專利名稱：細(xì)胞粘附抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制和防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞粘附媒介的病理的新型化合物。本發(fā)明還涉及包括這些化合物的藥物配制劑和使用它們來抑制和防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞粘附媒介的病理的方法。本發(fā)明的化合物和藥物組合物能夠用作治療或預(yù)防劑。它們特別適合于處理許多炎癥和自身免疫性疾病。
本
背景技術(shù)：
細(xì)胞粘附是細(xì)胞相互粘附、向特定目標(biāo)遷移或定位于細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)地過程。細(xì)胞粘附本身構(gòu)成了眾多生物現(xiàn)象下基本機(jī)理中的一種。例如，細(xì)胞粘附是造血細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞和隨后這些造血細(xì)胞從血管遷出并轉(zhuǎn)移至受傷處的主要原因。細(xì)胞粘附本身導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的病理如炎癥和免疫反應(yīng)。
在分子水平上對(duì)細(xì)胞粘附的研究揭示了各種細(xì)胞-表面大分子--總體上已知為細(xì)胞粘附分子或受體--媒介細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。例如，例如，稱作“整聯(lián)蛋白”的超家族的蛋白質(zhì)是造血細(xì)胞和它們的微環(huán)境之間相互粘附作用的關(guān)鍵媒介劑(M.E.Hemler，“整聯(lián)蛋白家族中的VLA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能和它們對(duì)白細(xì)胞的作用”，Ann.Rev.Immunol.，8，p.365(1990))。整聯(lián)蛋白是由稱作α和β的兩個(gè)亞單位組成的非共價(jià)雜二聚配合物。有至少12種不同的α亞單位(α1-α6，α-L，α-M，α-X，α-IIB，α-V和α-E)和至少9種不同的β(β1-β9)亞單位。以其α和β亞單位組分的類型為基礎(chǔ)，各整聯(lián)蛋白分子被分成亞族。
α4β1整聯(lián)蛋白，也已知為極遲抗原-4(“VLA-4”)或CD49d/CD29，是參與各種細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互粘附作用的白細(xì)胞表面受體(M.E.Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8，p.365(1990))。它用作細(xì)胞因子-誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，血管細(xì)胞粘附分子-1(“VCAM-1”)，以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)纖連蛋白(“FN”)的受體(Ruegg等人，J.Cell Biol.，177，p.179(1991)；Wayner等人，J.Cell Biol.，105，p.1873(1987)；Kramer等人，J.Biol.Chem.，264，p.4684(1989)；Gehlsen等人，Science，24，p.1228(1988))?？?VLA4單克隆抗體(“mAb’s”)已顯示能夠在活體內(nèi)、外抑制VLA4-依賴性相互粘附作用(Ferguson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，88，p.8072(1991))；Ferguson等人，J.Immunol.，150，p.1172(1993))?；铙w內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，VLA-4-依賴性細(xì)胞粘附的這一抑制作用可以防止或抑制多種炎癥和自身免疫性疾病(R.L.Lobb等人，“α4整聯(lián)蛋白在活體內(nèi)的病理生理作用”，J.Clin.Invest.，94，pp.1722-28(1994))。
為了驗(yàn)證為結(jié)合VLA-4所必要的最低活性氨基酸序列，Komoriya等人(“The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-SpecificAdhesion Site(CS1)Within the Alternatively Spliced Type III ConnectingSegment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine”，J.Biol.Chem.，266(23)，pp.15075-79(1991))合成了許多以特殊類型纖連蛋白的CS-1區(qū)(VLA-4結(jié)合域)的氨基酸序列為基礎(chǔ)的重疊肽。他們證實(shí)了8-氨基酸肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr[SEQ ID NO1]，以及兩種較小的重疊五肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val[SEQ ID NO2]和Leu-Asp-Val-Pro-Ser[SEQ ID NO3]，它們具有對(duì)FN-依賴性細(xì)胞粘附的抑制活性。這些結(jié)果表明三肽Leu-Asp-Val為細(xì)胞粘附活性的最小序列。隨后顯示，Leu-Asp-Val僅僅結(jié)合于表達(dá)VLA-4的活化形式的淋巴細(xì)胞，從而使該肽在活體內(nèi)的應(yīng)用成為問題(E.A.Wayner等人“Activation-DependentRecognition by Hematopoietic Cells of the LDV Sequence in the V Regionof Fibronectin”，J.Cell.Biol.，116(2)，pp.489-497(1992))。然而，某些含有LDV序列的較大肽隨后被顯示在活體內(nèi)具有活性[T.A.Ferguson等人，“Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated ImmuneResponses In Vivo”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，pp.8072-76(1991)；和S.M.Wahl等人，“Synthetic Fibronectin Peptides SuppressArthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion andRecruitment”，J.Clin.Invest.，94，pp.655-62(1994)]。
環(huán)狀五肽Arg-Cys-Asp-TPro-Cys(其中TPro表示4-硫代脯氨酸)，它能夠抑制VLA-4和VLA5粘附于FN，已有描述(D.M.Nowlin等人，“ANovel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1和α5β1 Integrin-mediated CellAdhesion(新型環(huán)狀五肽抑制α4β1和α5β1整聯(lián)蛋白媒介的細(xì)胞粘附)”，J.Biol.Chem.，268(27)，pp.20352-59(1993)；和PCT公開PCT/US91/04862)。此肽是以來自FN的三肽序列Arg-Gly-Asp為基礎(chǔ)的，它已知為多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的識(shí)別部位中的共同基序。
盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，仍然需要小的、特定的VLA-4-依賴性細(xì)胞粘附的抑制劑。理想地，此類抑制劑將是半肽或非肽的，這樣它們可以通過口服施用。此類化合物可以提供一種用來治療、防止或抑制由細(xì)胞粘附和VLA-4結(jié)合作用所媒介的各種病理的有用試劑。共同未決US專利申請(qǐng)08/376,372描述了具有細(xì)胞粘附抑制活性的一種含有β-氨基酸的線性肽基化合物。國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/15958和WO92/00995描述了具有細(xì)胞粘附控制活性的環(huán)狀肽和肽模擬化合物。國(guó)際專利申請(qǐng)WO93/08823和WO92/08464描述了含有胍基、脲和硫脲的細(xì)胞粘附控制化合物。US專利5,260,277描述了胍基細(xì)胞粘附控制化合物。
本發(fā)明概述
本發(fā)明通過提供抑制配體結(jié)合于VLA-4的新型半肽化合物解決了這一問題。這些化合物可用于抑制、防止和控制VLA-4-媒介的細(xì)胞粘附和與該粘附有關(guān)的病理，如炎癥和免疫反應(yīng)。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用或與其它治療劑或預(yù)防劑一起使用來抑制、防止或控制細(xì)胞粘附。本發(fā)明還提供了含有這些VLA-4-媒介的細(xì)胞粘附抑制劑的藥物配制劑和使用本發(fā)明的化合物和組合物來抑制細(xì)胞粘附的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，這些新型化合物、組合物和方法可以理想地用來治療炎癥和免疫疾病。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的化合物的方法和用于這些方法中的中間體。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述
在本說明書中使用以下簡(jiǎn)寫符號(hào) 試劑或片段Ac乙?；鵅n芐基Boc 叔丁氧基羰基Bu丁基Cbz 芐氧羰基Cy環(huán)己基CyM 環(huán)己基甲基DIPEA 二異丙基乙基胺EDC 1-(3-二乙基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺HOBT 1-羥基苯并三唑水合物i-amyl異戊基(isoamyl)i-Pn 異戊基(isopentyl)i-Pr 異丙基Me甲基2-MPUBA 4-(N’-(2-甲基苯基)脲)-苯基甲基氨基2-MPUPA 4-(N’-(2-甲基苯基)脲)-苯基乙?；鵑MP N-甲基吡咯烷酮NMM N-甲基嗎啉Ph苯基PUPA 4-(N’-苯基脲)苯基乙酰基Su琥珀酰亞胺基.TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四
氟硼酸鹽TEA 三乙基胺TFA 三氟乙酸THAM 三(羥基)甲基氨基甲烷
定義
這里所使用的術(shù)語“烷基”，單獨(dú)或組合，是指含有1-10個(gè)碳原子、優(yōu)選1-6個(gè)碳原子和更優(yōu)選1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，異戊基，己基，癸基等。
術(shù)語“鏈烯基”，單獨(dú)或組合，是指含有2-10個(gè)碳原子，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子和更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的的直鏈或支鏈鏈烯基。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于，乙烯基，E-和Z-丙烯基，異丙烯基，E-和Z-丁烯基，E-和Z-異丁烯基，E-和Z-戊烯基，癸烯基等。
術(shù)語“炔基”，單獨(dú)或組合，是指含有2-10個(gè)碳原子，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子和更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的的直鏈或支鏈炔基。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于，乙炔基，丙炔基，炔丙基，丁炔基，己炔基，癸炔基等。
術(shù)語“環(huán)烷基”，單獨(dú)或組合，是指含有3-10、優(yōu)選3-8和更優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的環(huán)烷基并可以是可選地被芳基稠合的環(huán)狀烷基。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基等。
術(shù)語“環(huán)烯基”，單獨(dú)或組合，是指含有4-8、優(yōu)選5或6個(gè)碳原子和一個(gè)或多個(gè)雙鍵的環(huán)狀碳環(huán)。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于環(huán)戊烯基，環(huán)己烯基，和環(huán)戊二烯基等。
術(shù)語“芳基”是指選自苯基，萘基，茚基，2，3-二氫化茚基，薁基，芴基，和蒽基的碳環(huán)芳族基；或選自呋喃基，噻吩基，吡啶基，吡咯基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，吡唑基，2-吡唑啉基，吡唑烷基，異噁唑基，異噻唑基，1，2，3-噁二唑基，1，2，3-三唑基，1，3，4-噻二唑基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪基，1，3，5-三嗪基，1，3，5-三噻烷基，中氮茚基，吲哚基，異氮雜茚基，3H-吲哚基，二氫吲哚基，苯并[b]呋喃基，2，3-二氫苯并呋喃基，苯并[b]噻吩基，1H-吲唑基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，4H-喹嗪基，喹啉基，異喹啉基，1，2-二氮雜萘基，2，3-二氮雜萘基，喹唑啉基，喹喔啉基，1，8-二氮雜萘基，蝶啶基，咔唑基，吖啶基，吩嗪基，吩噻嗪基，吩噁嗪基，吡唑并[1，5-c]三嗪基等的雜環(huán)芳族基。
在本申請(qǐng)中所定義的“芳基”、“環(huán)烷基”和“環(huán)烯基”可以獨(dú)立地含有至多三個(gè)取代基，該取代基獨(dú)立地選自鹵素，羥基，氨基，硝基，三氟甲基，三氟甲氧基，烷基，鏈烯基，炔基，氰基，羧基，烷酯基，Ar’-取代的烷基，Ar’-取代的鏈烯基或炔基，1，2-二氧基亞甲基，1，2-二氧基亞乙基，烷氧基，鏈烯氧基或炔氧基，Ar’-取代的烷氧基，Ar’-取代的鏈烯氧基或炔氧基，烷基氨基，鏈烯基氨基或炔基氨基，Ar’-取代的烷基氨基，Ar’-取代的鏈烯基氨基或炔基氨基，Ar’-取代的羰基氧基，烷基羰基氧基，脂族或芳族酰基，Ar’-取代的酰基，Ar’-取代的烷基羰基氧基，Ar’-取代的羰基氨基，Ar’-取代的氨基，Ar’-取代的氧基，Ar’-取代的羰基，烷基羰基氨基，Ar’-取代的烷基羰基氨基，烷氧基羰基氨基，Ar’-取代的烷氧基羰基氨基，Ar’-氧基羰基氨基，烷基磺?；被?，單或雙-(Ar’-磺?；?氨基，Ar’-取代的烷基磺?；被?，嗎啉代羰基氨基，硫代嗎啉代羰基氨基，N-烷基胍基，N-Ar’胍基，N，N-(Ar’，烷基)胍基，N，N-(Ar’，Ar’)胍基，N，N-二烷基胍基，N，N，N-三烷基胍基，N-烷基脲，N，N-二烷基脲，N-Ar’脲，N，N-(Ar’，烷基)脲，N，N-(Ar’)2脲，芳烷基氧基羰基取代的烷基，芳烷基氨基羰基，硫代芳基氧基和類似基團(tuán)；其中“Ar’”的定義與芳基類似，但含有至多三個(gè)選自鹵素，羥基，氨基，硝基，三氟甲基，三氟甲氧基，烷基，鏈烯基，炔基，1，2-二-氧基亞甲基，1，2-二氧基亞乙基，烷氧基，鏈烯氧基，炔氧基，烷基氨基，鏈烯基氨基或炔基氨基，烷基羰基氧基，脂族或芳族?；?，烷基羰基氨基，烷氧基羰基氨基，烷基磺?；被琋-烷基或N，N-二烷基脲的取代基。
術(shù)語“芳烷基”，單獨(dú)或組合，是指芳基取代的烷基，其中術(shù)語“烷基”和“芳基”如上所定義。合適芳烷基的例子包括，但不限于，苯甲基，苯乙基，苯己基，二苯基甲基，吡啶基甲基，四唑基甲基，呋喃基甲基，咪唑基甲基，吲哚基甲基，噻吩基丙基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“烷氧基”，單獨(dú)或組合，是指烷基醚基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義。合適的烷基醚基團(tuán)的例子包括，但不限于，甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“鏈烯氧基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式鏈烯基-O-的基團(tuán)，其中術(shù)語“鏈烯基”如上所定義，只是該基團(tuán)不是烯醇醚。合適的鏈烯氧基基團(tuán)的例子包括，但不限于，烯丙基氧基，E-和Z-3-甲基-2-丙烯氧基等。
術(shù)語“炔氧基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式炔基-O-的基團(tuán)，其中“炔基”如上所定義，只是該基團(tuán)不是炔醇醚。合適的炔氧基的例子包括，但不限于，炔丙氧基，2-丁炔氧基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“硫代烷氧基”是指具有通式烷基-S-的硫醚基團(tuán)，其中烷基如上所定義。
術(shù)語“烷基氨基”，單獨(dú)或組合，是指單-或二-烷基取代的氨基(即，具有通式烷基-NH-或(烷基)2-N-的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義)。合適的烷基氨基的例子包括，但不限于，甲基氨基，乙基氨基，丙基氨基，異丙基氨基，叔丁基氨基，N，N-二乙基氨基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“鏈烯基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式鏈烯基-NH-或(鏈烯基)2N-的基團(tuán)，其中術(shù)語“鏈烯基”如上所定義，只是該基團(tuán)不是烯胺。此類鏈烯基氨基的一個(gè)例子是烯丙基氨基。
術(shù)語“炔基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式炔基-NH-或(炔基)2N-的基團(tuán)，其中術(shù)語“炔基”如上所定義，只是該基團(tuán)不是炔胺。此類基團(tuán)的一個(gè)例子是炔丙基氨基。
術(shù)語“芳基氧基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-O-的基團(tuán)，其中芳基如上所定義。芳氧基的例子包括，但不限于，苯氧基，萘氧基，吡啶氧基等。
術(shù)語“芳基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-NH-的基團(tuán)，其中芳基如上所定義。芳基氨基的例子包括，但不限于，苯基氨基(苯胺基)，萘基氨基，2-、3-和4-吡啶基氨基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“雙芳基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-芳基-的基團(tuán)，其中術(shù)語“芳基”如上所定義。
術(shù)語“硫代芳基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-S-的基團(tuán)，其中術(shù)語“芳基”如上所定義。硫代芳基的例子是硫代苯基。
術(shù)語“芳基稠合的環(huán)烷基”，單獨(dú)或組合，是指與芳基共享兩個(gè)相鄰原子的環(huán)烷基，其中術(shù)語“環(huán)烷基”和“芳基”如上所定義。芳基稠合的環(huán)烷基的例子是苯并稠合的環(huán)丁基。
術(shù)語“脂族?；保瑔为?dú)或組合，是指來自鏈烷、鏈烯或炔羧酸的、具有通式烷基-CO-、鏈烯基-CO-和炔基-CO-的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”、“鏈烯基”和“炔基”如上所定義。此類脂族?；睦影ǎ幌抻?，乙?；?，丙?；?，丁?；?，戊?；?-甲基戊?；；?，丁烯基，丙炔?；谆蝉；取?br> 術(shù)語“芳族?；被颉胺减；?，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-CO-的基團(tuán)，其中術(shù)語“芳基”如上所定義。合適的芳族酰基的例子包括，但不限于，苯甲?；?-鹵素苯甲?；?，4-羧基苯甲酰基，萘?；?，吡啶基羰基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“雜環(huán)酰基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式雜環(huán)-CO-的基團(tuán)，其中術(shù)語“雜環(huán)”如下所定義。合適的雜環(huán)?；睦影ǖ幌抻?，四氫呋喃基羰基，哌啶基羰基，四氫噻吩羰基等。
術(shù)語“嗎啉代羰基”和“硫代嗎啉代羰基”，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合，分別是指N-羰基化嗎啉代和N-羰基化硫代嗎啉代。
術(shù)語“烷基羰基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式烷基-CONH的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義。
術(shù)語“烷氧基羰基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式烷基-OCONH-的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義。
術(shù)語“烷基磺?；被保瑔为?dú)或組合，是指具有通式烷基-SO2NH-的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義。
術(shù)語“芳基磺酰基氨基”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-SO2NH-的基團(tuán)，其中術(shù)語“芳基”如上所定義。
術(shù)語“N-烷基脲”，單獨(dú)或組合，是指具有通式烷基-NH-CO-NH-的基團(tuán)，其中術(shù)語“烷基”如上所定義。
術(shù)語“N-芳基脲”，單獨(dú)或組合，是指具有通式芳基-NH-CO-NH-的基團(tuán)，其中術(shù)語“芳基”如上所定義。
術(shù)語“鹵素”是指氟，氯，溴和碘。
術(shù)語“雜環(huán)”和“雜環(huán)類環(huán)”，單獨(dú)或組合，是指含有至少一個(gè)橋環(huán)N、O或S的非芳族3-至10-員環(huán)。該雜環(huán)可以任意性地被芳基稠合。該雜環(huán)也可以任意性地被一至三個(gè)取代基所取代，該取代基獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，氨基，硝基，三氟甲基，三氟甲氧基，烷基，芳烷基，鏈烯基，炔基，芳基、氰基，羧基，烷酯基，Ar’-取代的烷基，Ar’-取代的鏈烯基或炔基，1，2-二氧基亞甲基，1，2-二氧基亞乙基，烷氧基，鏈烯氧基或炔氧基，Ar’-取代的烷氧基，Ar’-取代的鏈烯氧基或炔氧基，烷基氨基，鏈烯基氨基或炔基氨基，Ar’-取代的烷基氨基，Ar’-取代的鏈烯基氨基或炔基氨基，Ar’-取代的羰基氧基，烷基羰基氧基，脂族或芳族?；珹r’-取代的?；珹r’-取代的烷基羰基氧基，Ar’-取代的羰基氨基，Ar’-取代的氨基，Ar’-取代的氧基，Ar’-取代的羰基，烷基羰基氨基，Ar’-取代的烷基羰基氨基，烷氧基羰基氨基，Ar’-取代的烷氧基羰基氨基，Ar’-氧基羰基氨基，烷基磺酰基氨基，單或雙-(Ar’-磺?；?氨基，Ar’-取代的烷基磺?；被?，嗎啉代羰基氨基，硫代嗎啉代羰基氨基，N-烷基胍基，N-Ar’胍基，N-N-(Ar’，烷基)胍基，N，N-(Ar’，Ar’)胍基，N，N-二烷基胍基，N，N，N-三烷基胍基，N-烷基脲，N，N-二烷基脲，N-Ar’脲，N，N-(Ar’，烷基)脲，N，N-(Ar’)2脲，芳烷基氧基羰基取代的烷基，羧基烷基，氧代，芳基磺酰基和芳烷基氨基羰基。
術(shù)語“離去基團(tuán)”一般是指容易被親核試劑置換的基團(tuán)，如胺，醇或硫醇親核試劑。該離去基團(tuán)是眾所周知的并包括羧化物，N-羥基琥珀酰亞胺，N-羥基苯并三唑，鹵素(鹵化物)，三氟硼酸根(triflate)，甲苯磺酸根，甲磺酸根，烷氧基，硫代烷氧基等。
術(shù)語“疏水性基團(tuán)”是指拒絕結(jié)合或吸附水的基團(tuán)。此類疏水性基團(tuán)的例子包括，但不限于，甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，苯基，芐基，萘基，N-芐基咪唑基，甲基硫代乙基和類似基團(tuán)。
術(shù)語“酸性官能團(tuán)”是指在其中具有酸性氫的基團(tuán)。此類基團(tuán)的例子包括，但不限于，羧酸，四唑，咪唑，羥基，巰基，羥基氨基羰基，磺酸，亞磺酸，磷酸和膦酸。
術(shù)語“適當(dāng)保護(hù)的α-氨基酸的活化衍生物”和“活化的取代的苯基乙酸衍生物”是指其中-OH基被優(yōu)越的離去基團(tuán)置換的羧酸衍生物。活化酸衍生物的例子包括，但不限于，相應(yīng)的酰鹵(例如酰氟，酰氯和酰溴)，相應(yīng)的活化酯(例如硝基苯酯，1-羥基苯并三唑的酯，HOBT，或羥基琥珀酰亞胺的酯，HOSu)，和現(xiàn)有技術(shù)中其它的普通衍生物。
術(shù)語“保護(hù)的”或“保護(hù)基團(tuán)”是指連接于分子的官能團(tuán)的、然后在后面的階段中除去來恢復(fù)原來的官能團(tuán)和分子的一種合適化學(xué)基團(tuán)。各種官能團(tuán)的合適保護(hù)基團(tuán)的例子描述在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，第2版，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis(有機(jī)合成的費(fèi)舍和費(fèi)舍氏試劑)，John Wiley and Sons(1994)；L.Paquette，ed.Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(有機(jī)合成試劑大全)，John Wiley and Sons(1995)。
本發(fā)明的化合物含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此存在外消旋物和外消旋混合物，單對(duì)映體，非對(duì)映異構(gòu)體混合物和各自的非對(duì)映異構(gòu)體。這些化合物的所有此類異構(gòu)體形式都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。各立體構(gòu)型碳原子可以是R或S構(gòu)型。盡管以具體的立體化學(xué)構(gòu)型說明了本發(fā)明中例舉的特定化合物，但具有在任何指定手性中心的相反立體化學(xué)形式或其混合形式的化合物都應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。盡管以具體的構(gòu)型說明了氨基酸和氨基酸側(cè)鏈，但天然和非天然形式都被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。
鑒于上述定義，在本說明書通篇中所使用的化學(xué)術(shù)語都能夠容易被本技術(shù)領(lǐng)域中那些熟練人員所理解。術(shù)語可以單獨(dú)使用或組合使用?；鶊F(tuán)的優(yōu)選和更優(yōu)選鏈長(zhǎng)適用于所有此類組合形式。
本發(fā)明提供一種化合物，它能夠通過抑制配體與受體的結(jié)合來抑制VLA-4-媒介的細(xì)胞粘附。這些化合物由通式(I)表示
Z-(Y1)-(Y2)-(Y3)n-X(I)和其藥物學(xué)上可接受的衍生物；其中
Z選自烷基；任意性被N-烷基-或N-芳基酰氨基取代的脂族?；?；芳酰基；雜環(huán)酰基；烷基-或芳基磺?；?；任意性被芳基取代的芳烷基羰基；雜環(huán)烷基羰基；烷氧基羰基；芳烷基氧基羰基；任意性與芳基稠合的環(huán)烷基羰基；雜環(huán)烷氧基羰基；烷基氨基羰基；任意性被雙(烷基磺?；?氨基、烷氧基羰基氨基或鏈烯基取代的芳基氨基羰基和芳烷基氨基羰基；烷基磺?；环纪榛酋；?；芳基磺酰基；任意性與芳基稠合的環(huán)烷基磺酰基；雜環(huán)磺?；浑s環(huán)烷基磺?；环纪檠趸驶?；芳氧基羰基；環(huán)烷氧基羰基；雜環(huán)基氧基羰基；雜環(huán)基烷氧基羰基；任意性被芳基取代的單-或二-烷基氨基羰基；(烷基)(芳烷基)氨基羰基；單-或二-芳烷基氨基羰基；單-或二-芳基氨基羰基；(芳基)(烷基)氨基羰基；單-或二-環(huán)烷基氨基羰基；雜環(huán)基氨基羰基；雜環(huán)基烷基氨基羰基；(烷基)(雜環(huán)基)氨基羰基；(烷基)(雜環(huán)基烷基)氨基羰基；(芳烷基)(雜環(huán)基)氨基羰基；(芳烷基)(雜環(huán)基烷基)氨基羰基；任意性被芳基取代的鏈烯?；?；任意性被芳基取代的鏈烯基磺?；?；任意性被芳基取代的炔?；蝗我庑员环蓟〈娜不酋；?；環(huán)烯基羰基；環(huán)烯基磺?；画h(huán)烷基鏈烷?；画h(huán)烷基烷基磺?；环蓟减；?，雙芳基磺?；煌檠趸酋；?；芳烷氧基磺?；煌榛被酋；环佳趸酋；?；芳基氨基磺?；?；N-芳基脲取代的鏈烷?；?；N-芳基脲取代的烷基磺?；画h(huán)烯基取代的羰基；環(huán)烯基取代的磺?；蝗我庑员环蓟〈逆溝┭趸驶?；任意性被芳基取代的鏈烯氧基磺酰基；任意性被芳基取代的炔氧基羰基；任意性被芳基取代的炔氧基磺?；?；任意性被芳基取代的鏈烯基-或炔基-氨基羰基；任意性被芳基取代的鏈烯基-或炔基-氨基磺?；货；被〈逆溚轷；?；酰基氨基取代的烷基磺?；话被驶〈逆溚轷；?；氨基甲?；〈逆溚轷；?；氨基甲?；〈耐榛酋；?；雜環(huán)基鏈烷?；浑s環(huán)氨基磺?；?；羧基烷基取代的芳烷?；?；羧基烷基取代的芳烷基磺酰基；氧代碳環(huán)基稠合的芳?；?；氧代碳環(huán)基稠合的芳基磺酰基；雜環(huán)基鏈烷酰基；N’，N’-烷基，芳基肼基羰基；芳氧基取代的鏈烷酰基和雜環(huán)基烷基磺?；?；
Y1是-N(R1)-C(R2)(A1)-C(O)-；
Y2是-N(R1)-C(R2)(A2)-C(O)-；
各Y3由通式-N(R1)-C(R2)(A3)-C(O)-表示；
各R1獨(dú)立地選自氫，烷基，和芳烷基；鏈烯基；炔基；環(huán)烷基；環(huán)烯基；環(huán)烷基烷基；芳基；氨基烷基；單-或二-烷基取代的氨基烷基；單-或二-芳烷基取代的氨基烷基；羥基烷基；烷氧基烷基；巰基烷基；硫代烷氧基烷基；
A1選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)烷基；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代酰基氨基、烷氧基羰基氨基、芳基、環(huán)烷基、羧基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、羥基、羧基烷基氨基羰基、羥基氨基羰基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基；
A2選自酸性官能團(tuán)和任意性被酸性官能團(tuán)、已保護(hù)的酸性官能團(tuán)或芳基取代的烷基；
各A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；芳基；環(huán)烷基；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代?；被⒎蓟?、環(huán)烷基、羧基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、羥基、羧基烷基氨基羰基、羥基氨基羰基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基；
或R1和任何A與它們所連接的原子一起形成3-至6-員環(huán)雜環(huán)；
各R2獨(dú)立地選自氫和烷基；
n是0-8的整數(shù)；和
X選自烷氧基；芳氧基；芳烷基氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基取代的烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；環(huán)烷基烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基；雜環(huán)；和(單-或二-羧酸)取代的烷基胺；雜環(huán)基氨基；雜環(huán)基取代的烷基氨基
其中通式I的化合物明顯地不是N’-羧基甲基-N-(苯基乙?；?L-亮氨?；?L-天冬氨?；?L-苯基丙氨酰基-L-脯氨?；?哌嗪(即，當(dāng)Z＝苯基乙酰基，Y1＝L，Y2＝D，Y3＝F/P，n＝2，和X＝4-羧基甲基哌嗪基)和明顯地不是苯基乙?；?L-亮氨?；?L-天冬氨?；?L-苯基丙氨酰基-D-脯氨酸酰胺(即，當(dāng)Z＝苯基乙?；?，Y1＝L，Y2＝D，Y3＝F/P，n＝2，和X＝NH2)。
“藥物學(xué)上可接受的衍生物”表示本發(fā)明化合物的任何藥物學(xué)上可接受的鹽，酸酯，該酸酯的鹽，酰胺或該酰胺的鹽。本發(fā)明也包括任何其它化合物，經(jīng)施用給病者后它能夠(直接或間接)提供本發(fā)明的化合物(例如前身藥物)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物的代謝物或殘留物，這些代謝物和殘留物有能力抑制、防止或控制細(xì)胞粘附和細(xì)胞粘附媒介的病理。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，A1選自環(huán)烷基；雜環(huán)(當(dāng)A1和R1連在一起)；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代的酰基氨基、芳基、羧基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、烷氧基羰基氨基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基。
更優(yōu)選地，A1選自氨基羰基乙基，芐基，正丁基，異丁基，羧基乙基，環(huán)己基，1-羥基乙基，羥基甲基，巰基甲基，1-甲基丙基，甲基硫代乙基，正丙基，異丙基，甲氧基羰基氨基丁基，6-氨基己?；被』?當(dāng)A1和R1連在一起)氮雜環(huán)丁烷，1-氮雜環(huán)丙烷，吡咯烷，和哌啶。
甚至更優(yōu)選地，A1選自芐基，正丁基，異丁基，甲基硫代乙基，環(huán)己基，1-甲基丙基，正丙基和異丙基。另外優(yōu)選的A1是(當(dāng)A1和R1連在一起)吡咯烷。
在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，A2選自任意性被氨基、氨基羰基、芳基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、羥基氨基羰基、羧基、含有NH的雜環(huán)、羥基或巰基所取代的烷基；任意性被氨基、氨基羰基、羧基、含NH的雜環(huán)、羥基或巰基所取代的芳烷基；和雜環(huán)(當(dāng)A2和R1連在一起)。
更優(yōu)選地，R2選自羧基甲基，2-羧基乙基，1-羧基乙基，羥基氨基羰基甲基，羥基甲基，巰基甲基，咪唑基甲基，N-Bn-咪唑基甲基，苯基，甲酯基甲基，芐酯基甲基，和(當(dāng)A2和R1連在一起)氮雜環(huán)丁烷，1-氮雜環(huán)丙烷，吡咯烷，和哌啶。
甚至更優(yōu)選地，A2選自羧基甲基，2-羧基乙基，1-羧基乙基，羥基氨基羰基甲基，羥基甲基，巰基甲基和咪唑基甲基。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)烷基；和任意性被芳基、環(huán)烷基、羧基、羥基氨基羰基、烷氧基、芳烷氧基、巰基、含N的雜環(huán)、羧基烷基氨基羰基或氨基取代的?；被〈耐榛?。
更優(yōu)選地，A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)己基；和任意性被苯基、環(huán)己基、羧基、羥基氨基羰基、甲氧基、芐氧基、巰基、N-芐基咪唑基、生物素基、四唑基、纈氨酰基-N-羰基或6-氨基己?；被〈耐榛?。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，各Y3獨(dú)立地選自氨基酸和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，Y1是亮氨?；?R1＝H，R2＝H，A1＝i-Bu)；Y2是天冬氨酰基(R1＝H，R2＝H，A2＝羧基甲基)；n＝2；和Y3是纈氨酰基脯氨?；?R1＝H，R2＝H，A3＝i-pr)/(R2＝H，R1與A3＝脯氨酸)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，X選自烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基所取代的單-和二-烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；環(huán)烷基烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基；含N的雜環(huán)；雙羧酸取代的烷基胺和(單或雙羧基)甲基氨基羰基取代的含N雜環(huán)。
更優(yōu)選地，X選自氨基，甲基氨基，異丙基氨基，異丁基氨基，正丁基氨基，叔丁基氨基，異戊基(isoamyl)氨基，異戊基(isopentyl)氨基，己基氨基，環(huán)己基氨基，環(huán)己基甲基氨基，甲基苯基氨基，苯基甲基氨基，苯基氨基，4-甲氧基苯基甲基氨基，二甲基氨基，二異丙基氨基，二異丁基氨基，羥基，甲氧基，正丁氧基，叔丁氧基，芐氧基，2-哌啶羧酸，N’-(α，α′-雙羧甲基)-2-哌啶羧酰胺，N’-羧甲基-2-哌啶羧酰胺，1-羥甲基-2-甲基丙基氨基，1-N’-甲基酰氨基-1-甲基乙基氨基，3，3-二甲基丁基氨基，1-N’-甲基酰氨基丁基氨基，1-酰氨基-2-甲基丁基氨基，1-甲酯基-2-甲基丁基氨基，1-N’-甲基酰氨基-2-甲基丁基氨基，1-羧基-1-苯基甲基氨基，嗎啉代，哌啶基，N-苯基哌嗪基，2-甲基哌啶基，和哌嗪基。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，Z選自脂族?；?，芳?；?，芳烷基羰基，雜環(huán)?；?，烷氧基羰基，芳烷氧基羰基和雜環(huán)烷基羰基。更優(yōu)選，Z是(N-Ar’-脲)-對(duì)位-取代的芳烷基羰基；甚至更優(yōu)選地，Z是(N-Ar’-脲)-對(duì)位-取代的苯基甲基羰基或(N-Ar’-脲)-對(duì)位-取代的吡啶基甲基羰基。甚至更優(yōu)選，Z是(N-鄰位取代的-Ar’脲)-對(duì)位-取代的苯基甲基羰基或(N-間位取代的-Ar’脲)-對(duì)位取代的-苯基甲基羰基。
本發(fā)明的一些特定的優(yōu)選化合物的例子被提供在表1中。
表1
Z-(Y1)-(Y2)-(Y3)n-X(I)其中Y1是-N(R1)-C(R2)(A1)-C(O)-；
Y2是-N(R1)-C(R2)(A2)-C(O)-；
各Y3由通式-N(R1)-C(R2)(A3)-C(O)-表示；
對(duì)于A1，A2和A3，單個(gè)字母代碼是指由該字母表示的對(duì)應(yīng)氨基酸的側(cè)鏈。大寫字母(例如A)表示L-氨基酸，而小寫字母(例如a)表示D-氨基酸。大寫和小寫字母兩者(例如L(l))表示混合物。
除非有相反的指示；在本表中的化合物所具有R1和R2為氫。其中表1中的Het1，Het2，Het3，Het4和Het5被定義如下
更優(yōu)選的通式(I)的化合物是選自表1中列出的化合物No.1，2，4，144，145，146，147，148，206，315，316，317，337，338，345，346，347，357，358和359。甚至更優(yōu)選的通式(I)的化合物是選自表1中列出的化合物No.1，206，316，358和359。最優(yōu)選的通式(I)化合物是選自表1中列出的化合物No.358和359。
本發(fā)明的其它化合物是具有通式II的化合物
K-(Y1)-(Y2)(Y3)n-J(II)和其藥物學(xué)上可接受的衍生物，其中
K選自氫，烷基，脂族?；减；?，芳烷基羰基，雜環(huán)?；酋；纪榛驶?，雜環(huán)烷基羰基，烷氧基羰基，芳烷氧基羰基，雜環(huán)烷氧基羰基，烷基氨基羰基和芳烷基氨基羰基；
J選自烷氧基；芳氧基；芳烷基氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基所取代的烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基和(單-或雙-羧酸)-取代的烷基胺；和
各Y1，Y2，Y3，R1，A1，A2，A3，R2和n獨(dú)立地如以上通式I中所定義。
可以使用任何普通的技術(shù)合成本發(fā)明的化合物。優(yōu)選地，這些化合物是從容易獲得的起始原料如α-氨基酸和它們的官能化等同物由化學(xué)方法合成的。合成這些化合物的模式和收斂方法也是優(yōu)選的。在收斂方法中，例如，在合成的最后階段中將最終產(chǎn)物的大片段連接在一起，而不是向正在增長(zhǎng)的分子鏈中增量引入小片段。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物可以按以下方法合成。被保護(hù)的氨基酸或官能化等同物被偶聯(lián)到適宜的活化的酯結(jié)構(gòu)部分上。偶聯(lián)的產(chǎn)物，如果適當(dāng)?shù)毓倌芑?，可以進(jìn)一步與另一種活化的酯結(jié)構(gòu)部分反應(yīng)。這一物質(zhì)能夠進(jìn)一步加以處理獲得本發(fā)明的所需化合物。在以上順序的各步驟中，酯能夠水解成相應(yīng)的酸得到本發(fā)明的另一化合物。通過標(biāo)準(zhǔn)方法該酸也可以被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸衍生物。
此外，上述活化的酯結(jié)構(gòu)部分能夠首先被連接，然后所得到的化合物能夠連接于另外的氨基酸或它們的官能團(tuán)等同物上。在此時(shí)，能夠進(jìn)行最終的處理和/或必要的去保護(hù)步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在合適的條件下，所需官能度能夠被引入(保護(hù)或去保護(hù))活化的酯結(jié)構(gòu)部分中的一個(gè)中。該酯然后與氨基酸衍生物或由先前偶聯(lián)于活化酯的氨基酸衍生物組成的結(jié)構(gòu)部分發(fā)生偶聯(lián)。所得到的產(chǎn)物然后進(jìn)行任何去保護(hù)步驟(若必要的話)，得到本發(fā)明的化合物。
此外，本發(fā)明的化合物可通過使用固體支持體技術(shù)來合成。使用標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)偶聯(lián)技術(shù)在樹脂上組裝核心氨基酸或它們的官能化等同基團(tuán)。當(dāng)所需核心完成時(shí)，所得到的片段能夠與活化的酯結(jié)構(gòu)部分偶聯(lián)和/或該片段的系留端可以進(jìn)一步衍生化得到所需產(chǎn)物。在該合成順序的任何時(shí)間可以使用合適的保護(hù)/去保護(hù)方法。
本發(fā)明的化合物也可以通過附加合適的官能團(tuán)增強(qiáng)選擇性生物性能來改性。此類改性在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的并包括這樣一些方法，它們可提高生物穿透入給定的生物系統(tǒng)(例如血液，淋巴系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng))中的能力，增加口服施用性，提高溶解度以實(shí)施注射施藥，改變代謝機(jī)理和改變排泄速度。這些改性的例子包括，但不限于，用聚乙二醇酯化，用三甲基乙酸酯(pivolates)或脂肪酸取代物衍生化，轉(zhuǎn)化成氨基甲酸酯，芳環(huán)的羥基化，和芳族環(huán)上雜原子取代。
在整個(gè)申請(qǐng)中所使用的術(shù)語“患者”是指哺乳動(dòng)物，包括人。術(shù)語“細(xì)胞”是指哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人體細(xì)胞。
一旦合成，根據(jù)本發(fā)明的化合物的活性和VLA-4特異性能夠使用活體內(nèi)、外分析來測(cè)定。
例如，通過測(cè)定為阻斷VLA-4-表達(dá)細(xì)胞與纖連蛋白-或CS1-涂敷的板的結(jié)合所需要的抑制劑的濃度來測(cè)量這些化合物的細(xì)胞粘附抑制活性。在該分析方法中，微量滴定孔(well)用纖連蛋白(含有CS-1序列)或CS-1涂敷。如果使用CS-1，它必須共軛到載體蛋白質(zhì)上，如牛血清白蛋白，為的是結(jié)合于孔上。一旦孔被涂敷，然后將變化濃度的試驗(yàn)化合物與適當(dāng)標(biāo)記的VLA-4-表達(dá)細(xì)胞一起添加。此外，可以首先添加試驗(yàn)化合物，然后在添加細(xì)胞之前與已被涂敷的孔一起培養(yǎng)。讓細(xì)胞在孔中培養(yǎng)至少30分鐘。在培養(yǎng)后，傾空孔并加以洗滌。對(duì)于各種濃度試驗(yàn)化合物的每一種濃度，以及對(duì)于不合試驗(yàn)化合物的對(duì)照物，通過定量被結(jié)合于板的熒光或放射性來測(cè)量結(jié)合的抑制作用。
在該分析中可以使用的VLA-4-表達(dá)細(xì)胞包括Ramos細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞，A375黑素瘤細(xì)胞，以及人外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)。在該分析所使用的細(xì)胞可以是熒光或放射性標(biāo)記的。
直接結(jié)合分析也可以用來定量本發(fā)明化合物的抑制活性。在該分析中，一種VCAM-IgG融合蛋白質(zhì)(它含有被連接在IgGl分子(“VCAM2D-IgG”)的鉸接區(qū)上的VCAM的前兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(D1D2))被共軛到標(biāo)記酶上，如堿性磷酸酶(“AP”)。這一VCAM-IgG融合體的合成描述在PCT公開WO90/13300，其公開內(nèi)容被引入本文供參考。該融合體與標(biāo)記酶的共軛連接是通過現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的交聯(lián)方法實(shí)現(xiàn)的。
然后將VCAM-IgG酶共軛體放入多孔過濾板的各孔內(nèi)，如含于Millipore Multiscreen Assay System(多孔多篩分析系統(tǒng))(Millipore Corp.，Bedford，MA)中的。然后將不同濃度的試驗(yàn)抑制化合物加入到孔中，隨后添加VLA-4-表達(dá)細(xì)胞。細(xì)胞，化合物和VCAM-IgG酶共軛體被混合在一起并在室溫下培養(yǎng)。
在培養(yǎng)之后，將各孔抽真空，留下孔和任何結(jié)合的VCAM。結(jié)合VCAM的定量是通過添加被共軛于VCAM-IgG的酶的合適比色底物并測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的量來測(cè)定的。減少的反應(yīng)產(chǎn)物表明增加的結(jié)合抑制活性。
為了分析本發(fā)明化合物的VLA-4抑制特異性，對(duì)其它主要類型的整聯(lián)蛋白即β2和β3，以及其它β1整聯(lián)蛋白如VLA-5、VLA-6和α4β7進(jìn)行分析。這些分析類似于上述粘附抑制和直接的結(jié)合分析，取代該合適的整聯(lián)蛋白-表達(dá)細(xì)胞和相應(yīng)的配體。例如，多形核細(xì)胞(PMNs)在它們的表面上表達(dá)β2整聯(lián)蛋白并結(jié)合于ICAM。在血小板聚集中包括β3整聯(lián)蛋白，在標(biāo)準(zhǔn)血小板聚集分析方法中測(cè)量抑制作用。VLA-5專門結(jié)合于Arg-Gly-Asp序列，而VLA-6結(jié)合于層粘連蛋白。最近發(fā)現(xiàn)α4β7是VLA-4的類似物，它也結(jié)合纖連蛋白和VCAM。在一結(jié)合分析方法中測(cè)定對(duì)于α4β7的特異性，該分析方法利用了上述VCAM-IgG-酶標(biāo)記共軛體和表達(dá)α4β7、但非VLA-4的細(xì)胞系如RPMI-8866細(xì)胞。
一旦VLA-4-特異性抑制劑被確認(rèn)，它們進(jìn)一步在活體內(nèi)分析中被鑒定。一種這樣的分析是測(cè)試哺乳動(dòng)物體內(nèi)接觸過敏性的抑制，如這方面的描述有P.L.Chisholm等人“Monoclonal Antibodies to the Integrin α-4Subunit Inhibit the Murine Contact Hypersensitivity Response(整聯(lián)蛋白α-4小單元的單克隆抗體抑制鼠接觸過敏性反應(yīng))”，Eur.J.Immunol.，23，PP.682-688(1993)和“Current Protocols in Immunology”(免疫學(xué)概論)”，J.E.Coligan等人編，John Wiley & Sons(紐約)出版，1，pp.4.2.1-4.2.5(1991)，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容被引入本文供參考。在該分析中，動(dòng)物的皮膚通過暴露于刺激物如二硝基氟代苯致敏，隨后用輕的物理刺激如用尖刺輕輕地劃皮膚。在恢復(fù)期過后，該動(dòng)物按照同樣的方法進(jìn)行再敏感化。在致敏幾天后，將動(dòng)物的一只耳朵暴露于化學(xué)刺激物，而另一只耳朵用非刺激物對(duì)照溶液處理。在耳朵處理不久后，通過皮下注射為動(dòng)物施用給定各種劑量的VLA-4抑制劑。通過測(cè)量處理/未處理耳朵中動(dòng)物的耳朵膨脹反應(yīng)來分析與細(xì)胞粘附有關(guān)的炎癥的活體內(nèi)抑制作用。使用卡尺或其它合適的儀器測(cè)量耳朵厚度來測(cè)量膨脹情況。按這種方式，能夠確認(rèn)最適合于抑制炎癥的本發(fā)明的那些抑制劑。
另一種用來測(cè)試本發(fā)明的抑制劑的活體內(nèi)分析是羊氣喘分析。該分析基本上是按W.M.Abraham等人“α-Integrins Mediate Antigen-inducedLate Bronchial Responses and Prolonged Airway Hyperresponsiveness inSheep”，J.Clin.Invest.(臨床研究期刊)，93，pp.776-87(1994)所述來進(jìn)行，其公開內(nèi)容被引入本文供參考。該分析測(cè)量了在氣喘羊體內(nèi)蛔蟲抗原-誘發(fā)的后期氣管反應(yīng)和氣管反應(yīng)性過度的抑制。
本發(fā)明的化合物能夠以一種從無機(jī)或有機(jī)酸和堿衍生而來的藥物學(xué)上可接受的鹽形式使用。包括在該酸鹽內(nèi)的是以下這些乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙烷磺酸鹽，富馬酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙烷磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲烷磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，pamoate，果膠酯酸鹽，過硫酸鹽，3-苯基-丙酸鹽，苦味酸鹽，新戊酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫代氰酸鹽，甲苯磺酸鹽，和十一烷酸鹽。堿的鹽包括銨鹽，堿金屬鹽，如鈉和鉀鹽，堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽，有機(jī)堿的鹽，如二環(huán)己基胺鹽，N-甲基-D-葡糖胺，三(羥基甲基)甲基胺和氨基酸如精氨酸、賴氨酸等的鹽。同樣，堿性含氮基團(tuán)能夠用試劑加以季銨化，此類試劑比如是低級(jí)烷基鹵化物類，如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯類，如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯，長(zhǎng)鏈鹵化物類如癸基、月桂基、十四烷基和硬脂酰的氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基鹵化物，如芐基和苯乙基的溴化物等等。從而獲得水或油可溶或可分散的產(chǎn)物。
本發(fā)明的化合物可以配制成藥物組合物，它可以通過口服施用，腸胃外施用，通過噴射吸入，局部施用，直腸施用，鼻部施用，頰部施用，陰道施用或經(jīng)由植入藥包施用。這里所使用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下，靜脈，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜腔內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，肝內(nèi)，病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明的任何化合物，或其藥物學(xué)上可接受的衍生物，連同任何藥物學(xué)上可接受的載體。這里所使用的術(shù)語“載體”包括可接受的輔助劑和媒介劑。在本發(fā)明的藥物組合物中可使用的藥物學(xué)上可接受的載體包括，但不限于，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，鹽類或電解質(zhì)類，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯基吡咯烷酮，纖維素基物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯(鹽)，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可以是無菌的可注射制劑形式，例如無菌的可注射水或油懸浮液?？梢愿鶕?jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)使用合適的分散或潤(rùn)濕劑和懸浮劑來配制該懸浮液。該無菌可注射制劑也可以是在非毒性腸胃外-可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的媒介劑和溶劑當(dāng)中能夠使用的是水，Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。還有，無菌、固定油是平常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，任何清淡固定油都可以使用，包括合成的單-或二酸-甘油酯。脂肪酸，如油酸和其甘油酯衍生物可用于注射劑的制備，與天然的藥物學(xué)上可接受的油一樣，如橄欖油或蓖麻油，尤其為它們的聚氧乙烯化變體形式。這些油溶液或懸浮液也可含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，如PH.Helv或類似醇。
本發(fā)明的藥物組合物能夠以任何口服可接受的劑量形式來口服，這些形式包括、但不限于膠囊劑、片劑、含水懸浮液或溶液。對(duì)于口服施用的片劑，常常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂也是一般使用的。對(duì)于膠囊劑形式的口服，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當(dāng)為口服施用需要含水懸浮液時(shí)，活性成分與乳化劑和懸浮劑混合。若需要，還可以使用某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
此外，本發(fā)明的藥物組合物能夠以直腸施用的栓劑形式施用。這些是通過將藥劑和合適的非刺激性賦形劑混合來制備，這些賦形劑在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體，從而在直腸中熔化釋放出藥物。此類原料包括可可脂，蜂蠟和聚乙二醇。
本發(fā)明的藥物組合物還可以局部施用，尤其當(dāng)被處理目標(biāo)包括局部施用容易到達(dá)的區(qū)域或組織，包括眼病、皮膚病或下部腸道病。比較容易制備供這些區(qū)域或組織用的合適的局部配制劑。
下部腸道的局部施用能夠以直腸栓劑配制劑(參見以上內(nèi)容)或以合適的灌腸配制劑形式來進(jìn)行。也可以使用局部-經(jīng)皮貼片。
對(duì)于局部施用，該藥物組合物可以被配制成在一種或多種載體中含有被懸浮或溶解的活性組分的合適膏劑。用于本發(fā)明化合物的局部施用的載體包括，但不限于，礦物油，液體礦脂，白色礦脂，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蠟和水。此外，該藥物組合物能夠被配制成在一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體中含有被懸浮或溶解的活性組分的合適洗劑或乳膏。合適的載體包括、但不限于礦物油，脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，聚乙氧基醚60，十六烷基酯蠟，cetearyl醇，2-辛基十二烷醇，芐基醇和水。
對(duì)于眼部施用，藥物組合物可以被配制成在等滲的、PH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的微?；瘧腋∫海?，優(yōu)選地，配制成在等滲的、PH調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的溶液，有或沒有防腐劑如氯化芐基烷翁(benzylalkoniumchloride)。此外，對(duì)于眼部施用，藥物組合物可以被配制成膏劑如礦脂劑。
本發(fā)明的藥物組合物也可以通過鼻用氣霧劑或通過使用噴霧器、干粉吸入器或計(jì)量劑量吸入器吸入來施用。此類組合物可根據(jù)藥物配制劑技術(shù)中眾所周知的技術(shù)來制備并可以配制成在鹽水中的溶液，使用芐基醇或其它合適的防腐劑，增強(qiáng)生物利用率的吸收促進(jìn)劑，碳氟化合物，和/或其它普通的增溶劑或分散劑。
與載體物質(zhì)混合來生產(chǎn)單個(gè)劑量形式的活性成分的量將根據(jù)被治療的主體和使用的具體形式來變化。然而，應(yīng)該理解，任何具體的患者的特定劑量和治療方式取決于各種因素，包括所使用的特定化合物的活性，年齡，體重，健康狀況，性別，飲食，施用時(shí)間，排泄速度，藥物組合，以及治療醫(yī)生的判斷和被治療疾病的嚴(yán)重程度?；钚猿煞值牧恳踩Q于治療劑或預(yù)防劑，即使有也很少，與該成分一起施用。
有效防止、控制或抑制細(xì)胞粘附的本發(fā)明化合物的劑量和劑量率將取決于許多因素，如抑制劑的性質(zhì)，患者的大小，治療的目標(biāo)，被治療的病理的性質(zhì)，所使用的特定藥物組合物，和治療醫(yī)生的判斷。約0.001至約100mg/kg體重/天，優(yōu)選約0.1至約10mg/kg體重/天的劑量水平的活性成分化合物是有用的。
根據(jù)另一實(shí)施方案含有本發(fā)明化合物的組合物還包括附加的試劑，該試劑選自皮質(zhì)類固醇，支氣管擴(kuò)張藥，止喘藥(肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑)，抗炎藥，抗風(fēng)濕藥，免疫抑制劑，抗代謝物，免疫調(diào)節(jié)劑，治牛皮癬藥和抗糖尿病藥。在這些類別的每一種中特定的化合物可以選自在“ComprehensiveMedicinal Chemistry”，Pergamon Press，Oxford，England，pp.970-986(1990)(其公開內(nèi)容被引入本文供參考)中以合適的分組標(biāo)題列出的任何那些化合物。也包括在該組中的是諸如茶堿、柳氮磺胺吡啶和氨基水楊酸鹽(抗炎藥)；環(huán)孢菌素、FK-506和雷怕霉素(免疫抑制劑)；環(huán)磷酰胺和氨甲蝶呤(抗代謝物)；和干擾素(免疫調(diào)節(jié)劑)的化合物。
根據(jù)其它實(shí)施方案，本發(fā)明提供了防止、抑制或控制與細(xì)胞粘附有關(guān)的炎癥和與細(xì)胞粘附有關(guān)的免疫或自身免疫反應(yīng)。VLA4-相關(guān)的細(xì)胞粘附對(duì)各種炎癥、免疫和自身免疫疾病起著中心作用。因此，本發(fā)明化合物對(duì)細(xì)胞粘附的抑制可以用于治療或防止炎癥、免疫和自身免疫性疾病的方法中。優(yōu)選地，用本發(fā)明的方法治療的疾病選自氣喘、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、移植排斥、多發(fā)性硬化病、糖尿病和炎癥性腸病。
這些方法可在單獨(dú)治療中或在結(jié)合有抗炎藥或免疫抑制劑的結(jié)合療法中使用本發(fā)明的化合物。結(jié)合療法包括在同一時(shí)間或在不同時(shí)間以單劑量形式使用該藥劑或以多劑量形式使用。
為了更充分地理解本發(fā)明，給出下面的實(shí)施例。這些實(shí)施例的目的是僅僅用來說明，絕不能認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
在溶液中形成酰胺鍵的一般方法
方法A與EDC/HOBt的偶聯(lián)
羧酸(1.2當(dāng)量)在DMF中的溶液在0℃下用HOBT(1.8當(dāng)量)和EDC(1.4當(dāng)量)處理。混合物在0℃下被攪拌1-2小時(shí)，然后添加游離胺(1.0當(dāng)量，用TEA或DIPEA中和)。在RT下攪拌3小時(shí)以上后，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋，用水(1x)，5％含水檸檬酸(2x)，飽和NaHCO3(2x)和鹽水(1x)洗滌，干燥(硫酸鈉或硫酸鎂)，真空濃縮。
方法B使用活化酯(N-羥基琥珀酸酯或氯化物)的偶聯(lián)
游離胺(1-1.2當(dāng)量，用TEA或DIPEA中和)在CH2Cl2中的溶液用活化酯或酰鹵(1當(dāng)量)在0℃下或RT下處理。在RT下攪拌1小時(shí)后，反應(yīng)混合物用5％檸檬酸水溶液(2x)、飽和碳酸氫鈉(2x)和鹽水(1x)洗滌，干燥(硫酸鈉或硫酸鎂)，和真空濃縮。
在溶液中形成脲的一般方法
方法C用異氰酸酯和胺形成脲。
胺(1當(dāng)量)和TEA(1當(dāng)量)在二氯甲烷中的溶液用異氰酸酯(1當(dāng)量)處理和在RT下攪拌0.5小時(shí)。在真空濃縮后，產(chǎn)物直接使用或通過色譜分離加以提純。
在溶液中去保護(hù)的一般方法
方法D用TFA除去BOC
tBuOC(O)NH-R(其中R是任意性被任何數(shù)目的合適官能團(tuán)取代的烷基)在二氯甲烷中的溶液在0℃下用三氟乙酸處理。反應(yīng)液升溫至RT(室溫)并攪拌1-2小時(shí)。在真空濃縮后，所得到的胺/TFA鹽在使用之前被貯存和用TEA或DIPEA中和。
方法E用HCl除去BOC
tBuOC(O)NH-R(其中R是任意性被任何數(shù)目的合適官能團(tuán)取代的烷基)在二噁烷中的溶液在0℃下用4N HCl(在二噁烷中)處理。反應(yīng)液升溫至RT(室溫)并攪拌1-2小時(shí)。在真空濃縮后，所得到的胺/HCl鹽在使用之前被貯存和用TEA或DIPEA中和。
方法F氫化
起始原料和10％Pd/C在甲醇，水，乙酸乙酯和/或DMF中的混合物在氫氣氣氛(40-50psi)下、在RT下被劇烈攪拌2小時(shí)以上。所得到的混合物通過一柱塞的硅藻土(Celite)過濾，真空濃縮濾液。
在固體支持體上形成酰胺鍵的一般方法
方法G用DCC/HOBt的偶聯(lián)
樹脂(參見以下的樹脂MCB1的制備)，tBuOC(O)NH-AAx-CO2H(其中AA是氨基酸或官能等同物)或R1-CO2H(10當(dāng)量)，HOBt(10當(dāng)量)，DCC(10當(dāng)量)和N-甲基嗎啉(3當(dāng)量)在NMP中的混合物在RT下被振蕩0.5小時(shí)。樹脂然后用NMP(2x)和二氯甲烷(3x)洗滌。
方法H用胺從樹脂中置換
樹脂和胺(xs)在DMF中的混合物在RT下被振蕩6小時(shí)。樹脂然后用甲醇(3x)洗滌，合并的溶液進(jìn)行真空濃縮。
在固體支持體上去保護(hù)的一般方法
方法I用TFA/CH2Cl2除去BOC
樹脂和50％TFA/CH2Cl2的混合物在RT下被振蕩0.5小時(shí)。樹脂用二氯甲烷(2x)、異丙醇(1x)和二氯甲烷(3x)洗滌。
方法J使用清除劑的HF處理
在-10℃-0℃下和在作為清除劑的茴香醚或硫代茴香醚的存在下用HF處理被保護(hù)的產(chǎn)物1.5小時(shí)。在0℃下用氮?dú)饬鞒F。
實(shí)施例1
普通中間體的合成
琥珀酰亞胺3-異喹啉羧酸鹽(iOn-OSu)
3-異喹啉羧酸(1.2當(dāng)量)在DMF中的溶液在0℃下用EDC(1.4當(dāng)量)處理。混合物在0℃下被攪拌1-2小時(shí)，然后添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.0當(dāng)量)。在RT下攪拌3小時(shí)以上，反應(yīng)混合物被傾入60％飽和碳酸氫鈉中然后過濾產(chǎn)物1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)9.35(s，1H)，8.67(s，1H)，8.09(m，1H)，7.96(m，1H)，7.82(m，2H)，2.94(s，4H)。
琥珀酰亞胺2-喹啉羧酸鹽(On-OSu)
2-喹啉羧酸(1.2當(dāng)量)在DMF中的溶液在0℃下用EDC(1.4當(dāng)量)處理?；旌衔镌?℃下被攪拌1-2小時(shí)，然后添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.0當(dāng)量)。在RT攪拌3小時(shí)以上后，反應(yīng)混合物被傾入60％飽和碳酸氫鈉中，過濾產(chǎn)物1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)8.35(d，1H)，8.27(d，1H)，8.19(d，1H)，7.87(d，1H)，7.80(m，1H)，7.68(m，1H)，2.91(s，4H)。
4-異氰酸基苯基乙酸甲酯(KC1)
對(duì)-氨基苯基乙酸甲酯(9.8g，59.4mmol)在二氯甲烷(200mL)和TEA(25mL，18g，178.2mmol)中的充分?jǐn)嚢璧睦鋮s溶液用COCl2(96mL的在甲苯中的1.9M溶液)處理1小時(shí)。反應(yīng)混合物在0℃下被另外攪拌1小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物和添加3∶1乙醚/石油醚(125mL)。過濾混合物，濾液被濃縮得到棕色液體形式的KC1。通過蒸餾提純粗產(chǎn)物(118-120℃/1.0mm)，獲得無色液體形式的純KC1(8.5g，75％)1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)7.20(d，J＝8.4Hz)，7.02(d，J＝8.4Hz)，3.69(s，3H)，3.48(s，2H)。
4-苯基脲基苯基乙酸
使用方法C，用4-氨基-苯基乙酸和異氰酸苯基酯制備4-苯基脲基苯基乙酸1H NMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)8.72-8.64(m，2H)，7.44(d，2H)，7.36(d，2H)，7.28(d，2H)，7.16(d，2H)，6.96(t，1H)，3.52(s，2H)；m/z 272。
4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸
使用方法C，用4-氨基-苯基乙酸和異氰酸鄰-甲苯基酯制備4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸1H NMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)8.97(s，1H)，7.88(s，1H)，7.83(d，1H)，7.38(d，2H)，7.17-7.09(m，4H)，6.92(t，1H)，3.48(s，2H)，2.23(s，3H)；m/z 285。
4-(2-氟苯基)脲基苯基乙酸
使用方法C，用2-氟苯胺和KC1制備4-(2-氟苯基)脲基苯基乙酸1HNMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)9.00(s，1H)，8.51(d，2.4Hz，1H)，8.14(dd，8.3Hz，1.5Hz，1H)，7.37(d，8.5Hz，2H)，7.07-7.25(m，4H)，6.99(m，1H)，3.48(s，2H)。
4-(2-羥基苯基脲基)苯基乙酸
使用方法C，用2-羥基苯胺和KC1制備4-(2-羥基苯基脲基)苯基乙酸1H NMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)9.90(s，1H)，9.25(s，1H)，8.12(s，1H)，8.02(bd，1H)，7.37(d，2H)，7.13(d，2H)，6.70-6.97(m，3H)，3.48(s，2H)。
N-琥珀酰亞胺4-(2-(3-甲基吡啶基脲基)苯基乙酸鹽
按照以下方法在三個(gè)步驟中制備
使用方法C，用2-氨基-3-甲基吡啶和KC1，得到4-(2-(3-甲基吡啶基脲基)苯基乙酸甲酯。
4-(2-(3-甲基吡啶基脲基)苯基乙酸甲酯(1當(dāng)量)在甲醇中的溶液用1N氫氧化鈉(2當(dāng)量)處理。反應(yīng)被攪拌16小時(shí)，然后小心地用1N HCl酸化至PH7，然后用乙酸酸化至PH3。過濾產(chǎn)物并用甲醇洗滌，然后用乙醚洗滌，得到4-(2-(3-甲基吡啶基脲基)苯基乙酸1H NMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)11.97(s，1H)，8.64(brs，1H)，8.31(s，1H)，7.69(m，1H)，7.62(d，8.4Hz，2H)，7.33(d，8.4Hz，2H)，7.09(m，1H)，3.62(s，2H)，2.38(s，3H)；m/z 286。
4-(2-(3-甲基吡啶基脲基)苯基乙酸(1當(dāng)量)，N-羥基琥珀酰亞胺(1.2當(dāng)量)和EDC(1.2當(dāng)量)在DMF中的溶液用TEA調(diào)節(jié)至堿性(PH10)。在RT下攪拌12小時(shí)后，將反應(yīng)液傾入60％飽和碳酸氫鈉中并過濾產(chǎn)物1HNMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)12.04(s，1H)，8.84(s，1H)，8.31(s，1H)，7.72(m，3H)，7.42(m，2H)，7.10(m，1H)，4.18(s，2H)，2.98(3，4H)，2.38(s，3H)；m/z 383。
N-琥珀酰亞胺4-(2-吡啶基脲基)苯基乙酸鹽
按照以下方法在三個(gè)步驟中制備
使用方法C，用2-氨基-吡啶和KC1，得到4-(2-吡啶基脲基)苯基乙酸甲酯。1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)8.20(s，2H)，7.62-7.51(m，3H)，7.33(d，2H)，7.01(d，2H)，6.89-6.85(m，1H)，3.70(s，3H)，3.59(s，2H)。
4-(2-吡啶基脲基)苯基乙酸甲酯(5.7g，20.0mmol)在甲醇(20mL)中的溶液用1N氫氧化鈉(40mL)處理。反應(yīng)被攪拌16小時(shí)，然后小心地用1N HCl酸化至PH7，然后用乙酸酸化至PH3。過濾產(chǎn)物并用甲醇洗滌，然后用乙醚洗滌，得到白色粉末形式的4-(2-吡啶基)脲基苯基乙酸(4.7g，87％)1HNMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)10.62(bs，1H)，9.53(bs，1H)，8.39(d，1H)，7.82(t，1H)，7.63-7.55(m，1H)，7.33-7.27(d，2H)，7.14-7.08(m，1H)，3.62(s，3H)。
4-(2-吡啶基)脲基苯基乙酸(1當(dāng)量)，N-羥基琥珀酰亞胺(1.2當(dāng)量)和EDC(1.2當(dāng)量)在DMF中的溶液用TEA調(diào)節(jié)至堿性(PH10)。在RT下攪拌12小時(shí)后，將反應(yīng)液傾入60％飽和碳酸氫鈉中，過濾產(chǎn)物1HNMR(CD3SOCD3，300MHz，ppm)10.08(s，1H)，9.57(s，1H)，8.39(m，1H)，7.86(m，1H)，7.62(m，3H)，7.38(d，2H)，7.12(m，1H)，4.15(s，2H)，2.91(s，4H)；m/z 369。
3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸
按照以下方法在六個(gè)步驟中從3-甲氧基-4-硝基苯甲酸制備
3-甲氧基-4-硝基苯甲酸(2.01g，10.2mmol)和亞硫酰二氯(2.3mL，31.5mmol)的混合物在80-90℃下攪拌1.5小時(shí)。濃縮反應(yīng)液，殘留物用乙醚稀釋。有機(jī)溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2x)，水，然后飽和氯化鈉水溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)，并加以濃縮獲得3-甲氧基-4-硝基苯甲酰氯(1.92g，87％)，白色固體1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)7.95-7.70(m，3H)，4.06(s，3H)。
TMSCHN2(在己烷中濃度2M，1.5mL，3.0mmol)和三乙基胺(420μl，3.0mmol)的冷(0℃)溶液用3-甲氧基-4-硝基苯甲酰氯(0.52g，2.4mmol)在乙腈(8.5mL)中的溶液處理。反應(yīng)在0℃下被攪拌24小時(shí)，然后濃縮。殘留物與飽和碳酸氫鈉水溶液一起被制成淤漿，混合物用乙醚萃取(3x)。合并的乙醚洗滌液用水洗滌，然后用飽和氯化鈉水溶液洗滌，干燥(MgSO4)和濃縮，獲得ω-重氮基-3-甲氧基-4-硝基苯乙酮(0.53g，100％)，白色泡沫1HNMR(CDCl3，300MHz，ppm)7.88(d，10Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.27(d，10Hz，1H)，5.97(s，1H)，4.02(s，3H)。
ω-重氮基-3-甲氧基-4-硝基苯乙酮(7.95g，35.9mmol)在t-BuOH(100mL)中的回流溶液用苯甲酸銀(2.50g，10.9mmol)在三乙胺(15mL)中的過濾溶液經(jīng)1小時(shí)滴加進(jìn)去進(jìn)行處理。在回流45分鐘后，添加脫色用的炭，通過硅藻土(Celite)墊過濾熱的混合物。濃縮濾液，殘留物用乙酸乙酯稀釋。有機(jī)溶液用5％碳酸氫鈉水溶液(2x)，水，5％檸檬酸水溶液，水，然后飽和氯化鈉水溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)和濃縮，獲得3-甲氧基-4-硝基苯基乙酸叔丁基酯(8.92g，93％)，棕色油1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)7.83(d，8.3 H2，1H)，7.03(s，1H)，6.93(d，8.3Hz，1H)，3.97(s，3H)，3.58(s，2H)，1.45(s，9H).
3-甲氧基-4-硝基苯基乙酸叔丁基酯(0.144g，0.539mmol)和10％Pd/C(0.155g)在乙酸乙酯(8mL)和甲醇(2mL)中的混合物在H2(40-60psi)下攪拌2小時(shí)。混合物通過Celite過濾，濃縮濾液，獲得淺黃色油形式的4-氨基-3-甲氧基苯基乙酸叔丁基酯(0.123g，96％)1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)6.70(m，3H)，4.04(bs，2H)，3.84(s，3H)，3.42(s，2H)，1.43(s，9H).
使用方法C，用4-氨基-3-甲氧基苯基乙酸叔丁基酯和異氰酸苯基酯，得到3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸叔丁基酯1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)8.00(d，11 Hz，1H)7.65-6.94(m，7H)，6.80(d，9.0Hz，1H)，6.74(s，1H)，3.68(s，3H)，3.45(s，2H)，1.44(s，9H).
3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸叔丁基酯(0.108g，0.303mmol)在三氟乙酸(5.0mL)中的溶液被攪拌30分鐘。濃縮反應(yīng)液，殘留物與二氯甲烷(2x)一起共蒸發(fā)，然后與乙醚共蒸發(fā)，獲得3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸(0.090g，99％)，為白色泡沫1H NMR(CD3SOCD3，300 MHz，ppm)9.28(s，1H)，8.18(s，1H)，8.02(d，7.5Hz，1H)，7.58-7.15(m，5H)，6.91(bm，2H)，6.77(d，7.5Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.49(s，2H).
N-琥珀酰亞胺3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸鹽
3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸(1當(dāng)量)在DMF中的溶液在0℃下用EDC(1.1當(dāng)量)處理?；旌衔镌?℃下被攪拌1-2小時(shí)，然后添加N-羥基琥珀酰亞胺(1.1當(dāng)量)。在RT下攪拌3小時(shí)以上后，將反應(yīng)混合物傾入60％飽和碳酸氫鈉水溶液中，過濾出N-琥珀酰亞胺3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸鹽。
N-琥珀酰亞胺6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸鹽
按照以下方法在六個(gè)步驟中從2，6-二氯-3-硝基吡啶制備
2，6-二氯-3-硝基吡啶(92％，9.9g，47mmol)和碳酸鉀粉末(6.5g，47mmol)在甲醇(100mL)中的淤漿在RT下被攪拌一星期。過濾反應(yīng)液和濃縮。殘留物被分配在乙酸乙酯和60％飽和碳酸氫鈉水溶液中。有機(jī)溶液用60％飽和碳酸氫鈉水溶液(2x)，水，然后飽和氯化鈉水溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)和濃縮，獲得2-氯-6-甲氧基-5-硝基吡啶和2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶(8.9g，100％)為淺黃色固體
1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)8.31(d，8.3 Hz，1H)，8.28(d，8.9 Hz，1H)，7.10(d，8.3 Hz，1H)，6.82(d，8.9Hz，1H)，4.15(s，3H)，4.06(s，3H).
2-氯-6-甲氧基-5-硝基吡啶和2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶(8.9g，47mmol)，丙二酸叔丁基甲基酯(10mL，60mmol)，和NaH(95％，3.1g，120mmol)在THF(250mL)中的混合物在RT下被攪拌24小時(shí)。濃縮反應(yīng)液，殘留物用三氟乙酸(200mL)處理2小時(shí)。濃縮反應(yīng)液，通過快速色譜分離(硅膠，95∶5己烷-乙酸乙酯)分離出產(chǎn)物，獲得6-(2-甲氧基-3-硝基)吡啶基乙酸甲酯(3.3g，62％)為黃色油1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)8.27(d，8.0 Hz，1H)，7.04(d，8.0 Hz，1H)，4.09(s，3H)，3.85(s，2H)，3.75(s，3H).
6-(2-甲氧基-3-硝基)吡啶基乙酸甲酯(0.047g，0.21mmol)和10％Pd/C(0.063g)在乙酸乙酯(2mL)和乙醇(1mL)中的混合物在H2(40-50psi)下攪拌6小時(shí)?；旌衔锿ㄟ^硅藻土(Celite)過濾，濃縮濾液，獲得6-(2-甲氧基-3-氨基)吡啶基乙酸甲酯(0.041g，100％)，淺黃色油1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)6.82(d，7.6 Hz，1H)，6.65(d，7.6 Hz，1H)，3.94(s，3H)，3.70(s，3H)，3.65(s，2H).
使用方法C，用6-(2-甲氧基-3-氨基)吡啶基乙酸甲酯和異氰酸鄰-甲苯基酯，得到6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸甲酯1H NMR
(CDCl3，300 MHz，ppm)8.33(d，7.9 Hz，1H)，7.51(d，7.8 Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.17(m，2H)，7.08(m，2H)，6.77(d，7.9 Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.71(s，3H)，3.67(s，2H)，2.20(s，3H).
6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸甲酯(0.023g，0.070mmol)在甲醇(1.0mL)中的溶液用2MLiOH(90μL，0.18mmol)處理。反應(yīng)液被攪拌18小時(shí)，用水(5.0mL)稀釋，用乙醚洗滌(2x)。水溶液用5％檸檬酸水溶液酸化。過濾產(chǎn)物，用水洗滌，然后用乙醚洗滌，得到白色固體形式的6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸(0.014g，64％)1H NMR(CD3OD，300 MHz，ppm)8.50-8.25(m，3H)，7.60(bd，1H)，7.28-7.00(m，3H)，4.01(s，3H)，3.69(s，2H)，2.30(s，3H)；MS，m/2 316.
6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸(1.61g，5.10mmol)在DMF中的溶液在0℃下用EDC(1.00g，5.2mmol)處理?；旌衔镌?℃下被攪拌1-2小時(shí)，然后添加N-羥基琥珀酰亞胺(0.60g，5.2mmol)。在RT下攪拌3小時(shí)以上后，將反應(yīng)混合物傾入60％飽和碳酸氫鈉水溶液中，過濾出N-琥珀酰亞胺6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸鹽。
H-LD(OBn)V-NHCH3
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和甲基胺)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D來制備H-LD(OBn)V-NHCH3。
H-LD(OBn)V-OCH3
通過順序使用方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu和H-Val-OMe)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D來制備H-LD(OBn)V-OCH3。
H-LD(OBn)V-OBn
通過順序使用方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu和H-Val-OBn)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D來制備H-LD(OBn)V-OBn。
H-LD(OBn)VP-OBn
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和H-Pro-OBn)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D，來制備H-LD(OBn)VP-OBn。
H-LD(OBn)VP-OMe
通過順序使用方法A(用BOC-Val-OH和H-Pro-OMe)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D，來制備H-LD(OBn)VP-OMe。
H-LDVP-OH
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和H-Pro-OBn)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，方法F，然后方法D，來制備H-LDVP-OH。
H-MD(OBn)VP-OBn
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和H-Pro-OBn)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Met-OSu)，然后方法D，來制備H-MD(OBn)VP-OBn。
H-LD(OBn)VP-NH2
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和H-Pro-NH2)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，然后方法D，來制備H-LD(OBn)VP-NH2。
樹脂(MBC1)
根據(jù)文獻(xiàn)中的方法來合成改性樹脂MBC1(0.437mmol/g)(參見Richter，L.S.，等人，Tetrahedron Lett.35，p.5547(1994))。MBC1用50TFA/CH2Cl2和三乙基硅烷在RT下處理2小時(shí)，然后在使用前用CH2Cl2(2x)，異丙醇(1x)和CH2Cl2(3x)洗滌。
MBC2
通過順序使用方法G(用BOC-Asp(OBn)-OH)，方法I，方法G(用BOC-Leu-OH)，方法I，然后方法G(用4-苯基脲基苯基乙酸)，來制備MBC2。
MBC3
通過順序使用方法G(用BOC-Val-OH)，方法I，方法G(用BOC-Asp(OBn)-OH)，方法I，然后方法G(用BOC-Leu-OH)，方法I，方法G(用4-苯基脲基苯基乙酸)，來制備MBC3。
MBC4
通過順序使用方法G(用BOC-Pro-OH)，方法I，方法G(用BOC-Val-OH)，方法I，然后方法G(用BOC-Asp(OBn)-OH)，方法I，方法G(用BOC-Leu-OH)，方法I，然后方法G(用4-苯基脲基苯基乙酸)，來制備MBC4。
實(shí)施例2
化合物77
通過使用方法A(用吡啶甲酸和H-LD(OBn)V-OBn)，然后方法F制備化合物77。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 451。
實(shí)施例3
化合物64
通過使用方法A(用氫化肉桂酸和H-LD(OBn)V-OBn)，然后方法F制備化合物64。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 478。
實(shí)施例4
化合物155
通過使用方法B(用4-苯基丁酰氯和H-LD(OBn)V-OBn)，然后方法F制備化合物155。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 492。
實(shí)施例5
化合物157
通過使用方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu和異丁基胺)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，方法D，方法B(用iQn-OSu)，然后方法F，制備化合物157。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 457。
實(shí)施例6
化合物164
通過使用方法B(用Qn-OSu和H-LD(OBn)V-NHCH3)，然后方法F制備化合物164。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 514。
實(shí)施例7
化合物174
通過使用方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu和纈氨酸醇)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，方法D，方法B(用Qn-OSu)，然后方法F，制備化合物174。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 487。
實(shí)施例8
化合物177
通過使用方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu和H-Thr-OCH3)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，方法D，方法B(用4-甲氧基苯磺酰氯)，然后方法F，制備化合物177。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 532。
實(shí)施例9
化合物180
通過順序使用方法B(用BOC-Val-OSu和甲基胺)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-N-MeLeu-OSu)，方法D，方法B(用苯基乙酰氯)，然后方法F，制備化合物180。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 491。
實(shí)施例10
化合物189
通過使用方法B(用BOC-Val-OSu和甲基胺)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(BOC-Leu-OSu)，方法D，方法B(用苯基磺酰氯)，然后方法F，制備化合物189。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z499。
實(shí)施例11
化合物345
通過使用方法A(用4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)V-OBn)，然后方法F制備化合物345。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z 606。
實(shí)施例12
化合物206
通過使用方法A(用4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物206。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z709。
實(shí)施例13
化合物144
通過使用方法A(用4-(2-羥基苯基脲基)苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物144。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z711，24.6分鐘(梯度8)。
實(shí)施例14
化合物145
通過使用方法A(用4-苯基脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物145。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z695，26.8分鐘(梯度8)。
實(shí)施例15
化合物146
通過使用方法A(用4-(2-羥基苯基脲基)苯基乙酸和H-MD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物146。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z729，22.4分鐘(梯度8)。
實(shí)施例16
化合物1
通過使用方法A(用3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物1。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z725，28.5分鐘(梯度8)。
實(shí)施例17
化合物2
通過使用方法A(用3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸和H-MD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物2。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z743，27.0分鐘(梯度8)。
實(shí)施例18
化合物315
通過使用方法A(用4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸和H-MD(OBn)VP-OBn)，然后方法F制備化合物315。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z727。
實(shí)施例19
化合物346
通過使用方法B(用N-羥基琥珀酰亞胺4-(2-(3-甲基吡啶基-脲基))苯基乙酸鹽和H-LDVP-OH)制備化合物346。通過HPLC提純得到化合物346m/z710。
實(shí)施例20
化合物316
通過使用方法B(用N-羥基琥珀酰亞胺4-(2-吡啶基-脲基)苯基乙酸鹽和H-LDVP-OH)制備化合物316。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z696。
實(shí)施例21
化合物4
通過使用方法B(用N-羥基琥珀酰亞胺6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸鹽和H-LDVP-OH)制備化合物4。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z740，30.7分鐘(梯度8)。
實(shí)施例22
化合物147
通過使用方法B(用N-羥基琥珀酰亞胺3-甲氧基-4-苯基脲基苯基乙酸鹽和H-LD(OBn)VP-NH2)，然后方法F制備化合物147。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z724，26.7分鐘(梯度8)。
實(shí)施例23
化合物148
通過使用方法A(用4-鄰-甲苯基脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-NH2)，然后方法F，制備化合物148。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z708，26.0分鐘(梯度8)。
實(shí)施例24
化合物317
通過使用方法B(用N-羥基琥珀酰亞胺6-(2-甲氧基-3-鄰-甲苯基脲基)吡啶基乙酸鹽和H-LD(OBn)VP-NH2)，然后方法F，制備化合物317。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z739，28.0分鐘(梯度8)。
實(shí)施例25
化合物336
通過使用方法A(用4-(2-氟苯基)脲基苯基乙酸和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F，制備化合物336。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z713。
實(shí)施例26
化合物32
通過使用方法B(用iQn-OSu和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F，制備化合物32。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z598，24.7min(梯度8)。
實(shí)施例27
化合物34
通過使用方法B(用苯基乙酰氯和H-LD(OBn)VP-OBn)，然后方法F，制備化合物34。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z561，23.7min(梯度8)。
實(shí)施例28
化合物39
通過使用方法A(用3-(4-羥基苯基)丙酸和H-LD(OBn)VP-OMe)，然后方法F，制備化合物39。通過HPLC提純得到化合物39m/z591，21.5min(梯度8)。
實(shí)施例29
化合物42
通過順序使用方法A(用BOC-Val-OH和H-homoPro-OBn)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-OSu)，方法D，方法B(苯基乙酰氯)，然后方法F，制備化合物42。通過HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z575，26.4min(梯度8)。
實(shí)施例30
化合物52
通過順序使用方法A(用BOC-norVal-OH和甲基胺)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-Osu)，方法D，方法B(用Qn-OSu)，然后方法F，來制備化合物52。由HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z518，30.2分鐘(梯度8)。
實(shí)施例31
化合物46
通過順序使用方法A(用BOC-Val-OH和甲基胺)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法A(用BOC-N-MeLeu-OH)，方法D，方法A(用3-(4-羥基苯基)丙酸)，然后方法F，來制備化合物46。由HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z521，18.7分鐘(梯度8)。
實(shí)施例32
化合物61
通過順序使用方法B(用BOC-Thr-OSu和嗎啉)，方法D，方法B(用BOC-Asp(OBn)-OSu)，方法D，方法B(用BOC-Leu-Osu)，方法D，方法B(用Qn-OSu)，然后方法F，來制備化合物61。由HPLC提純得到標(biāo)題化合物m/z572，24.0分鐘(梯度8)。
實(shí)施例33
化合物213
通過使用用MBC2和芐基胺的方法H，然后使用方法J來制備化合物213m/z588。
實(shí)施例34
化合物214
通過使用用MBC2和嗎啉的方法H，然后使用方法J來制備化合物214m/z568。
實(shí)施例35
化合物215
通過使用用MBC2和異丙基胺的方法H，然后使用方法J來制備化合物215m/z540。
實(shí)施例36
化合物216
通過使用用MBC2和環(huán)己基胺的方法H，然后使用方法J來制備化合物216m/z580。
實(shí)施例37
化合物217
通過使用用MBC2和異丁基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物217m/z554。
實(shí)施例38
化合物218
通過使用用MBC2和哌啶的方法H和然后使用方法J來制備化合物218m/z566。
實(shí)施例39
化合物318
通過使用用MBC3和嗎啉的方法H和然后使用方法J來制備化合物318m/z667。
實(shí)施例40
化合物319
通過使用用MBC3和異丙基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物319m/z640。
實(shí)施例41
化合物320
通過使用用MBC3和環(huán)己基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物320m/z679。
實(shí)施例42
化合物321
通過使用用MBC3和芐基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物321m/z687。
實(shí)施例43
化合物322
通過使用用MBC3和哌啶的方法H和然后使用方法J來制備化合物322m/z665。
實(shí)施例44
化合物323
通過使用用MBC3和異丁基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物323m/z653。
實(shí)施例45
化合物324
通過使用用MBC4和環(huán)己基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物324m/z777。
實(shí)施例46
化合物325
通過使用用MBC4和哌啶的方法H和然后使用方法J來制備化合物325m/z763。
實(shí)施例47
化合物326
通過使用用MBC4和芐基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物326m/z785。
實(shí)施例48
化合物327
通過使用用MBC4和異丙基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合物327m/z736。
實(shí)施例49
化合物328
通過使用用MBC4和異丁基胺的方法H和然后使用方法J來制備化合防328m/z750。
實(shí)施例50
化合物363
A.鄰-甲苯基脲基苯基乙酸(3.53g，12.4mmol)，H-Leu-OtBu·HCl(2.78g，12.4mmol)，TBTU(3.98g，12.4mmol)，和iPr2NEt(4.32mL，24.8mmol)在DMF(25mL)中的混合物在RT下被攪拌一夜。通過添加水(10mL)來沉淀產(chǎn)物。通過在中級(jí)玻璃碎料上過濾，用2∶1的DMF/H2O(35mL)、H2O(25mL)和乙醚(2×25mL)洗滌，然后在過濾器上干燥來收集固體物(4.18g，74％)。將所有的產(chǎn)物懸浮在CH2Cl2(16mL)中，用TFA(16mL)處理和在RT下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)物濃縮成漿，從CH2Cl2(2×20mL)中蒸發(fā)。殘留物與乙醚(100mL)一起在RT下研磨2小時(shí)。通過在中級(jí)玻璃碎料上過濾，用乙醚(50mL)洗滌和在過濾器上干燥來收集固體物(3.40g，93％)MS(FAB)398。
B.DCC(0.206g，1.0mmol)和HOBT(0.135g，1.0mmol)在EtOAc(6mL)中的混合物在RT下被攪拌20分鐘直至均勻?yàn)橹?。添加Fmoc-Asp-OtBu(0.411g，1.0mmol)，胡椒基胺(0.12mL，1.0mmol)，和N-甲基嗎啉(0.22mL，2.0mmol)。在攪拌一夜后，過濾反應(yīng)液分離出固體物，濾餅用新鮮EtOAc(10mL)洗滌。濾液用H2O(2x)、5％檸檬酸(1x)、5％碳酸氫鈉(1x)和鹽水(1x)洗滌，然后干燥(用硫酸鎂)。在SiO2上快速色譜柱分離，用100％CHCl3-2％MeOH/CHCl3洗脫，得到0.54g(100％)的固體形式的純產(chǎn)物mp＝128-130℃；TLC(2％MeOH/CHCl3)Rf＝0.10；Ms(FAB)545；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)7.75-7.72(m，2H，7.59-7.56(m，2H)，7.40-7.34(m，2H)，7.30-7.25(m，2H)，6.71-6.66(m，3H)，6.13-6.10(m，2H)，5.84(s，2H)，4.46(m，1H)，4.38-4.16(m，5H)，2.86(dd，1H，J＝4.7，15.6Hz)，2.72(dd，1H，J＝4.16，15.6 Hz)，1.45(s，9H).
C.來自實(shí)施例50B的產(chǎn)物(0.25g，0.46mmol)，哌啶(0.45mL，4.6mmol)，和CH2Cl2(0.45mL)在RT下攪拌90分鐘。反應(yīng)混合物被蒸發(fā)成固體殘留物。使用MeOH/EtOAc梯度在SiO2上進(jìn)行快速色譜柱分離，得到無色油狀產(chǎn)物(0.138g，93％)Ms(FAB)323；TLC(10％MeOH/EtOAc)Rf＝0.15；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)7.63(brs，1H)，6.75-6.68(m，3H)，5.90(s，2H)，4.34(dd，1H，J＝5.7，14.7Hz)，4.28(dd，1H，J＝5.7，14.7Hz)，3.65(dd，1H，J＝3.4，9.3Hz)，2.62(dd，1H，J＝3.4，15.7Hz)，2.38(dd，1H，J＝9.3，15.7Hz)，1.74(s，2H)，1.42(s，9H).
D.來自實(shí)施例50C的產(chǎn)物(2.55g，7.91mmol)和Eschenmoser氏鹽(1.61g，8.70mmol)在MeCN(80mL)中在惰性氣氛下回流42小時(shí)。反應(yīng)被冷卻至RT和蒸發(fā)至干。殘留物用5％碳酸氫鈉稀釋和用EtOAc(3x)萃取。合并的有機(jī)萃取液用5％碳酸氫鈉(1x)，H2O(1x)和鹽水(1x)洗滌，和干燥(用硫酸鎂)。粗產(chǎn)物溶于乙醚(250mL)中并通過SiO2的短墊層，用乙醚洗脫，然后用EtOAc洗脫。如此獲得的稍顯不純的產(chǎn)物進(jìn)一步與冰冷乙醚一起(30mL)研磨來提純并通過過濾收集，得到白色固體(0.904g，34％)
mp＝121-123℃；TLC(10％MeOH/CHCl3)R＝0.59；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)6.75-6.66(m，3H)，5.92(s，2H)，4.66(A of AB，1H，J＝14.7Hz)，4.23(B of AB，1H，J＝14.7 Hz)，4.15(ABq，2H，J＝11.9 Hz)，3.68(dd，dd，1H，J＝5.2，10.9 Hz)，2.72(dd，1H，J＝5.2，17.3 Hz)，2.41(dd，1H，J＝10.9，17.3 Hz)，1.45(s，9H)；C，H，N for C1-H22N2O5，theory--C61.07，H6.63，N8.38，found--C60.80，H6.59，N8.22.
E.來自實(shí)施例50D的產(chǎn)物(0.50g，1.5mmol)，來自實(shí)施例50A的產(chǎn)物(0.596g，1.5mmol)，和EDC(0.314g，1.64mmol)在NMP(3mL)中在RT下被攪拌48小時(shí)。將反應(yīng)物傾入EtOAc(60mL)，用H2O(8×6mL)，鹽水(1x)洗滌和干燥(用硫酸鎂)。在SiO2上快速色譜柱分離，用100％CHCl3-30％EtOAc/CHCl3洗脫，得到淺黃色油形式的產(chǎn)物(0.94g，88％)MS(FAB)714；TLC(10％ MeOH/CHCl3)Rf＝0.40；1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
F.來自實(shí)施例50E的產(chǎn)物(0.94g，1.32mmol)在TFA(10mL)中在RT下被攪拌3小時(shí)。反應(yīng)物被濃縮至干，從CH2Cl2(3×10mL)中蒸發(fā)出殘留物。粗產(chǎn)物與乙醚一起在RT下研磨，通過過濾收集并在過濾器上干燥(0.733g，84％)MS(FAB)658(M+H)，680(M+Na)；TLC(5％ HOAc/EtOAc)Rf＝0.15；1H NMR(d6-DMSO，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
實(shí)施例51
化合物364
A.按照與實(shí)施例50B相同的方式，F(xiàn)moc-Asp-OtBu(8.23g，20.0mmol)與H-Gly-OBn.HCl(4.03g，20.0mmol)反應(yīng)。在SiO2上快速色譜柱分離，用EtOAc/己烷梯度，得到蠟狀固體形式的產(chǎn)物(9.8g，88％)
MS(FAB)559；TLC(10％MeOH/CHCl3)Rf＝0.71；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)7.73(d，2H，J＝7.5 Hz)，7.59(d，2H，J＝7.4 Hz)，7.40-7.26(m，9H)，6.44(br s，1H)，6.09(d，1H，J＝8.3 Hz)，5.13(s，2H)，4.52-4.49(m，1H)，4.41-4.29(m，2H)，4.21(t，1H，J＝7.1 Hz)，4.04(d，2H，J＝5.2 Hz)，2.95(dd，1H，J＝4.6，15.7 Hz)，2.79(dd，1H，J＝4.3，15.7 Hz)，1.46(s，9H).
B.按照與實(shí)施例50C中相同的方式將來自實(shí)施例51A的產(chǎn)物(9.8g，17.54mmol)去保護(hù)。通過SiO2的墊層過濾，用100％EtOAc、隨后用5％MeOH/CHCl3，得到油形式的產(chǎn)物(4.24g，72％)MS(FAB)337；TLC(3％ MeOH/EtOAc)R＝0.15；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)8.00(t，1H，J＝5.4 Hz，7.30-7.21(m，5H)，5.07(s，2H)，3.98(AB of ABX，2H，J＝5.4，18.1 Hz)，3.60(dd，1H，J＝3.4，9.2 Hz)，2.60(dd，1H，J＝3.4，5.4 Hz)，2.38(dd，1H，J＝9.2，15.4 Hz)，1.79(br s，2H)，1.36(s，9H).
C.按照與實(shí)施例50D中相同的方式將來自實(shí)施例51B(4.24g，12.60mmol)的產(chǎn)物環(huán)化。使用EtOAc/CHCl3梯度進(jìn)行快速色譜柱分離，得到漿狀產(chǎn)物(1.4g，32％)MS(FAB)349；TLC(1∶1 EtOAc/CHCl3)Rf＝0.53；1H NMR(CDCl3，300 MHz，ppm)7.35-7.25(m，5H)，5.11(s，2H)，4.21(A of AB，1H，J＝17.5 Hz)，3.95(B of AB，1H，J＝17.5 Hz)，3.71(dd，1H，J＝5.1，11.2 Hz)，2.68(dd，1H，J＝5.1，17.2 Hz)，2.36(dd，1H，J＝11.2，17.2 Hz)，1.43(s，9H).
D.使用實(shí)施例50E的方法，實(shí)施例51C的產(chǎn)物(1.40g，4.02mmol)與實(shí)施例50A的產(chǎn)物偶聯(lián)。使用CHCl3/EtOAc梯度進(jìn)行快速色譜柱分離，得到脆的淺黃色泡沫形式的產(chǎn)物(2.21g，76％)MS(FAB)728；TLC(1∶1 CHCl3/EtOAc)Rf＝0.28；1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
E.按實(shí)施例50F中所述將實(shí)施例51D的產(chǎn)物(0.15g，0.21mmol)去保護(hù)和提純。獲得近乎白色固體形式的產(chǎn)物(0.127g，90％)MS(FAB)672(M+H)，695(M+Na)；TLC(9∶1∶0.1 CHCl3/MeOH/AcOH)Rf＝0.54；1H NMR(d6-DMSO，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
實(shí)施例52
化合物365
A.來自實(shí)施例51E的產(chǎn)物(0.100g，0.15mmol)，4-甲氧基芐基胺(20μl，0.15mmol)，和TBTU(0.0482g，0.15mmol)在NMP(0.3mL)中的混合物用iPrNEt(78μl，0.45mmol)處理。在RT下攪拌一夜后，反應(yīng)液用EtOAc(10mL)稀釋，用水(5×2mL)、5％檸檬酸(2×2mL)、5％碳酸氫鈉(2×2mL)和鹽水(1×2mL)洗滌，然后干燥(用硫酸鎂)。通過SO2的短墊層過濾，用2％MeOH/CHCl3、隨后用4％ MeOH/CHCl3洗脫，得到泡沫形式的產(chǎn)物(0.087g，73％)MS(FAB)792；TLC(9∶1 CHCl3/MeOH)Rf＝0.41；1HNMR(CDCl3，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
B.實(shí)施例52A的產(chǎn)物(0.087g，0.11mmol)和Degussa型E101NE/W10％Pd/C(0.017g)在MeOH(10mL)中的懸浮液在25psi H2下被氫化18小時(shí)。反應(yīng)液通過硅藻土(Celite)過濾，用甲醇漂洗。濾液被蒸發(fā)至干。殘留物與乙醚一起研磨和通過過濾收集米色固體(36.1mg，47％)MS(FAB)701(M+H)，723(M+Na)；1H NMR(d6-DMSO，300MHz，ppm)與非對(duì)映體的結(jié)構(gòu)和指示一致。
實(shí)施例53
抑制VLA4-依賴性粘附于BSA-CS1
該分析方法用來評(píng)估針對(duì)VLA4的本發(fā)明抑制化合物的潛力。
1.CS1與BSA的共軛
我們將BSA-SMCC(Pierce Chemical，Rockford，IL；Catalog#77115)以10mg/mL的濃度溶解在水中。[SEQ ID NO.4]Cys-Tyr-Asp-Glu-Leu-Pro-Gln-Leu-Val-Thr-Leu-Pro-His-Pro-Asn-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr(“Cys-Tyr-CS1肽”)，它通過常規(guī)的固相化學(xué)方法合成并通過HPLC提純，也以10mg/mL的濃度被溶解于10mMHEPES PH5、50mM NaCl和0.1mM EDTA中。然后混合500μl BSA-SMCC、250μl Cys-Tyr-CS1肽和75μl的1mM HEPES PH7.5，并讓共軛反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。通過添加1μl的β-巰基乙醇來終止反應(yīng)。通過SDS-PAGE分析樣品被交聯(lián)的情況。該反應(yīng)產(chǎn)生Cys-Tyr-CS1肽的多個(gè)分子與各BSA分子的共軛。
2.粘附分析用的板的制備
用100μL已在0.05M碳酸氫鈉(15mM碳酸氫鈉，35mM碳酸鈉)中稀釋至1μg/mL的上述BSA-CS1溶液(PH9.2)涂敷Linbro titertek聚苯乙烯96孔平底板(Flow Laboratories，Maclean，VA；catalog#76-231-05)的孔。一些孔沒有用CS1涂敷，為的是分析非特異性細(xì)胞結(jié)合(NSB)。該板然后在4℃下培養(yǎng)一夜。
在此培養(yǎng)之后，通過顛倒和擦拭該板來除去孔的內(nèi)容物。所有的孔然后用100μl的1％BSA(在PBS中)溶液，用0.02％NaN3溶液封閉，在室溫下最少1小時(shí)。
3.熒光標(biāo)記的Ramos細(xì)胞的制備
Ramos細(xì)胞在含有1％BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、保持和標(biāo)記。剛好在進(jìn)行該分析之前，將2′，7，-雙-(2-羧基乙基)-5(和-6)羧基熒光素乙酰氧基甲基酯(“BCECF-AM”；Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon；catalog#B-1150)加入到Ramos細(xì)胞培養(yǎng)物(4×106個(gè)細(xì)胞/mL)中，至最終濃度為2μM。該細(xì)胞在37℃下被培養(yǎng)20分鐘。
在標(biāo)記之后，該細(xì)胞在分析緩沖液(24mM TRIS，137mM NaCl，2.7mMKCl，PH7.4，含有0.1％BSA和2mM葡萄糖)中被洗滌兩次，以除去任何來源于培養(yǎng)基的陽離子。將細(xì)胞再懸浮于分析緩沖液中至4×106個(gè)細(xì)胞/mL，將2mM MnCl2加入來上調(diào)細(xì)胞表面上的VLA4。
4.分析的進(jìn)行
剛好在進(jìn)行該分析之后，從96-孔板中移出BSA封閉溶液和用100μl分析緩沖液洗滌這些孔。然后向每一孔中加入25μl試驗(yàn)細(xì)胞粘附抑制化合物(以2倍于最終濃度)和25μl標(biāo)記Ramos細(xì)胞。在預(yù)料的IC50范圍內(nèi)選擇最終濃度，通常在0.01nM-10μM之間。各濃度的化合物被試驗(yàn)三次。該化合物和細(xì)胞在室溫下被培養(yǎng)30分鐘。
然后傾空該板的內(nèi)容物并用分析緩沖液洗滌孔4次。使用光學(xué)顯微鏡檢查NSB孔。如果幾個(gè)以上的細(xì)胞粘附于那些孔，再一次洗滌該板以除去該剩余的非特異性結(jié)合細(xì)胞。
Ramos細(xì)胞與CS1肽涂敷的孔的結(jié)合是通過向每一孔中添加100μl分析緩沖液和在Millipore Cytofluor 2300 System板讀取器(設(shè)定在485nm激發(fā)和530nm發(fā)射)中定量熒光而測(cè)量的。結(jié)合被表達(dá)為IC50 - - 抑制劑的濃度，在此濃度下發(fā)生50％的對(duì)照物結(jié)合。結(jié)合百分?jǐn)?shù)由下式計(jì)算[(FTB-FNS)-(FI-FNS)]/[(FTB-FNS)×100＝％結(jié)合，
其中FTB是沒有添加抑制劑時(shí)被結(jié)合于含有CS1的孔的總熒光；FNS是在缺少CS1的孔內(nèi)被結(jié)合的熒光；FI是在含有本發(fā)明抑制劑的孔內(nèi)被結(jié)合的熒光。
類似分析本發(fā)明的其它化合物。這些化合物中每一種的IC50范圍被表示在下表中表中簡(jiǎn)寫A-＜50nm；B-50nm-10μm；C-＞10μm；nd-未檢測(cè)。在本表中所有測(cè)試的化合物顯示出IC50＜1mM。
實(shí)施例54
VLA4-呈遞細(xì)胞與VCAM-IgG的直接結(jié)合
接著檢查本發(fā)明化合物抑制VCAM/VLA4結(jié)合的能力，利用VCAM-IgG-堿性磷酸酶共軛體。為了進(jìn)行本分析，使用Millipore MultiscreenAssay System(Millipore Corp.，Bedford，MA)來有效地洗滌細(xì)胞。
1.VCAM-IgG-AP共軛體的制備
VCAM2D-IgG表達(dá)載體的構(gòu)建，用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和所得到的表達(dá)產(chǎn)物的提純描述在PCT公開WO90/13300，其公開內(nèi)容被引入本文供參考。
1.2ml的提純VCAM2D-IgG(5mg/ml，在10mM HEPES中，PH7.5)與44μl的Traut氏試劑(2-iminothiolane，20mg/ml，在水中；PierceChemical，Rockford，IL.)在室溫下反應(yīng)30分鐘。樣品在用100mM NaCl、10mM MES、pH5.0平衡過的15mL Sephadex G-25柱上脫鹽。收集1ml各種級(jí)分，測(cè)定280nm下的吸光度。匯集兩個(gè)峰級(jí)分。
1ml的牛小腸堿性磷酸酶(19mg/ml；Pierce Chemical，Rockford，IL)與100μl的Sulfo-SMCC(30mg/ml，在水中)和100μl 1M HEPES(PH7.5)在室溫下反應(yīng)35分鐘。反應(yīng)混合物在已用150mM氯化鈉、10mMHEPES(PH6.0)平衡的12ml SepHadex G-25柱上脫鹽。收集1ml的級(jí)分，測(cè)定在280nm下的吸光度。合并兩峰值級(jí)分并在冰塊上貯存。
通過在室溫下培養(yǎng)30分鐘，堿性磷酸酶-SMCC和VCAM 2D-IgG-iminothilane加合物按2∶1的摩爾比在Tris-HCL(PH7.5)中進(jìn)行交聯(lián)。由SDS-PAGE測(cè)定交聯(lián)程度。交聯(lián)的產(chǎn)物通過添加2mM氯化鎂和0.25mM氯化鋅來加以穩(wěn)定并在4℃下貯存。
2.結(jié)合分析
首先向每一孔中添加275μl的含有0.1％Tween20和2％BSA的PBS(“封閉緩沖劑”)并在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)來封閉96-孔過濾板。然后將該板放入真空歧管中，封閉緩沖液通過過濾孔的底部排泄到廢物收集盤中。然后用200-250μl的含有0.1％BSA、2mM葡萄糖和1mM HEPES的Tris-緩沖的鹽水(PH7.5)(“分析緩沖液”)洗滌孔三次以洗掉任何殘留的封閉緩沖劑。將板排空，并在紙巾上擦拭以除去板下側(cè)的緩沖劑。
然后準(zhǔn)備VCAM-IgG-AP的貯備溶液(4μg/mL，在分析緩沖液中)，然后讓其通過0.2μ低蛋白質(zhì)結(jié)合的針筒式過濾器(Gelman Sciences，AnnArbor，MI #4454)過濾。所得到的溶液然后按1∶10稀釋在分析緩沖液中，將25μl加入到被洗滌過的板的每一個(gè)孔中。
將待測(cè)試的細(xì)胞粘附抑制劑在分析緩沖液中稀釋至2x最終濃度，然后將25μl各稀釋液加入到板上三個(gè)一組的孔中。所使用的最終濃度是0.01nM-10μM。總結(jié)合和非特異性結(jié)合的對(duì)照孔接受25μl的分析緩沖液，而不是抑制劑。總結(jié)合孔在分析緩沖液中含有細(xì)胞和VCAM-IgG-AP。非特異性結(jié)合孔在分析緩沖液中僅僅含有VCAM-IgG-AP。
Jurkat細(xì)胞在分析緩沖液中洗滌1次以除去生長(zhǎng)介質(zhì)并以8×106/mL再懸浮于含有2mM MnCl2的分析緩沖液中。向每一孔中加入50μl的Jurkat細(xì)胞，非特異性結(jié)合孔除外，它們接受50μl分析緩沖液以保持最終分析體積為100μl/孔。通過彈該板的側(cè)面來輕輕地混合孔的內(nèi)容物。然后將該板在無干擾的情況下在室溫下培養(yǎng)60分鐘。
在60分鐘培養(yǎng)結(jié)束后，將該板放入真空歧管中來清空該板上的內(nèi)容物。向每一孔中小心地加入100μl含有1mM MnCl2的分析緩沖液(洗滌緩沖液)，以便不干擾底部上的細(xì)胞。真空抽除洗滌緩沖液，該板再次用150μl洗滌緩沖液洗滌。在再次清空洗滌緩沖液后，板的下側(cè)在紙巾上擦拭。
接著，制備4-硝基苯基磷酸鹽在0.1M甘氨酸、1mM ZnCl2中的10mg/mL溶液(PH10.5)(底物緩沖液)，立即向各孔中添加100μl。板在室溫下培養(yǎng)30分鐘，進(jìn)行比色反應(yīng)。通過向每一孔中添加100μl的3N氫氧化鈉來停止反應(yīng)。
使用真空歧管將96-孔過濾板的內(nèi)容物直接轉(zhuǎn)移至96-孔平底板上。該板在405nm波長(zhǎng)下被讀數(shù)以測(cè)定結(jié)合于細(xì)胞上的VCAM共軛體的量。結(jié)合百分?jǐn)?shù)由下式計(jì)算[(ATB-ANS)-(AI-ANS)]/[(ATB-ANS)×100＝％結(jié)合，
其中ATB是沒有添加抑制劑時(shí)含有CS1的孔在405nm下的吸光度；ANS是缺少CS1的孔在405nm下的吸光度；和AI是在含有本發(fā)明抑制劑的孔在405nm下的吸光度。
在相同的分析中分析本發(fā)明的其它化合物。IC50值與從前面實(shí)施例描述的CS1結(jié)合分析所得到的那些值具有可比性，雖然某些化合物在本分析中顯示出比前面分析中高10倍的結(jié)合。
實(shí)施例55
鼠接觸超敏性的抑制
用戊基巴比妥鈉(90mg/kg，i.p.)麻醉20-g雌性Balb/c小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)。腹部皮膚的3cm2區(qū)域通過完全剃掉毛來暴露。此處皮膚用70％乙醇擦拭，隨后在裸露的腹部皮膚上涂敷25μl的0.5％ DNFB(在4∶1 v/v丙酮∶橄欖油中)。然后用涂敷移液吸管尖輕輕地劃擦所述皮膚，以引發(fā)輕微的炎癥。在初始致敏后的24小時(shí)，在同一腹部皮膚部位再次用25μl 0.5％DNFB致敏，隨后再次用移液吸管尖輕輕劃擦。進(jìn)行第二次致敏，與此同時(shí)束縛未麻醉的小鼠。
第5天(在初始致敏120小時(shí)后)，用90∶10 mg/kg氯氨酮∶賽拉嗪麻醉(i.p.)這些小鼠，向左耳的背面涂敷亞刺激劑量的10μl的0.2％ DNFB。右耳接受4∶1 v/v丙酮∶橄欖油媒介物的類似涂敷。
在激發(fā)免疫反應(yīng)后的4小時(shí)，通過皮下(s.c.)注射，對(duì)小鼠施用了在100μl0.5％磷酸鈉緩沖液(PH8.8)和3％v/v DMSO中各種濃度的本發(fā)明的抑制劑。不太可溶的抑制劑偶然需要高達(dá)30％DMSO添加量，被測(cè)試的最高濃度。8只小鼠的各組用于所測(cè)試的各治療。陽性(PS2抗小鼠VLA-4抗體，8mg/kg，i.v.)，和陰性對(duì)照(磷酸鹽-緩沖的生理鹽水，PBS，100μl i.v.；DMSO，在PBS中，100μl s.c.)組例行進(jìn)行測(cè)試，作為測(cè)試化合物的分析的一部分來對(duì)比。
在激發(fā)小鼠24小時(shí)后再次用氯氨酮∶賽拉嗪麻醉，用精確至10-4英寸的精確度的工程用測(cè)微計(jì)測(cè)量?jī)啥涞亩浜穸?。每只鼠的耳朵膨脹反?yīng)是其對(duì)照-和DNFB-激發(fā)的耳朵厚度的差值。典型的未抑制的耳朵膨脹反應(yīng)是65-75×10-4英寸。通過將處理過的各組與它們的陰性對(duì)照組比較來判斷耳朵膨脹反應(yīng)的抑制效果。抑制百分?jǐn)?shù)計(jì)算如下
使用方差的單向分析，然后使用p＜0.05由Tukey-Kramer HonestlySignificant Difference(JMP，SAS Institute)的計(jì)算來評(píng)價(jià)處理組當(dāng)中差值的統(tǒng)計(jì)顯著性。
本發(fā)明的抑制劑導(dǎo)致在DNFB處理小鼠的耳朵膨脹反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)顯著性的減少，與未抑制的對(duì)照動(dòng)物相比而言。
實(shí)施例56
在變應(yīng)性羊體內(nèi)的蛔蟲抗原-誘發(fā)的后期
氣管敏感性
在本研究中使用預(yù)先顯示對(duì)蛔蟲suum抗原同時(shí)產(chǎn)生早期和后期支氣管反應(yīng)的羊。用于該實(shí)驗(yàn)的方案被描述在W.M.Abraham等人，J.Clin.Invest.，93，pp.776-87(1994)，只是施用于動(dòng)物的本發(fā)明的VLA-4抑制劑被溶于3-4ml的50％乙醇水溶液中并由氣霧劑噴霧來施用。
結(jié)果顯示，所有本發(fā)明的VLA-4抑制劑都抑制與施用蛔蟲suum抗原有關(guān)的氣管反應(yīng)。
盡管前面給出了許多本發(fā)明的實(shí)施方案，顯然，本文的基本結(jié)構(gòu)能夠加以改變以提供其它化合物和利用這一化合物的方法。所以，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到的是，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求限定而不是由以實(shí)施例方式給出的特定實(shí)施方案限定。
序列表(1)一般信息
(i)申請(qǐng)人
(A)名稱Biogen，Inc.(except US)
(B)街道14 Cambridge Center
(C)城市Cambridge
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02142
(G)電話617-679-2200
(H)傳真617-679-2838
(A)名稱Ko-Chung Lin(US only)
(B)街道253 Lincoln Street
(C)城市Lexington
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02173
(A)名稱Steven P.Adams(US only)
(B)街道12 Berkley Lane
(C)城市Andover
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)01810
(A)名稱Alfredc C.Castro(US only)
(B)街道31 Glenwood Avenue
(C)城市Woburn
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)01801
(A)名稱Craig N.Zimmerman(US only)
(B)街道134 Highland Avenue #6
(C)城市Somerville
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02143
(A)名稱Julio Hernan Cuervo(US only)
(B)街道16 Elmer Street #303
(C)城市Cambridge
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02138
(A)名稱Wen-Cherng Lee(US only)
(B)街道192 Spring Street
(C)城市Lexington
(D)州Masschusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02173
(A)名稱Charles E.Hammond(US only)
(B)街道4 Chester Avenue
(C)城市Burlington
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)01803
(A)名稱Mary Beth Carter(US only)
(B)街道106 Sycamore Street
(C)城市Belmont
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02178
(A)名稱Ronald G.Almquist(US only)
(B)街道50 Solomon Pierce Roao
(C)城市Lexington
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)02173
(A)名稱Carol Lee Ensinger(US only)
(B)街道732 Princeton Blvd.Apt #20
(C)城市Lowell
(D)州Massachusetts
(E)國(guó)家United States of America
(F)郵政編碼(ZIP)01851
(ii)發(fā)明名稱細(xì)胞粘附抑制劑
(iii)序列數(shù)4
(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)介質(zhì)類型軟盤
(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)
(vi)在先申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/498,237
(B)遞交日11-JUL-1995(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈形單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(iii)假設(shè)無
(xi)序列描述SEQ ID NO1
Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
1 5(2)SEQ ID NO2的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型肽
(iii)假設(shè)無
(iv)反義無
(xi)序列描述SEQ ID NO2
Glu Ile Leu Asp Val
1 5(2)SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型肽
(iii)假設(shè)無
(iv)反義無
(xi)序列描述SEQ ID NO3
Leu Asp Val Pro Ser
15(2)SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度27個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型肽
(iii)假設(shè)無
(xi)序列描述SEQ ID NO4Cys Tyr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu1 5 10 15His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 2權(quán)利要求
1、具有以下通式(I)的細(xì)胞粘附抑制化合物
Z-(Y1)-(Y2)-(Y3)n-X(I)和其藥物學(xué)上可接受的衍生物；其中
Z選自烷基；任意性被N-烷基-或N-芳基酰氨基取代的脂族?；环减；?；雜環(huán)酰基；烷基-或芳基磺酰基；任意性被芳基取代的芳烷基羰基；雜環(huán)烷基羰基；烷氧基羰基；芳烷基氧基羰基；任意性與芳基稠合的環(huán)烷基羰基；雜環(huán)烷氧基羰基；烷基氨基羰基；任意性被雙(烷基磺酰基)氨基、烷氧基羰基氨基或鏈烯基取代的芳基氨基羰基和芳烷基氨基羰基；烷基磺?；环纪榛酋；?；芳基磺?；蝗我庑耘c芳基稠合的環(huán)烷基磺?；?；雜環(huán)磺?；?；雜環(huán)烷基磺酰基；芳烷氧基羰基；芳氧基羰基；環(huán)烷氧基羰基；雜環(huán)基氧基羰基；雜環(huán)基烷氧基羰基；任意性被芳基取代的單-或二-烷基氨基羰基；(烷基)(芳烷基)氨基羰基；單-或二-芳烷基氨基羰基；單-或二-芳基氨基羰基；(芳基)(烷基)氨基羰基；單-或二-環(huán)烷基氨基羰基；雜環(huán)基氨基羰基；雜環(huán)基烷基氨基羰基；(烷基)(雜環(huán)基)氨基羰基；(烷基)(雜環(huán)基烷基)氨基羰基；(芳烷基)(雜環(huán)基)氨基羰基；(芳烷基)(雜環(huán)基烷基)氨基羰基；任意性被芳基取代的鏈烯?；蝗我庑员环蓟〈逆溝┗酋；蝗我庑员环蓟〈娜蝉；?；任意性被芳基取代的炔基磺酰基；環(huán)烯基羰基；環(huán)烯基磺?；画h(huán)烷基鏈烷?；?；環(huán)烷基烷基磺?；环蓟减；?，雙芳基磺酰基；烷氧基磺酰基；芳烷氧基磺酰基；烷基氨基磺酰基；芳氧基磺?；?；芳基氨基磺酰基；N-芳基脲取代的鏈烷?；籒-芳基脲取代的烷基磺酰基；環(huán)烯基取代的羰基；環(huán)烯基取代的磺?；蝗我庑员环蓟〈逆溝┭趸驶?；任意性被芳基取代的鏈烯氧基磺?；蝗我庑员环蓟〈娜惭趸驶?；任意性被芳基取代的炔氧基磺酰基；任意性被芳基取代的鏈烯基-或炔基-氨基羰基；任意性被芳基取代的鏈烯基-或炔基-氨基磺?；货；被〈逆溚轷；?；?；被〈耐榛酋；话被驶〈逆溚轷；话被柞；〈逆溚轷；?；氨基甲?；〈耐榛酋；浑s環(huán)基鏈烷?；浑s環(huán)氨基磺?；霍然榛〈姆纪轷；霍然榛〈姆纪榛酋；谎醮辑h(huán)基稠合的芳?；?；氧代碳環(huán)基稠合的芳基磺?；?；雜環(huán)基鏈烷?；?；N’，N’-烷基，芳基肼基羰基；芳氧基取代的鏈烷?；碗s環(huán)基烷基磺酰基；
Y1是-N(R1)-C(R2)(A1)-C(O)-；
Y2是-N(R1)-C(R2)(A2)-C(O)-；
各Y3由通式-N(R1)-C(R2)(A3)-C(O)-表示；
各R1獨(dú)立地選自氫，烷基，和芳烷基；鏈烯基；炔基；環(huán)烷基；環(huán)烯基；環(huán)烷基烷基；芳基；氨基烷基；單-或二-烷基取代的氨基烷基；單-或二-芳烷基取代的氨基烷基；羥基烷基；烷氧基烷基；巰基烷基；硫代烷氧基烷基；
A1選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)烷基；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代?；被?、烷氧基羰基氨基、芳基、環(huán)烷基、羧基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、羥基、羧基烷基氨基羰基、羥基氨基羰基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基；
A2選自酸性官能團(tuán)和任意性被酸性官能團(tuán)、已保護(hù)的酸性官能團(tuán)或芳基取代的烷基；
各A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；芳基；環(huán)烷基；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代?；被⒎蓟?、環(huán)烷基、羧基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、羥基、羧基烷基氨基羰基、羥基氨基羰基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基；
或R1和任何A與它們所連接的原子一起形成3-至6-員環(huán)雜環(huán)；
各R2獨(dú)立地選自氫和烷基；
n是0-8的整數(shù)；和
X選自烷氧基；芳氧基；芳烷基氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基取代的烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；環(huán)烷基烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基；雜環(huán)；和(單-或二-羧酸)取代的烷基胺；雜環(huán)基氨基；雜環(huán)基取代的烷基氨基
其中通式I的化合物明顯地不是N’-羧基甲基-N-(苯基乙酰基-L-亮氨?；?L-天冬氨?；?L-苯基丙氨?；?L-脯氨?；?哌嗪(即，當(dāng)Z＝苯基乙酰基，Y1＝L，Y2＝D，Y3＝F/p，n＝2，和X＝4-羧基甲基哌嗪基)和明顯地不是苯基乙酰基-L-亮氨?；?L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨?；?D-脯氨酸酰胺(即，當(dāng)Z＝苯基乙?；?，Y1＝L，Y2＝D，Y3＝F/P，n＝2，和X＝NH2)。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中
Z選自烷基；任意性被N-烷基-或N-芳基酰氨基取代的脂族?；?；芳?；?；雜環(huán)?；?；烷基-和芳基磺?；蝗我庑员环蓟〈姆纪榛驶?；雜環(huán)烷基羰基；烷氧基羰基；芳烷氧基羰基；任意性與芳基稠合的環(huán)烷基羰基；雜環(huán)烷氧基羰基；烷基氨基羰基；芳基氨基羰基和任意性被雙-(烷基磺?；?氨基、烷氧基羰基氨基或鏈烯基取代的芳烷基氨基羰基；
各R1獨(dú)立地選自氫，烷基和芳烷基；和
X選自烷氧基；芳氧基；芳烷基氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基取代的烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；環(huán)烷基烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基；雜環(huán)；和(單-或雙-羧酸)取代的烷基胺。
3、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A1選自環(huán)烷基；雜環(huán)(當(dāng)A1和R1連在一起時(shí))；和任意性被氨基、?；被?、氨基取代?；被?、芳基、羧基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、芳烷基氧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、(烷基)(芳烷基)氨基羰基、芳烷基氨基羰基、二芳烷基氨基羰基、烷氧基羰基氨基、巰基、硫代烷氧基或雜環(huán)所取代的烷基。
4、根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A1選自氨基羰基乙基，芐基，正丁基，異丁基，羧基乙基，環(huán)己基，1-羥基乙基，羥基甲基，巰基甲基，1-甲基丙基，甲基硫代乙基，正丙基，異丙基，甲氧基羰基氨基丁基，6-氨基己?；被』?當(dāng)A1和R1連在一起)氮雜環(huán)丁烷，1-氮雜環(huán)丙烷，吡咯烷，和哌啶。
5、根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A1選自芐基，正丁基，異丁基，甲基硫代乙基，環(huán)己基，1-甲基丙基，正丙基和異丙基。
6、根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A1是(當(dāng)A1和R1連在一起)吡咯烷。
7、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A2選自任意性被氨基、氨基羰基、芳基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、羥基氨基羰基、羧基、含有NH的雜環(huán)、羥基或巰基所取代的烷基；任意性被氨基、氨基羰基、羧基、含NH的雜環(huán)、羥基或巰基所取代的芳烷基；和雜環(huán)(當(dāng)A2和R1連在一起)。
8、根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A2選自羧基甲基，2-羧基乙基，1-羧基乙基，羥基氨基羰基甲基，羥基甲基，巰基甲基，咪唑基甲基，N-Bn-咪唑基甲基，苯基，甲酯基甲基，芐酯基甲基，和(當(dāng)A2和R1連在一起)氮雜環(huán)丁烷，氮雜環(huán)丙烷，吡咯烷，和哌啶。
9、根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A2選自羧基甲基，2-羧基乙基，1-羧基乙基，羥基氨基羰基甲基，羥基甲基，巰基甲基和咪唑基甲基。
10、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)烷基；和任意性被芳基、環(huán)烷基、羧基、羥基氨基羰基、烷氧基、芳烷氧基、巰基、含N的雜環(huán)、羧基烷基氨基羰基或氨基取代的酰基氨基所取代的烷基。
11、根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中A3獨(dú)立地選自氨基酸側(cè)鏈和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基；環(huán)己基；和任意性被苯基、環(huán)己基、羧基、羥基氨基羰基、甲氧基、芐氧基、巰基、N-芐基咪唑基、生物素基、四唑基、纈氨?；?N-羰基或6-氨基己?；被〈耐榛?。
12、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中各Y3獨(dú)立地選自氨基酸和對(duì)應(yīng)的被保護(hù)的衍生基。
13、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中
n是2；
Y1是亮氨酰基；
Y2是天冬氨酰基；和
Y3是纈氨?；滨；?。
14、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中X選自烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；羥基；氨基；任意性被羥基、氨基羰基、N-烷基氨基羰基、羧基或烷氧基羰基所取代的單-和二-烷基氨基；二烷基氨基；環(huán)烷基氨基；環(huán)烷基烷基氨基；二環(huán)烷基氨基；(烷基)(芳基)氨基；任意性被羧基取代的芳烷基氨基；二芳烷基氨基；芳基氨基；含N的雜環(huán)；雙羧酸取代的烷基胺和(單或雙羧基)甲基氨基羰基取代的含N雜環(huán)。
15、根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中X選自氨基，甲基氨基，異丙基氨基，異丁基氨基，正丁基氨基，叔丁基氨基，異戊基，異戊基氨基，己基氨基，環(huán)己基氨基，環(huán)己基甲基氨基，甲基苯基氨基，苯基甲基氨基，苯基氨基，4-甲氧基苯基甲基氨基，二甲基氨基，二異丙基氨基，二異丁基氨基，羥基，甲氧基，正丁氧基，叔丁氧基，芐氧基，2-哌啶羧酸，N’-(α，α′-雙-羧甲基)-2-哌啶羧酰胺，N’-羧甲基-2-哌啶羧酰胺，1-羥甲基-2-甲基丙基氨基，1-N’-甲基酰氨基-1-甲基乙基氨基，3，3-二甲基丁基氨基，1-N’-甲基酰氨基丁基氨基，1-酰氨基-2-甲基丁基氨基，1-甲酯基-2-甲基丁基氨基，1-N’-甲基酰氨基-2-甲基丁基氨基，1-羧基-1-苯基甲基氨基，嗎啉代，哌啶基，N-苯基哌嗪基，2-甲基哌啶基，和哌嗪基。
16、根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中Z選自脂族?；减；?，芳烷基羰基，雜環(huán)?；?，烷氧基羰基，芳烷基氧基羰基和雜環(huán)烷基羰基。
17、根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中Z是(N-Ar’-脲)-對(duì)位-取代的芳烷基羰基。
18、根據(jù)權(quán)利要求17的細(xì)胞粘附抑制化合物，其中Z是(N-Ar’-脲)-對(duì)位-取代的苯基甲基羰基。
19、根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞粘附抑制化合物，它們選自化合物No.1，2，4，144，145，146，147，148，206，315，316，317，337，338，345，346，347，357，358和359。
20、根據(jù)權(quán)利要求19的細(xì)胞粘附抑制化合物，它們選自化合物No.1，206，316，358和359。
21、根據(jù)權(quán)利要求20的細(xì)胞粘附抑制化合物，它們選自化合物No.358和359。
22、包括根據(jù)權(quán)利要求1-21中任何一項(xiàng)的化合物和藥物學(xué)上可接受載體的一種藥物組合物，該化合物的含量足以有效地防止、抑制或控制細(xì)胞粘附。
23、根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，進(jìn)一步包括選自皮質(zhì)類固醇，支氣管擴(kuò)張藥，止喘藥，抗炎藥，抗風(fēng)濕藥，免疫抑制劑，抗代謝物，免疫調(diào)節(jié)劑，治牛皮癬藥和抗糖尿病藥的藥劑。
24、一種防止、抑制或控制哺乳動(dòng)物中細(xì)胞粘附的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求22或23的藥物組合物的步驟。
25、根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中該方法用于防止、抑制或控制炎癥。
26、根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中炎癥是與細(xì)胞粘附有關(guān)的炎癥。
27、根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中該方法用于防止、抑制或控制免疫或自身免疫性反應(yīng)。
28、根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中免疫或自身免疫性反應(yīng)是與細(xì)胞粘附有關(guān)的免疫或自身免疫性反應(yīng)。
29、根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中該方法用來治療或防止選自氣喘、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、移植排斥、多發(fā)性硬化病、糖尿病和炎癥性腸病的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制和防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞粘附媒介的病理的新型化合物。本發(fā)明還涉及包括這些化合物的藥物配制劑和使用它們抑制和防止細(xì)胞粘附和細(xì)胞粘附媒介的病理的方法。本發(fā)明的化合物和藥物組合物能夠用作治療劑或預(yù)防劑。它們尤其適合于治療許多炎癥和自身免疫性疾病。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1193325SQ96196380
公開日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1996年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月11日
發(fā)明者K-C·林, S·P·阿達(dá)姆斯, A·C·卡斯特羅, C·N·齊默曼, J·H·奎爾沃, W-C·李, C·E·哈默德, M·B·卡爾特, R·G·阿爾奎斯特, C·L·恩斯格爾 申請(qǐng)人:拜奧根有限公司