專(zhuān)利名稱(chēng)：體內(nèi)糖尿病檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用自身反應(yīng)性物質(zhì)產(chǎn)生一種用于診斷影響免疫系統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的體質(zhì)的物質(zhì)。
近年來(lái)，對(duì)諸如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和少年糖尿病(IDDM)這類(lèi)自身免疫性疾病的產(chǎn)生過(guò)程中的分子關(guān)系的解釋已有了迅速的進(jìn)展，而且已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)這類(lèi)疾病的早期診斷和隨后的治療的具體的應(yīng)用。
目前已經(jīng)證實(shí)，在這類(lèi)疾病的產(chǎn)生過(guò)程中，除了遺傳的疾病體質(zhì)外，環(huán)境因素也起了一定的作用。在遺傳的危險(xiǎn)因素方面，例如在IDDM中，只有MHC II型抗原的一些等位基因與這類(lèi)疾病密切相關(guān)。因此可以通過(guò)分析這些等位基因而為IDDM定義一個(gè)易感人群(如參見(jiàn)Thomson等人，J.Hum.Genet.43(1988)，799-816或Todd等人，Nature 329(1987)，599-604)。
在IDDM產(chǎn)生過(guò)程中的環(huán)境因素可能是外源的免疫原性的活性肽序列。在這方面已經(jīng)對(duì)病毒抗原進(jìn)行了討論，它們與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)有部分同源性。在特殊情況下，尤其是在出生后的一段時(shí)間，通過(guò)食物而被吸收的抗原如牛血清白蛋白能夠引起免疫反應(yīng)，由于與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)的同源性，這種反應(yīng)會(huì)引起一個(gè)自身攻擊性的過(guò)程。
在IDDM中的發(fā)病過(guò)程中，典型的現(xiàn)象就是由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞引起的胰臟β細(xì)胞的逐漸破壞。這一過(guò)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于葡萄糖代謝被破壞這一現(xiàn)象變得明顯之時(shí)。當(dāng)糖尿病的癥狀可被檢測(cè)到時(shí)，80％以上的β細(xì)胞已經(jīng)被破壞了。因此，在較早的時(shí)期在易感人群中檢測(cè)到這些自身攻擊性T細(xì)胞就顯得十分地重要，這樣就能夠?yàn)楸桓腥镜娜颂峁┘皶r(shí)的治療。
目前已經(jīng)證實(shí)，在自身免疾性疾病中，內(nèi)源性組織的破壞在開(kāi)始時(shí)進(jìn)行得十分緩慢。在這一過(guò)程的開(kāi)始階段，自身攻擊性T細(xì)胞可能只識(shí)別一種或幾種自身抗原。在Kaufman等人(Nature 368(1993)，69-72)和Tisch等人(Nature 368(1993)，72-78)的報(bào)道中，I型糖尿病的動(dòng)物模型(NOD小鼠)顯示，當(dāng)這種小鼠自然發(fā)生糖尿病時(shí)，初始的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)是針對(duì)谷氨酸脫羧酶的。在該過(guò)程的初始階段，在NOD小鼠體內(nèi)只在谷氨酸脫羧酶(GAD)的C-末端識(shí)別1至2個(gè)表位。上面已經(jīng)提到，葡萄糖代謝的改變?cè)谶@一階段還不能被檢測(cè)到，而此時(shí)perinsulitis已經(jīng)能夠被檢測(cè)到了。只有當(dāng)疾病進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，通過(guò)自身攻擊性T細(xì)胞來(lái)識(shí)別的GAD的肽的譜才能變得更寬。一旦糖尿病已經(jīng)明顯，也就可以檢測(cè)到預(yù)先活化的T細(xì)胞，它們對(duì)抗其它的島細(xì)胞抗原，例如外周蛋白、熱激蛋白HSP65和羧肽酶H。
有證據(jù)表明，在人中針對(duì)GAD的免疫反應(yīng)也與I型糖尿病的產(chǎn)生有因果關(guān)系。因此舉例來(lái)說(shuō)，在大約80％的前期糖尿病中可以檢測(cè)到針對(duì)GAD的自身抗體，盡管人們估計(jì)這些自身抗體不是主要的病原。而且有人推測(cè)在I型糖尿病中T淋巴細(xì)胞對(duì)胰臟β-細(xì)胞有逐步破壞。已經(jīng)有一些研究小組(Harrison等.，J.Clin.Invest.89(1992)，1161；Honeyman等.，J.Exp.Med.177，(1993)，535)檢測(cè)到了針對(duì)GAD的上述T淋巴細(xì)胞。這些小組發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞與GAD 67kd分子的肽片段反應(yīng)，該片斷含有氨基酸208至404。
EP-A-0 519 469公開(kāi)了得自人GAD 65kd分子的自身免疫反應(yīng)多肽。這些多肽的氨基酸序列如下X-P-E-V-K-(T或E)-K-Z其中X是從1至10個(gè)氨基酸中選出的一個(gè)任選序列，Z是從1至8個(gè)氨基酸中選出的一個(gè)任選序列。
歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?5 100 764.0中也提出了得自人GAD 65的自身反應(yīng)肽序列以及一種含有這些肽的藥物組合物。該申請(qǐng)還描述了使用這種藥物組合物來(lái)產(chǎn)生一種物質(zhì)，該物質(zhì)被用來(lái)診斷影響免疫系統(tǒng)的疾病或疾病體質(zhì)，或用來(lái)診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病的體質(zhì)。
本發(fā)明的目的之一是提供一種用于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，特別是自身免疫性疾病的診斷方法，該方法一方面盡可能地減少病人的不適感，另一方面能夠進(jìn)行快速和可靠的診斷。
該目的是通過(guò)用自身反應(yīng)性物質(zhì)產(chǎn)生一種用于診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的體質(zhì)的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，其中該物質(zhì)被皮內(nèi)給藥，診斷依據(jù)是在給藥部位是否出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
本發(fā)明的診斷方法與目前市場(chǎng)上可得到的方法不同，目前使用的方法被用于細(xì)胞介導(dǎo)免疫的一般性檢測(cè)，不同之處在于，這些檢測(cè)使用了病人已經(jīng)接觸過(guò)的外源性抗原，例如純化的蛋白質(zhì)衍生物(PPD)、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、念珠菌屬(Candida)等。這些檢測(cè)被用于確定被檢測(cè)者的免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)病沒(méi)有被檢測(cè)。
在另一個(gè)被廣泛用來(lái)確定變應(yīng)性反應(yīng)的檢測(cè)，例如穿刺(prick)檢測(cè)中，抗原不是在皮內(nèi)給藥。不是由T細(xì)胞介導(dǎo)的陽(yáng)性反應(yīng)可以在四小時(shí)內(nèi)被檢測(cè)到，其特征是表面出現(xiàn)腫脹，而不是出現(xiàn)結(jié)節(jié)。
本發(fā)明提供了一種用于在體內(nèi)檢測(cè)針對(duì)自身反應(yīng)性物質(zhì)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生的方法。這種細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)顯示了免疫系統(tǒng)的特定疾病，特別是自身免疫性疾病或這類(lèi)疾病的體質(zhì)的存在。另外，細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)還顯示腫瘤疾病或其體質(zhì)的存在。
適合于本發(fā)明方法的自身反應(yīng)性物質(zhì)或自身抗原是天然、合成或重組物質(zhì)，例如核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)、多肽、蛋白質(zhì)、肽類(lèi)以及它們的復(fù)合物，例如肽與諸如MHC分子或肽結(jié)合衍生物這樣的多肽所形成的復(fù)合物。另外的合適的自身反應(yīng)物質(zhì)是特定的免疫原性表位、片斷、類(lèi)似物、擬形物或例如通過(guò)化學(xué)修飾而產(chǎn)生的衍生物以及上述這些物質(zhì)的混合物?？蓪⒆陨矸磻?yīng)性物質(zhì)原樣給藥或以載體結(jié)合形式給藥，例如以脂肽形式給藥。自身反應(yīng)性物質(zhì)可被單獨(dú)給藥或與附加的物質(zhì)，例如附加的刺激組分或佐劑一同給藥。通過(guò)重組DNA技術(shù)或例如肽的固相合成的合成方法，可以由天然來(lái)源制得自身抗原。
在內(nèi)源性抗原方面，除了自身反應(yīng)物質(zhì)外，還可以使用那些盡管是外源性抗原但與自身抗原有免疫學(xué)關(guān)系的自身反應(yīng)物質(zhì)。這類(lèi)外源抗原的例子就是與得自?xún)?nèi)源性蛋白質(zhì)的自身反應(yīng)性肽序列有同源性的肽。具體的例子有具有序列L-V-Y-P-G-P-I-P-N(氨基酸60-68)的得自牛β-酪蛋白A的肽，它與內(nèi)源性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-2在序列Q-I-G-P-G-P-I-P-W(氨基酸412-420)區(qū)域中有同源區(qū)的部分；具有序列K-V-K-I-L-P-E-V-K-E-K-H-E(氨基酸33-45)的得自柯薩基病毒蛋白質(zhì)P2-C的肽，它與谷氨酸脫羧酶在序列R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K-G-M(氨基酸155-167)區(qū)域中有同源性。
本發(fā)明的方法包括將不同的自身抗原在皮內(nèi)給藥并確定在給藥部位是否發(fā)生局部的陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)。該陽(yáng)性反應(yīng)在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所特有的時(shí)刻進(jìn)行確定，其確定時(shí)間優(yōu)選是在給藥至少24小時(shí)之后，更優(yōu)選是在給藥后的24小時(shí)至1周之內(nèi)，最優(yōu)選是在給藥后的40-80小時(shí)之間。
陽(yáng)性反應(yīng)優(yōu)選地包括在給藥部位出現(xiàn)腫塊，可以通過(guò)目測(cè)或/和觸診對(duì)其進(jìn)行定性確定，也可以通過(guò)諸如超聲波或照相的方法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。
在另一方面，還可以確定陽(yáng)性反應(yīng)的產(chǎn)物，例如諸如γ-干擾素的細(xì)胞因子，它是由諸如白細(xì)胞的浸潤(rùn)細(xì)胞在給藥部位釋放的。
本發(fā)明的方法尤其適合于診斷自身免疫性疾病或自身免疫性疾病的體質(zhì)。
舉例來(lái)說(shuō)，可用本發(fā)明的方法診斷的自身免疫性疾病有糖尿病，尤其是I型糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、巴西多氏病、類(lèi)風(fēng)濕性脊柱炎、急性前眼色素層炎、Good-pasture綜合征、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常天皰瘡、免疫甲狀腺炎、硬皮病、克羅恩氏病、Sjogren綜合征、萊特爾氏綜合癥、腸炎或Graves病。本發(fā)明的方法尤其優(yōu)選地用于診斷T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，例如IDDM、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化，本發(fā)明的方法最優(yōu)選地用于診斷IDDM。
舉例來(lái)說(shuō)，用于診斷IDDM的自身反應(yīng)物質(zhì)有谷氨酸脫羧酶(GAD)65kd或67kd、酪氨酸磷酸酶(38kd的抗原)、羧肽酶H、胰島素、熱激蛋白、38kd的胰島素分泌顆粒蛋白質(zhì)或其部分。人GAD 65kd或它的部分肽序列被更優(yōu)選地用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
然而類(lèi)似的診斷也可用于其它的自身免疫性疾病。這類(lèi)自身免疫性疾病的例子有多發(fā)性硬化，其中可以檢測(cè)到對(duì)抗髓鞘堿性蛋白質(zhì)或蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)等的反應(yīng)性T細(xì)胞；類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中可以檢測(cè)到對(duì)抗II型膠原、細(xì)胞角蛋白、得自大腸桿菌(E.coli)的dnaJ蛋白和Hsp65的反應(yīng)性T細(xì)胞；巴西多氏病，其中可以檢測(cè)到對(duì)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶的反應(yīng)性T細(xì)胞。在患重癥肌無(wú)力時(shí)可以檢測(cè)到對(duì)抗乙酰膽堿受體或其它有關(guān)的自身反應(yīng)物質(zhì)的反應(yīng)性T細(xì)胞。在患紅斑狼瘡時(shí)可以檢測(cè)到對(duì)抗HSP90的反應(yīng)性T細(xì)胞，而在Graves病中則有對(duì)抗TSH受體的反應(yīng)性T細(xì)胞。
總之，該診斷可以用于影響免疫系統(tǒng)的所有疾病，例如也可以用于動(dòng)脈硬化。在這種情況下，已經(jīng)證實(shí)該病與對(duì)抗熱激蛋白Hsp65的免疫反應(yīng)有關(guān)(Xu等人，Lancet 341，8840(1993)，255-259)。
一個(gè)更進(jìn)一步的應(yīng)用是診斷性地檢測(cè)與腫瘤抗原反應(yīng)的T細(xì)胞。例如檢測(cè)對(duì)抗與黑素瘤有關(guān)的抗原MAGE1的T細(xì)胞，該T細(xì)胞分離自黑素瘤患者(van der Bruggen等人，Science 254(1991)，1643-1647)。在用傳統(tǒng)的方法還不能檢測(cè)到腫瘤(由于細(xì)胞物質(zhì)還太少)之前就可以檢測(cè)到這些T細(xì)胞了。另外，特異性反應(yīng)性T細(xì)胞還可被用于監(jiān)測(cè)一種抗腫瘤的疫苗接種。
另外，使用肽、肽的衍生物或類(lèi)似地結(jié)合的分子作為自身反應(yīng)性物質(zhì)也是可能的。為了診斷IDDM，優(yōu)選地使用一種或幾種得自GAD、尤其是得自人GAD 65kd的肽，或者由其衍生的肽衍生物或肽擬形物。
為了診斷IDDM，十分優(yōu)選地使用含有如下氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列 (I)D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R，(b)氨基酸序列 (II)S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K，(c) 氨基酸序列 (III)N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T，(d) 氨基酸序列 (IV)T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G，(e) 氨基酸序列 (V)P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W，(f) 氨基酸序列 (VI)T-Y-F-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R，
(g)氨基酸序列 (VII)F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I，(h)氨基酸序列 (VIII)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，(i)氨基酸序列 (IX)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(j)示于

圖1或圖2的氨基酸序列中的一個(gè)，(k)長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸的示于(a)至(i)中的氨基酸序列的部分區(qū)域，或/和(l)與示于(a)至(j)中的氨基酸序列有基本上相同的對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親合力的氨基酸序列。
氨基酸序列(I)至(VII)相應(yīng)于人GAD 65kd的氨基酸殘基86-105(I)、246-265(II)、146-165(III)、166-186(IV)、176-195(V)、206-225(VI)和556-575(VII)。在序列SEQ ID NO.1-7中對(duì)氨基酸序列I-VII進(jìn)行了陳述。
氨基酸序列(VIII)相應(yīng)于人GAD 65kd的氨基酸殘基266-290，氨基酸序列(IX)相應(yīng)于人GAD 65kd的氨基酸殘基306-325。示于圖1和2中的氨基酸序列也是人GAD 65kd的部分序列。在序列SEQ ID NO.8-28中給出了圖1和2的氨基酸序列。在序列SEQ ID NO.29和30中給出了氨基酸序列(VIII)和(IX)。
人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，含有人GAD 65上述區(qū)域的肽與從最近發(fā)現(xiàn)的I型糖尿病中分離出來(lái)的T細(xì)胞亞群發(fā)生特異性反應(yīng)。因而本發(fā)明中的肽是早期的自身表位，它的應(yīng)用使對(duì)I型糖尿病的極早期的診斷成為可能。
氨基酸序列(I)至(IX)是得自人谷氨酸脫羧酶(GAD)的65kd的同型物的部分區(qū)域，GAD完整的氨基酸序列描述于Bu等人(Proc.Nat.Acad.Sci USA 89(1992)，2115ff.)的文章中。氨基酸序列(I)至(IX)是這樣被發(fā)現(xiàn)的，即先建立得自I型糖尿病的外周血的T細(xì)胞系，然后在體外用得自豬腦的GAD或用重組的人GAD刺激它們并在增殖檢測(cè)中用得自人GAD序列的合成肽序列檢測(cè)這些T細(xì)胞系。
可以通過(guò)使用化學(xué)方法的已知合成過(guò)程來(lái)生產(chǎn)這些肽，也可以通過(guò)基因工程來(lái)生產(chǎn)，基因工程方法是在一個(gè)合適的宿主細(xì)胞，尤其是大腸桿菌(E.coli)中克隆并表達(dá)編碼這些肽的DNA序列。
具有特定的(I)至(IX)的氨基酸序列或示于圖1和2中的氨基酸序列的部分區(qū)域的肽也是優(yōu)選的，其長(zhǎng)度至少為6個(gè)氨基酸，優(yōu)選為至少8個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為至少10個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為至少15個(gè)氨基酸。本發(fā)明的氨基酸的最小長(zhǎng)度是通過(guò)它識(shí)別MHC分子、與該分子特異性地結(jié)合以及與相應(yīng)的T細(xì)胞受體反應(yīng)的能力來(lái)確定的。
得自GAD并與MHC結(jié)合的本發(fā)明肽的部分的最大長(zhǎng)度優(yōu)選為100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為50個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為25個(gè)氨基酸。
除了上述的肽外，也可以使用與上述的肽序列有基本相同的對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親合力的肽，它們優(yōu)選地得自上述的氨基酸序列，方法是對(duì)不同的氨基酸殘基或?qū)Π被釟埢囊恍〔糠只驅(qū)σ灶?lèi)似方式結(jié)合的修飾后的物質(zhì)進(jìn)行取代、缺失或插入。
特別地，本發(fā)明還涉及肽的變種，它們的序列與上述的氨基酸序列不是完全相同，而是只含有相同或密切相關(guān)的“錨位”。術(shù)語(yǔ)“錨位”是指一種對(duì)于與一種MHC分子，尤其是與DR3、DR4或DQ類(lèi)的MHC分子相結(jié)合必不可少的氨基酸殘基。舉例來(lái)說(shuō)，Hammer等人在Cell 74(1993)，197-203中對(duì)用于DRB10401結(jié)合基元的錨位進(jìn)行了陳述。這類(lèi)錨位被保留在本發(fā)明的肽中或被具有在化學(xué)性質(zhì)上密切相關(guān)的側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代(例如纈氨酸取代丙氨酸，異亮氨酸取代亮氨酸，反之亦然)。存在于本發(fā)明的肽中的錨位可以用一種簡(jiǎn)單的方式測(cè)定，方法是檢測(cè)上述特定肽的變種與MHC分子的結(jié)合能力。本發(fā)明的肽的特點(diǎn)是它們具有與上述的肽基本相同的對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親和力。與初始的肽或其部分序列相比，得自這些肽的肽優(yōu)選具有至少30％的序列同源性，更優(yōu)選為至少50％，最優(yōu)選為至少60％。
特定的肽的變種的例子有得自人GAD 67的相應(yīng)的同源肽部位，Bu等人也對(duì)其完整的氨基酸序列進(jìn)行了描述，同上文。
“基本相同的對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親和力”這一概念也包括一種與(I)至(VIII)的氨基酸序列相比或與示于圖1和2中的氨基酸序列相比得到了提高的結(jié)合特異性或/和親和力，這尤其多見(jiàn)于長(zhǎng)度優(yōu)選為8至15個(gè)氨基酸的縮短的肽中。
本發(fā)明還涉及肽的衍生物。這一術(shù)語(yǔ)包括那些其中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸已經(jīng)被化學(xué)反應(yīng)所衍生化了的肽。本發(fā)明的肽衍生物的例子尤其指這些分子，即那些主鏈或/和反應(yīng)性的氨基酸側(cè)基，例如自由氨基、自由羧基或/和自由羥基已經(jīng)被衍生化了的分子。氨基衍生物的具體例子有磺胺類(lèi)或羧酰胺、硫代氨基甲酸乙酯衍生物以及銨鹽，例如氫氯化物。羧基衍生物的例子有鹽類(lèi)、酯類(lèi)和酰胺類(lèi)。羥基衍生物的例子有O-?；騉-烷基衍生物。根據(jù)本發(fā)明，肽的衍生物這一概念還包括這樣一些肽，其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被與20個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸為同系物的天然存在或非天然存在的氨基酸所取代。這些同系物的例子有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥(niǎo)氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。
另外的合適的肽衍生物是肽和輔劑組分之間的絡(luò)合物或共價(jià)鍵，它們與諸如脂類(lèi)的自身抗原被一同給藥。在這種情況下，肽也可以被用作脂肽。
本發(fā)明還包括多肽，其中結(jié)合MHC的肽部位是一個(gè)更大的多肽單元的組分，其中結(jié)合MHC的肽與多肽單元的殘余部分之間的連接處優(yōu)選有一個(gè)事先確定的斷點(diǎn)，例如一個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及肽擬形物，它們與上述的肽或肽的衍生物有基本相同對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親和力。就其與MHC分子的相互作用而言，肽擬形物是可以取代肽的化合物，而且與天然的肽相比，它們有更高的代謝穩(wěn)定性、更好的生物可獲得性和更長(zhǎng)的作用持續(xù)性。制備肽擬形物的方法描述于Giannis和Kolter，Angew.Chem.105(1993)，1303-1326；Lee等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993)，2006-2010以及Dorsch等人，Kontakte(Darmstadt)(1993)(2)，48-56。就本發(fā)明的肽擬形物的制備而言，參考了這些文獻(xiàn)中公開(kāi)的內(nèi)容。
一種更合適的自身反應(yīng)性物質(zhì)是一種復(fù)合物，它包含至少一種肽、肽的衍生物或肽擬形物以及至少一種MHC分子或一種MHC分子的肽結(jié)合衍生物。在這種復(fù)合物中，結(jié)合常數(shù)優(yōu)選為至少10-7l/mol、更優(yōu)選在10-810-9l/mol之間的肽、肽的衍生物或肽擬形物與MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物相結(jié)合。另外，肽、肽的衍生物或肽擬形物也可以通過(guò)光接頭與MHC分子共價(jià)結(jié)合，或者是共價(jià)的遺傳性肽-MHC融合體。這種肽-MHC融合蛋白質(zhì)優(yōu)選含有一種HLA-DRβ鏈以及一種與其遺傳性地融合的自身反應(yīng)性肽。這種復(fù)合物更優(yōu)選地含有II型MHC分子或其肽結(jié)合衍生物。
編碼II型MHC分子的基因的核苷酸序列參見(jiàn)Corell等人(Mol.Immunol.28(199D，533-543)。該文獻(xiàn)被包括在本發(fā)明的內(nèi)容中。
“MHC分子的肽結(jié)合衍生物”這一概念包括MHC分子的片斷，它們是通過(guò)對(duì)天然MHC分子的蛋白水解酶切或通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)制備的，而且它們基本上保持了它們的肽結(jié)合特性。也可以將這一概念理解為包括融合蛋白質(zhì)，其中除了含有負(fù)責(zé)結(jié)合肽的MHC部分外，還含有其它多肽組分。
肽-MHC復(fù)合物的制備優(yōu)選是通過(guò)將不含肽的MHC分子或MHC分子衍生物與本發(fā)明的肽、肽衍生物或肽擬形物相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。舉例來(lái)說(shuō)，不含肽的MHC分子的制備是通過(guò)伸展天然MHC分子以解離結(jié)合的肽并使空MHC分子重折疊而實(shí)現(xiàn)的(參見(jiàn)Dornmair and McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)，4134-4138以及WO91/14701)。其它用于制備肽和MHC分子的復(fù)合物的方法描述于歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)NO.95 100 764.0中。該文獻(xiàn)被包括在本發(fā)明的內(nèi)容中。
本發(fā)明還涉及一種組合物在一種診斷方法中的使用，該組合物包括一種作為活性成分的自身反應(yīng)性物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、肽的衍生物、肽擬形物或/和肽-MHC復(fù)合物，它們選擇性地與佐劑或其它通常的藥物添加劑相組合，該方法包括將這種組合物在皮內(nèi)給藥。該組合物還可以含有一種附加的刺激組分，例如諸如IL-2和IL-4或/和表面抗原B7的細(xì)胞因子(參見(jiàn)Wyss-Coray等人，Eur.J.Immunol.23(1993)，2175-2180；Freeman等人，Science 262(1993)，909-911)，該刺激組分可以結(jié)合在T細(xì)胞的表面分子CD-28之上。這種附加的刺激組分的存在可以改進(jìn)或/和改善該組合物的診斷效果。
另外，在本發(fā)明的方法中進(jìn)行具有陽(yáng)性或/和陰性對(duì)照的附加的檢測(cè)也是優(yōu)選的。例如，可以使用一種不反應(yīng)的多肽，例如人血清白蛋白，或者只含添加劑的制品，例如緩沖液作為陰性對(duì)照。例如，得自培養(yǎng)了瘤細(xì)菌的培養(yǎng)基的純化后的蛋白質(zhì)衍生物(例如購(gòu)自Statens Serum Institute，Copenhagen Denmark)或已知在許多人中可以導(dǎo)致強(qiáng)烈的T細(xì)胞刺激的破傷風(fēng)類(lèi)毒素可以被用作陽(yáng)性對(duì)照抗原。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將自身反應(yīng)性物質(zhì)與一種佐劑一同給藥也是優(yōu)選的。合適的佐劑的例子有氫氧化鋁、不完全弗氏佐劑，磷酸鋁以及適合于與肽連接的脂類(lèi)(脂肽)。
自身反應(yīng)性物質(zhì)可以通過(guò)已知的方法給藥，例如使用具有大小為26G針頭的一般的皮內(nèi)注射器。含有自身反應(yīng)性物質(zhì)的組合物的優(yōu)選的皮內(nèi)給藥劑量為20μl至500μl，更優(yōu)選為50μl至200μl，給藥的合適體位以使所提供的自身抗原最便于達(dá)到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞為準(zhǔn)。例如為診斷IDDM，可將該藥注射進(jìn)前臂(正面)。
在組合物中的自身抗原的濃度可以根據(jù)各種情況下所使用的自身抗原在一個(gè)很寬的范圍內(nèi)變化。1至100μg/ml的濃度，尤其是5至2μg/ml的濃度是優(yōu)選的。
另外，也可以在一臺(tái)裝置中進(jìn)行給藥，該裝置包含一個(gè)用于存儲(chǔ)含有自身反應(yīng)性物質(zhì)的制劑的容器、一個(gè)用于存儲(chǔ)陽(yáng)性對(duì)照制劑的容器以及一個(gè)用于存儲(chǔ)陰性對(duì)照制劑的容器。舉例來(lái)說(shuō)，該裝置可以包含2到10個(gè)用于存儲(chǔ)含有自身反應(yīng)性物質(zhì)的制劑的容器?？梢砸砸环N簡(jiǎn)單的方式使用該裝置以便同時(shí)檢測(cè)許多自身反應(yīng)性物質(zhì)。
本發(fā)明的另一主題是確定一種特異性T細(xì)胞亞群，其中含有T細(xì)胞的樣品與自身反應(yīng)性物質(zhì)相接觸，而該樣品優(yōu)選地得自給藥部位的組織樣品，然后測(cè)定T細(xì)胞與自身反應(yīng)性物質(zhì)的反應(yīng)。舉例來(lái)說(shuō)，T細(xì)胞與自身抗原的特異性反應(yīng)可以通過(guò)T細(xì)胞繁殖的增加來(lái)檢測(cè)到，而繁殖的增加可以通過(guò)放射性的摻入而加以測(cè)量。在另一方面，T細(xì)胞的反應(yīng)也可以通過(guò)使用一種被標(biāo)記了的自身抗原來(lái)直接檢測(cè)，例如該自身抗原與可溶性的MHC分子以復(fù)合物的形式存在。在這一實(shí)施方案中，自身反應(yīng)性物質(zhì)優(yōu)選地是與連接在其上的熒光標(biāo)記基團(tuán)一同使用。舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)FACS分析來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中T細(xì)胞與連接有T細(xì)胞特異抗體的第一個(gè)熒光標(biāo)記物相接觸，然后與連接有第二個(gè)熒光標(biāo)記物的自身抗原相接觸，然后通過(guò)熒光顯影分析法來(lái)確定雙重標(biāo)記細(xì)胞的存在。以這種方式就可以確定一個(gè)T細(xì)胞亞群，其特征就是它與一種自身抗原的反應(yīng)性。該方法還可以選擇性地包括對(duì)預(yù)先活化的T細(xì)胞的選擇，例如通過(guò)與IL-2的培養(yǎng)或/和通過(guò)與IL-2受體抗體的培養(yǎng)、隨后例如使用免疫-磁方法對(duì)抗體結(jié)合細(xì)胞的分離來(lái)選擇性地富集IL-2受體-陽(yáng)性T細(xì)胞。在另一方面，在T細(xì)胞與自身抗原接觸后，可以首先選擇預(yù)先活化的細(xì)胞。
在對(duì)該方法的一個(gè)修正中，還可以確定預(yù)先活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞(具有作為表面標(biāo)記的IL-2受體的T細(xì)胞)與沒(méi)有活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞(沒(méi)有IL-2受體的T細(xì)胞)的比率。
本發(fā)明的另一主題是分離與一種自身抗原反應(yīng)的T細(xì)胞亞群。在該方法中，取自給藥部位的含有T細(xì)胞的組織樣品與一種自身抗原相接觸，然后識(shí)別這些與自身抗原反應(yīng)的T細(xì)胞并選擇性地將它們與其它的T細(xì)胞分離。在這種情況下，在T細(xì)胞與自身抗原接觸之前或/和之后，也可以對(duì)預(yù)先活化的T細(xì)胞，即含有IL-2受體的T細(xì)胞進(jìn)行選擇。在該方法中，舉例來(lái)說(shuō)，可以以下列形式使用自身抗原自身抗原與MHC分子形成的復(fù)合物、自身抗原被固定化在載體上，這就簡(jiǎn)化了將陽(yáng)性反應(yīng)的T細(xì)胞群與其它T細(xì)胞分離的過(guò)程。通過(guò)重新刺激，從以這種方式分離出的T細(xì)胞亞群中可以建立起T細(xì)胞系。然后就可以使用這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞系使病人免疫。
在用于識(shí)別特異性T細(xì)胞亞群的診斷方法中，也可以使用一種抗獨(dú)特型抗體來(lái)代替自身抗原，該抗體模仿了MHC肽復(fù)合物的作用。通過(guò)把對(duì)一個(gè)特定的抗原有特異性的T細(xì)胞亞群用作生產(chǎn)抗體用的免疫源(例如在小鼠中)，或通過(guò)首先產(chǎn)生一種對(duì)抗自身抗原的第一抗體，然后再產(chǎn)生一種對(duì)抗第一抗體的抗獨(dú)特型抗體，就可以很方便地得到上述抗體。
通過(guò)識(shí)別這些在體內(nèi)被激活的T細(xì)胞的產(chǎn)物而不是分離這些T細(xì)胞，也可以識(shí)別特異的T細(xì)胞亞群。這可以通過(guò)收集組織樣品(例如精細(xì)的針吸出物)并測(cè)定其中所含的細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，也可以原位測(cè)定細(xì)胞因子，方法是使用一種長(zhǎng)效藥膏，其中固定化有針對(duì)各種細(xì)胞因子的抗體。通過(guò)一種傳統(tǒng)的固相免疫分析法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子，其中使用了酶底物，它可以產(chǎn)生一種不溶性的有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物可被直接讀取或使用掃描儀讀取。
最后，本發(fā)明涉及一種試劑盒，它用于在體內(nèi)診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或這種病的體質(zhì)，其中包括a)至少一種以可接受的藥物組合物形式存在的自身反應(yīng)性物質(zhì)，b)任選的至少一種以可接受的藥物組合物形式存在的對(duì)照物質(zhì)，c)用于自身反應(yīng)性物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)的皮內(nèi)給藥的裝置，以及d)任選的用于對(duì)檢測(cè)結(jié)果的診斷性評(píng)價(jià)的裝置。
用于自身反應(yīng)性物質(zhì)以及對(duì)照物質(zhì)的組合物中優(yōu)選地含有佐劑并且可選擇性地含有其它普通的藥物載體物質(zhì)、稀釋劑和添加劑。
與圖1和2以及序列SEQ ID NO.1-30相結(jié)合的下述實(shí)施例是為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
圖1顯示得自人GAD 65kd的自身反應(yīng)性氨基酸序列，圖2顯示得自人GAD 65kd的其它自身反應(yīng)性氨基酸序列，SEQ ID NO.1-7顯示得自人GAD(I)-(VII)的自身反應(yīng)性氨基酸序列，SEQ ID NO.8-11顯示得自圖1中的人GAD的自身反應(yīng)性氨基酸序列，SEQ ID NO.12-28顯示得自圖2中的人GAD的自身反應(yīng)性氨基酸序列，SEQ ID NO.29和30顯示得自人GAD(VIII)和(IX)的自身反應(yīng)性氨基酸序列。
實(shí)施例1(對(duì)比例)體外試驗(yàn)從8個(gè)最近感染了IDDM的病人體內(nèi)以及12個(gè)健康人體內(nèi)收集外周靜脈血。通過(guò)Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離外周血淋巴細(xì)胞，然后將其與下述物質(zhì)一起用于體外刺激a)重組人GAD 65kd，作為檢測(cè)抗原；b)純化后的蛋白質(zhì)衍生物(PPD)，作為陽(yáng)性對(duì)照抗原；c)人血清白蛋白(HSA)，作為陰性對(duì)照抗原。
在上述抗原存在或只有培養(yǎng)基存在的條件下，在具有96個(gè)孔的圓底培養(yǎng)器的1個(gè)孔內(nèi)將1×105個(gè)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)在37℃和5％CO2的條件下在100μl的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)五天(RPMI 1640培養(yǎng)基，5％人血清，2mmol/l谷氨酰胺，10U/ml青霉素，10μg/ml鏈霉素和50nmol/l 2-巰基乙醇)。
5天以后，向每一個(gè)孔內(nèi)加入20μl含有0.5μCi 3H胸苷的RPMI 1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，然后收集細(xì)胞。通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)計(jì)量胸苷的摻入。將結(jié)果作為刺激指數(shù)(SI，即用抗原存在時(shí)的cpm除以抗原不存在時(shí)即只有培養(yǎng)基存在時(shí)的cpm)。
得自IDDM病人和對(duì)照組正常人的淋巴細(xì)胞針對(duì)不同的抗原的繁殖反應(yīng)結(jié)果被列于表1和2中。
表1
表2
對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析顯示，使用rhGAD 65kd時(shí)，得自最近診斷的IDDM病人的PBL增殖可以被認(rèn)為是陽(yáng)性的，其SI高于4.7(對(duì)照組正常人的平均值為+2SD)。
因此，在50％的IDDM病人(病人2、3、7和8)中觀察到了針對(duì)rhGAD 65kd的體外T細(xì)胞反應(yīng)。在病人1、2、4和8中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)GAD的抗體，而在病人3和5中沒(méi)發(fā)現(xiàn)。沒(méi)有對(duì)病人6和7的針對(duì)GAD的抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組的正常人對(duì)GAD 65kd無(wú)反應(yīng)。
在對(duì)于作為對(duì)照的HSA和PPD的反應(yīng)中，糖尿病人和對(duì)照組正常人根本沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的明顯差異。
實(shí)施例2體內(nèi)試驗(yàn)將100μl濃度為10μg/ml的rhGAD 65kd皮內(nèi)注射到實(shí)施例1中的八個(gè)IDDM病人的右前臂中。
用含有1％HSA，pH7.3的生理鹽水稀釋抗原。將同樣體積(100μl)的濃度為10μg/ml的HSA注射到右上臂作為陰性對(duì)照。
在18個(gè)IDDM病人中的5個(gè)中以PPD作為陽(yáng)性對(duì)照抗原。在所有病人中都將HSA作為陰性對(duì)照。
在體內(nèi)診斷中，在給藥部位的結(jié)節(jié)的形成(真皮厚度的特異性增加)即被認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。在給藥48小時(shí)之后進(jìn)行診斷。通過(guò)在給藥部位的超聲波測(cè)量來(lái)確定和計(jì)量結(jié)果。沒(méi)有觀察到副作用。
該試驗(yàn)的結(jié)果列于表3中。
表3
在八個(gè)被檢測(cè)的IDDM病人中，有五個(gè)對(duì)rhGAD 65有陽(yáng)性反應(yīng)。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)Boehringer Mannheim GmbH(B)街道Sandhofer Str.112-132(C)城市Mannheim(E)國(guó)家丹麥(F)郵碼(ZIP)68305(ii)發(fā)明名稱(chēng)體內(nèi)糖尿病檢測(cè)(iii)序列數(shù)30(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)數(shù)據(jù)載體軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，version#1.30(EPA)(vi)原始申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)朌E19526561.0(B)申請(qǐng)日20-July-1995(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala Cys Asp1 5 10 15Gly Glu Arg20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO2Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro Glu Val1 5 10 15Lys Glu Lys20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu Met His1 5 10 15Cys Gln Thr20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO4Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro Arg Tyr Phe Asn Gln Leu1 5 10 15Ser Thr Gly20(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO5Pro Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala1 5 10 15Ala Asp Trp20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO6Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys1 5 10 15Lys Met Arg20(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO7Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp1 5 10 15Phe Leu Ile20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO8Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser1 5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO9Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp1 5 10(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO10Leu Ala Phe Leu Gln Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO11Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys1 5 10(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO12Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO13Leu Ala Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met1 5 10(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO14Leu Leu Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly1 5 10(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO15Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala1 5 10(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO16Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg Ser Thr Lys1 5 10(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO17Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly1 5 10(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO19Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro1 5 10(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO20Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu1 5 10(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO21Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp Gly Lys Pro Gln His Thr1 5 l0(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO23Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly1 5 10(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO24Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu1 5 10(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO25Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val1 5 10(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO26Leu Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe1 5 10(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO27Tyr Ile Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu1 5 10(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO28Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe1 5 10(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO29Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His1 5 10 15Phe Ser Leu Lys Lys Gly Ala Ala20 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO30Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu Glu Ala1 5 10 15Lys Gln Lys20
權(quán)利要求
1.用自身反應(yīng)性物質(zhì)產(chǎn)生一種用于診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的體質(zhì)的物質(zhì)的應(yīng)用，其中該物質(zhì)被皮內(nèi)給藥，診斷的根據(jù)是在給藥部位是否出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1的用于診斷自身免疫病或自身免疫病體質(zhì)的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1的用于診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病體質(zhì)的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1至3的應(yīng)用，其中核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、多肽以及它們的復(fù)合物、免疫原性表位、片斷、類(lèi)似物、擬形物或衍生物以及它們的混合物選擇性地以一種載體結(jié)合的形式用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中肽、肽衍生物或肽擬形物選擇性地以與MHC分子或其肽結(jié)合衍生物所形成的復(fù)合物的形式用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)的應(yīng)用，用于診斷糖尿病、多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、巴西多氏病、類(lèi)風(fēng)濕性脊椎炎、急性前眼色素炎、Good-pasture綜合征、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、免疫甲狀腺炎、硬皮病、克羅恩氏病、Siogren綜合征、萊特爾氏綜合癥、腸炎或Graves病。
7.如權(quán)利要求6用來(lái)診斷I型糖尿病(IDDM)的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中谷氨酸脫羧酶(GAD)或它的部分被用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求7或8的應(yīng)用，其中人GAD 65kd被用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中一種或幾種得自GAD的肽或其肽衍生物或肽擬形物選擇性地以與MHC分子或其肽結(jié)合衍生物所形成的復(fù)合物的形式用作自身反應(yīng)性物質(zhì)。
11.如權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中使用了肽或肽衍生物，它們包括(a)氨基酸序列 (I)D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R，(b)氨基酸序列 (II)S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K，(c)氨基酸序列 (III)N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T，(d)氨基酸序列 (IV)T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G，(e)氨基酸序列 (V)P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W，(f)氨基酸序列 (VI)T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R，(g)氨基酸序列 (VII)F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I，(h)氨基酸序列 (VIII)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，(i)氨基酸序列 (IX)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(j)示于圖1或2的氨基酸序列中的一種，(k)長(zhǎng)度至少為6個(gè)氨基酸的示于(a)至(i)中的氨基酸序列的部分區(qū)域，或/如(l)與示于(a)至(j)中的氨基酸序列具有基本相同的對(duì)MHC分子的結(jié)合特異性或/和親和力的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求5、10或11中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中肽或肽衍生物的長(zhǎng)度至少為8個(gè)氨基酸。
13.如權(quán)利要求12中的應(yīng)用，其中肽或肽衍生物的長(zhǎng)度至少為10個(gè)氨基酸。
14.如權(quán)利要求5、10或11中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中肽或肽衍生物的長(zhǎng)度可達(dá)到25個(gè)氨基酸。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中陽(yáng)性反應(yīng)的測(cè)定時(shí)刻至少在給藥的24小時(shí)之后。
16.如權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中，陽(yáng)性反應(yīng)的測(cè)定時(shí)刻在給藥后的24小時(shí)至1周之內(nèi)。
17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中陽(yáng)性反應(yīng)通過(guò)在給藥部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)測(cè)定。
18.如權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中陽(yáng)性反應(yīng)通過(guò)對(duì)給藥部位的視覺(jué)觀察或/和對(duì)相關(guān)皮膚區(qū)域的觸摸來(lái)測(cè)定。
19.如權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中陽(yáng)性反應(yīng)優(yōu)選地通過(guò)超聲波或照相方法定量測(cè)定。
20.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中陽(yáng)性反應(yīng)通過(guò)檢測(cè)在給藥部位由浸潤(rùn)細(xì)胞釋放的物質(zhì)來(lái)測(cè)定。
21.如權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中檢測(cè)細(xì)胞因子。
22.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中用陽(yáng)性或/和陰性對(duì)照進(jìn)行附加的測(cè)定。
23.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中自身反應(yīng)性物質(zhì)與一種佐劑一同給藥。
24.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中給藥在一臺(tái)裝置中進(jìn)行，該裝置包含至少一個(gè)用于存儲(chǔ)自身反應(yīng)性物質(zhì)的制劑的容器、一個(gè)用于存儲(chǔ)陽(yáng)性對(duì)照制劑的容器以及一個(gè)用于存儲(chǔ)陰性對(duì)照制劑的容器。
25.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的應(yīng)用，還包括確定或分離一種特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞亞群，其中將得自給藥部位的組織樣品與一種自身反應(yīng)性物質(zhì)接觸，與自身反應(yīng)性物質(zhì)反應(yīng)的T細(xì)胞被識(shí)別并被選擇性地與其它T細(xì)胞分離。
26.用于在體內(nèi)診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的體質(zhì)的方法，其中自身反應(yīng)性物質(zhì)被皮內(nèi)給藥，診斷的根據(jù)是在給藥部位是否出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
27.用于在體內(nèi)診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或其體質(zhì)的試劑盒，它包括(a)至少一種以可接受的藥物組合物形式存在的自身反應(yīng)性物質(zhì)，(b)可選擇的至少一種以可接受的藥物組合物形式存在的對(duì)照物質(zhì)，(c)用于自身反應(yīng)性物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)的皮內(nèi)給藥的裝置，以及(d)用于診斷性地評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果的可選裝置。
28.如權(quán)利要求27的試劑盒，其中用于自身反應(yīng)性物質(zhì)和對(duì)照物質(zhì)的組合物中含有佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用自身反應(yīng)性物質(zhì)產(chǎn)生一種用于診斷細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的體質(zhì)的物質(zhì)的應(yīng)用,其中該物質(zhì)被皮內(nèi)給藥,診斷的根據(jù)是在給藥部位是否出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1191493SQ96195689
公開(kāi)日1998年8月26日 申請(qǐng)日期1996年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月20日
發(fā)明者J·安德?tīng)? M·甘茲, P·斯塔爾, R·基恩施恩蓋爾, G·G·朱恩格, P·波茲里, F·多尼 申請(qǐng)人:伯倫格曼海姆有限公司