàn)X是OH的式I化合物，即32(S)-二氫化合物活性得到改善，如上面的試驗(yàn)所揭示的，并且比其相應(yīng)的對(duì)映體，即32(R)-二氫化合物更穩(wěn)定，比如若進(jìn)行下面的試驗(yàn)可看出將試驗(yàn)化合物在大鼠血清中保溫，經(jīng)不同的保溫時(shí)間之后，以MBA測(cè)試法，測(cè)定其與FKBP 12的結(jié)合親和力。當(dāng)親和力降低時(shí)，則名義上IC50提高。親和力的降低一般歸因于化合物在大鼠血清中的不穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.式I化合物
其中R1是烷基、鏈烯基、鏈炔基、羥烷基、羥鏈烯基、羥鏈炔基、芐基、烷氧芐基、或氯芐基；R2選自式II或式III
其中R3選自H、烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、硫代烷基、芳烷基、羥芳烷基、羥芳基、羥烷基、二羥烷基、羥烷氧烷基、羥烷芳烷基、二羥烷芳烷基、烷氧烷基、烷基羰基氧烷基、氨烷基、烷氨烷基、烷氧羰基氨烷基、烷基羰基氨烷基、芳基亞磺酰氨烷基、烯丙基、二羥烷基烯丙基、二氧戊環(huán) 烯丙基、烷酯烷基、和烷基甲硅烷基；R4是氫、甲基，或者R4和R3連在一起形成C2-6亞烷基；R5是R6O-CH2-(其中R6選自H、烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、羥烷羰基、氨烷羰基、甲?；?、硫代烷基、芳烷基、羥芳烷基、羥芳基、羥烷基、二羥烷基、羥烷氧烷基、羥基烷芳烷基、二羥烷基芳烷基、烷氧烷基、烷基羰基氧烷基、氨烷基、烷氨烷基、烷氧羰基氨烷基、烷羰基氨烷基、芳基亞磺酰氨烷基、烯丙基、二羥烷基烯丙基、二氧戊環(huán)基烯丙基、和烷酯烷基)，R7CO(其中R7選自H、烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、氨基、烷氨基、氨基酸殘基、或N，N-二取代氨基，其中所述取代基(a)選自烷基、芳基、或芳烷基，或(b)形成雜環(huán)結(jié)構(gòu))，R8NCH-(其中R8是烷基、芳基、氨基、烷氨基、芳氨基、羥基、烷氧基或芳磺酰氨基)，-O-CH-O-，或者取代的二氧次甲基；Y選自O(shè)、(H、OH)和(H、OR9)，其中R9選自C1-4烷基、烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、羥烷基羰基、氨基烷羰基、甲酰基或芳基；并且X是OH或H；其中“alk”(本文中譯為“鏈”或“烷”)或“alkyl”(本文中譯為“烷基”)均指任意由氧鍵隔斷或不隔斷的C1-10脂族取代基；“ar”或“aryl” (本文中均譯為“芳基”)均指單環(huán)、任選雜環(huán)，任意被取代(或未被取代)的C4-14芳香取代基，其先決條件是，若X是OH，R1是烷基、且R2是式II殘基時(shí)，則R3不是H。
2.式Ia化合物
其中R1是C3-10鏈-2-炔基或C3-10羥基鏈-2-炔基，R2是權(quán)利要求1定義的式II或III殘基，并且Y是O。
3.式Ib化合物
其中R1是C1-10烷基、C3-10鏈烯基、C3-10羥基鏈烯基、C3-10鏈-2-炔基、C3-10羥基鏈-2-炔基、或C1-10烷氧基C1-10烷基，R2是權(quán)利要求1定義的式II或式III殘基，并且Y是O。
4.化合物16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫-雷帕霉素或16-戊-2-炔氧基-32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素。
5.化合物32-脫氧-雷帕霉素，或16-戊-2-炔氧基-32-脫氧-雷帕霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的式I化合物的制備方法，該方法包括a) 為生產(chǎn)X是H的式I化合物，將式IVa化合物32位上的羰基還原消除，
其中R1和Y定義同上，式IVa化合物是被保護(hù)或未被保護(hù)的，如果需要，除去存在的保護(hù)基；b)為生產(chǎn)X是OH的式I化合物，將上面定義的式IVa化合物32位上的羰基進(jìn)行立體有擇還原；c)將R1是烷基的式I化合物轉(zhuǎn)化，提供R1是烷基以外其它基團(tuán)的式I化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意之一的化合物，用作藥物。
8.一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1-5任意之一的化合物，與其藥物學(xué)上可接受的稀釋劑或載體相結(jié)合。
9.用于免疫抑制，炎癥或感染的藥盒或藥包，其中包括含有權(quán)利要求1-5任意之一化合物的藥物組合物，并包括含有免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑，或者抗炎劑或抗感染劑的藥物組合物。
10.針對(duì)需要治療的個(gè)體，預(yù)防或治療急、慢性器官或組織移植排斥，移植血管病變，平滑肌細(xì)胞增生及遷移導(dǎo)致的血管內(nèi)膜增厚或腫瘤的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用有效量權(quán)利要求1-5任意之一的化合物。
全文摘要
式(Ⅰ)化合物,其中R
文檔編號(hào)A61K31/436GK1187821SQ96194681
公開日1998年7月15日 申請(qǐng)日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月9日
發(fā)明者S·科滕斯, R·塞德拉尼 申請(qǐng)人:諾瓦蒂斯有限公司