專利名稱：重組mva病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從改良安卡拉痘苗病毒(MVA)衍生的重組痘苗病毒及其包含且能夠表達(dá)插入到MVA染色體上自然發(fā)生缺失位點(diǎn)上的外源基因；涉及使用這類重組MVA病毒產(chǎn)生多肽，例如抗原或治療劑，或產(chǎn)生用于基因治療的病毒載體，以及使用這類編碼抗原的重組MVA病毒作為疫苗。
本發(fā)明的目的之一是提供一個(gè)重組MVA病毒，它可作為有效且特別安全的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種簡(jiǎn)單、有效、安全的方法產(chǎn)生多肽，例如抗原或治療劑，產(chǎn)生重組病毒用作疫苗以及產(chǎn)生病毒載體用于基因治療。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一個(gè)基于表達(dá)T7RNA聚合酶的重組MVA病毒的表達(dá)系統(tǒng)，以及基于此表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生多肽，例如抗原或治療藥劑，或產(chǎn)生病毒載體用于基因治療或用作疫苗。
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬的一員，曾用作活疫苗免疫人天花病。世界范圍用痘苗病毒成功的接種最終導(dǎo)致天花病因-天花病毒的絕跡[天花的全球絕跡。全球天花絕跡鑒定委員會(huì)的最后報(bào)告。公共衛(wèi)生歷史，第4號(hào)(History ofPublic Health，No.4)，日內(nèi)瓦世界衛(wèi)生組織，1980]。因而世界衛(wèi)生組織(WHO)宣告，除了有高度危險(xiǎn)痘病毒感染的人群(例如實(shí)驗(yàn)室人員)外，已全世界性地停止接種。
最近，痘苗病毒也已用于設(shè)計(jì)病毒載體，以進(jìn)行重組基因表達(dá)和可能用作重組活疫苗[Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.[1982美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PN.A.S.USA)79，7415-7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B.生物技術(shù)和遺傳工程評(píng)論2(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2)，383-407]。這必然伴有在DNA重組技術(shù)幫助下把編碼外源抗原的DNA序列(基因)引入痘苗病毒基因組。如果基因整合到病毒DNA中對(duì)病毒生活周期非必需的位點(diǎn)，可能新產(chǎn)生的重組痘苗病毒是感染性的，即能夠感染外源細(xì)胞并從而表達(dá)整合的DNA序列[歐洲專利申請(qǐng)83,286號(hào)和110,385號(hào)(EP PatentApplications No.83,286 and No.110,385)]。用這種方法制備的重組痘苗病毒一方面可用作活疫苗預(yù)防傳染性疾病，另一方面可用于在真核細(xì)胞中制備異源蛋白質(zhì)。
表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶基因的重組痘苗病毒可以建立廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成重組蛋白(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，MMizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.自然(Nature)348，91-92.)。在所有方案中，重組基因表達(dá)依賴于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中T7 RNA聚合酶的合成。最普遍的一個(gè)方案是用于瞬時(shí)表達(dá)(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F(xiàn).W.和Moss，B.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.)Sci.USA 83，8122-8126和美國(guó)專利申請(qǐng)(US patent application)7.648.971)。首先，一個(gè)感興趣的外源基因插入質(zhì)粒并在T7 RNA聚合聚啟動(dòng)子控制之下。隨后，質(zhì)粒引入到細(xì)胞的原生質(zhì)體中，該細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法由產(chǎn)生T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒預(yù)先感染。
此轉(zhuǎn)染方案非常簡(jiǎn)單因?yàn)椴恍铇?gòu)建新的重組病毒并且特別有效，有超過80％的細(xì)胞表達(dá)感興趣的基因[Elroy-Stein，O.和Moss，B.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，6743-6747]。痘苗病毒/T7 RNA聚合酶雜合系統(tǒng)比其它瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)很可能在于它不依賴于質(zhì)粒到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。在過去，該系統(tǒng)在病毒學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中對(duì)檢測(cè)目的是極其有用的(Bunocore，L.和Rose，J.K.自然(Nature)345，625-628，Pattnaik，A.K.和Wertz，G.W.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc Natl.Acad.Sci.USA)88，1379-1383，Karschin，A.，Aiyar，J.，Gouin，A.，Davidson，N.和Lester，H.A.歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)278，229-233，Ho，B.Y.，Karschin，A.，Raymond，J.，Branchek，T.，Lester，H.A.和Davidson，N.歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Lett.)301，303-306，Buchholz，C.J.，Retzler C.，Homann，H.E.，和Neubert，W.J.病毒學(xué)(Virology)204，770-776)。然而，痘苗病毒/T7 RNA聚合聚雜合系統(tǒng)的重要前景應(yīng)用，例如產(chǎn)生重組蛋白或重組病毒顆粒用于人體的新的治療或預(yù)防方法，可能由于重組痘苗載體的大量復(fù)制而受到阻礙。
痘苗病毒對(duì)人是感染性的并且在根除天花運(yùn)動(dòng)中的接種時(shí)偶而會(huì)觀察到嚴(yán)重的并發(fā)癥。關(guān)于并發(fā)癥發(fā)病率的最好綜述由一項(xiàng)美國(guó)國(guó)家調(diào)查提供，該調(diào)查檢測(cè)了大約一千二百萬接種疫苗的人，接種疫苗基于紐約城市衛(wèi)生委員會(huì)痘苗病毒菌株(Lane，J.，Ruben，F(xiàn).，Neff，J.和Millaar，J.新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)281，1201-1208)。因而安全性考慮和規(guī)范影響了使用痘苗病毒作為載體發(fā)展重組活疫苗的最令人鼓舞的可能性。此外，文獻(xiàn)中描述的大多數(shù)重組痘苗病毒基于西方保藏的痘苗病毒菌株(Westem Reservestrain ofvaccinia virus)。另一方面，眾所周知此菌株有較高的神經(jīng)毒性因而不適用于人類和動(dòng)物(Morita等，疫苗(Vaccine)5，65-70)。對(duì)于載體應(yīng)用，通過使用高度減毒的痘苗病毒菌株可以減小健康危險(xiǎn)。特別發(fā)展了許多這類痘苗病毒以避免天花接種中的不希望的副作用。因而，通過痘苗病毒安卡拉菌株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞中長(zhǎng)期的連續(xù)傳代產(chǎn)生了改良安卡拉痘苗病毒(VVA)(綜述參看Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.感染(Infection)3，6-14；瑞士專利號(hào)(Swiss Patent No.)568，392)。MVA病毒按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于1987年11月15日保藏于CNCM(巴斯德研究所，微生物菌種國(guó)家收藏館(Institut Pasteur，Collection Nationale de Culturesde Microorganisms，)25，rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，保藏號(hào)1-721。MVA的特點(diǎn)是強(qiáng)減毒性，也就是說通過減少的毒性或感染性同時(shí)保持良好的免疫原性。檢測(cè)了MVA病毒以確定它相對(duì)于野生型CVA菌株基因組的變化。檢測(cè)到六個(gè)主要的共31,000堿基對(duì)的基因組DNA缺失(缺失I，II，III，IV，V和VI)(Meyer，H.，SuTTer，G.和Mayr A.普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)72，1031-1038)。產(chǎn)生的MVA病毒其宿主細(xì)胞嚴(yán)格限于禽源細(xì)胞。另外，MVA具有高度減毒的特征。在多種動(dòng)物模型中的檢驗(yàn)證明MVA甚至在免疫抑制的動(dòng)物中都是無毒性的。更重要的是，MVA菌株的優(yōu)秀特性已在廣泛的臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.l，Abt.Org.B167，375-390，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。在這些超過120,000人的研究中，包括高危病人，沒發(fā)現(xiàn)有與MVA疫苗相關(guān)的副作用。
已發(fā)現(xiàn)MVA在人細(xì)胞中的復(fù)制在感染后期受到阻礙，防止了成熟感染性病毒粒子的組裝。盡管如此，MVA甚至在非允許細(xì)胞中也能高水平表達(dá)病毒的和重組的基因，并建議作為有效的和特別安全的基因表達(dá)載體(Sutter，G.和Moss，B.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851)。最近，在MVA基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的痘病毒載體系統(tǒng)，外源DNA序列插入MVA基因組的缺失III或TK基因(Sutter，G.和Moss，B.發(fā)育生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(Dev.Biol.Stand.)Basel，Karger 84，195-200和美國(guó)專利(USpatent)5,185,146)。
為了進(jìn)一步開發(fā)MVA的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)通過DNA重組把外源基因引入痘苗病毒MVA菌株的新的可能方法。由于發(fā)明不是要改變MVA病毒的基因組，因此必需使用符合此需要的方法。依據(jù)本發(fā)明，一個(gè)外源DNA序列準(zhǔn)確地在MVA基因組天然發(fā)生缺失位點(diǎn)重組到病毒DNA。
本發(fā)明從而特別地包括單獨(dú)的下述內(nèi)容或它們的組合一個(gè)重組MVA病毒包含并能夠表達(dá)至少一種插入MVA基因組自然發(fā)生缺失位點(diǎn)的外源基因；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒包含并能夠表達(dá)至少一種插入MVA基因組缺失II位點(diǎn)的外源基因；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一個(gè)標(biāo)記，一個(gè)治療基因或一個(gè)抗原決定簇；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一個(gè)來自于病原性病毒、細(xì)菌、或其它微生物，或來自于寄生蟲，或腫瘤細(xì)胞的抗原決定簇；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一個(gè)來自于惡性瘧蟲(Plasmodium Falciparum)，分枝桿菌(Mycobacteria)，皰疹病毒，流感病毒(influenza virus)，肝炎或人免疫缺陷病毒的抗原決定簇；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的抗原決定簇是人免疫缺陷病毒(HIV)的nef或人酪氨酸酶；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其為MVA-LAI nef或MVA-hTYR；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其為MVA-T7 pol；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒，其中的外源基因處于痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5的轉(zhuǎn)錄控制之下；如上所述的重組MVA病毒，基本上不含能夠在人細(xì)胞中復(fù)制的病毒；一個(gè)如上所述的重組MVA病毒用于處在T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的DNA序列的轉(zhuǎn)錄；由任一上述重組MVA病毒感染的真核細(xì)胞；由一種上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶；由一種上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還包含載有一種或幾種處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的外源基因的一種或幾種表達(dá)載體；如上所述細(xì)胞的應(yīng)用以產(chǎn)生由上述外源基因編碼的多肽，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞，以及b)分離由上述的外源基因編碼的多肽。
由一種上述重組MVA病毒感染的細(xì)胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還包含表達(dá)載體，該表達(dá)載體載有處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制之下的病毒基因和/或編碼一病毒載體基因組的一個(gè)病毒載體構(gòu)建體；如上所述細(xì)胞的應(yīng)用以產(chǎn)生病毒顆粒，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞，以及b)分離病毒顆粒；由一種如上所述MVA病毒感染的細(xì)胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還含有a)載有一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的表達(dá)載體，它能夠感染和指導(dǎo)由上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體攜帶的一種或幾種外源基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)，以及b)一種或幾種表達(dá)載體，其載有的基因處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下并編碼上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的基因組包裝所必需的多肽；如上所述細(xì)胞的應(yīng)用以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)上述的細(xì)胞，以及b)分離逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；含有一種上述重組MVA病毒的疫苗，其中的外源基因在生理可接受載體中編碼一抗原決定簇；一種如上所述重組MVA病毒的應(yīng)用，其中的外源基因編碼一種疫苗制劑中的抗原決定簇；一種如上所述疫苗的應(yīng)用以免疫活的動(dòng)物體，包括人；一種如上所述包括MVA-LAInef的疫苗的應(yīng)用以防止或治療人免疫缺陷病毒(HIV)感染或愛滋病(AIDS)；一種如上所述包括MVA-hTYR的疫苗的應(yīng)用以防止或治療黑素瘤；一種疫苗，其第一種組分包括一種如上所述的重組MVA病毒，其中包括的外源基因在生理可接受載體中編碼T7 RNA聚合酶；第二種組分包括一個(gè)載有在生理可接受載體中處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的抗原決定簇的DNA序列，兩種組分可同時(shí)包含或分別包含；如上所述疫苗的應(yīng)用以免疫活的動(dòng)物體，包括人，包含用疫苗的第一種和第二種組分對(duì)上述活的動(dòng)物體，包括人，進(jìn)行同時(shí)接種或在同一接種部位延時(shí)接種；以及術(shù)語“基因”表示編碼一種蛋白或肽的任何DNA序列。
術(shù)語“外源基因”表示插入一DNA序列的基因，該序列中通常未發(fā)現(xiàn)該基因。
外源基因可以是例如標(biāo)記基因、治療基因、編碼抗原決定簇的基因或病毒基因。這類基因在本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知。
改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，一個(gè)宿主范圍局限的和高度減毒的痘苗病毒菌株，在測(cè)試的人和大多數(shù)其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中不能增殖。但由于在非允許細(xì)胞中病毒基因表達(dá)未受損傷，依據(jù)本發(fā)明的重組MVA病毒可能用作特別安全和有效的表達(dá)載體。
編碼抗原決定簇的重組MVA病毒在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組痘苗病毒，其含有編碼外源抗原，優(yōu)選地屬于致病病原體的基因，以及以生理可接受形式包含此類病毒的疫苗。本發(fā)明也涉及制備此類重組MVA痘苗病毒或疫苗的方法；涉及應(yīng)用這些疫苗預(yù)防那些致病病原體引起的感染。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一個(gè)編碼HIVnef的基因。
我們已構(gòu)建了重組MVA病毒，允許HIV-Inef基因在痘苗病毒早/晚期啟動(dòng)子P7.5的控制下進(jìn)行表達(dá)。靈長(zhǎng)類慢病毒的調(diào)節(jié)性Nef蛋白合成于病毒復(fù)制周期的早期并已表明對(duì)高滴度病毒復(fù)制和體內(nèi)疾病誘導(dǎo)起重要作用。這提示HIV Nef可能在愛滋病病理中有關(guān)鍵作用。Nef促進(jìn)病毒感染性增加和HIV致病性的分子機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。但是，Nef是免疫原性的并且Nef特異抗原可用作疫苗防治HIV感染和愛滋病。
在本文中，表達(dá)HIVnef基因的重組MVA病毒可用于人體免疫，一方面作為預(yù)防疫苗防止人HIV病毒，另一方面用于HIV感染或愛滋病人的免疫治療。另外，表達(dá)HIVnef基因的MVA病毒也可用于重組HIV Nef蛋白的產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一編碼人酪氨酸酶的基因。
我們已構(gòu)建了重組MVA病毒，允許人酪氨酸酶基因在痘苗病毒早/晚期啟動(dòng)子P7.5的控制下進(jìn)行表達(dá)。近來。人酪氨酸酶被鑒定為黑素瘤特異性腫瘤抗原，它可造成抗腫瘤的溶細(xì)胞T-淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生(Brichard，V.等實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)178，489-495)。由于正常細(xì)胞中看來只有黑素細(xì)胞表達(dá)酪氨酸酶基因，因而酪氨酸酶成為黑素瘤免疫治療的有效目標(biāo)抗原。所以，表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用于黑素瘤病人以誘導(dǎo)激發(fā)腫瘤排斥或防止轉(zhuǎn)移的免疫反應(yīng)。表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可直接用作抗黑素瘤疫苗，或用病毒制備抗黑素瘤疫苗。在一個(gè)例子中，表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用于產(chǎn)生重組酪氨酸酶蛋白，它作為抗原用于疫苗制劑。在另一個(gè)例子中，用表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒作為表達(dá)載體，來自腫瘤病人的細(xì)胞體外修飾以表達(dá)酪氨酸酶并繼而轉(zhuǎn)移回病人來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)?；诒磉_(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒的制備疫苗可用于腸胃外或腫瘤部位?？梢苑乐鼓[瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤的諸如大小、形狀、稠度、血管形成或其它表型變化。以表達(dá)人酪氨酸酶基因的重組MVA為基礎(chǔ)制備的疫苗可用于手術(shù)切除腫瘤前、期間或切除后。
為了制備疫苗，依據(jù)本發(fā)明的MVA痘苗病毒要轉(zhuǎn)換成生理可接受形式。這可基于制備MVA疫苗以免疫天花的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行(如Stickl，H.等Dtsch.Med.Wschr.99，2386-2392所述)。典型地，大約106-108重組MVA顆粒在含2％胨和1％人白蛋白的100毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中凍干并置于一個(gè)安瓿管中，優(yōu)選地是一玻璃安瓿管。凍干品可含有補(bǔ)充劑(例如甘露糖醇、葡聚糖、蔗糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它助劑(例如抗氧化劑，穩(wěn)定劑等，以適用于腸胃外給藥。玻璃安瓿管繼而密封并可優(yōu)選地在-20℃以下貯存幾個(gè)月。
用于接種或治療的凍干品可溶于0.1到0.5毫升水溶液，優(yōu)選地是生理鹽水中，并經(jīng)腸胃外給藥例如肌肉內(nèi)接種或局部給藥例如接種到腫瘤或在腫瘤部位局部給藥。根據(jù)本發(fā)明的疫苗或治療優(yōu)選地采用肌肉內(nèi)注射(Mayr，A.等Zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.B 167，375-390)。給藥方式，劑量和給藥次數(shù)可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員對(duì)所知方式進(jìn)行優(yōu)化。合適的話，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)接種多次以獲得對(duì)外源抗原合適的免疫反應(yīng)是適宜的。
使用重組MVA病毒產(chǎn)生異源多肽依據(jù)本發(fā)明的重組MVA痘苗病毒也可用于在真核細(xì)胞中制備異源多肽。這導(dǎo)致產(chǎn)生被重組痘苗病毒感染的細(xì)胞。編碼異源多肽的基因在細(xì)胞中表達(dá)，并分離所表達(dá)的異源多肽。產(chǎn)生此類異源多肽的方法通常為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知(EP-A-206和EP-A-205,939)。由于MVA病毒的特殊屬性，在重組MVA病毒幫助下產(chǎn)生的多肽非常適于用作人和動(dòng)物藥物。
編碼T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒及其應(yīng)用于表達(dá)在T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的DNA序列在本發(fā)明的進(jìn)一個(gè)實(shí)施方案中，我們構(gòu)建了重組MVA病毒，允許在痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5的控制下表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶。MVA-T7 pol重組病毒作為表達(dá)系統(tǒng)的用途已經(jīng)過誘導(dǎo)處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制之下的重組基因表達(dá)的瞬間轉(zhuǎn)染分析得到證實(shí)。使用大腸桿菌(E.coli)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因作為報(bào)告基因，我們發(fā)現(xiàn)MVA-T7聚合酶誘導(dǎo)的CAT基因表達(dá)就象衍生于痘苗病毒復(fù)制型WR菌株的痘苗病毒/T7pol重組體一樣有效。
依據(jù)本發(fā)明的MVA/T7聚合酶雜合系統(tǒng)從而可用作簡(jiǎn)單、有效和安全的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，以在缺乏大量痘苗病毒復(fù)制的情況下產(chǎn)生多肽。
此表達(dá)系統(tǒng)也可用于在T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下產(chǎn)生重組病毒粒子以用于免疫接種或基因治療，上述病毒粒子通過被表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA或包含所有或部分基因的DNA構(gòu)建體以及為產(chǎn)生諸如MVA粒子或逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子等的病毒粒子所必需的基因組或重組基因組感染的細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括兩種組分1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身是一個(gè)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒(載體質(zhì)粒)，其中編碼病毒蛋白的基因被將要傳遞給靶細(xì)胞的治療基因和標(biāo)記基因代替。由于編碼病毒蛋白的基因替代損壞了病毒，必須在系統(tǒng)中存在第二種組分提供給修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒丟失的病毒蛋白以拯救該病毒。第二種組分是2)產(chǎn)生大量病毒蛋白但又缺乏產(chǎn)生可復(fù)制型病毒能力的細(xì)胞系。此細(xì)胞系稱為包裝細(xì)胞系并含有被一個(gè)或多個(gè)攜帶能夠包裝修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因(編碼gag，pol和env多肽的基因)的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染的一細(xì)胞系。
為了產(chǎn)生包裝的載體，載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系。在這種情況下，含有插入的治療和標(biāo)記基因的改良逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組從載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄并包裝入改良逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子(重組病毒粒子)。然后用此重組病毒感染靶細(xì)胞，其載體基因組和任何攜帶的標(biāo)記或治療基因整合到靶細(xì)胞DNA。受此重組病毒粒子感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的載體病毒，因?yàn)檫@些細(xì)胞中沒有病毒蛋白質(zhì)。但攜帶治療和標(biāo)記基因的載體DNA整合到了細(xì)胞DNA并能在感染細(xì)胞中表達(dá)。
依據(jù)本發(fā)明表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒可用于產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所需的蛋白。為此目標(biāo)，把一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))的gag，pol和env基因置于一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體(例如質(zhì)粒)中T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下。表達(dá)載體隨后引入用重組MVA病毒感染的表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)入載有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的一個(gè)表達(dá)載體，通常處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
WO 94/29437，WO 89/11539和WO 96/07748描述了不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體，它們可用上述包裝系統(tǒng)進(jìn)行包裝。
表達(dá)T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒的再一個(gè)應(yīng)用是產(chǎn)生重組蛋白，非感染性病毒粒子，或感染性突變病毒粒子，以用于生產(chǎn)疫苗或治療劑(Buchholz等，病毒學(xué)(Virology)，204，770-776(1994)和EP-B1-356695)。為此目的，把病毒基因(例如HIV-1的gag-pol和env基因)置于一個(gè)表達(dá)載體(例如質(zhì)?；蚱渌亟MMVA病毒)中T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。此構(gòu)建體隨后引入用重組MVA病毒感染的表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞中。重組病毒基因高效轉(zhuǎn)錄，重組蛋白大量制造并可純化。此外，表達(dá)的重組病毒蛋白(例如HIV-1的env，gag)可能組裝成假病毒粒子從細(xì)胞出芽并可從組織培養(yǎng)物中分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由MVA-T7pol系統(tǒng)表達(dá)的病毒蛋白(來源于例如人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(Measles virus))通過克服病毒增殖中吸附和感染，脫殼，核酸復(fù)制，病毒基因表達(dá)，裝配，出芽或其它步驟中的缺陷來拯救引入的突變病毒，從而可產(chǎn)生并純化所述的突變病毒。
MVA-T7pol也可與攜帶感興趣抗原基因(例如，HIV的nef，tat，gag，pol或env或其它基因)的DNA序列同時(shí)使用進(jìn)行免疫。首先，給定抗原(例如人免疫缺陷病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人乳頭瘤病毒(HPV)，單純皰疹病毒(HSV)，麻疹病毒，流感病毒或其它)的編碼序列克隆到處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制之下優(yōu)選地是質(zhì)粒的載體中并使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法擴(kuò)增和純化產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體。其次，載體DNA同時(shí)或在適當(dāng)時(shí)間延遲后與MVA-T7pol一起免疫接種。在接種部位，感興趣的重組基因在含有載體DNA和MVA-T7pol的細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并且相應(yīng)抗原存在于宿主免疫系統(tǒng)刺激了抗原特異性免疫反應(yīng)。這種使用非復(fù)制痘苗載體MVA-T7pol的方案代表了一種提供給定抗原有效瞬時(shí)表達(dá)而又避免了組成型基因表達(dá)潛在危險(xiǎn)的核酸免疫接種的有前途的新方法。
重組MVA痘苗病毒可按下文陳述進(jìn)行制備。
一個(gè)包含側(cè)翼為MVA基因組中鄰近自然發(fā)生缺失例如缺失II的MVADNA序列的編碼一個(gè)外源多肽DNA序列的DNA構(gòu)建體，引入到用MVA感染的細(xì)胞中，以發(fā)生同源重組。一旦把DNA構(gòu)建體引入真核細(xì)胞并且外源DNA與病毒DNA重組，就可能通過對(duì)所需重組痘苗病毒用已知的方式，優(yōu)選地在標(biāo)記幫助下，分離到所需重組痘苗病毒(對(duì)比Nakano等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79，1593-1596，F(xiàn)ranke等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)1918-1924，Chakrabarti等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)3403-3409，F(xiàn)athi等，病毒學(xué)(Virology)97-105)。要插入的DNA-構(gòu)建體可以是線狀的或環(huán)狀的。環(huán)狀DNA是優(yōu)選的，特別是質(zhì)粒。DNA-構(gòu)建體包含位于MVA基因組自然發(fā)生缺失例如缺失II左方和右方側(cè)翼的序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和AltenburgerJ.(1989)病毒學(xué)集刊(Arch.Virol.)105，15-27)。外源DNA序列插入位于自然發(fā)生缺失側(cè)翼的序列之間。外源DNA序列可以是編碼治療多肽，例如組織血纖維溶酶原激活劑(t-PA)或干擾素，或來自致病病原體的抗原決定簇的基因。致病病原體可以是導(dǎo)致疾病的病毒、細(xì)菌和寄生蟲，也可能是在有機(jī)體中無限制增殖從而可能導(dǎo)致病理生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。這些致病病原體的例子由Davis，B.D.等做過描述(微生物學(xué)(Microbiology)第三版，HarperIntemational Edition)。優(yōu)選的致病病原體抗原來自人免疫缺陷病毒(例如HIV-1和HIV-2)，導(dǎo)致肺結(jié)核的分枝桿菌，寄生蟲惡性瘧蟲，以及黑素瘤細(xì)胞。
為了表達(dá)一個(gè)DNA序列或基因，DNA中必須存在基因轉(zhuǎn)錄必需的調(diào)節(jié)序列。這些調(diào)節(jié)序列(稱為啟動(dòng)子)為本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并包含例如EP-A-198,328中所述的痘苗病毒11kDa基因和那些7.5kDa基因(EP-A-110,385)。DNA構(gòu)建體可通過轉(zhuǎn)染，例如通過磷酸鈣沉淀方法(Graham等，病毒學(xué)(Virol.)52，456-467；Wigler等，細(xì)胞(Cell)777-785)通過電穿孔方法(Neumann等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO J.I，)841-845)，通過微注射方法(Graessmann等，酶學(xué)方法(Meth.Enzymology)101，482-492(1983))，通過脂質(zhì)體方法(Straubinger等，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology 101，512-527(1983)，通過原生質(zhì)球方法(Schaffner，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77，2163-2167(1980))或其它本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法引入到MVA感染的細(xì)胞。通過磷酸鈣沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)染是優(yōu)選的方法。
下面的詳細(xì)實(shí)施例是為了有助于對(duì)本發(fā)明的更好理解。但不是說本發(fā)明僅局限于實(shí)施例內(nèi)容。


圖1圖示MVA基因組圖譜和用于通過同源重組插入外源DNA的質(zhì)粒圖譜MVA基因組中的Hind III限制性位點(diǎn)標(biāo)在上面。顯示了重疊MVA基因組中缺失II接界的900 bp HindIII-HindIII N片段。鄰近缺失II的MVADNA序列通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增并用于構(gòu)建插入質(zhì)粒pUCIILZ。圖2pUCIILZP7.5用于插入缺失II的MVA載體質(zhì)粒，包含P11-Lac Z表達(dá)盒和痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5以表達(dá)可克隆到質(zhì)粒SmaI位點(diǎn)的感興趣基因。圖3pUCIILZdel P7.5用于在MVA基因組缺失II位點(diǎn)插入外源基因的MVA載體質(zhì)粒，含有自缺失P11-Lac Z表達(dá)盒和痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5以表達(dá)可克隆到質(zhì)粒SmaI/NotI克隆位點(diǎn)的感興趣基因。圖4重組病毒MVA-T7 pol的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn))圖譜以及使T7 RNA聚合酶基因插入MVA基因組HingIIIN片段中缺失II位點(diǎn)的載體質(zhì)粒pUCIILZT7pol的圖譜。圖5MVA-T7pol病毒DNA的Sourthern印跡檢測(cè)圖6用[35S]甲硫氨酸對(duì)蛋白進(jìn)行代謝標(biāo)記。SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳檢測(cè)。泳道1MVAT7pol，泳道2MVA，泳道3CV-1細(xì)胞。圖7氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)檢測(cè)用含有處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制下的CAT基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的以及用MVA-T/pol或WR-T7pol感染的CV-1細(xì)胞。裂解物用于檢測(cè)CAT活性。C是指氯霉素，1-AcC和3-AcC是指單和三乙酰化形式的氯霉素。Cat活性用60分鐘內(nèi)形成的乙?；a(chǎn)物百分?jǐn)?shù)表示。圖8MVA-LAInef的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn))圖譜以及使HIV-1 LAI的nef基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點(diǎn)上的載體質(zhì)粒pUCIILZdel P7.5-LAInef的圖譜。圖9MVA-hTYR的構(gòu)建圖示MVA基因組(HindIII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn))圖譜以及使人酪氨酸酶基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點(diǎn)上的載體質(zhì)粒pUCIILZdel P7.5-TYR的圖譜。
實(shí)施例1.病毒的生長(zhǎng)和純化1.1 MVA病毒的生長(zhǎng)MVA病毒是一種高度減毒的痘苗病毒，它由安卡拉痘苗病毒(CVA)通過在原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)培養(yǎng)物中長(zhǎng)期連續(xù)傳代衍生而來。關(guān)于產(chǎn)物的歷史、特性及MVA菌株的應(yīng)用的概括性綜述參考Mayr等在感染(Infection)3，6-14 中發(fā)表的總結(jié)。由于在CEF中的減毒，MVA病毒在這種禽宿主細(xì)胞中復(fù)制到很高的滴度。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MVA是嚴(yán)格生長(zhǎng)局限的，并且檢測(cè)不到病毒引起的典型噬斑形成。所以，MVA病毒要生長(zhǎng)于CEF細(xì)胞。為了制備CEF細(xì)胞，從孵化11天的雞蛋中分離胚，去除末端，并把胚絞碎后在含有0.25％胰蛋白酶的溶液中37℃解離20分鐘。過濾產(chǎn)生的細(xì)胞懸液并用SorvaURC-3B離心機(jī)在室溫下2000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞，重懸于10體積培養(yǎng)基A(Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM Eagle)，例如可獲取于LifeTechnologies GmbH，Eggenstein，Germany)，并再用Sorvall RC-3B離心機(jī)在室溫下2000rpm離心5分鐘進(jìn)行沉淀。細(xì)胞沉淀重懸于含10％胎牛血清(FCS)，青霉素(100單位/毫升)，鏈霉素(100毫克/毫升)和2mM谷氨酰氨的培養(yǎng)基A中以獲得含500000細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液。用這種方法獲得的CEF細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。把它們放到培養(yǎng)基A中，按照所需細(xì)胞濃度在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃生長(zhǎng)1-2天，并直接或再進(jìn)行一次細(xì)胞傳代后用于感染。制備原代培養(yǎng)物的詳細(xì)描述可在R.I.Freshney，“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”(“Culture ofanimal cell”)，Alan R.Liss Verlag，New York 一書中第11章99頁及其下列等等中找到。
MVA病毒按下面方法用于感染。CEF細(xì)胞培養(yǎng)在175厘米2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在90％-100％鋪滿時(shí)，去除培養(yǎng)基并且細(xì)胞在培養(yǎng)基A中與MVA病毒懸液(每個(gè)細(xì)胞0.01感染單位(IU)，0.02毫升/厘米2)共培養(yǎng)1小時(shí)。然后添加更多的培養(yǎng)基A(0.2毫升/厘米2)并且把培養(yǎng)瓶在37℃培養(yǎng)2-3天(直到大約90％的細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng))。通過刮細(xì)胞單層到培養(yǎng)基并在Sorvall RC-3B離心機(jī)中4℃3000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞物質(zhì)制備粗病毒貯存物。粗病毒制劑在進(jìn)一步處理(例如病毒純化)前貯存于-20℃。1.2病毒的純化為獲得盡可能純的并且不含對(duì)宿主細(xì)胞特異組分的病毒所采用的純化步驟類似于Joklik所述(病毒學(xué)(Virology)18，9-18 )。融解貯存于-20℃的粗病毒保存物并在PBS中懸浮一次(10-20倍沉淀體積)，懸浮液如上述方式離心。新沉淀懸浮于10倍體積Tris緩沖液1(10mM Tris-HCl pH9.0)，懸浮液用超聲波簡(jiǎn)短處理(Labsonic L，B.Braun Biotech Intemational，Melsungen Germany；2×10秒，60瓦，室溫)以進(jìn)一步離解細(xì)胞碎片并從細(xì)胞物質(zhì)中釋放病毒粒子。細(xì)胞核和較大細(xì)胞碎片繼而通過懸浮液的簡(jiǎn)短離心去除(獲取于杜邦公司(Du Pont Co.)的Sorvall GSA轉(zhuǎn)頭，D-6353 BadNauheim，F(xiàn)RG；3000rpm 10℃離心3分鐘)。沉淀再一次懸浮于Tris緩沖液1，用超聲波處理并離心，如上所述。收集的含游離病毒粒子的上清液聯(lián)合并鋪層于10mM Tris-HCl，pH9.0的10毫升36％蔗糖墊層上，在Beckman SW27/SW 28離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中4℃13,500rpm離心80分鐘。去掉上清液，含有病毒粒子的沉淀溶解于10毫升pH9.0的1mM Tris-HCl，用超聲波簡(jiǎn)短處理(室溫下2×10秒，儀器如上所述)均勻，加樣到20％-40％蔗糖梯度(蔗糖溶于1mM Tris-HCl，pH9.0)以進(jìn)一步純化。梯度液在Beckmann SW 41離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中4℃13,000rpm離心50分鐘。離心后，含有病毒粒子的分離帶在抽吸去帶上面體積后用移液管收集。獲得的蔗糖溶液用三倍體積PBS稀釋然后病毒粒子再通過離心沉淀(Beckmann SW 27/28，60分鐘，13,500rpm，4℃)?，F(xiàn)在，沉淀絕大部分由純病毒粒子構(gòu)成，它重懸于PBS并平衡至病毒濃度平均相當(dāng)于1-5×109IU/ml。純化的病毒貯存液貯存于-80℃并直接或用PBS稀釋后用于隨后的實(shí)驗(yàn)。1.3 MVA病毒的克隆為了產(chǎn)生均勻貯存病毒制劑，獲取于Anton Mayr教授的MVA病毒通過在96孔組織培養(yǎng)板上CEF培養(yǎng)物中連續(xù)三次傳代過程中的有限稀釋進(jìn)行克隆化。篩選到MVA克隆F6并在CEF中擴(kuò)增以獲得病毒的工作貯存物，作為產(chǎn)生本發(fā)明申請(qǐng)中描述的重組MVA病毒以及用于產(chǎn)生以前描述的重組MVA病毒的起始材料(Sutter，G.and Moss，B. 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851；Sutter，G.，Wyatt，L.，F(xiàn)oley，P.，Bennink，J.和Moss，B. 疫苗(Vaccine)12，1032-1040；Hirsch，V.，F(xiàn)uerst，T.，Sutter，G.，Carroll，M.，Yang，L.，Goldstein，S.，Piatak，M.，Elkins，W.，Alvord，G.，Montefiori，D.，Moss，B.and Lifson，J. 病毒學(xué)雜志(J.Virol.)70，3741-3752)。2.重組MVA病毒的構(gòu)建及其特征2.1.載體質(zhì)粒構(gòu)建為了實(shí)現(xiàn)重組MVA病毒的產(chǎn)生，構(gòu)建了新的載體質(zhì)粒。插入到MVA基因組的外源基因準(zhǔn)確定位于MVA基因組自然發(fā)生缺失II位點(diǎn)。位于MVA基因組HindIIIN片段中2500bp缺失位點(diǎn)側(cè)翼的MVADNA序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger，J. ，病毒學(xué)集刊(J.Arch.Virol.)105，15-27)用PCR法擴(kuò)增并克隆到質(zhì)粒pUC18的多克隆位點(diǎn)。用于左方600 bpDNA側(cè)翼的引物是5′-CAGCAGGGTACCCTCATCGTACAGGACGTTCTC-3＇和5＇-CAGCAGCCCGGGTATTCGATGATTATTTTTAACAAAATAACA-3＇(限制性酶KpnI和SmaI位點(diǎn)下面劃線)。用于右方550 bp DNA側(cè)翼的引物是5＇-CAGCAGCTGCAGGAATCATCCATTCCACTGAATAGC-3＇和5＇CAGCAGGCATGCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGA-3＇(限制性酶PstI和SphI位點(diǎn)下面劃線)。在插入到pUC18的MVADNA這兩段側(cè)翼之間，利用BamHI位點(diǎn)插入處于痘苗病毒晚期啟動(dòng)子P11控制之下的大腸桿菌(Escherichiacoli)Lac Z基因(通過pIIILZ限制性消化制備，Sutter，G.和Moss，B. 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNAS USA)89，10847-10851)，從而產(chǎn)生MVA插入載體pUCIILZ[圖1]。接下來一段含有痘苗病毒早期一晚期啟動(dòng)子P7.5以及用于克隆的SmaI位點(diǎn)的289 bp片段(通過EcoRI和XbaI限制性消化質(zhì)粒載體pSCII制備[Chakra barti等，1985，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Molecular and CellularBiology)5，3403-3409])插入到pUCIILZ的SmaI位點(diǎn)產(chǎn)生了MVA載體pUCIILZ P7.5[圖2]。為了構(gòu)建一個(gè)載體質(zhì)粒以通過報(bào)告酶β-半乳糖苷酶的瞬時(shí)合成實(shí)現(xiàn)重組MVA病毒的分離，一個(gè)來自大腸桿菌(E.coli)Lac Z開放閱讀框3＇末端的330 bp DNA片段用PCR擴(kuò)增(引物是5＇-CAGCAGGTCGACCCCGACCGCCTTACTGCCGCC-3＇和5＇-GGGGGGCTGCAGATGGTAGCGACCGGCGCTCAG-3＇)并克隆到pUCIILZ P7.5的SalI和PstI位點(diǎn)，獲得MVA載體pUCIILZdel P7.5[圖3]。利用SmaI位點(diǎn)，此載體質(zhì)?？捎糜诎烟幱诙幻绮《締?dòng)子P7.5轉(zhuǎn)錄控制之下的編碼外源基因的DNA序列插入到MVA染色體。在通過篩選β-半乳糖苷酶活性分離到所需重組病毒后，重組病毒的進(jìn)一步增殖導(dǎo)致通過同源重組產(chǎn)生再改造P11-LacZ表達(dá)盒的自缺失。2.2.重組病毒MVAT7pol的構(gòu)建和特征一個(gè)含有處于痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5控制之下的噬菌體T7RNA聚合酶完整基因的3.1 Kbp DNA片段用EcoR1從質(zhì)粒pTFF3上切下(Fuerst，T.R..，Niles，E.G.，Studier，F(xiàn).W.和Moss，B.，1986，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(P.N.A.S.USA)83，8122-8126)，與Klenow DNA聚和酶一起溫育修飾產(chǎn)生平頭末端，并克隆到pUCIILZ的單獨(dú)SmaI限制性位點(diǎn)。產(chǎn)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體pUCIILZ T7pol[圖4]。選擇痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5作為T7 RNA聚合酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。與較強(qiáng)的痘苗病毒晚期啟動(dòng)子(例如P11)相反，此啟動(dòng)子系統(tǒng)使重組基因在靶細(xì)胞感染后立即表達(dá)。指導(dǎo)外源基因插入MVA基因組缺失II位點(diǎn)的質(zhì)粒pUCIILZ T7pol用于產(chǎn)生重組病毒MVAT7pol。
用MVA在每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)為0.05 TCID50情況下感染的CEF細(xì)胞，按照前面所述使用質(zhì)粒pUCIILZ T7pol DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Sutter，G.，Wyatt，L.，F(xiàn)oley，P，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。表達(dá)T7RNA聚合酶并共表達(dá)β-D-半乳糖苷酶的重組MVA病毒(MVA P7.5-T7pol)通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)進(jìn)行連續(xù)五輪噬斑純化選擇出來。隨后，通過感染CEF單層擴(kuò)增重組病毒，并用PCR檢測(cè)DNA以證實(shí)病毒貯存物的遺傳均一性。MVA-T7pol病毒DNA的Southem印跡檢測(cè)證明了重組基因在MVA基因組中缺失II位點(diǎn)的穩(wěn)定整合[圖5]。
為檢測(cè)重組MVAT7pol的T7 RNA聚合酶表達(dá)，測(cè)定了來自病毒感染的組織培養(yǎng)物中的[35S]甲硫氨酸標(biāo)記多肽。生長(zhǎng)于12孔板上的單層猴腎細(xì)胞系CV-1用病毒以每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)20TCID50進(jìn)行感染。感染3到5小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，并用1毫升無甲硫氨酸培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)物一次。每孔加入補(bǔ)充有50微居里(μCi)[35S]甲硫氨酸的0.2毫升無甲硫氨酸培養(yǎng)基并在37℃溫育30分鐘。感染細(xì)胞的胞質(zhì)抽提物通過每孔在0.2毫升0.5％Nonidet P-40裂解緩沖液中37℃溫育10分鐘制備，樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。CV-1細(xì)胞與MVAT7pol的代謝標(biāo)記顯示了兩種額外多肽的合成(i)一個(gè)大約116,000道爾頓的蛋白代表共表達(dá)的大腸桿菌β-半乳糖苷酶以篩選重組病毒以及(ii)一個(gè)98,000道爾頓的蛋白，同噬菌體T7 RNA聚合酶預(yù)期大小一致[圖6]。由MVA T7pol產(chǎn)生的大量β-半乳糖苷酶是令人注目的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)插入到MVA基因組缺失II位點(diǎn)時(shí)有P11-Lac Z基因構(gòu)建體的強(qiáng)表達(dá)，揭示MVA載體病毒中的重組基因當(dāng)插入到MVA基因組的該位置時(shí)可能會(huì)更有效地表達(dá)。
MVA-T7pol重組病毒作為表達(dá)系統(tǒng)的用途與WR-T7pol重組病毒vTF 7-3(Fuerst等1986)的比較通過一個(gè)質(zhì)粒載體DNA的共轉(zhuǎn)染進(jìn)行了測(cè)定，該質(zhì)粒載體衍生于pTM1(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，Mizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.(1990)自然(Nature)348，91-92)并含有(克隆到pTM1多克隆位點(diǎn)的NcoI和BamHI位點(diǎn))處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子(PT7)控制之下的大腸桿菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。轉(zhuǎn)染和感染的CV-1細(xì)胞懸浮于0.2毫升0.25M Tris-HCl(pH7.5)。三輪凍融循環(huán)后，通過離心澄清裂解液，測(cè)定了上清液中蛋白含量，并且含0.5，0.25，0.1微克總蛋白的樣品按Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.(1984)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)49，857-864所述檢測(cè)了酶活性。放射自顯影后，用Fuji成像檢測(cè)系統(tǒng)定量標(biāo)記斑點(diǎn)。結(jié)果表明通過使用高減毒痘苗載體MVA，可能利用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶系統(tǒng)時(shí)就象使用完全的可復(fù)制型痘苗病毒重組體一樣有效[圖7]。2.3.重組病毒MVA-LAInef的構(gòu)建及其特征一個(gè)含有HIV-1 LAI完整nef基因的648bp DNA片段通過PCR從質(zhì)粒DNA制備(pTG 1166由M-P.-P.Kieny，Transgene S.A.，Strasbourg惠贈(zèng)；PCR引物為5＇-CAGCAGGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGT-3＇和5＇-CAGCAGGGATCCATGTCAGCAGTTCTTGAAGTAC TCCGG-3＇)，用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI消化，與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾以產(chǎn)生平頭末端，并克隆到pUCIILZdel P7.5的SmaI位點(diǎn)以產(chǎn)生載體pUCIIL Zdel P7.5-LAInefI圖8]。此質(zhì)粒可用于改造MVA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5控制下表達(dá)HIV-1 LAI的nef基因。
用MVA在每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)0.05 TCID50感染的CEF細(xì)胞再按前述方法用質(zhì)粒pUCIIL Zdel P7.5-LAInef的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Sutter，G.，Wyatt，L.，F(xiàn)oley，P.，Bennink，J.和Moss，B. 疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。含有nef基因和瞬時(shí)共表達(dá)大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續(xù)幾輪噬斑純化選擇出來。此后含有nef基因和缺失Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續(xù)噬斑純化篩選以尋找CEF細(xì)胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨后，重組病毒感染CEF單層進(jìn)行擴(kuò)增，并且用PCR檢測(cè)MVA-LAInef病毒DNA以證實(shí)病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southern印跡檢測(cè)證實(shí)了MVA-LAInef的遺傳穩(wěn)定性并精確表明nef基因和大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因缺失整合到了病毒基因組缺失II位點(diǎn)。
重組Nef蛋白的有效表達(dá)通過對(duì)來自MVA-LAInef感染的CEF細(xì)胞的蛋白裂解液使用引導(dǎo)抗HIV-1 Nef的鼠單克隆抗體(由K.Krohn惠贈(zèng)并按照Ovod，V.，Lagerstedt，A.，Ranki，A.，Gombert，F(xiàn).，Spohn，R.，Tahtinen，M.，Jung，G.，和Krohn，K. 愛滋病(AIDS)6，25-34所述使用)進(jìn)行Westem印跡檢測(cè)得以證實(shí)。2.4.重組病毒MVA-hTYR的構(gòu)建及特征一個(gè)含有編碼人酪氨酸酶完整基因的1.9kb DNA片段[酪氨酸酶C-DNA克隆123，B2分離自病人SK 29(AV)的黑素細(xì)胞系SK 29-MEL，GenBank Acc.no.UO 1 873；Brichard，V.，Van Pel，A.，Wolfel，T.，Wolfel，C.，DePlaen，E.，Lethe，B.，Coulie，P.和Boon，B.(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)178，489-495]通過EcoR1消化從質(zhì)粒pc DNAI/Amp-Tyr[Wolfel，T.，Van Pel，A.，Brichard，V.，Schneider，J.，Seliger，B.，Meyer zum Buschenfelde，K.和Boon，T.(1994)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.ImmunoI)24，759-764]制備，與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾產(chǎn)生平頭末端，并克隆到pUCIILZdel P7.5的SmaI位點(diǎn)以產(chǎn)生載體pUCIIL Zdel P7.5-TYR[圖9]。此質(zhì)?？捎糜诟脑霱VA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5控制下表達(dá)人酪氨酸酶基因。
MVA以每細(xì)胞感染復(fù)數(shù)0.05 TCI D50感染的CEF細(xì)胞用前述的質(zhì)粒pUCIIL Zdel P7.5-TYR的DNA轉(zhuǎn)染(Sutter，G，Wyatt，L.，F(xiàn)oley，P.，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。穩(wěn)定表達(dá)人酪氨酸酶基因并瞬時(shí)共表達(dá)大腸桿菌Lac Z基因的重組MVA病毒通過在CEF細(xì)胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續(xù)幾輪噬斑純化選擇出來。此后，表達(dá)編碼人酪氨酸酶基因并有缺失的Lac Z標(biāo)記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續(xù)噬斑純化以篩選CEF細(xì)胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨后，重組病毒感染CEF單層進(jìn)行擴(kuò)增，并且用PCR檢測(cè)MVA-hTYR病毒DNA以證實(shí)病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southem印跡檢測(cè)證實(shí)了MVA-hTYR的遺傳穩(wěn)定性并精確表明重組酪氨酸酶基因和大腸桿菌Lac Z標(biāo)記基因缺失整合到了病毒基因組中缺失II位點(diǎn)重組人酪氨酸酶的有效表達(dá)通過對(duì)來自MVA-hTYR感染的CEF細(xì)胞的蛋白裂解液使用兔多克隆抗體(由V.Hearing惠贈(zèng)并按照J(rèn)imenez，M.，Kameyama，K.，Maloy，L.，Tomita，Y.和Hearing，V. 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(P.N.A.S.USA)85，3830-3834所述使用)或引導(dǎo)抗酪氨酸酶的鼠單克隆抗體(由L.Old惠贈(zèng)并按照Chen，Y.，Stockert，E.，Tsang，S.，Coplan，K.和Old，L. 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(P.N.A.S.USA)92，8125-8129所述使用)進(jìn)行Western印跡檢測(cè)得以證實(shí)。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱GSF-Forschungszentrumfuer Umwelt und GesundheitGmbH(B)街道Ingolstaedter Landstr.1，Neuherberg(C)城市Oberschleissheim(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵編(ZIP)85764(ii)發(fā)明名稱重組MVA病毒及其應(yīng)用(iii)系列數(shù)目8(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版本(EPO)(vi)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朌K 0782/95(B)申請(qǐng)日1995，7，4(2)序列資料1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi))序列描述序列1CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC33(2)序列資料2(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度42堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi))序列描述序列2CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA42(2)序列資料3(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi)序列描述序列3CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC 36(2)序列資料4(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi)序列描述序列4CAGCAGGCAIGCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA36(2)序列資料5(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi)序列描述序列5CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTIACTGCC GCC 33(2)序列資料6(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi))序列描述序列6GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 33(2)序列資料7(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi)序列描述序列7CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGIAGT39(2)序列資料8(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA-引物”(xi)序列描述序列8CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG 39
權(quán)利要求
1.一種重組MVA病毒，含有并能夠表達(dá)至少一種插入到MVA基因組中自然發(fā)生缺失位點(diǎn)的外源基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組MVA病毒，含有并能夠表達(dá)至少一種插入到MVA基因組中缺失II位點(diǎn)的外源基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1到2所述的一種重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一種標(biāo)記，一種治療劑或一種抗原決定簇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組MVA病毒，其中的外源基因編碼來源于一種致病性病毒，一種細(xì)菌，或其它微生物，或來源于一種寄生蟲，或一種腫瘤細(xì)胞的一種抗原決定簇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組MVA病毒，其中的外源基因編碼來源于惡性瘧原蟲，分枝桿菌，皰疹病毒，流感病毒，肝炎病毒，或人免疫缺陷病毒的一種抗原決定簇。
6.根據(jù)權(quán)利要求4到5所述的一種重組MVA病毒，其中的抗原決定簇是HIVnef或人酪氨酸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組MVA病毒，其是MVA-LAInef或MVA-hTYR。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到2所述的一種重組MVA病毒，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種重組MVA病毒，其是MVA-T7pol。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9所述的一種重組MVA病毒，其中的外源基因處于痘苗病毒早期/晚期啟動(dòng)子P7.5的轉(zhuǎn)錄控制之下。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10所述的重組MVA病毒，基本上沒有能夠在人體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求8到9所述的一種重組MVA病毒的應(yīng)用，用于在T7RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下轉(zhuǎn)錄DNA序列。
13.一種用根據(jù)權(quán)利要求1到11中任何一個(gè)所述的重組MVA病毒感染的真核細(xì)胞。
14.一種用根據(jù)權(quán)利要求8到9所述的一種重組MVA病毒感染的根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種細(xì)胞，它另外含有一種或多種攜帶處于一個(gè)T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的一種或幾種外源基因的表達(dá)載體。
16.利用根據(jù)權(quán)利要求15所述細(xì)胞生產(chǎn)由該外源基因編碼的多肽，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，以及b)分離由該外源基因編碼的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種細(xì)胞，它另外含有攜帶處于一個(gè)T7RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的病毒基因，和/或編碼一種病毒載體基因組的一種病毒載體構(gòu)建體的表達(dá)載體。
18.應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求17所述細(xì)胞生產(chǎn)病毒粒子，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，以及b)分離病毒粒子。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種細(xì)胞，它另外包含a)一種載有一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的表達(dá)載體，能夠感染并指導(dǎo)靶細(xì)胞中由上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體所攜帶的一種或多種外源基因的表達(dá)，以及b)一種或多種攜帶處于T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子控制之下的編碼該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體基因組包裝所必需多肽的基因的表達(dá)載體。
20.應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求19所述細(xì)胞生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子，包括a)在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，以及b)分離逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子
21.一種處于一生理可接受載體中的并含有根據(jù)權(quán)利要求3到7所述一種重組MVA病毒的疫苗。
22.應(yīng)用權(quán)利要求3-7所述的重組MVA病毒制備疫苗。
23.應(yīng)用權(quán)利要求21所述的疫苗免疫包括人在內(nèi)的活體動(dòng)物，其包括用該疫苗接種包括人在內(nèi)的活動(dòng)物體。
24.應(yīng)用一種根據(jù)權(quán)利要求21所述的含有MVA-LAInef的疫苗預(yù)防或治療HIV感染或愛滋病。
25.應(yīng)用一種根據(jù)權(quán)利要求21所述的含有MVA-hTYR的疫苗預(yù)防或治療黑素瘤。
26.一種疫苗，包括作為第一種組分的一種存在于生理可接受載體中的根據(jù)權(quán)利要求8到9所述的一種重組MVA病毒，以及作為第二種組分的一個(gè)存在于生理可接受載體中的攜帶處于一個(gè)T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的一種抗原決定簇的DNA序列，可同時(shí)含有或分別含有該兩種組分。
27.應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求26所述的一種疫苗免疫接種一活動(dòng)物體(包括人)，包括用疫苗的第一種和第二種組分同時(shí)或在同一接時(shí)部位于一段時(shí)間延遲后接種上述活動(dòng)物體(包括人)。
28.應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求8到9所述的一種重組MVA病毒制備根據(jù)權(quán)利要求26所述的一種疫苗。
全文摘要
包含并能表達(dá)插入改良安卡拉痘苗病毒(MVA)基因組自然發(fā)生缺失位點(diǎn)的外源基因的重組MVA病毒,以及應(yīng)用這類重組MVA病毒生產(chǎn)多肽,例如抗原或治療劑,和重組病毒以用作疫苗或產(chǎn)生病毒載體用于基因治療。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1189857SQ96195254
公開日1998年8月5日 申請(qǐng)日期1996年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月4日
發(fā)明者格爾德·薩特, 馬里恩·奧爾曼, 沃爾克·厄夫勒 申請(qǐng)人:Gsf環(huán)境與健康研究中心有限公司