專利名稱：：治療人黃斑變性的純玉米黃質(zhì)3r－3'r立體異構(gòu)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，它涉及稱為玉米黃質(zhì)(縮寫為ZX)的一種黃色色素的某種異構(gòu)體。如果作為藥物或維生素給人施用，則該色素可治療或預防一種能損壞視網(wǎng)膜而引起失明、被稱為黃斑變性的疾病。視網(wǎng)膜是一種連接眼球背面的組織。視網(wǎng)膜很復雜，它包括12層不同的層。在很多醫(yī)學教材中對它描述和闡釋過，例如Gittinger1988，和Vaughn和Asbury1992(后面列出了所有引文)。視網(wǎng)膜中部有一個稱為視網(wǎng)膜黃斑的特殊圓形區(qū)，它在人眼中直徑約為1-1.5毫米。該黃斑有兩個特征使它有別于視網(wǎng)膜的其它部分。首先，該黃斑含有較少的視網(wǎng)膜桿；它的感光器大多數(shù)呈圓錐形(在凹部即黃斑的正中心，根本就沒有視網(wǎng)膜桿)。其次，該黃斑明顯呈黃色，這是由稱為黃體素和玉米黃質(zhì)的兩種色素引起的。兩種色素都屬于稱為“類胡蘿卜素”的一類分子。在概述黃斑變性之后，下文將討論這些類胡蘿卜素色素的化學性質(zhì)。黃斑變性“黃斑變性”是指涉及逐漸損傷視網(wǎng)膜細胞或視網(wǎng)膜中心黃斑區(qū)內(nèi)感光錐體的任意疾病。論文和教科書例如Taylor1993、Gittinger1988和Vaughan和Asbury1992中對它描述和闡釋過。有數(shù)種黃斑變性。最常見的一種稱為“年齡相關(guān)性黃斑變性”，通?？s寫為AMD(某些文獻中為ARMD)。AMD能損壞視力，程度從輕度降低視力至完全失明。有兩種AMD，常稱為“濕”形和“干”形。濕形涉及在視網(wǎng)膜內(nèi)進攻性生長毛細血管和其它血管，直至血管干擾和破壞視網(wǎng)膜層的正常組織。盡管有時可利用激光隔離新形成的血管來治療這種AMD，但激光療法只能暫時延遲血管生長，它通常不能防止最終基本上喪失全部視力；濕形AMD幾乎總是導致最終完全失明或接近完全失明。患AMD的患者中大約只有5-10％的人患有濕形AMD。另一種AMD稱為“干”形AMD。由于至少有90％的AMD屬于這種類型，所以通常也就將它簡稱為AMD。雖然這種AMD通常不會引起完全失明，但它能嚴重損傷患者的視力，致使患者不能認識或鑒別熟悉物體如朋友或親戚的面孔。于是，它常會導致機能性失明，使得人們不能在公共場所安全地駕車或行走，不能進行正常活動。還有多種疾病涉及黃斑變性癥狀，這些疾病包括Stargardt病、Best病、Batten病、Sjogren-Larsson綜合征、視網(wǎng)膜錐-桿營養(yǎng)不良和羊蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥。描述這些疾病的論文引用于Dorey等1993中。此外，涉及溶酶體貯存問題(例如家族性黑蒙性白癡)或漸進性神經(jīng)細胞變性(如阿爾茨海默氏病)的其它疾病也與黃斑變性有關(guān)。這些疾病中有很多具有遺傳成分，這已由遺傳證實；已分離出引起這些疾病的一些基因，并且遺傳篩查試驗可指示一個人是否具有缺損基因。遺傳試驗或家族史證明，攜帶或很可能攜帶這種基因的人患黃斑變性的危險性較高。通過慢慢地奪去人們的視力，AMD使它的受害者們遭受極大的痛苦。它每年耗費億萬美元，既包括生產(chǎn)率的損耗，也包括對于必須為患有失明或視力受嚴重損害的人們提供或幫助支付醫(yī)療保健費用和其它幫助的家庭成員、保險機構(gòu)、社會團體和其它單位造成的沉重負擔。鑒于AMD引起的這些問題，科學家和醫(yī)師們數(shù)十年來一直在探索治療或預防由黃斑變性引起的失明和其它視力降低的方法。然而，盡管努力了半個多世紀，但迄今未獲有效的療法。診斷脈絡(luò)膜小疣和脂褐質(zhì)黃斑變性通常由特殊的視網(wǎng)膜照片來診斷。在一種診斷方法中，醫(yī)師對患者注射熒光標記藥物，讓藥物循環(huán)流經(jīng)患者全身，然后拍攝視網(wǎng)膜的放大照片，稱為血管造影照片。醫(yī)師分析該照片以確定兩種細胞碎片中一種或兩種的存在與否和濃度。已知的并研究了數(shù)十年的一種細胞碎片稱為脈絡(luò)膜小疣。它分為兩種不同形式。少量的硬脈絡(luò)膜小疣(直徑小于63微米的小顆粒)通常存在于40歲以上的人眼內(nèi)。除非存在量反常，硬脈絡(luò)膜小疣不表示視網(wǎng)膜損傷。反之，大量的更大軟脈絡(luò)膜小疣沉積物(也稱為濕脈絡(luò)膜小疣)表示發(fā)生或出現(xiàn)了明顯視網(wǎng)膜損傷，因為軟脈絡(luò)膜小疣大斑點能破壞和瓦解視網(wǎng)膜層，并阻止視網(wǎng)膜細胞吸收血液中的正常營養(yǎng)物質(zhì)。視網(wǎng)膜中含有大量軟脈絡(luò)膜小疣的患者常稱為患有黃斑變性?；键S斑變性的患者中常見的另一種視網(wǎng)膜碎片稱為脂褐質(zhì)。直到最近才明了脂褐質(zhì)與AMD之間的關(guān)系(例如，Weiter等1988，和Dorey等，1993)。類胡蘿卡素化學“類胡蘿卜素”包括一大類分子；業(yè)已鑒定了600種以上類胡蘿卜素的性質(zhì)。這些分子具有一些特征，包括1.類胡蘿卜素是由5個碳原子的分子即異戊二烯偶合而生成的。由于結(jié)構(gòu)單元含有5個碳原子，所以多數(shù)類胡蘿卜素包含5個碳原子的倍數(shù)。2.類胡蘿卜素具有多重不飽和鍵。這使它們能吸收光譜的藍色和近紫外區(qū)內(nèi)高能光波。3.由于類胡蘿卜素吸收藍色和近紫外光譜區(qū)中的波長，不吸收其它光譜區(qū)中更長的波長，所以類胡蘿卜素通常呈黃色、橙色、棕色或紅色。“類胡蘿卜素”這一名稱來自胡蘿卜；最先知道的類胡蘿卜素被鑒定為使胡蘿卜顯橙色的色素。類胡蘿卜素在溶液中引起的顏色由多種因素決定，包括濃度和存在的其它化學物質(zhì)。4.類胡蘿卜素具有“共軛”雙鍵。這表明雙鍵與單鍵交替存在，所以鏈中每個碳原子與另一個碳原子形成雙鍵，但沒有碳原子與另外兩個碳原子同時形成雙鍵。對于這種排列的理解可參考圖1，該圖中示出了β-胡蘿卜素、ZX和黃體素的結(jié)構(gòu)。不同類胡蘿卜素的共軛程度不同，共軛程度更高的分子通常提供更好的保護作用以抗高能光輻射所致的“光毒”損害。例如，圖1中所示的3種類胡蘿卜素，每一分子的整個直鏈部分都是共軛結(jié)構(gòu)，具有交替的雙鍵和單鍵。在β-胡蘿卜素和ZX的分子中，共軛結(jié)構(gòu)延續(xù)至兩個端環(huán)上的第一個鍵。但黃體素的共軛程度更低，因為它的端環(huán)之一上的雙鍵未形成完全共軛結(jié)構(gòu)的正確排列。ZX和黃體素的唯一差別在于一個(而不是兩個)端環(huán)上雙鍵的位置。由于(通過進化)設(shè)計和選擇類胡蘿卜素吸收藍光和近紫外光可能有害的能量，所以實際上它們被用作防護色素。它們在植物中廣泛存在，因為植物的主要目的之一是盡可能多地吸收陽光，同時將由藍光輻射、紫外線輻射和近紫外線輻射引起的細胞損傷減至最小。紫外線輻射對植物的損壞是一個嚴重問題，而類胡蘿卜素有助于使它減至最小。由于類胡蘿卜素相當適合于防止光毒損害，所以動物也已(通過進化)獲得了利用類胡蘿卜素作為光防護色素的方法。由于動物自體不能合成類胡蘿卜素，所以它們必須消化來自植物源的類胡蘿卜素(或類胡蘿卜素前體)。β-胡蘿卜素就是一個例子；哺乳動物必須從植物或從肉類獲取它。一旦進入哺乳動物體內(nèi)，β-胡蘿卜素就被轉(zhuǎn)化為其它分子形式，包括維生素A(視黃醇)，它是通過將β-胡蘿卜素裂解為兩半而形成的。類胡蘿卜素可分為兩大類胡蘿卜素和葉黃素。胡蘿卜素不含任何氧；它們是純粹的烴類，只由碳和氫構(gòu)成。而葉黃素(如ZX和黃體素)還含有氧。圖1示出了ZX的左、右端環(huán)上碳原子的編號。一般將左端環(huán)上的碳原子從1至6編號，而右端環(huán)上的碳原子被稱為“撇”號數(shù)，例如3’碳(發(fā)音為“三撇”)。由于ZX的左、右端是完全對稱的，所以術(shù)語“左”和“右”僅僅是習慣說法以便于討論。但是應(yīng)注意，黃體素是非對稱的；“左”環(huán)上的雙鍵位置與“右”環(huán)上的雙鍵位置不同。由于ZX是通過在β-胡蘿卜素分子兩端的#3碳原子上連接兩個羥基而形成的，所以它的化學名稱為3，3′-二羥基-β-β-胡蘿卜素；一些化學家將它稱為胡蘿卜素-二醇。該分子被命名為“玉米黃質(zhì)”“zeaxanthin”是因為它最早被鑒定為使玉米呈黃色的色素，而玉米的學名是Zeamavs。如前所述，自然界中已鑒定出600種以上的類胡蘿卜素。有幾十種在生物化學和商業(yè)上很重要。ZX和黃體素在本發(fā)明中尤為重要，因為它們存在于哺乳動物和大多數(shù)其它動物的視網(wǎng)膜中。黃體素在商業(yè)上很重要，因為它(以植物提取物的形式，主要得自金盞花)被普遍喂食給雞，而使雞皮膚和蛋黃的顏色更黃，從而吸引銷售商和消費者。ZX可具有相同效果并且比黃體素效力更大，但ZX資源太貴而不能用作家禽飼料。美國專利5,308,759和5,427,783(由Gierhart轉(zhuǎn)讓給AppliedFoodBiotechnology，Inc，該公司是此處的受讓人和申請人)旨在論述ZX太貴不能用作動物飼料的問題。這些專利涉及利用細菌在商業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)ZX，使它可給家禽和魚喂食。除了植物外，一些類胡蘿卜素還由某些細菌合成。這些細菌是在直接受太陽光曝曬的場所進化而成的，所以它們的類胡蘿卜素與植物中的一樣起相同的光防護作用。描述得自細菌的類胡蘿卜素的文獻包括McDermott等1972，美國專利5,429,939(Misawa等1995)，和那些參考文獻中引用的其它論文。美國專利5,429,939(Misawa等1995)列出了編碼生物合成包括ZX在內(nèi)的各種類胡蘿卜素時涉及的酶的一些基因的DNA序列。還描述了在生成ZX中各主要基因(包括crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ)的作用。包含帶有這些基因的質(zhì)粒的細胞保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(例如噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)ATCC19321和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)ATCC39368)，和日本發(fā)酵研究所(例如，大腸桿菌(E.Coli)FERMBP2377)。玉米黃質(zhì)立體化學和異構(gòu)體類胡蘿卜素化學的一個重要方面包括“立體化學”和“立體異構(gòu)體”)。該標題在任何大學有機化學課本中均有闡釋。只要有機分子中某個碳原子連有4種不同的原子或分子基團，則該碳原子被稱為“手性”碳原子。當某有機分子中存在一個手性碳原子時，則與手性碳原子鍵連的4個不同基團可按兩種排列方式之一排列。這兩種不同的排列方式稱為立體異構(gòu)體。這兩種立體異構(gòu)體中之一將使偏振光“向右”偏轉(zhuǎn)，而另一種立體異構(gòu)體將使偏振光“向左”偏轉(zhuǎn)。引起向右偏轉(zhuǎn)的異構(gòu)體稱為R型立體異構(gòu)體(也稱為D型立體異構(gòu)體)。引起向左偏轉(zhuǎn)的異構(gòu)體稱為S型立體異構(gòu)體(也稱為L型立體異構(gòu)體)。由于ZX中的#3和#3’碳原子都有手性，所以它有4種可能的立體異構(gòu)體。在3R-3’R異構(gòu)體中，#3和#3’碳原子都具有R構(gòu)型。在3S-3’S異構(gòu)體中，#3和#3’碳原子都具有L構(gòu)型。為方便起見，本文將這兩種立體異構(gòu)體稱為R-R異構(gòu)體和S-S異構(gòu)體。第三種和第四種異構(gòu)體是兩種“混合的”或“內(nèi)消旋”(一個R和一個S)異構(gòu)體3R-3’S異構(gòu)體和3S-3’R異構(gòu)體。由于ZX是關(guān)于中點完全對稱的，所以這兩種異構(gòu)體在各方面都相同；如果將3R-3’S異構(gòu)體畫在紙上，則旋轉(zhuǎn)紙會使它變成3S-3’R異構(gòu)體。實際上，一個“內(nèi)消旋”異構(gòu)體是由S-R和R-S異構(gòu)體二者組成的。如果采用標準的化學合成方法制備ZX，則這4種可能的異構(gòu)體每種均占總量的大約25％。然而，由于S-R和R-S異構(gòu)體其實是相同的，所以它們的“內(nèi)消旋”異構(gòu)體將占總量的50％，而R-R和S-S異構(gòu)體大約各占25％。所有這三種立體異構(gòu)體的混合物稱為“外消旋”混合物。然而，類胡蘿卜素在視網(wǎng)膜組織中的細胞和酶特異性極其精確，且不同的異構(gòu)體或立體異構(gòu)體不能互換。雖然在慣常的化學術(shù)語中可將黃體素和ZX看作彼此的異構(gòu)體(因為它們具有相同數(shù)量的碳原子、氫原子和氧原子)，但視網(wǎng)膜細胞將它們當作完全不同的和性質(zhì)截然不同的分子。由于生物學因素的緣故，適合于本文的唯一異構(gòu)體為立體異構(gòu)體。本文提到的玉米黃質(zhì)的“異構(gòu)體”都表示ZX的具體立體異構(gòu)體，而不包括黃體素。黃體素和ZX被當成完全不同的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素中可能出現(xiàn)的小的、微細的和輕微的立體異構(gòu)差異實際上都對視網(wǎng)膜組織極為重要。顯然，能被人視網(wǎng)膜細胞正常吸收和利用的ZX立體異構(gòu)體只有R-R異構(gòu)體(即3R-3’R立體異構(gòu)體)。據(jù)報道，業(yè)已在視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)微量的ZX的內(nèi)消旋(R-S)異構(gòu)體。然而，這些微量物可能是由于在一定條件下自發(fā)進行的某些分子轉(zhuǎn)化作用，致使從黃體素前體形成內(nèi)消旋-玉米黃質(zhì)(Bone等1993和1994)。在實驗室中，ZX的立體異構(gòu)體可通過例如手性柱色譜法(Bone等1993)或圓二色性分析法(Britton1994)的方法來相互區(qū)分。黃斑中的玉米黃質(zhì)和黃體素早在1970年，人們就已熟知類胡蘿卜素在保護植物避免光毒損壞中的作用。人們還知道動物組織中存在類胡蘿卜素，和動物的所有類胡蘿卜素都源自植物，因為動物不能合成類胡蘿卜素?；谶@些信息，許多文章指出了動物和植物中類胡蘿卜素之間的相似性，并總結(jié)出類胡蘿卜素在動物體內(nèi)起保護作用避免光毒損傷。認識了類胡蘿卜素在動物體內(nèi)的光防護性作用之后，研究人員開始研究類胡蘿卜素在視網(wǎng)膜中的化學性質(zhì)和作用。一組實驗包括的測試中對實驗動物喂不合任何類胡蘿卜素的食物，這類食物由不含類胡蘿卜素的谷物或籽(如買羅高粱籽)制備。結(jié)果表明，喪失類胡蘿卜素的實驗動物視網(wǎng)膜中未生長任何黃斑區(qū)，且這些視網(wǎng)膜中含有異常高含量的軟脈絡(luò)膜小疣，表示視網(wǎng)膜已受損害(Malinow等1980，Kirschfeld1982，Ham等1984，和Snodderly等1984)。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，研究人員認為類胡蘿卜素似乎對健康的視網(wǎng)膜至關(guān)重要。這些研究人員當時一直在為常識即胡蘿卜和葉多的綠蔬菜對眼有好處搜集分子角度的證據(jù)。然而，科學家們尚不知黃斑中的黃色色素是否以最終形式吸收，或者它們是否可在動物體內(nèi)用其它前體如β-胡蘿卜素或番茄紅素而合成。在1949年把黃體素鑒定為黃斑中黃色色素之一(Wald1949)。直到多年后才將ZX鑒定為另一種黃斑色素(Bone等1985)。至八十年代中期或晚期歸納了關(guān)于黃斑色素的已知信息的論文包括Handelman和Dratz1986，Werner等1987，Pease等1987，Haegerstrom-Portnoy1988，和Handelman等1988。這些論文特別證實，ZX(它是充分共軛的，因而它多少比黃體素提供更好的保護作用以抗光能引起的損傷)是在凹部即黃斑正中心的小區(qū)內(nèi)主要的色素。同心地離開凹部而向黃斑的外周邊靠近，則ZX的量逐漸減少，而黃體素的量隨之漸增，所以在黃斑外圍，黃體素是主要的黃色色素。更近期的文獻闡述了視網(wǎng)膜老化和損傷的各方面，且尤其集中于在視網(wǎng)膜中作為防護劑的類胡蘿卜素，這類文獻包括Sperduto等1990，Gerster1991，Schalch1992，和Seddon等1994?？傊?，十余年前人們就已知黃體素和ZX是黃斑中的兩種色素，且科學家們在十多年前就預測到這些色素能幫助保護黃斑以抗光毒損傷。然而，盡管10多年前就有這些發(fā)現(xiàn)和建議，但還沒有人開發(fā)出能明顯有效地預防或阻止(更不用說逆轉(zhuǎn))逐漸加重的黃斑變性的任何藥物、任何營養(yǎng)的或飲食的輔助劑或其它形式的療法。需要對前面的話語需稍作限定，因為已知β-胡蘿卜素、維生素A和維生素E對于保護視網(wǎng)膜組織有一定程度的有益效果(例如參見，美國專利5,310,764，Baranowitz等1994，和下面引用的由theEyeDiseaseCaseControlStudyGroup撰寫的兩篇論文)。這些專利和論文聲稱或建議，β-胡蘿卜素、維生素A和維生素E對于預防或減輕與黃斑變性相關(guān)的損壞作用具有可測到的效果。這種說法可能正確，因為類胡蘿卜素、維生素A和維生素E一般可起抗氧化劑作用。但遺憾的是，β-胡蘿卜素、維生素A和維生素E帶給視網(wǎng)膜的益處相當有限，且不能達到有效治療的程度。實際上，黃斑變性都是不可預防的、不可阻止的和不可逆轉(zhuǎn)的。任何廣譜抗氧化劑(如β-胡蘿卜素、維生素A和維生素E)都只能達到治標程度。由于未能達到真正的效果，所以業(yè)已應(yīng)用那些維生素(獲得極為有限的和不理想的成功)試圖減緩黃斑變性引起的嚴酷損傷。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，還應(yīng)注意很多保健食品店銷售的類胡蘿卜素制品標示為有益于眼睛和視力。那種對于類胡蘿卜素混合物的標稱可能有道理，因為(如前所述)已知β-胡蘿卜素和維生素A適用作一般的抗氧化劑。但是，可商購的類胡蘿卜素混合物都不含甚至是微量的ZX。保健食品店銷售的類胡蘿卜素混合物中絕大部分類胡蘿卜素都是非玉米黃質(zhì)的類胡蘿卜素(主要是β-胡蘿卜素和維生素A)。幾個重要的管理機構(gòu)和研究聯(lián)合體的主張和研究目標也值得認真關(guān)注。在美國，theNationalInstituteofHealth(通過theNationalEyeInstitute(NEI)和theNationalAdvisoryEyeCouncil起作用)最近發(fā)表了兩篇報道，即“VisionResearchANationalPlan1994-1998，”NIHPublicationNo.93-3186(1994；具體見pp.55-65)，和“Agerelatedeyediseasestudy，”NIHPublication93-2910(1993)。兩篇報道和他們描述的研究工作都集中于認為β-胡蘿卜素(而不是ZX)是治療AMD最有前途的化合物。就申請人所知和所信，在與NEI的官員們探討了本主題后，NEI和隸屬于theNationalInstituteofHealth的其它機構(gòu)都不愿資助或者最近尚未資助有關(guān)玉米黃質(zhì)有可能治療AMD的研究。反之，NIH和其它靠稅款資助的機構(gòu)撥給數(shù)百萬美元以資助關(guān)于β-胡蘿卜素作為治療或預防AMD最有前途的候選物質(zhì)的研究。應(yīng)仔細關(guān)注的其它主要研究人員屬于“EyeDiseaseCaseControlStudyGroup”。該研究小組近期發(fā)表了如下兩篇論文“Antioxidantstatusandneovascularage-relatedmaculardegeneration，”Arch.Ophthalmol.11104-109(1993)和“Riskfactorsforneovascularage-relatedmaculardegeneration，”Arch.Ophthalmol.101701-1708(1992)。同NIH的正式報道一樣，這兩篇論文均未啟示或建議將玉米黃質(zhì)作為藥物用于治療AMD，且該聯(lián)合組織也拒絕資助任何關(guān)于ZX作為治療或預防AMD的可能物質(zhì)的研究。還應(yīng)注意，在將類胡蘿卜素用于治療或預防癌(起始于Peto等1981)和用于阻止膽固醇形成和減少在動脈內(nèi)沉積的斑塊(Jialal等1991)方面引起很多關(guān)注。有大量科學文獻涉及不同活性的類胡蘿卜素，且對于化學合成包括黃體素和ZX的類胡蘿卜素的方法存在著濃厚興趣。然而，不管過去數(shù)十年中所有對類胡蘿卜素的研究和合成方面的努力怎樣，迄今尚未見報道治療或預防黃斑變性的任何有效方法。鑒于黃斑變性給受害者們和社會造成的巨大費用和痛苦，必須指出，這是一個嚴重問題。因此，本發(fā)明可能是一項重大突破，它提供如下兩項(1)安全而有效的藥物，用于治療被診斷為患有黃斑變性的患者，和(2)可與維生素九相比的營養(yǎng)輔劑，任何到了或過了中年、可能患有黃斑變性的男士或女士想要減小疾病危險性的話均可服用它。黃體素和玉米黃質(zhì)的合成現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)有技術(shù)中很多項目描述了制備ZX的方法。這些項目可分為兩類發(fā)酵法，其中微生物在制備過程中起關(guān)鍵作用；和非發(fā)酵合成法，其中應(yīng)用純粹的化學反應(yīng)。現(xiàn)有技術(shù)有很多項目建議ZX應(yīng)當用于已知用途，例如家禽飼料或魚飼料中的添加劑，使肉的顏色變深使之更具吸引力。顯然，這些嘗試均未導致任何在商業(yè)規(guī)模上的生產(chǎn)或銷售ZX。在1995年10月，購買純化形式或半濃縮形式的ZX(其中ZX含量約在5wt％以上)的唯一途徑需要從專門的化學公司例如AtomergicChemicalsCorporation(Farmingdale，NY)或SpectrumChemicalManufacturingCompany(Gardena，CA)購買毫克量的ZX。1995年這些專業(yè)制造商的純ZX(為含有不需要的S-S和S-R異構(gòu)體的合成外消旋混合物形式)，價格為每毫克約$90-約$125。換算成每克ZX(外消旋混合物形式)約$100,000(以美國貨幣表示)。顯然，這些制劑在用作藥物或營養(yǎng)輔劑方面沒有現(xiàn)實可能性，不僅因為它們價格高昂，還因為它們含有大量不需要的和可能有害的S-S和內(nèi)消旋異構(gòu)體。在本發(fā)明之前，公眾根本得不到任何形式的純化或半純化的R-R玉米黃質(zhì)。描述利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)ZX的現(xiàn)有技術(shù)項目包括(1)Courington和Goodwin1955，已知這是描述由得自黃桿菌屬(Flavobacter)的細菌生產(chǎn)ZX的最早文獻。(2)美國專利3,891,504(Schocher和Wiss，1975，轉(zhuǎn)讓給HoffmanLaRoche)，也描述了由黃桿菌屬細胞生產(chǎn)ZX。將這類含有ZX的細胞喂給雞之后，引起了適度著色。(3)美國專利3,841,967(Dasek等，1974)和美國專利3,951,743(Shepherd等，1976)。它們均轉(zhuǎn)讓給Nestle。這些專利描述了可用于提高細菌生產(chǎn)的ZX量的方法和營養(yǎng)物。(4)更近期的美國專利(US5,308,759和5,427,783，均由Gierhart發(fā)明)，轉(zhuǎn)讓給AppliedFoodBiotechnology，Inc.，與本文相同的受讓人與申請人。這些專利描述了從密蘇里河分離的細菌菌株(多食黃桿菌(Flavobacteriummultivorum))。發(fā)現(xiàn)這些細菌可產(chǎn)生ZX而不會產(chǎn)生大量其它類胡蘿卜素。這對于本文提及的家禽和魚很重要，其中對家禽和魚喂食可使肉和蛋黃顏色更深；因為被動物食用后，攝入血流時類胡蘿卜素之間相互競爭。因此，由Gierhart鑒定的多食黃桿菌菌株中沒有其它類胡蘿卜素，就可使動物組織獲得更多的作為色素的ZX，于是就會提高它的效力和性能?！?59專利要求了生產(chǎn)用于家禽或魚飼料的ZX的方法，用到AFB的多食黃桿菌。分案即’783專利，要求了飼料混合物。這兩件專利都限于將ZX用于家禽飼料或魚飼料，且都未提及將ZX用于醫(yī)治人的任何信息。Gierhart的兩件專利均未述及有關(guān)ZX的具體立體異構(gòu)體，原因有二(1)當1989年提出這些申請時，還不知道由AFB的多食黃桿菌細胞產(chǎn)生的ZX立體異構(gòu)體情況，和(2)由于這些專利只涉及生產(chǎn)用于家禽飼料或魚飼料的ZX，所以沒有明顯理由涉及不同的立體異構(gòu)體。AFB的野生型菌株多食黃桿菌保藏于ATCC，并獲得ATCC登記號為55238。由于這些細菌產(chǎn)生一種稱為鞘脂的脂質(zhì)，所以ATCC將這類細菌重新歸類為多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummultivorum)，并在它們的目錄中該名下列出了這些細胞。ATCC目錄中的鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)名尚未出現(xiàn)于被視為微生物分類學正式指南的下列參考著作中Bergy’sManualofSystematicBacteriology，它由InternationalJournalofSystematicBacteriology增補和修訂。在過去20年中報道了由標準化學合成法(未應(yīng)用微生物)制備ZX，包括美國專利4,153,615(Saucy1979)，4,952,716(Lukac等1990)，和5,227,507(Lukac等1993)。然而，這些方法存在嚴重的缺點。它們通常需要很多反應(yīng)步驟，且每步的產(chǎn)率小于100％，所以多步操作最后的ZX終產(chǎn)率相當小。此外，化學合成一般生成不需要的ZX的S-S和S-R立體異構(gòu)體，還有各種轉(zhuǎn)化或降解產(chǎn)物如氧化的玉米黃質(zhì)，和在直鏈部分和/或端環(huán)上失去一個或多個雙鍵的玉米黃質(zhì)分子?？傊诒景l(fā)明之前，還沒有作為藥物或營養(yǎng)輔劑適合人們消費的純化過的R-R玉米黃質(zhì)的已知資源。因此，本發(fā)明的一個目的是公開AFB的多食黃桿菌菌株(ATCC登記號為55238)及其誘變子代能產(chǎn)生作為單一可檢測異構(gòu)體的ZX的R-R立體異構(gòu)體，而不產(chǎn)生可檢測量的、不需要的S-S或S-R立體異構(gòu)體。本發(fā)明的另一個目的是公開應(yīng)用AFB的多金黃桿菌菌株(ATCC登記號為55238)的子代細胞來制備藥劑的方法，該藥劑用于治療業(yè)已診斷為患有黃斑變性、特別是年齡相關(guān)性黃斑變性的患者。本發(fā)明的又一個目的是公開應(yīng)用AFB的多食黃桿菌菌株(ATCC登記號為55238)的子代細胞來制備供人服用的營養(yǎng)輔劑的方法，該營養(yǎng)輔劑的形式可與維生素丸相比，或作為如人造黃油的食品中的添加劑，用于減小生命晚期黃斑變性的危害。本發(fā)明的第三個目的是公開含有作為單獨或最主要異構(gòu)體的R-R立體異構(gòu)體的玉米黃質(zhì)制劑，這類制劑呈適于人口服的調(diào)和物形式，可作為藥物以治療視網(wǎng)膜疾病或變性，或者作為營養(yǎng)輔劑以減小老人們視力衰退的危害。下列對本發(fā)明的概述和描述將使這些和其它目的更為明顯。本發(fā)明公開了制備玉米黃質(zhì)的方法，該玉米黃質(zhì)含有作為單獨可檢測的或最重要的異構(gòu)體的玉米黃質(zhì)3R-3’R立體異構(gòu)體(也稱為R-R異構(gòu)體，或R-R玉米黃質(zhì))，它作為藥物或營養(yǎng)輔劑供人吸收。ZX是人視網(wǎng)膜黃斑細胞中的一種黃色色素，能吸收藍光和近紫外光輻射，因而能保護視網(wǎng)膜以抗光毒損傷。只含有所需的R-R異構(gòu)體的ZX制劑是由多食黃桿菌細胞株(ATCC登記號為55238)產(chǎn)生的。這些細菌不產(chǎn)生任何可檢測量的不需要的S-S或S-R立體異構(gòu)體；并且它們不合成大量的其它類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素或黃體素，口服后這些類胡蘿卜素可與ZX競爭消化攝取。應(yīng)用這類細菌合成之后，ZX可由例如溶劑提取的方法純化，并可口服，可作為患有黃斑變性患者的治療藥物，也可作為營養(yǎng)輔劑供想要減小患年齡相關(guān)性黃斑變性的危險性的人們服用(年齡約為50或60歲的人普遍會患年齡相關(guān)性黃斑變性)。還公開了便于吸收的調(diào)和物，例如(1)含有與例如植物油的載體混合的R-R玉米黃質(zhì)的水密膠囊；(2)含有作為添加劑的R-R玉米黃質(zhì)的各種食品(例如人造黃油、乳制品、糖漿、制曲奇餅干面團和未猛烈燒烤過的肉制品)，和(3)可加入湯、色拉、飲料或其它食品的粒狀調(diào)和物。圖1描繪了β-胡蘿卜素、黃體素和玉米黃質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，示出了這三種類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)和端環(huán)的編號系統(tǒng)。這些結(jié)構(gòu)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。圖2包括的流程圖描述了由微生物生產(chǎn)ZX的發(fā)酵和純化步驟，其中合成立體異構(gòu)純的3R-3’R玉米黃質(zhì)。本發(fā)明公開了制備藥物或營養(yǎng)調(diào)和物的方法，其中的藥物或營養(yǎng)調(diào)和物供人服用以預防或減輕黃斑變性，該病會損壞視力和引起失明。供人吸收的玉米黃質(zhì)制劑應(yīng)含有作為“最主要”異構(gòu)體的ZX的3R-3’R立體異構(gòu)體(為方便起見，也稱為R-R異構(gòu)體，或R-R玉米黃質(zhì))。此處定義的“最主要的異構(gòu)體”表示至少含有90％或更多的R-R異構(gòu)體的制劑，其中包括的不需要的S-S或S-R異構(gòu)體占制劑中所有玉米黃質(zhì)的10％以下。任何供人用的制劑應(yīng)優(yōu)選包含作為單獨可檢測異構(gòu)體的ZX的R-R異構(gòu)體，其中不含可檢測量的不需要的S-S或S-R異構(gòu)體。本文公開了這類制劑。近期，采用手性柱色譜分析法(如Bone等，1993年所述)已發(fā)現(xiàn)，當按實施例中所述方法發(fā)酵時，由AppliedFoodBiotechnology(AFB)分離的多食黃桿菌菌株(ATCC登記號為55238)產(chǎn)生作為單獨可檢測ZX異構(gòu)體的R-R異構(gòu)體。如實施例4中所述，Landrum教授的分析表明，由發(fā)酵得自多食黃桿菌菌株的細胞產(chǎn)生的ZX制劑中沒有可檢測量的S-S異構(gòu)體或R-S內(nèi)消旋異構(gòu)體。如果讓人服用作為藥物或營養(yǎng)輔劑的ZX制劑，則玉米黃質(zhì)的R-R、R-S或S-S異構(gòu)體的差異相當重要，因為天然存在于人視網(wǎng)膜中的ZX異構(gòu)體只有R-R異構(gòu)體。據(jù)認為，從醫(yī)藥角度來看，吸收大量的R-S和S-S異構(gòu)體將是很不希望的和危險的，因為(1)人視網(wǎng)中沒有天然存在的R-S和S-S異構(gòu)體，只是當黃體素在視網(wǎng)膜細胞內(nèi)降解時可能形成作為副產(chǎn)物的極微量這兩種異構(gòu)體，和(2)R-S和S-S異構(gòu)體會競爭替換視網(wǎng)膜組織中所需的R-R異構(gòu)體，可能導致嚴重的長期細胞損傷和醫(yī)學并發(fā)癥。本文公開的由多食黃桿菌發(fā)酵制備的ZX制劑立體異構(gòu)純度極有價值，因為化學合成ZX之后分離立體異構(gòu)體特別難且費用昂貴。雖然在小規(guī)模的實驗裝置中有可能分離立體異構(gòu)體，但在商業(yè)化規(guī)模中分離費用卻特別高。用作治療AMD患者的處方藥物在本發(fā)明的第一方面中，本文公開的R-R玉米黃質(zhì)制劑可作為藥物調(diào)制和服用，即作為可由醫(yī)師開處方的藥劑，用于治療業(yè)已診斷為患有黃斑變性，或患有能引起以黃斑變性為癥狀或表現(xiàn)的疾病的患者，例如Stargardt病、Best病、Batten病、Sjogren-Larsson綜合征、視網(wǎng)膜錐-桿營養(yǎng)不良、羊蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥，或溶酶體貯存病例如家族性黑蒙性自癡。當用于這類治療時，ZX制劑必須具有足夠量ZX的R-R異構(gòu)體以達到治療劑的含量，如下文所述，該治療劑處于可供人服用的載體物質(zhì)或劑型(例如膠囊)中。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于藥物治療的ZX以單位劑量形式包裝，例如膠囊或藥片。每個劑量優(yōu)選應(yīng)至少包含約1毫克(mg)R-R玉米黃質(zhì)，如果要求更佳療效，還可包含約3mg-約10mg玉米黃質(zhì)。在本發(fā)明的第二方面，本文公開的R-R玉米黃質(zhì)制劑可作為預防藥劑調(diào)制和供已診斷為對黃斑變性易感性高的患者服用，例如因為家族史或遺傳診斷為上面列舉的疾病的患者。供很可能會患AMD但實際上尚未患有AMD的患者服用而制備的單位劑量，可包含更少的量，例如每個劑量約0.1mg-約2mg。應(yīng)用本文的公開說明，這些劑量均可以商業(yè)上合理的價格提供。含有25毫克(或更少的量)呈油狀載體流體的膠囊可以經(jīng)濟的方式制備，其中采用微生物發(fā)酵和溶劑提取步驟相結(jié)合。如果運用更徹底的純化如實施例4中所述方法，則可生產(chǎn)含量更高(例如每個劑量100毫克或更多)的粉狀調(diào)和物。用作維生素或營養(yǎng)輔劑在本發(fā)明的第三個方面中，ZX可被制作成和包裝成維生素或營養(yǎng)輔劑或食品添加劑的形式，供這種人消費，即他們目前未患黃斑變性，但希望在生命晚期減小患黃斑變性的可能性。用于這類目的吸收時，合適的劑量應(yīng)為遠遠高于現(xiàn)今保健食品店中出售的粉狀物中測得的痕量，但要少于當ZX作為治療藥物供已診斷為患有AMD的患者服用時的量。基于每天吸收的劑量，這種劑量可能在約0.05毫克至多達約5mg的范圍內(nèi)。例如，當R-R玉米黃質(zhì)屬于多種維生素膠囊或片劑中一打或更多種物質(zhì)之一時，合適的劑量為0.05-1.0mg；但對于需要更高劑量的人們購買的不需處方但可合法出售的這類輔劑，劑量可以為1mg-5mg。不管是用作治療藥物還是營養(yǎng)輔劑，供人服用的ZX制劑應(yīng)含有作為ZX的單獨的或“最主要立體異構(gòu)體”的R-R異構(gòu)體。本文應(yīng)用的術(shù)語“最主要的立體異構(gòu)體”所描述的ZX制劑中所需的ZX的R-R異構(gòu)體至少約占混合物中全部ZX的90％，而不需要的S-S或S-R異構(gòu)體少于約10％。在任何供人吸收的制劑中，R-R異構(gòu)體都應(yīng)優(yōu)選為唯一可檢測到的ZX的異構(gòu)體。本發(fā)明已在商業(yè)規(guī)模和合理價格上使這一條件切實可行，因為本文描述的多食黃桿菌細菌系產(chǎn)生的R-R異構(gòu)體是唯一可檢測到的ZX的立體異構(gòu)體。如果純化后發(fā)酵的混合物中存在任何S-S或S-R異構(gòu)體，則它們的量少到按實施例4中所述方法測不出。此外，與大多數(shù)細菌菌株不同，本文所述的多食黃桿菌細胞不產(chǎn)生類胡蘿卜素的混合物；這些細胞產(chǎn)生的可檢測類胡蘿卜素只有R-R玉米黃質(zhì)。由于ZX必定與其它類胡蘿卜素競爭消化攝取和組織沉積，這樣在口服之后可能有利于提高ZX攝取和視網(wǎng)膜沉積，尤其是當ZX被用作藥物治療黃斑變性病例時。通過細菌發(fā)酵法進行的工業(yè)規(guī)模制備如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知那樣，用于在實驗裝置中發(fā)酵細菌的方法當轉(zhuǎn)化為大規(guī)模的制備操作時費用很高且難于控制。因此，本申請人為商業(yè)應(yīng)用多食黃桿菌研制了更好的營養(yǎng)物和方法。與在此之前在美國專利5,308,759和5,427,783中公開的介質(zhì)和條件相比，該改進的營養(yǎng)物和方法大大易于操作，且生產(chǎn)每克ZX的費用要低得多。優(yōu)選的營養(yǎng)物和條件描述于實施例1中。發(fā)酵后，可往細胞中加入一種或多種穩(wěn)定化合物，以防ZX在純化期間降解。在開始巴氏殺菌或其它處理之前，當細胞仍在發(fā)酵罐中時就可加入穩(wěn)定劑。申請人已測試了各種候選穩(wěn)定劑。應(yīng)用實施例2中列舉的組合穩(wěn)定劑可獲得迄今最佳結(jié)果。加入穩(wěn)定劑之后，可加熱至55℃達25分鐘對細菌進行巴氏殺菌，以殺死細菌而不損壞ZX。然后將培養(yǎng)物冷卻至室溫，通過機械方法如交叉流微量過濾從細胞中脫除液體。這樣可將細胞和固形物的濃度從約10vol％的初始值提高到約60-80vol％的濾后濃度。于是形成細胞漿?？膳c含有存活的或已殺死但完整的微生物細胞的其它食品(干酪、酸牛奶、啤酒等)相比，多食黃桿菌細胞(呈完整的和可能存活的狀態(tài))可適于人們直接吸收。多食黃桿菌細胞沒有已知的致病性。它們是從冷水流分離出來的，且由于它們適于在冷水中生活，所以它們在人體的溫度下不能很好地生存或繁殖。此外，這些細胞沒有任何已知的毒性成分；它們呈革蘭氏陰性，因而沒有革蘭氏陽性菌那樣的細胞壁結(jié)構(gòu)。當以細胞漿的形式直接向鳥或魚喂食時，該細菌細胞顯得很適合于作遞送載體。當動物消化該細胞時便釋出ZX，于是ZX被吸收入血流，沉積入各種組織(包括視網(wǎng)膜)中適當?shù)牟课?。因此，含R-R玉米黃質(zhì)的完整多食黃桿菌細胞可適合人們直接消費，需要的話，可以下述三種形式中的任一種(1)完整的存活形式；(2)巴氏殺菌后完整的殺滅形式；或(3)調(diào)和物，該調(diào)和物中的細菌細胞已被殺死且它們的膜已破裂，以破開細胞使得更易于獲得ZX。這可通過下列方法達到，如超聲處理(運用高頻聲波)、高壓或研磨。如果采用溶劑提取操作來破裂細胞膜，則可略去這一步驟。需要的話，ZX制劑可包括細胞漂洗步驟，其中在發(fā)酵后通過用含所需組分如穩(wěn)定劑、防腐劑、調(diào)味劑等等的溶液沖洗細胞而除去多余的營養(yǎng)物和廢代謝物。純化需要的話，可將細胞漿(含完整的或破裂的細胞)干燥以進一步濃縮細胞并提高干物料中的ZX濃度。這可通過機械方法例如噴霧干燥(利用熱能)或者冷凍干燥(在真空下凍干)來實現(xiàn)。如果進行干燥，則所得固體殘余物常被稱為干生物量；它一般包含約1-10wt％的ZX，和其它細胞固形物、得自發(fā)酵介質(zhì)的殘余固體和上述穩(wěn)定劑。先于或晚于(或代替)破裂或干燥，可進行提取步驟以濃縮ZX，它主要積聚于細胞膜中。提取用的合適溶劑一般包括極性有機溶劑。迄今認為最佳溶劑是四氫呋喃(THF)，它侵蝕細胞從而無需單獨的膜破裂步驟。雖然在實驗室操作中應(yīng)用THF時不需攪拌，但在工業(yè)生產(chǎn)中在溶劑混合步驟期間可能需要攪拌。其它溶劑也已測試過而且將繼續(xù)測試和估價，但迄今測試的沒有一種有THF那樣好。迄今測試過的非環(huán)狀有機溶劑(例如丙酮和乙醚)具有較低的ZX溶解度，而其它溶劑如甲醇、乙醇、和己烷對ZX的溶解度甚至更小。在使溶劑盡可能多地溶解ZX的條件下，將溶劑與細胞漿或干生物量混合。然后采用例如離心分離或過濾法將溶解的液體部分與固形物分離。固形物可以棄去或用作其它處理步驟(需要的話，包括重復的溶劑提取循環(huán))的原料。通常通過蒸發(fā)處理液體部分以除去溶劑。殘留下粘稠的油狀物，其中含有R-R玉米黃質(zhì)和由溶劑從細胞漿中溶出的其它可溶性組分。當將THF用于一次性操作提取含1-3wt％ZX的細胞時，接著蒸發(fā)除去THF之后，所得液體包含約5wt％-約20wt％ZX。表現(xiàn)出良好的初步結(jié)果的另一種溶劑提取包括運用超臨界流體(即在常壓下一般是氣體但在較高壓力下變成可作為溶劑的液體的化合物)。二氧化碳是在超臨界提取中用得最廣泛的溶劑，且可獲得工業(yè)規(guī)模的CO2提取系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，在高壓反應(yīng)器中將液化二氧化碳與細胞漿或干生物量混合。然后使該液體流過一系列容器，這些容器逐漸減小壓力。ZX可在較高壓力下從溶液中沉淀析出，所以可在減壓步驟早期收集ZX，而大量雜質(zhì)仍溶于二氧化碳中并將被帶到進一步降壓的其它反應(yīng)器中。應(yīng)用夾帶劑(例如乙醇、丙二醇或乙酸乙酯)可進一步提高超臨界溶劑提取的效果。在初步實驗中已測試了幾種這類夾帶劑，它們業(yè)已表現(xiàn)為顯著提高ZX在超臨界二氧化碳中的溶解性。雖然在超臨界提取中廣泛應(yīng)用了二氧化碳，但也用到其它化合物(包括各種含氮或含氯氟烴化合物)?？梢詼y試隨壓力變化經(jīng)歷氣相和液相的任何這類溶劑，以確定它是否適合于如本文所述純化得自細菌的ZX。需要的話，由溶劑提取或超臨界提取而得的含ZX的油狀流體，可與如植物油那樣的載體物質(zhì)混合，然后不需要任何進一步純化ZX而包封于供人吸收而設(shè)計的膠囊內(nèi)。這樣可提供制備供人吸收的半純、可消化形式的R-R玉米黃質(zhì)的經(jīng)濟方法，可作為藥物供給患有黃斑變性的患者，或者作為營養(yǎng)輔劑供給希望在生命晚期減小患黃斑變性的危險性的人們。也可進一步純化呈半純、油狀液體的R-R玉米黃質(zhì)，以提高ZX濃度和除去任何雜質(zhì)。這可通過例如下列方法實現(xiàn)(1)雙溶劑系統(tǒng)，其中應(yīng)用兩種選擇的溶劑的組合；(2)在基質(zhì)(例如織物濾床)上吸附，促使ZX結(jié)晶；或(3)逆流色譜法。實施例4中描述了采用色譜法純化ZX至約98％的純度。用于其它類胡蘿卜素的純化方法公開于美國專利5,382,714(Khachik1995)和4,851,339(Hills1989)中。由于它們的化學相似性，可純化β-胡蘿卜素或黃體素的任何技術(shù)也可能在純化ZX時給出良好結(jié)果。服用方法經(jīng)口吸收是讓人服用ZX以保護視網(wǎng)膜的優(yōu)選方法，如下文所述，采用的吸收方式例如有日服或周服的膠囊，或應(yīng)用添加了ZX的食品或食品添加劑。治療時不需在固定的時間間隔按時服用(如日服或周服藥丸)，而是時斷時續(xù)地服用使得每次劑量能在適當?shù)臅r間段(例如一天或更多天，優(yōu)選在一周以內(nèi))消逝，這樣就能使小量ZX逐漸沉積于黃斑組織內(nèi)。與任何維生素輔劑一樣，單次劑量可能有益，但單次劑量在數(shù)年期間沒有定期小劑量那樣好。對于哺乳動物攝取類胡蘿卜素的研究表明，日服比周服或其它偶爾攝取更好，由于血液濃度中表現(xiàn)出的“荷載”因素。由于口服后攝取類胡蘿卜素量較低，所以患有嚴重黃斑變性的患者最好采用其它服藥方式例如肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或植入緩釋裝置?？勺⑸涞妮d體調(diào)和物可包括水、緩沖劑和帶有多羥基的有機化合物如丙二醇、葡聚糖或環(huán)糊精化合物?？刹捎酶鞣N口服包裝方式，只要它能保護ZX以防氧化和考慮ZX的油性性質(zhì)。合適的口服組合物實例包括(a)可消化的水密膠囊和含于其內(nèi)的流體，該膠囊和流體大小應(yīng)適于整個吞咽，且都是藥理上可接受的，其中的流體含有與適當載體或稀釋劑如植物油混合的R-R玉米黃質(zhì)。需要的話，如實施例9或10中所述那樣，該流體化ZX可以是微膠囊化或包封于微膠粒內(nèi)，以保護ZX防止在胃中降解。這種膠囊可由較硬的、緊密的材料制成，或者由柔韌的材料例如包封維生素E的常用膠囊材料制成。如果構(gòu)成膠囊的材料能抗胃中的酸性并能被腸道中的酶消化，則可保護ZX以防在胃中降解，并提高ZX的生物利用率。然而，已知至少一部分作為咀嚼的植物質(zhì)成分進入胃的ZX能在經(jīng)過胃時未受損壞；因此，保護ZX以抗胃酸并非很重要，且膠囊材料的選擇將是經(jīng)濟上的優(yōu)選問題而不是科學規(guī)定。(b)適于人口服的片劑，該片劑包含R-R玉米黃質(zhì)和與玉米黃質(zhì)相容的可壓縮的粘結(jié)材料，該粘結(jié)材料能使該片劑在適當壓力下壓縮之后保持其形狀，并且該片劑是藥理上可接受的，其大小適于整個能吞咽。需要的話，該片劑可帶有一層包衣以保護ZX抗胃酸。(c)包含供人消費的食品的組合物，它是營養(yǎng)上可接受的且味道良好，它適合作為玉米黃質(zhì)的載體，且它含有作為添加劑的R-R玉米黃質(zhì)。ZX是一種橙黃色色素，它的疏水性通常與植物油、油酥和雞油一樣；它也類似于如β-胡蘿卜素的其它類胡蘿卜素食品著色劑。因此，它可作為營養(yǎng)著色劑加入各種食品，例如人造奶油、乳制品、糖漿、焙烤食品、制曲奇餅干面團、胡桃巧克力小方餅面糊、不進行猛烈燒烤的肉制品和湯佐料。其它合適的食品可包括粒狀調(diào)和物，例如用作湯、色拉、焙烤食品等等的添加劑的加鹽的或加香料的調(diào)料。需要的話，粒狀調(diào)和物可具有保護性包衣以減弱胃酸對ZX的降解。許多文獻描述了β-胡蘿卜素和其它類胡蘿卜素作為著色劑和營養(yǎng)添加劑的應(yīng)用；實例包括Klaui等1970；Klaui和Bauernfeind1981；Colombo和Gerber1991，和美國專利4,522,743(Horn等1985)，5,180,747(Matsuda等1993)，5,350,773(Schweikert等1994)，和5,356,636(Schneider等1994)。由于它們的化學相似性，任何在供人食用的食品中加入β-胡蘿卜素或黃體素的方法也同樣可能直接應(yīng)用于R-R玉米黃質(zhì)。(d)包含供人吃的食料的組合物，其中的食料含有對人無害的微生物細胞，它還含有玉米黃質(zhì)的R-R異構(gòu)體。這種食料可選自干酪、酸牛奶、牛奶和啤酒。需要的話，該微生物細胞可以是存活的，或者它們已由例如巴氏殺菌或裂解的方法殺死。其它包裝形式也行得通而且可優(yōu)選供各種應(yīng)用。檢測動物內(nèi)的R-R玉米黃質(zhì)測試用得自ATCC55238系的多食黃桿菌細胞合成的ZX在一種鳥內(nèi)的保護視網(wǎng)膜作用，該鳥名為Coturnixcoturnixiaponica，通常稱為日本鵪鶉。這種鳥為人的黃斑變性提供有用的動物模型，是因為下列因素的緣故(1)在一些重要方面日本鵪鶉的整個視網(wǎng)膜象人的黃斑。例如，該鵪鶉視網(wǎng)膜包含ZX和黃體素，而且與人的黃斑相似，它富含感光錐而不是視網(wǎng)膜桿。(2)日本鵪鶉視網(wǎng)膜表現(xiàn)出與人視網(wǎng)膜有某些相同的病理癥狀。例如，日本鵪鶉視網(wǎng)膜積累軟脈絡(luò)膜小疣和脂褐質(zhì)，它們與人的AMD發(fā)生緊密相關(guān)。(3)雖然鵪鶉視網(wǎng)膜比人視網(wǎng)膜小得多，但由于存在ZX和黃體素而使整個鵪鶉視網(wǎng)膜呈黃色。這有效地使鵪鶉的整個視網(wǎng)膜作為人視網(wǎng)膜中心小黃斑區(qū)的模型，而且它使得分析和觀察容易得多。(4)日本鵪鶉的視網(wǎng)膜無血管，其結(jié)構(gòu)類似于人視網(wǎng)膜的凹部區(qū)。(5)日本鵪鶉的壽命大致為1-1.5年(雌性)和3-4年(雄性)。這使得易于研究老化過程，而對于壽命更長的動物卻很難進行這種研究。在Fite等1991和Fite等1993中，這些因素討論得更詳細。測試試驗如實施例5-8中所述。結(jié)果極好，清楚地表明由多食黃桿菌細胞生產(chǎn)的R-R玉米黃質(zhì)(1)在口服后適當?shù)爻练e于黃斑中，和(2)在保護視網(wǎng)膜細胞以抗光毒損傷方面高度有效。此外，如實施例8中討論的那樣，初步結(jié)果表明，在保護視網(wǎng)膜以抗光毒損傷方面R-R玉米黃質(zhì)遠比β-胡蘿卜素有效。當以高劑量對試驗動物喂食β-胡蘿卜素時，β-胡蘿卜素提供的較小保護效果甚至達不到統(tǒng)計顯著性水平。反之，當對動物喂食同樣劑量的R-R玉米黃質(zhì)時，它完全阻滯和防止了被測視網(wǎng)膜損傷的顯示。R-R玉米黃質(zhì)的微生物源本文公開的多食黃桿菌細胞在ATCC保藏(如前所述，ATCC登記號為55238；按ATCC分類，將它們稱為多食鞘氨醇桿菌，但在Bergy’sManual中未改變它們的名稱)。該細胞系為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供數(shù)種選擇方法以進行微生物法合成異構(gòu)體純的R-R玉米黃質(zhì)。首先，這些細胞直接的和未修飾的子代可用于合成R-R玉米黃質(zhì)而沒有可檢測量的其它不需要的立體異構(gòu)體。由這些細胞產(chǎn)生的全部類胡蘿卜素包括90％以上的ZX，即所需的類胡蘿卜素。其次，ATCC55238株的子代在修飾后可用于提高ZX的R-R異構(gòu)體產(chǎn)量的方法中?？捎美缦铝袛?shù)種方法中的任一種產(chǎn)生突變型或其它變種細胞系(1)用例如紫外線或X-射線輻射的誘變劑或者用已知的化學誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍處理野生型ATCC55238株的子代；(2)通過將多食黃桿菌細胞與能主動地促進細菌細胞之間DNA綴合和交換的其它種細菌混合，而產(chǎn)生有性組合體；或者(3)用能引起較大量DNA重排的細菌轉(zhuǎn)座子或病毒處理多食黃桿菌。這些技術(shù)引起子細胞中的隨機改變，再通過篩選試驗分析這些子代以鑒定和分離能生產(chǎn)更高含量ZX的子代細胞。應(yīng)用能抑制產(chǎn)生ZX的生物合成途徑中涉及的一種或多種酶的化學物質(zhì)(例如二苯胺、煙堿或洛伐他汀)便利篩選試驗的進行。在非專業(yè)人員的術(shù)語中，這些抑制藥物產(chǎn)生障礙物，后者只能由可產(chǎn)生異常高含量ZX的突變型細胞克制。幸好可用于鑒定高產(chǎn)量突變體或變體的試驗簡便、快速和容易。由于ZX是黃色色素，所以可簡便地采用目視觀察培養(yǎng)板來鑒定具有下列所需特征的突變型菌落(1)良好的細胞生長速率和(2)可產(chǎn)生異常大量黃色色素的能力。需要的話，在用誘變劑處理后的篩選試驗中也可應(yīng)用自動化設(shè)備(例如自動化平板讀數(shù)器，或與流式細胞儀聯(lián)用的細胞分選裝置)。這些誘變技術(shù)和篩選技術(shù)都是本領(lǐng)域中常見的和熟知的。直接從ATCC55238野生型株得到的任何細胞都看成這些細胞的子代，即使它們被按上面列舉的任意方法修飾、誘變或與其它細胞系有性組合。在第三種可選方法中，可生產(chǎn)非子代微生物細胞，它們包含分離自或者得自ATCC55238細胞系的基因，它們表達有助于合成R-R玉米黃質(zhì)的酶。這類基因可應(yīng)用已知技術(shù)分離和鑒定。例如，得自列于美國專利5,429,939(Misawa等1995，上面討論的)中生產(chǎn)類胡蘿卜素“crt”基因的DNA序列，可作為雜交探針用于在ATCC55238細胞系基因組中搜尋具有同源DNA序列的產(chǎn)生類胡蘿卜素的基因。從這些細胞分離的產(chǎn)生類胡蘿卜素的基因于是就可被插入能用于基因轉(zhuǎn)化任何類型所需宿主細胞的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或其它合適的載體，其中的宿主細胞例如有大腸桿菌(E.coli)細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。這種可控基因工程能應(yīng)用得自ATCC55238細胞的基因使轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生R-R玉米黃質(zhì)。此外，ATCC55238細胞的ZX-生產(chǎn)基因的蛋白質(zhì)編碼部分(即轉(zhuǎn)錄成信使RNA的基因部分，它隨后被翻譯成合成ZX的酶)可處于高效能和/或誘導型基因啟動子控制之下。包含得自不同基因的基因啟動子的這類“嵌合的”基因可用于多種目的，例如(1)當細胞在生長和繁殖時抑制ZX的生產(chǎn)，然后在發(fā)酵期間大大提高細胞生產(chǎn)的ZX；和(2)將基因插入優(yōu)選為商用的新型宿主細胞，例如大腸桿菌細菌或酵母細胞，其中可應(yīng)用熟知的和高度優(yōu)化的發(fā)酵、處理和純化技術(shù)。從ATCC55238細胞系分離的ZX-生產(chǎn)基因還可用其它熟知技術(shù)增強。例如，細菌基因常應(yīng)用“非優(yōu)選的”密碼子，減少和控制由基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。為了松馳這種限制機理，得自ATCC55238細胞系的ZX合成基因中的非優(yōu)選密碼子可由能增強ZX-生產(chǎn)酶在選擇的宿主細胞中表達的“優(yōu)選”密碼子替代。另一個實例是，半胱氨酸殘基可通過在相同或其它蛋白質(zhì)分子中與其它半胱氨酸殘基形成不希望有的二硫鍵而阻礙酶的活性或穩(wěn)定性。因此，有時可通過用其它氨基酸殘基置換一個或多個半胱氨酸殘基而增大酶的活性或穩(wěn)定性(例如，授予Mark的美國專利4,737,462)。此外，蛋白質(zhì)的表達常?？赏ㄟ^插入編碼例如甘氨酸的常見氨基酸的密碼子以代替編碼蛋氨酸和色氨酸的密碼子而得以增強，其中后兩種氨基酸較不常見并且傾向于減緩和減少蛋白質(zhì)的表達。當引起這種性質(zhì)的氨基酸取代的合成基因產(chǎn)生后，可測試修飾的蛋白質(zhì)以確定它被以更高量或更穩(wěn)定的形式表達時是否保持所需的酶促活性。這些是已知基因工程技術(shù)的實例，它們可通過從ATCC55238細胞系分離的ZX-生產(chǎn)基因來評價，以確定這種修飾作用是否可提高多食黃桿菌細胞或其它種類宿主細胞生產(chǎn)的ZX。權(quán)利要求中的短語“已被遺傳工程化以包含至少一個玉米黃質(zhì)-合成基因的細胞，其中的基因含有得自ATCC登記號為55238的多食黃桿菌菌株的DNA序列”包括這樣的細胞，它含具有化學法合成的DNA序列的基因，合成中應(yīng)用通過分析ATCC55238細胞系或其子代而確定的DNA或mRNA序列。自動DNA合成儀是人們熟知的并可用于復制任何已知基因序列，而無需復制起始宿主細胞?！坝衩S質(zhì)-合成基因”包括這樣的任意基因它能表達ZX生物合成途徑中涉及的酶或其它蛋白質(zhì)，而且如果它被插入適當?shù)乃拗骷毎涂捎糜谔岣遉X生產(chǎn)，不用考慮ZX生物合成途徑中該基因編碼的具體酶。實施例實施例1工業(yè)規(guī)模發(fā)酵本申請人在初始小規(guī)模實驗室試驗多食黃桿菌而優(yōu)選的營養(yǎng)培養(yǎng)基等同于美國專利5,308,759(Gierhart1994)和5,427,783(Gierhart1995)中實施例3的營養(yǎng)培養(yǎng)基E。該營養(yǎng)培養(yǎng)基包含數(shù)種昂貴且難于加工的成分。為減少費用和為方便起見，在這些申請最初提出之后進行了大量研究以制備更好的工業(yè)規(guī)模營養(yǎng)培養(yǎng)基。目前優(yōu)選用于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的營養(yǎng)培養(yǎng)基已排除玉米粉和幾種其它成分。這些優(yōu)選的培養(yǎng)基包含濃度在1-10％w/v范圍內(nèi)的高麥芽糖淀粉糖漿或甜菜糖蜜，還有0.5-4％w/v的玉米浸泡液的濃縮液；0.5％w/v的七水合硫酸銨；0.5％w/v的氯化鈉；0.1％w/v的七水合硫酸鎂；0.1％w/v的乙酸鈉；0.001％w/v的七水合硫酸亞鐵；0.2％w/v的酵母提取物；0.01％w/v的硫胺素-HCl；1-6％w/v的水解酪蛋白(例如NZAmineHD，由SheffieldProducts，DivisionofQuestInternational，Norwich，NY出售)；和1％v/v的植物油。當這些組分一起混合后，加入足夠的NaOH以提高pH至6.5；反之，如果將該營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.5，如美國專利5,308,759和5,427,783中實驗室規(guī)模的試驗中所述，則太多的固形物從玉米浸泡液的濃縮液中沉淀析出。該培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌30分鐘滅菌之后被冷卻至27℃并用5-10％v/v的“液體預培養(yǎng)物”接種，該“液體預培養(yǎng)物”中包含能產(chǎn)生R-R玉米黃質(zhì)而不產(chǎn)生S-S或S-R立體異構(gòu)體的多食黃桿菌菌株。用于制備液體預培養(yǎng)物的細胞被保持在平板計數(shù)瓊脂的斜面試管上。對這些斜面培養(yǎng)物用多食黃桿菌的克隆菌落接種，其中該桿菌得自由本申請人在ATCC保藏的菌株(ATCC登記號為55238)。在28℃下培養(yǎng)48小時之后，在4℃下冷藏原種斜面直至用作液體培養(yǎng)基的接種物。存活細胞也可應(yīng)用通常的冰箱、干冰或液氮冷凍以長期貯存。液體預培養(yǎng)物的制備如下應(yīng)用得自瓊脂斜面的細胞接種盛裝在300ml帶擋板的燒瓶中、按上述方法制備的30ml液體培養(yǎng)基。生長條件為28℃、pH7.2-7.6，通過在250RPM下攪拌使之通氣，培養(yǎng)24小時。在初始培養(yǎng)24小時后，將盛于一個或多個30ml預培養(yǎng)燒瓶中的細胞用于接種盛裝在適當大小發(fā)酵罐中的數(shù)量多十倍的營養(yǎng)培養(yǎng)基。然后在28℃下將細胞培養(yǎng)48-72小時。應(yīng)用NaOH和/或磷酸將pH維持在6.80-7.20。這樣將溶解氧的含量保持在30-40％的飽和度在罐內(nèi)攪拌速度為400-1000RPM時，以每分鐘每體積液體為1體積空氣的流速將過濾后的空氣鼓泡通過該發(fā)酵罐。定期取樣進行高效液相色譜分析表明，將細胞在這些條件下發(fā)酵約72小時內(nèi)一般可產(chǎn)生最大量的ZX。實施例2穩(wěn)定劑的加入通過實施例1的發(fā)酵法生產(chǎn)的ZX需要穩(wěn)定以便于后續(xù)的純化和配制，并保證純度?？稍谥苽浠蚣兓^程期間的任意時刻將穩(wěn)定化合物加入多食黃桿菌細胞(或含有ZX的細胞提取物)；通常，當細胞仍在發(fā)酵罐內(nèi)時應(yīng)加入一種或多種穩(wěn)定劑。申請人已測試了各種候選穩(wěn)定劑。迄今獲得的最佳結(jié)果是應(yīng)用了穩(wěn)定劑的一種組合，在加入細胞之前將它們一起混合于少量合適的溶劑(例如20升發(fā)酵罐應(yīng)用約2毫升乙醇)。優(yōu)選的穩(wěn)定劑混合物包括叔丁基氫醌(縮寫為TBHQ；也稱為2-(1，1-二甲基)-1，4-苯二酚)，用量為當與細胞混合后，形成的最終濃度范圍為約250μg/L(每升微克)至高達約50mg/L；混合后濃度范圍約250μg/L至約250mg/L的乙氧喹；濃度范圍為約250μg/L至約250mg/L的α-生育酚；和濃度范圍約500μg/L至約500mg/L的EDTA(乙二胺四乙酸)。適當?shù)臐舛瓤勺兎秶鷮?，這取決于很多因素，例如后續(xù)的純化步驟和預期的包裝和吸收方式。這些穩(wěn)定劑當用于一次通過性THF提取、接著與植物油混合并水密包封于維生素類丸劑時，它們的優(yōu)選濃度約為TBHQ25-50mg/L；乙氧喹250-500μg/L；α-生育酚250-500μg/L；和EDTA500-1000μg/L。加入穩(wěn)定劑后，將細胞培養(yǎng)物加熱至55℃達25-50分鐘進行巴氏滅菌。這樣可殺死細菌而不損壞它們產(chǎn)生的ZX。然后將培養(yǎng)物冷卻至室溫，采用交叉流微量過濾系統(tǒng)將培養(yǎng)液中的含ZX細胞和其它固形物與液相分離，這樣可使細胞/固形物濃度從初始值約10-15vol％提高到約60-80vol％的濾后濃度。該方法得到一種細胞漿，它還含有來自營養(yǎng)培養(yǎng)基的某些殘余固形物。至于如實施例5-7中所述對進行視網(wǎng)膜試驗的日本鵪鶉喂食的ZX制劑，將該細胞漿冷凍至-70℃，然后在25℃的完全真空下凍干，得到含有約1-10wt％ZX的干生物量。在過去的試驗中，分別測定每批中的ZX量，再合并不同濃度的每批物質(zhì)并混在一起以保證用于日本鵪鶉試驗時的恒定濃度。生產(chǎn)供人吸收的ZX時，如實施例3中所述那樣用溶劑提取而得粘稠的油狀流體。實施例3半純化成油狀液體在按實施2中所述那樣產(chǎn)生細胞漿后，可用多種方法中的任一種處理它們。如前所述，需要的話可采用例如下列方法破碎細胞膜以打開細胞且更易于獲得ZX超聲處理(高頻聲波)、高壓或研磨，將細胞溫度保持在低于約30℃以防氧化。不過，當將四氫呋喃(THF)用于溶劑提取步驟中時就不需該處理步驟，因為無需機械作用幫助THF就能很有效地破裂細胞膜。在實驗室規(guī)模操作中應(yīng)用THF時不需攪拌；但在工業(yè)制備操作中的溶劑混合步驟期間攪拌很可能有益于操作。在迄今做過的試驗中，THF提取包括了將約8-20份體積的已純化過濾了的THF與1份體積其中含60-80％固形物的細胞漿在低于25℃下混合2-24小時。THF主動攻擊細胞，得到一種絮凝固形物的懸浮液。在高達20000g下離心數(shù)分鐘后，大部分THF可通過傾析除去。殘余的THF可被真空蒸發(fā)掉，留下粘稠的油狀物。在一次性通過的操作中用THF提取而處理含1-3wt％ZX的細胞漿時，所得油狀物通常含有約5-20wt％的ZX。實施例4制備呈干粉形式、高度純化的玉米黃質(zhì)，它含有100％純R-R異構(gòu)體呈干粉形式、高度純化的玉米黃質(zhì)制劑，是通過下述液相色譜法處理實施例3中所述的THF提取的油狀流體而制備的。將含ZX的油狀液體溶于己烷，然后通過裝填中性氧化鋁粉的色譜柱。應(yīng)用兩倍于柱體積的己烷洗柱，以除去例如β-胡蘿卜素和番茄紅素的類胡蘿卜素雜質(zhì)以及脂質(zhì)和其它雜質(zhì)。然后使80∶20的己烷∶丙酮混合物流過柱子以釋放ZX。真空干燥洗脫出的ZX溶解物。色譜分析表明，ZX純度至少達98％，只有痕量的可檢測雜質(zhì)。在相對未保護狀態(tài)(處于正常冷藏，中等頻度地取樣，未含任何抗氧化劑，并且未采取任何防止與大氣中的氧接觸的措施)下大致貯存6個月后，取該ZX制劑樣本交給FloridaInternationalUniversityinMiami，F(xiàn)lorida的JohnLandrum教授(Bone，Landrum等的論文的合作者)進行立體異構(gòu)分析。他應(yīng)用二氨基甲酸酯衍生作用進行手性柱色譜分析，結(jié)果表明，該六個月未保護的制劑含92％ZX。雜質(zhì)似乎主要是先于ZX洗脫的酮-類胡蘿卜素；酮-類胡蘿卜素是在類胡蘿卜素分子某處連接有額外的氧原子，且它們屬于類胡蘿卜素未在抗氧化保護下貯存后形成的常見副產(chǎn)物。Landrum教授的手性分析表明，該制劑中100％的ZX是所需的R-R異構(gòu)體。其中沒有可檢測量的、ZX的不需要的S-S或S-R立體異構(gòu)體。我們認識到，上述色譜法純化盡管完全可行并且高度有效，但不太適合工業(yè)上大量制備高度純化的ZX。美國專利5,382,714(Khachik1995；也可參見Khachik等1991)中描述了一種為純化黃體素而開發(fā)的可選方法，該方法在兩溶劑提取體系中應(yīng)用冷乙醇-水混合物，接著冷凍干燥，這為工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用提供了一種良好的備選方法。實施例5應(yīng)用不同的規(guī)定食物組進行玉米黃質(zhì)對日本鵪鶉的試驗所有涉及日本鵪鶉的試驗都是與AppliedFoodBiotechnology，Inc.(本申請的受讓人)簽約在theSchepensEyeResearchInstituteofHarvardMedicalSchool(Boston，Massachusetts)進行的。所有的處理組和對照組都包含統(tǒng)計上顯著數(shù)量的鳥。在大多數(shù)場合中，對照組中的數(shù)量與處理組中一樣多。缺乏類胡蘿卜素的鳥食得自PurinaMills(St.Louis，Missouri)。這種鳥食只出售供實驗應(yīng)用；是采用天然缺乏類胡蘿卜素的谷物(如買羅高粱籽)制得的。喂食給日本鵪鶉的所有ZX制劑都呈得自多食黃桿菌細胞的干生物量形式，所述細胞被發(fā)酵、用實施例2中所述穩(wěn)定劑穩(wěn)定化，進行了巴氏殺菌以殺死細胞，并用凍干法干燥。這些發(fā)酵和制備步驟是由AppliedFoodBiotechnology，Inc.在O’Fallon，Missouri的設(shè)施中完成的。所有試驗動物都是從缺乏類胡蘿卜素的蛋孵化的。這些蛋是通過對成熟后的親代鳥(稱為P1鳥)只喂食缺乏類胡蘿卜素的飼料而得到的。打破它們的蛋并分析類胡蘿卜素，直至那些蛋變成缺乏類胡蘿卜素的蛋。缺乏類胡蘿卜素的親代鳥后來下的蛋被用于孵化所有試驗組和對照組鳥。將試驗組和對照組鳥分成四大組，它們接受不同的規(guī)定食物，根據(jù)它們接受的規(guī)定食物中類胡蘿卜素不同而將這些組稱為C+組、C-組、BC+組、ZX(+5)組和ZX(+50)組。給C+組鳥喂食含幾種類胡蘿卜素的標準商品化食物；該食物中還含有作為添加劑的合成α-生育酚(維生素E)。給C-組鳥喂食的食物如前述那樣基本上缺乏所有的類胡蘿卜素。不過，該食物含有所有的其它基本營養(yǎng)物，它還包含作為添加劑的合成維生素A和E。給BC+組喂食的食物缺乏除了作為添加劑的β-胡蘿卜素之外的所有類胡蘿卜素，與高用量ZX組中所用的配料相同(即每千克飼料加入50mgβ-胡蘿卜素)。在開始進行光損傷操作之前7天，轉(zhuǎn)而對BC+組的鳥喂食含β-胡蘿卜素的食物。該組可直接比較β-胡蘿卜素和ZX補充鳥的一個亞組，在光損傷之前7天，使該亞組的鳥從缺乏的食物轉(zhuǎn)至ZX補充的食物。如實施例8中所述，這種直接比較表明，ZX在防止光毒損傷中高度有效，而β-胡蘿卜素的保護效果太低而達不到統(tǒng)計上有效量。給ZX+組的鳥喂食的食物缺乏所有其它類胡蘿卜素，但其中包括含有得自AFB的多食黃桿菌細胞的R-R玉米黃質(zhì)的干生物量。對這些鳥喂食兩種不同劑量的ZX以建立劑量-和-效果相互關(guān)系并與各種視網(wǎng)膜損傷指標關(guān)聯(lián)。ZX(+5)組鳥接受較少量ZX，平均每千克飼料中加入5mgZX。由于日本鵪鶉每天吃約25-35克食物，所以低劑量組中每只鳥每天吸收約0.125-0.175毫克ZX。ZX(+50)組中的鳥接受高十倍的量(每千克飼料50mgZX)，使得這些鳥每只每天平均消耗1.25-1.75毫克ZX。利用Stacewicz-Sapuntzakis等1993描述的方法，通過高效液相色譜(HPLC)法分析對照組、缺乏組和ZX+組的食物中類胡蘿卜素濃度。結(jié)果示于表1。表1注釋ZX＝3R-3’R-玉米黃質(zhì)β-Cryp＝β-隱黃質(zhì)β-Car＝β-胡蘿卜素Canthax＝斑蝥黃質(zhì)Lycop＝番茄紅素*＝初步鑒定；也可能是玉米黃質(zhì)的順式異構(gòu)體。所有的鳥都喂養(yǎng)和保持在正常孵化籠中。除了下面指出的之外，將它們保持在正常寬范圍光照狀態(tài)，每天光照10-14小時。實施例6視網(wǎng)膜沉積經(jīng)口吸收的玉米黃質(zhì)對于實施例5中描述的各組規(guī)定食物組鳥進行了化學分析以測定沉積在鳥視網(wǎng)膜中ZX(和其它類胡蘿卜素)的濃度。為了進行這些分析，將從缺乏類胡蘿卜素的蛋中孵化后被喂食規(guī)定食物至少達六個月的鳥采用頸離位法殺死。解剖剜出的眼剝下視網(wǎng)膜組織，采用玻璃的或聚四氟乙烯(TEFLONTM)研杵在250μl蒸餾過的去離子水中將單片視網(wǎng)膜組織研磨至近乎均勻。取10μL勻漿液用于勻漿液的蛋白質(zhì)分析以歸一化各視網(wǎng)膜樣本的結(jié)果。將含有2％w/v焦棓酚和50μl60％w/v氫氧化鉀的250μl甲醇加入殘留的240μl視網(wǎng)膜組織懸浮液中。在70℃水浴中加熱該混合物達1小時，接著先后加入500μl50％v/v乙醇和2ml己烷。充分旋轉(zhuǎn)混合該混合物，然后在5℃下放置直至出現(xiàn)分層。移出其中含己烷和提取的類胡蘿卜素、生育酚、和視黃醇的表相(即浮在殘余液面之上的更輕的相)。再往組織勻漿液中加入2ml己烷，旋轉(zhuǎn)該混合物后再次分離。取出表相與第一次的合并。在第次提取循環(huán)中再次重復上述操作，以保證完全提取類胡蘿卜素、生育酚和視黃醇。然后用1ml水洗滌合并的己烷提取液以除去殘余的氫氧化鉀。往該己烷一水混合液中又加入1ml己烷，然后用吸液管小心地吸出己烷層(表相)。接著在恒定氮氣流中蒸發(fā)己烷。殘余物中含類胡蘿卜素、生育酚、視黃醇和其它未鑒定的己烷可提取化合物。將該殘余物溶于溶劑(甲醇∶氯仿∶三乙胺)并按上述方法進行HPLC分析。結(jié)果列于下表2，它還示出了高強度光曝曬后的損傷程度。表2</tables>ND＝在這些樣本中未檢測到。檢測到黃體素樣化合物，但由HPLC保留時間和光電二極管陣列掃描該峰測知它顯然不是黃體素。應(yīng)注意，上述任一種食物喂食的鳥視網(wǎng)膜中均未檢測到β-胡蘿卜素。列于表2中的這些視網(wǎng)膜中的濃度表明，經(jīng)口吸收的R-R玉米黃質(zhì)確實沉積在接受作為食物輔劑、呈飼料添加劑形式的R-R玉米黃質(zhì)的試驗動物視網(wǎng)膜內(nèi)，其中的R-R玉米黃質(zhì)是通過將多食黃桿菌(ATCC登記號為55238)子代細胞發(fā)酵而產(chǎn)生的。這些發(fā)現(xiàn)很重要，因為ZX必須以正常方式消化，它必須通過腸屏障，它必須進入血流，而且它被鳥眼中視網(wǎng)膜細胞吸收的量必須足以保護視網(wǎng)膜組織以抗光毒損傷。所有這些障礙都被本文所述的細菌發(fā)酵制備的R-R玉米黃質(zhì)制劑克服了。實施例7R-R玉米黃質(zhì)對視網(wǎng)膜的保護每個規(guī)定食物組中某些鳥接受2,000-3,000勒的高強度可見光達28小時，其間采用包括1小時光照接著2小時幾乎全暗的循環(huán)。在此光照循環(huán)期后，將鳥置于幾乎全暗處達14小時，最后將鳥殺死。在初始試驗中，已測知這種高強度光照量能給所有類胡蘿卜素缺乏組的鳥造成嚴重損傷，并給對照(正常食物)組鳥造成適度損傷。在初始試驗中還測知，光照后需要14小時黑暗，這樣可測定未保護的(缺乏類胡蘿卜素的)鳥中編程性死亡錐核數(shù)的極大值。喂食對照食物的鳥在光照后約24小時表現(xiàn)出最多的編程性細胞死亡，而喂食添加了ZX的食物的鳥表現(xiàn)出最多編程性細胞死亡的時間遠遠大于24小時。可測知損傷之前的時間的延長明顯指示ZX的保護性效果。通過顯微解剖分離這些鳥的視網(wǎng)膜，在二甲苯中固定后于乙醇中干燥，再包埋于paraplast(Oxford，56℃)中。然后將paraplast中的視網(wǎng)膜組織切片，再用Gallyas1990的方法或者采用碘化丙錠染色以顯現(xiàn)表征編程性細胞死亡的固縮核。對放大400×(線型)倍時單個顯微視野內(nèi)看得見的固縮核數(shù)進行計數(shù)。對于每個處理組至少計數(shù)6到8個不同視野內(nèi)的核數(shù)，并取平均值。表2中的結(jié)果清楚地表明，視網(wǎng)膜細胞死亡和損傷(1)由細菌法合成的R-R玉米黃質(zhì)大為減少和/或延遲，與接受正常對照食物相比，甚至在低ZX(+5)用量時也一樣；(2)由更高ZX(+50)用量減少得更多。ZX(+50)處理組的視網(wǎng)膜中完全不存在任何固縮核，從而提供使人信服的證據(jù)，即得自多食黃桿菌細胞系(ATCC登記號為55238)的R-R玉米黃質(zhì)在保護視網(wǎng)膜細胞以抗光毒損傷方面獲得了巨大的、驚人的突破。就本申請人所知，尚沒有其它物質(zhì)能達到或接近這種保護程度。實施例8直接比較R-R玉米黃質(zhì)與β-胡蘿卜素在保護視網(wǎng)膜組織方面的作用如上所述，對于BC+食物組中的鳥喂食β-胡蘿卜素的量(每千克飼料50mg)相當于ZX(+50)組中玉米黃質(zhì)的用量。這就使得可直接比較β-胡蘿卜素與ZX在保護視網(wǎng)膜細胞以抗光毒方面的作用。結(jié)果表明，BC+組內(nèi)的光毒損傷只減小很小的幅度(平均約10％或更少)。與對照組中的標準偏差相比，這種減小量沒有統(tǒng)計意義；這種少量減小只是由于隨機波動這種情況的概率為0.12-0.14。β-胡蘿卜素在視網(wǎng)膜組織中不能提供較好的抗光毒保護作用，而相同用量的R-R玉米黃質(zhì)在指示細胞損傷和死亡的相同指標中表現(xiàn)為總體100％減少，充分證明了本發(fā)現(xiàn)的重要性。通過微生物發(fā)酵合成的R-R玉米黃質(zhì)，表現(xiàn)出遠遠超過任何現(xiàn)有物質(zhì)的重大突破。實施例9吸收增強劑的形成只包括所需的玉米黃質(zhì)R-R異構(gòu)體、直徑小于1微米的含玉米黃質(zhì)“膠粒”，可得自實施例3中所述的生物量的溶劑提取物或油狀流體，通過應(yīng)用Olson1994中描述的某幾種膽汁鹽。含有R-R玉米黃質(zhì)的油狀流體可與適當?shù)哪懼}，例如由MarcorDevelopmentCompanyofHackensack，NewJersey出售的甘氨膽酸或?；悄懰岬牧姿猁}混合；或者通過應(yīng)用含有膽汁鹽混合物的膽囊提取物，例如由SalzmanCorporationofDavenport，Iowa出售的產(chǎn)品。這種膽汁原料可與溶劑提取物或油狀物質(zhì)混合以及與其它某些鹽，包括氯化鈉、氯化鈣或氯化鉀混合。然后在包括例如旋轉(zhuǎn)葉片的混合裝置的機械勻漿器中處理該混合物，旋轉(zhuǎn)速度和持續(xù)時間可由例行實驗優(yōu)化，通過分析由葉片大小和形狀、旋轉(zhuǎn)速度和持續(xù)時間的各種組合決定的膠粒大小范圍而進行優(yōu)化。如果需要的話，可將所得膠粒干燥脫除溶劑，再應(yīng)用例如植物油的載體或稀釋劑稀釋至任何需要的濃度。然后就可將該混合物包封于膠囊或便于吞咽和能保護所得膠粒以抗胃酸降解的其它裝置中。也可利用其它乳化劑和脂質(zhì)以形成小粒徑的乳液?？衫妹枋鲇贠lson1994中的非離子型去污劑，例如Tweens和Spans，以及例如磷脂和鞘脂的脂質(zhì)原料，它們應(yīng)能形成小粒子(小于1微米)的脂質(zhì)囊。實施例9微膠囊化玉米黃質(zhì)本實施例描述了微膠囊化形式的玉米黃質(zhì)的制備。微膠囊是大小為10-1000μm的固體粒子，它被涂覆材料或殼包封的芯材(例如R-R玉米黃質(zhì))構(gòu)成，可應(yīng)用不同的化合物例如明膠、阿拉伯膠、淀粉、玉米醇溶蛋白(玉米的一種蛋白質(zhì))等等來制備。在制備殼材時，還可加入其它化合物以幫助保持所得制劑的形狀、結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或其它需要的特性。這類化合物可包括乳化劑，山梨醇，抗氧化劑如TBHQ或2-[1，1-二甲基]-1，4-苯二酚，或膠凝劑如角叉菜膠。將純的或部分純化的玉米黃質(zhì)溶于適當溶劑如乙醇、丙酮或THF中。一旦成為溶液，即可將溶解的玉米黃質(zhì)加入水而形成直徑小于10微米的微晶。如果在加入期間，在乳化劑例如Tween80的存在下對于水、玉米黃質(zhì)在溶劑中的結(jié)晶進行高頻超聲處理，則可改善該操作效果。一旦形成微晶，就將殼材加入水、玉米黃質(zhì)和溶劑的混合物。對于例如明膠的某些殼材，有必要將60℃這樣高的混合物溫度保持達2小時。等殼材完全溶解，就將整個混合物置于超聲發(fā)生器中達5-10分鐘，以便再乳化該晶體。微膠囊的形成是通過應(yīng)用合適的干燥方法如噴霧干燥，或者采用Sparks等在美國專利No.4,675,140中描述的旋轉(zhuǎn)盤干燥法來干燥芯和殼材的混合物而完成的。噴霧干燥器被廣泛用于食品和飼料工業(yè)。旋轉(zhuǎn)盤是這樣一種儀器，即它包括在控制的條件下能維持在一定溫度的一個盤(直徑約為4”)。它能在每分鐘1,000-10,000轉(zhuǎn)(rpm)范圍內(nèi)的不同速度下操作。當盤以例如4000rpm的速度旋轉(zhuǎn)時，將芯和殼材混合物加到盤的中央。當該液體與受熱的旋轉(zhuǎn)盤接觸時就形成微膠囊。微膠囊受離心力作用從中央拋射出去，并被收集在預涂有“收集”劑或“捕捉”劑例如疏水性淀粉或糊精的平表面。然后通過大小篩分法從捕捉劑中分離出微膠囊。將微膠囊置于容器內(nèi)避光和空氣并于冷藏條件下貯存直至稱入膠囊供口服。因此，本文顯示和描述了生產(chǎn)含供人吸收的R-R玉米黃質(zhì)的藥劑的新型和實用的方法；以及含微生物合成的R-R玉米黃質(zhì)的調(diào)和物，以用于預防或治療黃斑變性。雖然通過參照某些具體實施方案對本發(fā)明進行了舉例闡釋和描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白，闡釋性實施例的各種修飾、更改和等同是有可能的。受本文啟示而直接得出的任何這種改變，和未偏離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的任何改變，都應(yīng)認為屬于本發(fā)明的范圍。參考文獻Bauernfeind，J.C.(編輯)，作為著色劑和維生素A前體的類胡蘿卜素技術(shù)和營養(yǎng)應(yīng)用(AcademicPress，NewYork，1981)Bone，R.A.，“黃斑色素在檢測偏振光中的作用，”VisionResearch20213-220(1980)Bone，R.A.等，“人黃斑色素的初步鑒定，”VisionRes.251531-1535(1985)Bone，R.A.等，“HPLC法分析黃斑色素視網(wǎng)膜分布和年齡研究，”Invest.Opthalmol.Vis.Sci.29843-849(1988)Bone，R.A.等，“黃斑類胡蘿卜素的立體化學，”Invest.Opthalmol.Vis.Sci.342033-2040(1993)Bone，R.A.等，“黃斑色素立體異構(gòu)體在包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的各種眼中的分布，”ARVOAbstractsInvest.Ophthalmol.Vis.Sci.351502(1994)diMascio，P.等，“作為最有效生物類胡蘿卜素單線態(tài)氧猝滅劑的番茄紅素，”ArchivesofBiochemistryandBiophvsics274532-538(1989)Dorey，C.K.等，“衰老和AMD眼中的脂褐質(zhì)，”inRetinalDegeneration(Hollyfield等人編輯，PlenumPress，NewYork，1993)EyeDiseaseCaseControlStudyGroup，“抗氧化劑狀態(tài)和新血管的年齡相關(guān)性黃斑變性，”Arch.Ophthalmol.11104-109(1993)EyeDiseaseCaseControlStudyGroup，“新血管的年齡相關(guān)性黃斑變性的危險因素，”Arch.Ophthalmol.101701-1708(1992)Foote，C.S.等，“單線態(tài)氧的化學性質(zhì)。XI.單線態(tài)氧引起的類胡蘿卜素的順反異構(gòu)化作用和可能的猝滅機制，”J.Amer.Chem.Soc.925218-5219(1970)Foote，C.S.等，“單線態(tài)氧的化學性質(zhì)。X.類胡蘿卜素猝滅相當于生物保護作用，”J.Amer.Chem.Soc.925216-5218(1970)Gallyas，F(xiàn).，ActaNeuropathologica79620(1990)Gerster，H.，“綜述老化黃斑的抗氧化劑保護作用，”AgeandAging20060-69(1991)Gittinger，J.W.，眼科學臨床疑難手冊(Little-Brown，Boston，1988)Haegerstrom-Portnoy，G.，“短波敏感性視網(wǎng)膜錐的靈敏度隨老化而降低黃斑色素的保護作用？”J.Opt.Soc.Am.A52140-2144(1988)Ham，W.T.Jr.等“哺乳動物視網(wǎng)膜中產(chǎn)生光化學損傷時的基本原理，”CurrentEyeResearch3165-174(1984)Handelman，G.J.和Dratz，E.A.，“抗氧化劑在視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮中的作用以及原氧化劑引起的損傷的性質(zhì)，”Adv.inFreeRadicalBiology&Medicine21-89(1986)Handelman，G.J.等，“人黃斑和整個視網(wǎng)膜中的類胡蘿卜素，”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.29850-855(1988)Jialal，I.等，“β-胡蘿卜素抑制低密度脂蛋白的氧化修飾，”BiochimicaetBiophysicaActa1086134-138(1991)Khachik，F(xiàn).等，“用高效液相色譜法分離、鑒定和定量分析水果、蔬菜和人血漿中的類胡蘿卜素，”PureandApplied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