專利名稱：：預(yù)防或治療過(guò)敏的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)患食物過(guò)敏的病人抑制由食物引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)的方法和途徑。本發(fā)明尤其提供了預(yù)防或治療過(guò)敏癥，特別是嬰兒的牛奶過(guò)敏癥的方法。本發(fā)明也涉及研制用于帶有消化道屏障功能損害的過(guò)敏嬰兒的特殊配方。牛奶過(guò)敏癥(CMA)被定義為對(duì)牛奶蛋白的一種免疫介導(dǎo)的不良反應(yīng)。本選擇的治療是徹底除去牛奶抗原。對(duì)于有CMA的嬰兒，當(dāng)不能獲得人奶時(shí)，有必要用一種替代配方?；趶呐Ｄ讨蝎@得的乳清或酪蛋白的水解配方，被用于來(lái)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)并有減少的抗原負(fù)荷。對(duì)牛奶的初步熱處理主要影響蛋白的構(gòu)象，并且使它們易于水解。用胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰提取物和腸粘膜提取物的隨后的酶水解導(dǎo)致順序抗原決定基的逐漸破壞和將配方精制為最少的抗原和過(guò)敏形式。大多數(shù)情況下，可安全地采用徹底水解的牛奶衍生配方，這些有效且在臨床和代謝上有好的耐受性。但是，酶水解不一定使配方非過(guò)敏，因?yàn)樽罴训乃獬潭炔恢狼以谒馕镏锌梢詼y(cè)到微量的最初蛋白。因此要小心地將這些替代物引入有牛奶過(guò)敏癥的小孩。通過(guò)除去抗原來(lái)控制過(guò)敏性炎癥的方法不能令人滿意，尤其是對(duì)患有多種食物過(guò)敏的患者(Sampson等，1992)。這些患者經(jīng)常表現(xiàn)出增強(qiáng)的腸滲透性和腸防御屏障的機(jī)能異常(Majamaa等，1996，Majamaa和Isolauri，1996)。這增大了生長(zhǎng)紊亂和對(duì)多種食物敏化的危險(xiǎn)性。迫切需要有新方法來(lái)治療牛奶過(guò)敏以提高CMA中替代物配方。腸抗原處理決定著隨后的對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。在健康方面，抗原沿著二條功能路徑而越過(guò)上皮被吸收。主要路徑是降解性地減少了抗原的免疫原性，次要路徑可以運(yùn)輸對(duì)于特定抗原免疫反應(yīng)關(guān)鍵的完整的蛋白質(zhì)。異常的抗原吸收提高了致敏過(guò)程(Fargeas等，1995)。在免疫反應(yīng)中通過(guò)T輔助細(xì)胞(Th)的細(xì)胞因子的產(chǎn)物差別對(duì)免疫反應(yīng)本質(zhì)有重要的調(diào)控效應(yīng)。天然的免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子輪廓決定著隨后的特定的免疫反應(yīng)的表現(xiàn)型。除了控制IgE的合成外，IL-4對(duì)于Th2表現(xiàn)型，過(guò)敏炎癥的特征的發(fā)育和成熟是關(guān)鍵的。這個(gè)過(guò)程對(duì)于發(fā)展對(duì)攝入的蛋白的耐受性是關(guān)鍵性的?？诜褪苄允且环N抗原-特異的全身性非反應(yīng)狀態(tài)，其特征是局部抗原-特異性的IgA反應(yīng)。分離的人腸菌株，乳桿菌菌株GG(LactobacillusGG，ATCC53103)最近已表現(xiàn)出提高局部IgA的抗腸道中遇到的飲食的抗原的反應(yīng)性，因而有助于免疫消除(Isolauri等，1993)。但是還不知道特定的腸細(xì)菌菌株是否能直接改變食物抗原的免疫原性，因而抑制過(guò)敏反應(yīng)。健康腸的微生物群中包括乳桿菌。有假定認(rèn)為在腸道中乳桿菌通過(guò)與腸粘膜上的病原的微生物競(jìng)爭(zhēng)受體和營(yíng)養(yǎng)來(lái)起作用。益生的(probiotics)制劑是活的微生物制品，它通過(guò)維持消化道中的天然的微生物群落來(lái)提高健康。如果起作用的微生物和它們的行為模式已知，那么可將一種微生物制品認(rèn)作是一種益生制劑。這些益生制劑附著于腸粘膜上，集居于人的腸道，阻止了有害微生物的附著。一個(gè)關(guān)鍵的假設(shè)是它們到達(dá)消化道的粘膜并且在胃腸道的上部不被破壞。乳桿菌GG就是有益生制劑特性的已知的細(xì)菌之一。本發(fā)明者現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)胃腸道中的某些細(xì)菌，尤其是乳桿菌和有益生制劑特性的細(xì)菌，可用于增強(qiáng)清除飲食(eliminationdiets)的功效，提高口服耐受性，預(yù)防和治療病人的食物引起的過(guò)敏性。本發(fā)明的一個(gè)方面是用上述的胃腸的細(xì)菌進(jìn)行蛋白水解獲得的蛋白水解物也可用于達(dá)到所說(shuō)的目的。在這里我們表明根據(jù)本發(fā)明所得的蛋白水解物有提高低變應(yīng)原性的免疫學(xué)效應(yīng)。此水解物抑制過(guò)敏性反應(yīng)，因而提高消化道免疫屏障機(jī)能，即穩(wěn)定消化道粘膜屏障。本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的蛋白質(zhì)水解物的配方，這種配方抑制過(guò)敏性反應(yīng)且提高消化道免疫屏障機(jī)能。用從益生制劑的胃腸細(xì)菌中獲得的酶，尤其是有附著和集居(colonizing)特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌，和胰蛋白酶和/或胃蛋白酶來(lái)水解蛋白質(zhì)，可以獲得水解物配方。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)水解配方可通過(guò)胰蛋白酶和/或胃蛋白酶水解蛋白，且加入到水解物中獲得，這樣就得到了一種細(xì)菌制劑，它包含益生制劑的胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性和與同那些乳桿菌GG菌株(ATCC53103)相似的蛋白酶體系的乳桿菌。將這些細(xì)菌加入到水解物配方中，優(yōu)選地作為一種凍干的制品。當(dāng)對(duì)病人用這種水解物配方時(shí)，期望正在水解的細(xì)菌酶在體內(nèi)釋放，借此獲得的效果與用以上所定義的改進(jìn)的水解物配方相同。而且，活的細(xì)菌穩(wěn)定消化道粘膜屏障，增強(qiáng)了局部防御。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是預(yù)防或治療嬰兒由食物引起的過(guò)敏反應(yīng)的一個(gè)方法，它包含的步驟是對(duì)處于危險(xiǎn)中的嬰兒給予本發(fā)明的改進(jìn)的蛋白質(zhì)水解物配方，或是給予一種蛋白質(zhì)水解物的配方，同時(shí)用包含益生制劑的胃腸細(xì)菌，尤其是乳桿菌的細(xì)菌制品，這種乳桿菌有附著和集居特性，以及同那些菌株乳桿菌GG(ATCC53103)相似的蛋白酶體系。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案是治療病人牛奶過(guò)敏的一個(gè)方法，它包含對(duì)病人給予本發(fā)明的改進(jìn)的蛋白質(zhì)水解物的配方，或是實(shí)施一種蛋白質(zhì)水解物的配方，同時(shí)使用包含益生制劑的胃腸細(xì)菌，尤其是乳桿菌的細(xì)菌制品，這種乳桿菌有附著和集居特性，以及同那些菌株乳桿菌GG(ATCC53103)相似的蛋白酶體系。本發(fā)明也提供了提高病人對(duì)食物抗原耐受原的免疫反應(yīng)的一種方法，這包括對(duì)病人口服本發(fā)明的改進(jìn)的蛋白質(zhì)水解物的配方，或口服一種包含益生制劑的胃腸細(xì)菌，尤其是乳桿菌的細(xì)菌制品，這種乳桿菌有附著和集居特性，以及同那些菌株乳桿菌GG(ATCC53103)相似的蛋白酶體系，或是口服一種蛋白質(zhì)水解物的配方，同時(shí)用包含益生制劑的胃腸細(xì)菌，尤其是乳桿菌的細(xì)菌制品，這種乳桿菌有附著和集居特性，以及同那些菌株乳桿菌GG(ATCC53103)相似的蛋白酶體系。在本發(fā)明以上所定義的方法中，當(dāng)一種蛋白質(zhì)水解物的配方與前面所定義的選擇的益生制劑的細(xì)菌結(jié)合使用時(shí)，這樣的配方可以是任何合適的蛋白質(zhì)水解物配方，已知的或新穎的。它可以是部分的蛋白水解物，或是一種徹底的水解的配方。適合于此目的的蛋白質(zhì)水解物的制備公開于如EP專利申請(qǐng)No.601802中。用于本發(fā)明的配方和方法中的優(yōu)選的細(xì)菌是乳桿菌GG(ATCC53103)。在本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書中，片語(yǔ)“細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性，以及同那些菌株乳桿菌GG(ATCC53103)相似的蛋白酶體系的乳桿菌”應(yīng)該理解為其附著和集居特性與那些LGG菌株相當(dāng)?shù)募?xì)菌，例如EP專利199535中定義的。這些細(xì)菌也被設(shè)想為與LGG有相同的酶體系，這意味著從這種細(xì)菌中獲得的酶能把蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生水解產(chǎn)物，這與那些從LGG中衍生的酶獲得的效果一樣?？s寫CI置信區(qū)間IFN-γ干擾素-γIgA免疫球蛋白AIgE免疫球蛋白EIL-4白細(xì)胞介素-4LGG乳桿菌GG(ATCC53103)OKT3抗CD3抗體PBMC外周血單核細(xì)胞TNF-α腫瘤壞死因子-αWF受到徹底水解的乳清配方的測(cè)試組WF-GG受到徹底水解的乳清配方和LGG制品的測(cè)試組P/T-酪蛋白(casein)＝由胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的酪蛋白P/T-αS1-酪蛋白(casein)＝由胃蛋白酶成胰蛋白酶水解的αS1-酪蛋白圖1A-1D體外由有絲分裂原引起的PBMCs的增殖反應(yīng)，分別對(duì)于P/T-酪蛋白(1A)，P/T-αS1-酪蛋白(1B)，用LGG衍生的酶額外水解的P/T-酪蛋白(1C)，用LGG衍生的酶額外水解的P/T-αS1-酪蛋白(1D)。結(jié)果表達(dá)為對(duì)無(wú)水解的產(chǎn)物(PHA-RPMI1640)和有三種濃度(0.1，10和1000微克/毫升)下的水解產(chǎn)物的培養(yǎng)物每分鐘的平均計(jì)數(shù)。水平線代表6個(gè)實(shí)驗(yàn)的每分鐘的幾何平均計(jì)數(shù)，對(duì)每一個(gè)個(gè)體計(jì)數(shù)相同。圖2每個(gè)患者特應(yīng)性皮炎的臨床值(SCORAD)和其程度中值(A)，強(qiáng)度中值(B)和主觀值(C)，以上值是對(duì)嬰兒在處理前(O)和用徹底水解的乳清配方(WF)或同樣的用徹底水解的乳清配方和乳桿菌GG(WF-GG)處理一個(gè)月后的值(I)。圖3酪蛋白和乳桿菌GG降解的酪蛋白對(duì)特異反應(yīng)性的患者(a，b)和在非特異反應(yīng)性的健康孩子由PBMC的IL-4產(chǎn)物和IFN-γ產(chǎn)物的影響。白柱代表的是在對(duì)照培養(yǎng)物中中值細(xì)胞因子產(chǎn)物；黑柱代表在含有純化的酪蛋白的培養(yǎng)物中；陰影柱代表在含有乳桿菌GG降解的酪蛋白的培養(yǎng)物。橫切線代表上部和低處的四分位數(shù)。*統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)比于空白樣培養(yǎng)物是顯著的雙向(pairwise)。圖4αS1-酪蛋白和乳桿菌GG降解的αS1-酪蛋白對(duì)由PBMC的IL-4產(chǎn)物和IFN-γ產(chǎn)物的影響，這是在特異反應(yīng)性的患者(a，b)和非特異反應(yīng)性的健康孩子。白柱代表在對(duì)照培養(yǎng)物中的中值細(xì)胞因子產(chǎn)物；黑柱代表在含有純化的αS1-酪蛋白的培養(yǎng)物中的；陰影柱代表在含有乳桿菌GG降解的αS1-酪蛋白的培養(yǎng)物中的。橫切線代表上部和低部的四分位數(shù)(quartiles)。*統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)比到對(duì)照培養(yǎng)物明顯的雙向下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。描述了制備改進(jìn)的水解物的方法，和本研究中可以觀察到表現(xiàn)出良好的治療效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1用乳桿菌GG獲得的酶水解的牛酪蛋白在體外抑制淋巴細(xì)胞增殖1.a.牛奶蛋白的水解牛的全部酪蛋白和酪蛋白組分(αS1-酪蛋白)從牛奶中提純(Syvaoia，1992)。用以乳桿菌GG中獲取的酶混合物的水解對(duì)酪蛋白和αS1-酪蛋白分別進(jìn)行。用改進(jìn)的Exterkate和deVeer，1985的方法來(lái)分離酶。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)對(duì)冷凍的細(xì)菌細(xì)胞超聲處理釋放出酶。分離出離心的細(xì)胞的上層清液，將其用在對(duì)酪蛋白和αS1-酪蛋白的水解中，水解于34℃下進(jìn)行24小時(shí)。如此所得的GG-水解物進(jìn)一步用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解。簡(jiǎn)單地，樣品首先用0.1摩爾/升鹽酸中含0.1％的胃蛋白酶溶液在37℃下水解3小時(shí)，其溶液pH值為2.5。用250毫克碳酸氫鈉和2摩爾/升氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值后，加入0.1％的胰蛋白酶，它們?cè)?7℃，pH8.0下水解5小時(shí)。P/T-酪蛋白和P/T-αS1-酪蛋白樣品通過(guò)只用胃蛋白酶和胰蛋白酶如上所述那樣水解純化的酪蛋白和αS1-酪蛋白而獲得，只是不用GG-水解過(guò)程。1.b.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測(cè)試要對(duì)有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的全血液微量法做一個(gè)變更。本實(shí)驗(yàn)需6至8個(gè)健康的自愿者作供血者。簡(jiǎn)單地，獲得肝素抗凝的靜脈血液，并用含有抗菌素的RPMI1640培養(yǎng)介質(zhì)(GrandIslandBiologicalCo.NY.USA)將其稀釋為1∶7。植物凝集素(PHA)(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.，USA)用含抗菌素的RPMI1640進(jìn)行稀釋，培養(yǎng)液中其最終的濃度范圍是5到1250微克/毫升。酪蛋白和αS1-酪蛋白的凍干水解物用RPMI1640進(jìn)行稀釋到其最終濃度為0.1微克/毫升(低)，10微克/毫升(中等)和1000微克/毫升(高)，已證明在用伊紅的染料排斥研究中對(duì)T細(xì)胞是無(wú)毒的。采用2套實(shí)驗(yàn)研究有絲分裂原引起的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的增殖反應(yīng)，對(duì)于(A)用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的酪蛋白(＝P/T-酪蛋白)，(B)用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的αS1-酪蛋白(＝P/T-αS1-酪蛋白)，(C)另外用乳桿菌GG中獲得的酶水解的P/T-酪蛋白，和(D)另外用從乳桿菌GG中獲得的酶水解的P/T-αS1-酪蛋白。實(shí)驗(yàn)包含了四種對(duì)照培養(yǎng)物，它們是培養(yǎng)介質(zhì)和有絲分裂原的不同稀釋物，而且相應(yīng)的測(cè)試培養(yǎng)液是三種不同濃度的25微升的水解產(chǎn)物。檢測(cè)如Sutas等，1996中所描述那樣進(jìn)行。有絲分裂原引起的PBMCs增殖反應(yīng)以扣除本底后每分鐘的計(jì)數(shù)表示。給出對(duì)于含125微克/毫升的PHA和RPMI1640的對(duì)照培養(yǎng)液和含有125微克/毫升的PHA及在低、中、高濃度下的水解產(chǎn)物的三個(gè)測(cè)試培養(yǎng)液的結(jié)果。1.c.統(tǒng)計(jì)分析用一種非參數(shù)的配對(duì)檢驗(yàn)(Wilcoxonsigned-rank測(cè)試)來(lái)對(duì)比每個(gè)測(cè)試培養(yǎng)介質(zhì)與那些對(duì)照培養(yǎng)介質(zhì)中每分鐘計(jì)數(shù)值的變化。顯著水平P＜0.05。根據(jù)測(cè)試培養(yǎng)介質(zhì)中每分鐘計(jì)數(shù)值的減少或增大，雙向比較的明顯結(jié)果表示為抑制或刺激作用。1.d.結(jié)果在用乳桿菌中獲得的酶的水解P/T-酪蛋白和P/T-αS1-酪蛋白所做的實(shí)驗(yàn)中，同用P/T-酪蛋白和P/T-αS1-酪蛋白(圖1A和圖1B)相比，在0.1，10和1000微克/毫升(p＝0.03，p＝0.03，和p＝0.03)(圖1C和圖1D)的有絲分裂原引致的PBMCS的增殖明顯被抑制。實(shí)施例2.用乳膠菌補(bǔ)加的蛋白質(zhì)水解物配方來(lái)治療有特應(yīng)性皮炎的嬰兒2.a.患者和研究設(shè)計(jì)此研究包含31名嬰兒，年齡從2.5到15.7(平均為8)個(gè)月，他們符合孩子特異反應(yīng)性濕疹的Hanifin標(biāo)準(zhǔn)(Hanifin，1987)。根據(jù)特異反應(yīng)性濕疹他們被歸于兒科診所并被懷疑是牛奶過(guò)敏。這種癥狀的平均開始時(shí)間為2.4個(gè)月，哺乳期為5.9個(gè)月。在第一級(jí)親屬中有特異反應(yīng)性疾病(哮喘，特應(yīng)性濕疹和過(guò)敏性鼻炎)或食物過(guò)敏的陽(yáng)性家族史的有26(占84％)位患者。濕疹病斑用潤(rùn)膚劑和局部的皮質(zhì)類固醇來(lái)處理。但是沒有一位患者接受全身性皮質(zhì)類固醇治療。除了特應(yīng)性濕疹外，9位患者(占19％)可發(fā)現(xiàn)有胃腸紊亂，如拉稀，嘔吐或腹瀉。在完成研究期間后，將這些患者進(jìn)行雙盲空白對(duì)照劑對(duì)照的牛奶刺激實(shí)驗(yàn)。只有那些有陽(yáng)性反應(yīng)的(27/31)包括于最終的研究人口中。將這些患者在一個(gè)月隨機(jī)地分為兩組。一組(WF，n＝14)接受徹底水解的乳清配方(ValioLtd，Helsinki，F(xiàn)inland，EP-A-601802)，另一組(WF-GG，n＝13)接受同樣的配方，只是其中另有乳桿菌GG制品(5×108cfu/g)(由ValioLtd，Helsinki，F(xiàn)inland提供)。在用他們指定的配方治療一個(gè)月后，這兩組都接受一種徹底水解的乳清配方(ValioLtd)再額外治療一個(gè)月。在飲食前，測(cè)定所有患者的血清總IgE濃度，牛奶特定的IgE(RAST，pharmacia，Uppsala，瑞典)和皮刺試驗(yàn)。用一種市售的牛奶過(guò)敏原ALK(AllergologiskLaboratorium，Horsholm，丹麥)和稀釋到正常進(jìn)食濃度測(cè)試配方來(lái)在前臂手掌面進(jìn)行皮刺試驗(yàn)。用一個(gè)1毫米單峰有鈍邊小刀以防止較深的刺穿(ALK)，以每毫升10毫克的二鹽酸組胺(ALK)作為陽(yáng)性對(duì)照。15分鐘后觀察反應(yīng)，如果刺痕的平均直徑至少是3毫米，而同時(shí)陰性對(duì)照僅0毫米，那么將組胺反應(yīng)尺寸一半或以上的反應(yīng)記錄為陽(yáng)性。在實(shí)驗(yàn)開始前，一個(gè)月后(相當(dāng)于研究期間)和二個(gè)月后，收集糞便樣品以測(cè)定α-1抗胰蛋白酶和THF-α。根據(jù)由EuropeanTaskForce對(duì)特應(yīng)性皮炎建立的SCORAD方法(1993)，評(píng)價(jià)特應(yīng)性皮炎的嚴(yán)重程度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，皮炎的程度(scoreA)用九級(jí)規(guī)則(ruleofnines)來(lái)評(píng)估，皮炎的強(qiáng)度(scoreB)是紅斑，浮腫，和/或丘疹、脫皮，地衣化和干燥的單個(gè)值的總和。主觀值(scoreC)表現(xiàn)形式(scored1-10)包括瘙癢和睡眠損失是由父母的評(píng)估來(lái)確定的。SCORAD由下式計(jì)算出A/5+3.5×B+C此研究方案得到了Tanpere大學(xué)醫(yī)院倫理檢查委員會(huì)的批準(zhǔn)。征得了嬰兒父母的同意。2.b.糞便樣品中α-1抗胰蛋白酶的測(cè)定冷凍的糞便樣品在室溫下融化并攪勻，取約1克放入玻璃試管中并凍干。將所得的干材料研磨，將50毫克轉(zhuǎn)入一只Eppendorf試管中，加入1毫升0.15M的氯化鈉溶液，在一個(gè)渦旋混合器中在室溫下劇烈混合20分，提取α-1抗胰蛋白酶。所得懸浮液以25,000g離心10分鐘除去殘?jiān)?，將上層清液用于測(cè)定α-1抗胰蛋白酶，其使用的是根據(jù)制造商說(shuō)明書的BehringBNA濁度計(jì)。結(jié)果表示為每克干凍干的糞便中抗胰蛋白酶的毫克數(shù)。2.c.糞便樣品中TNF-α的測(cè)定深凍的糞便樣品在室溫下融化，懸浮于1∶1(w/v)的生理鹽水中，使其沉淀下來(lái)。將0.5-1.0毫升的上層清液轉(zhuǎn)到一Eppendorf試管中在25,000g下離心十分鐘，然后，將此上層清液用于測(cè)定TNF-α。使用一種商品化的酶免疫分析藥盒(HumanTNF-αELISAKit，EndogenInc.，Boston，Massachusetts，USA)，如在血清樣品所示的那樣以測(cè)定糞便的TNF-α。2.d.統(tǒng)計(jì)學(xué)因?yàn)檠錓gE濃度的非對(duì)稱分布，因而用對(duì)數(shù)(ln)轉(zhuǎn)變且數(shù)據(jù)以置信區(qū)間(CI)為95％的平均值給出。炎性參數(shù)的濃度以較低和較高四分位數(shù)的中值給出。將Wilcoxonsignedrank測(cè)試和Mann-WhitneyU-測(cè)試用于統(tǒng)計(jì)比較中。2.e.結(jié)果2.e.1臨床資料平均(95％CI)血清總IgE為31(15-61)kU/1，這是對(duì)接受水解物配方的病人而言的。在10/37(37％)的特應(yīng)性濕疹患者中，牛奶的RAST是陽(yáng)性的(＞0.4kU/l)。在8/31(30％)的患者中，牛奶的皮刺測(cè)試為陽(yáng)性的。在開始用藥前以及用藥1個(gè)月后，即研究期間后，每個(gè)患者中特應(yīng)性皮炎的嚴(yán)重性表現(xiàn)于圖2中。在用藥前，WF組和WF-GG組的中(低四分位數(shù)-高四分位數(shù))SCORAD值分別為21(14-31)和26(17-38)且(p＝0.33)。在那些用乳桿菌GG的患者中，一個(gè)月后，其SCORAD值有明顯的提高(p＝0.008)，但對(duì)那些僅用徹底水解的配方而無(wú)乳桿菌GG的患者，一個(gè)月后，其SCORAD值無(wú)明顯增加(p＝0.89)。這時(shí)，WF組的SCORAD值為19(13-31)，而WF-GG組的SCORAD值為15(7-28)。WF-GG的SCORAD值下降是由于特應(yīng)性皮炎，程度(scoreA，p＝0.004)，強(qiáng)度(scoreB，p＝0.05)和主觀值(scoreC，p＝0.01)的下降(圖2)。在WF組中，2個(gè)月可以實(shí)現(xiàn)SCORAD值的增加，而對(duì)WF-GG組在停止施用乳桿菌GG后，SCORAD值保持不變。在2個(gè)月時(shí)，中(低四分位數(shù)-高四分位數(shù))SCORAD值在WF組是14(2-38)而WF-GG組是16(6-25)。2.e.2.糞便中的α-1抗胰蛋白酶和TNF-α的濃度。在健康的對(duì)照(n＝9)中，α-1抗胰蛋白酶中值(低四分位數(shù)-高四分位數(shù))濃度是0.5(0.5-1.7)毫克/克。在施藥前，WF組和WF-GG組之間的α-1抗胰蛋白酶濃度是相當(dāng)?shù)?p＝0.22)。如表1中指示的，在一個(gè)月的研究期間中，WF-GG組的α-1抗胰蛋白酶濃度明顯下降(p＝0.03)，但WF組中的α-1抗胰蛋白酶濃度卻無(wú)明顯下降(p＝0.68)。在二個(gè)月時(shí)，α-1抗胰蛋白酶濃度對(duì)WF為1.2(0.5-1.6)而WF-GG為0.5(0.5-0.7)。在健康的對(duì)照中，糞便的TNF-α濃度為0(0-0.08)皮克/克。在特異反應(yīng)性的孩子中，糞便的TNF-α濃度明顯較高，P＜0.0001(表1)。施藥前，WF組和WF-GG組間TNF-α的濃度是相當(dāng)?shù)?p＝0.57)。在一個(gè)月的研究期間中(表1)，糞便的TNF-α濃度對(duì)于WF-GG組明顯下降(p＝0.003)，但WF組中不是這樣(p＝0.38)。在2個(gè)月時(shí)WF組的TNF-α濃度下降，而在也施用徹底的水解配方但無(wú)乳桿菌GG的WF-GG組，可以測(cè)到TNF-α增加的趨勢(shì)。此時(shí)TNF-α的濃度在WF中為84(25-129)而WF-GG中為144(20-338)表1在用藥前(0)和嬰兒接受徹底水解的乳清配方(WF)或還含有乳桿菌GG細(xì)菌的配方(WF-GG)一個(gè)月后的情況(I)下糞便的α-1抗胰蛋白酶和TNF-α的濃度，數(shù)據(jù)表示為中值(低四分位數(shù)-高四分位數(shù))。</tables>實(shí)施例3通過(guò)特異反應(yīng)性孩子中的外周血單核細(xì)胞抑制細(xì)胞因子產(chǎn)物3.a患者和方法研究了總共有14名年齡為5-29(平均為16)個(gè)月的患者，他們符合特應(yīng)性皮炎的Hanifin標(biāo)準(zhǔn)(Hanifin，1987)，另外有8名年齡相符的非特異反應(yīng)的健康兒童。在研究期間，他們中沒有一人接受全身性的皮質(zhì)類固醇。含有腹水流體的OKT3(抗-CD3-抗體)是由芬蘭赫爾辛基的赫爾辛基大學(xué)的細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)系的M.Kaartinen博士惠贈(zèng)。如Syvaoja(1992)所敘述的那樣，牛的全酪蛋白從牛奶中純化而來(lái)。純化的酪蛋白是用實(shí)施例1中描述的從乳桿菌GG中獲得的酶來(lái)水解的。將純化的酪蛋白或乳桿菌GG降解的酪蛋白凍干并貯于室溫中。在實(shí)驗(yàn)前，它們用RPMI1640來(lái)稀釋并且應(yīng)用過(guò)濾消毒裝置(0.1μm，Milliporecorporation，Bedford，MA，USA)。完全的培養(yǎng)介質(zhì)由含有10％的胎牛血清，10mMHepes緩沖液，2mML-谷氨酰胺(GibcoLifeTechnologies，Paisley，UK)，50U/ml的青霉素G(Sigma，St.Louis，MO，USA)，10mg/ml慶大霉素素(RousselLaboratoriesLtd，Uxbridge，Middlesex，UK)的RPMI1640所組成。取得5ml的周圍靜脈血液。含有90％的淋巴樣細(xì)胞的PBMC用FicollPaque(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)梯度離心，并以1×106細(xì)胞/毫升懸浮于完全的培養(yǎng)介質(zhì)中。用含有腹水流體的抗-CD3-抗體以預(yù)測(cè)定的最佳稀釋度預(yù)先涂到培養(yǎng)孔上。測(cè)試培養(yǎng)液還含有酪蛋白或乳桿菌GG降解的酪蛋白的稀釋物，它們的最終濃度為1mg/ml。對(duì)純化的αS1-酪蛋白或乳桿菌GG降解的αS1-酪蛋白，重復(fù)以上的實(shí)驗(yàn)。在一濕潤(rùn)的含5％的二氧化碳37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，收集上層清液，貯于-70℃下以用于細(xì)胞因子分析。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用商購(gòu)的ELISA試劑盒來(lái)測(cè)定培養(yǎng)物上層清液中的IL-4和IFN-γ(IL-4CLB，CompactHumanInterleukin-4ELISAKit，CentralLaboratoryoftheNetherlandsRedCrossB1oodTransfusionService，Amsterdam，TheNetherlands；IFN-γ，EIFNG，EndogenInc.，Cambridge，MA，USA)。比較于標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同途徑所得的結(jié)果相等，并以皮克/毫升表示。此檢測(cè)的靈敏度對(duì)IL-4為2.3皮克/毫升，而IFN-γ為5皮克/毫升。Wilcoxonsigned-rank測(cè)定用于統(tǒng)計(jì)比較測(cè)試培養(yǎng)物和對(duì)照培養(yǎng)物。顯著性水平為p＜0.05。3.b.結(jié)果在特異反應(yīng)性患者中，與對(duì)照培養(yǎng)液相比，含有純化的酪蛋白的培養(yǎng)液中的IL-4和IFN-γ產(chǎn)物均有增加，它們p值分別為0.008和0.008(圖3a，b)。當(dāng)用乳桿菌GG的酶降解時(shí)，牛酪蛋白中觀察不到這種效應(yīng)。相反，在含有乳桿菌GG降解的酪蛋白的培養(yǎng)液中，IL-4產(chǎn)物比對(duì)照的培養(yǎng)液中的明顯減少，p＝0.003(圖3a)，而這些培養(yǎng)液中IFN-γ產(chǎn)物與對(duì)照培養(yǎng)液中的相當(dāng)，p＝0.10(圖3b)。在健康的兒童中，含有純化的酪蛋白的培養(yǎng)液中的IL-4和IFN-γ產(chǎn)物均與對(duì)照培養(yǎng)液中的相當(dāng)，p＝0.10和p＝0.10(圖3c，d)。與特異反應(yīng)性的患者的發(fā)現(xiàn)相平行，對(duì)健康兒童在含有乳桿菌GG降解的酪蛋白的培養(yǎng)液中，同對(duì)照培養(yǎng)液中相比，IL-4產(chǎn)物也明顯要少，p＝0.01(圖3c)，而這些培養(yǎng)液中IFN-γ產(chǎn)物與對(duì)照培養(yǎng)物中的保持相當(dāng)，p＝0.50(圖3d)。用αS1-酪蛋白和乳桿菌降解的αS1-酪蛋白可以獲得平行的結(jié)果(圖4)。參考文獻(xiàn)關(guān)于特應(yīng)性皮炎的歐洲任務(wù)。特應(yīng)性皮炎的嚴(yán)重性的評(píng)估theSCORAD指標(biāo)。皮膚病學(xué)1993；18623～31。ExterkateF和deVeerG.由鏈球菌cremoris的細(xì)胞壁蛋白酶對(duì)酪蛋白的不完全分離和降解。實(shí)用環(huán)境微生物學(xué)1985；49328-32。FargeasMJ，TheodorouV，MoreJ，WalJM，F(xiàn)ioramortiJ，BuenoL在口敏化的豚鼠腸炎后促進(jìn)的全身性免疫和局部的反應(yīng)性。胃腸病學(xué)199510953-62HanifinJM.特應(yīng)性皮炎的流行病學(xué)。過(guò)敏反應(yīng)專論1987；21116-131IsolauriE，MajamaaH，ArvolaT，RantalaI，VirtanenE，Arvilommi，H.乳桿菌casei菌株GG倒轉(zhuǎn)由乳鼠中牛奶引起的增加的腸的滲透性。胃腸病學(xué)1993；105；1643-1650MajamaaH，IsolauriE.消化道粘膜屏障的評(píng)估有特應(yīng)性濕疹的兒童中增強(qiáng)的抗原轉(zhuǎn)移的證據(jù)。過(guò)敏反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志1996，在出版中MajamaaH，MiettinenA，LaineS，IsolauriE.有特應(yīng)性濕疹的兒童的炎癥糞便嗜伊紅的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)和腫瘤壞死因子作為食物過(guò)敏的無(wú)損傷的指示物。臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)敏反應(yīng)學(xué)1996；26181-187。SampsonHA，JameMJandBemhisel-BroadbentJ。一種從氨基酸中所得的用于有牛奶過(guò)敏癥的兒童的嬰兒配方的安全性兒科學(xué)1992；90463-465SutasY，SoppiE，KorhonenH，SyvaojaEL，SaxelinM，RokkaT，IsolauriE.用乳桿菌caseiGG獲得的酶水解牛酪蛋白在體外抑制淋巴細(xì)胞的增殖。過(guò)敏反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志1996，在出版中SyvaojaEL.定量測(cè)定主要的酪蛋白成分和從牛奶中純化αS2-及k-酪蛋白。Milchwissenschaft1992；47563-566。權(quán)利要求1.一種制備用于抑制過(guò)敏反應(yīng)和提高消化道免疫屏障機(jī)能的蛋白質(zhì)水解物配方的方法，它包括以下步驟用從包含益生的(probiotic)胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌的細(xì)菌制品中取得的酶來(lái)水解蛋白質(zhì)和用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶來(lái)水解蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1中所述的方法，其中的酶是從包含乳桿菌GG(ATCC53103)的細(xì)菌制劑中制備的。3.一種制備蛋白質(zhì)水解物配方以抑制過(guò)敏反應(yīng)和提高消化道免疫屏障機(jī)能的方法，它包括的步驟如下用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)，并在水解物中添加一種包含益生的胃腸道細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌的細(xì)菌制品。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的細(xì)菌制品包括乳桿菌GG(ATCC53103)。5.一種用于抑制過(guò)敏性反應(yīng)和促進(jìn)消化道免疫屏障機(jī)能的蛋白質(zhì)水解物配方，該水解物可用權(quán)利要求1到4中定義的任一種方法獲得。6.一種預(yù)防或治療由食物引起的嬰兒過(guò)敏性反應(yīng)的方法，包含對(duì)處于危險(xiǎn)中的嬰兒施以根據(jù)權(quán)利要求5所得的蛋白質(zhì)水解物配方。7.一種治療患者牛奶過(guò)敏的方法，包括對(duì)患者給予根據(jù)權(quán)利要求1制備的蛋白質(zhì)水解物配方。8.一種提高患者對(duì)食物抗原的耐受原免疫反應(yīng)的方法，它包括口服根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)水解物的配方。9.一種預(yù)防或治療嬰兒的食物引起的過(guò)敏性反應(yīng)的方法，包括對(duì)處于危險(xiǎn)中的嬰兒施用一種根據(jù)權(quán)利要求1制備的蛋白質(zhì)水解物的配方，同時(shí)施用一種生細(xì)菌制品，其包含益生的胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌。10.一種治療患者牛奶過(guò)敏反應(yīng)的方法，包括對(duì)患者施用一種蛋白質(zhì)水解物配方和一種細(xì)菌制品，它包含益生的胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌。11.一種促進(jìn)患者對(duì)食物抗原的耐受原免疫反應(yīng)的方法，包括口服一種細(xì)菌制品，這種制品包含益生的胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌，或是一種蛋白質(zhì)水解物配方和一種細(xì)菌制品，這種細(xì)菌制品包含益生的胃腸細(xì)菌，尤其是有附著和集居特性以及與那些乳桿菌GG(ATCC53103)菌株相似的蛋白酶體系的乳桿菌。12.一種根據(jù)權(quán)利要求9到11任何之一的方法，其中的細(xì)菌制劑包含乳桿菌GG(ATCC53103)。全文摘要本發(fā)明涉及抑制遭受食物過(guò)敏的病人的食物引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)的方法和途徑。本發(fā)明尤其提供了制備一種抑制過(guò)敏反應(yīng)和提高消化道免疫屏障物的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物配方的方法,和預(yù)防或治療過(guò)敏,尤其是嬰兒的牛奶過(guò)敏的方法,這是通過(guò)用從胃腸道中獲得的合適的益生菌(probioticbacteria),尤其是乳桿菌,來(lái)強(qiáng)化牛奶消食而進(jìn)行的。而且,施用一種由胃腸細(xì)菌免疫反應(yīng)改性的過(guò)敏原的片斷可以將敏感反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿硇缘姆磻?yīng)低下。用于本發(fā)明的一種優(yōu)選細(xì)菌是乳桿菌GG(ATCC53103)。文檔編號(hào)A61P37/08GK1187772SQ96194752公開日1998年7月15日申請(qǐng)日期1996年6月12日優(yōu)先權(quán)日1995年6月14日發(fā)明者埃里克·艾斯勞里,利納·麥特薩尼蒂,漢納·科霍恩,塞波·薩爾米恩,伊娃－莉薩·塞瓦加申請(qǐng)人:瓦里歐公司