專利名稱：軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療骨折或骨缺損的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有骨誘導(dǎo)因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。
背景技術(shù)：
作為軟骨/骨的修復(fù)方法，除患者本身的自體移植外，還可以采用在患部埋入由骨誘導(dǎo)因子和適當(dāng)載體組成的軟骨/骨缺損部位修補(bǔ)劑的方法來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，為了能在外科手術(shù)時(shí)讓患部露出并直接在患部施用含有骨誘導(dǎo)因子的軟骨/骨修復(fù)用材料，廣泛采用了易于操作的塊狀物、海綿體和薄板材等固體形態(tài)。此外，也可以使用凝膠或膏狀物等半固體形態(tài)。作為使這些固體或半固體形態(tài)成為可能的載體，利用了不銹鋼和鈦合金等金屬或膠原和羥基磷灰石(HAP)或這些的混合劑等。
另一方面，也有人嘗試了在骨折或變形關(guān)節(jié)癥等的治療中給藥骨誘導(dǎo)因子，以使外科手術(shù)成為不必要。這種給藥形態(tài)，從非侵襲性給藥即注射劑形態(tài)能減輕患者的痛苦這一點(diǎn)來(lái)看，是人們迫切希望的。然而，若以這種形態(tài)給藥單純的骨誘導(dǎo)因子水基液劑，則會(huì)引起給藥后藥物擴(kuò)散消失，因此，為了高效率地給藥骨誘導(dǎo)因子，有必要讓骨誘導(dǎo)因子在注射部位滯留一定時(shí)間。為此，設(shè)想了一種載體，使之在給藥時(shí)呈能用針注射的液狀，而在給藥后發(fā)生相變而呈凝膠狀，從而使骨誘導(dǎo)因子滯留在患部。作為這種載體，較好的是沒(méi)有毒性、與生物體的適合性良好、活體內(nèi)吸收性高者。
迄今為止，作為骨誘導(dǎo)因子的載體，膠原是已知的，而且證實(shí)有良好的生物體適合性和活體內(nèi)吸收性(特公平5-75425號(hào))。進(jìn)而，可以注射的、與膠原的組合也是已知的，因而有可注射的軟骨/骨形成材料的可能性(特公平7-23322號(hào)和特公平5-53140號(hào))。然而，現(xiàn)在作為醫(yī)藥品可供利用的膠原，因其來(lái)源是?；蜇i等天然來(lái)源的材料，因而其分子量、氨基酸組成量、保水量等不是恒定的。此外，這些膠原由于是與人體中不同種的蛋白質(zhì)，因而有抗原性等的副作用。特別是關(guān)于抗原性，即使使用去除了膠原的末端肽部位的非末端膠原，也不能完全沒(méi)有(J.American Academy of Dermatology 10，638-646和647-651，1984和J.American Academy of Dermatology21，1203-1208，1989)。
另一方面，已知可以用聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物等可生物降解聚合物作為醫(yī)藥用載體(美國(guó)專利5385887號(hào)和特公平6-22570號(hào))。但是，這些可生物降解聚合物的形狀是固體形態(tài)或半固體形態(tài)的，從保持一定形態(tài)這一點(diǎn)而言，屬于適用于外科手術(shù)時(shí)的材料群。即使可以用這樣的可生物降解聚合物制作可注射的復(fù)合體，在其制造步驟中也不能不使用有機(jī)溶劑，因而很容易預(yù)測(cè)有效成分骨誘導(dǎo)因子的失活會(huì)成為問(wèn)題。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是要提供能克服如上所述的先有技術(shù)方法的不利點(diǎn)乃至缺點(diǎn)，生物體內(nèi)吸收性高、與有效成分骨誘導(dǎo)因子的親合性良好，通過(guò)引起溫度依賴型溶膠-凝膠可逆變化而使骨誘導(dǎo)因子的藥效持久，而且抗原性等的副作用少的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。
本發(fā)明者等人在不必進(jìn)行外科手術(shù)的骨修復(fù)方法方面對(duì)成為有效成分的骨誘導(dǎo)因子與其載體的關(guān)系進(jìn)行了銳意探討，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)某種聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類中有生物體內(nèi)吸收性高、與骨誘導(dǎo)因子的親合性良好、能引起溫度依賴型溶膠-凝膠可逆變化者。本發(fā)明者等人還發(fā)現(xiàn)，在聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類水溶液中混合骨誘導(dǎo)因子，制成給藥時(shí)在1℃～30℃可以注射的液體、給藥后3分鐘以內(nèi)在37℃左右能凝膠化的骨形成材料，經(jīng)小鼠大腿部肌肉內(nèi)給藥后能使骨誘導(dǎo)因子保持在給藥部位，在此有異位軟骨/骨形成能力，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類與骨誘導(dǎo)因子的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。
所謂聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類，是以親水性低的聚二醇為疏水基、以環(huán)氧乙烷為親水基加成的高分子量非離子型表面活性劑的總稱，通過(guò)改變聚丙二醇的分子量和與環(huán)氧乙烷的混合比，可以構(gòu)成有各種特性的表面活性劑?？梢院铣傻木垩跻蚁┚垩醣┒碱惖慕M成是聚丙二醇的分子量在900～4000的范圍、總分子中環(huán)氧乙烷的重量是5％～90％。例如，旭電化公司制的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類(ADEKA)是按照聚丙二醇的分子量和加成環(huán)氧乙烷的重量比系統(tǒng)命名的，其分類圖表示在

圖1中。
聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類在產(chǎn)業(yè)上的利用，除作為一般洗滌劑、消泡劑使用外，在醫(yī)藥領(lǐng)域中可用于緩瀉劑、軟膏基劑、人造血液、錠劑包衣、賦形劑、注射劑增溶劑和溶解促進(jìn)劑等。尤其普郎尼克F-68(聚丙二醇的分子量1750、環(huán)氧乙烷含量80％)的抗溶血作用顯著，已由綠十字公司以EXOCOPOL名稱作為血液體外循環(huán)用添加劑銷售。從各種動(dòng)物的毒性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，顯然聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的毒性和刺激性是極低的，也沒(méi)有關(guān)于顯示抗原性等副作用的報(bào)告(FragranceJournal 7，82-87，1974)。毒性試驗(yàn)的結(jié)果列于表1中。
表1ADEKA普郎尼克的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果ADEKA普郎尼克動(dòng)物種LD50(g/kg)L-44，L-62，L-64 大鼠 5F-68 小鼠 ＞15F-68 大鼠、兔、狗 無(wú)急性毒性反應(yīng)P-85 大鼠 34.6另一方面，在使用上，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類就顯示可逆溶膠-凝膠相變這一點(diǎn)而言也比膠原的溫度變化時(shí)發(fā)生不可逆相轉(zhuǎn)移優(yōu)異。這種性質(zhì)可以通過(guò)選擇能使顯示相變的溫度達(dá)到最佳的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類和改變?cè)摼垩跻蚁┚垩醣┒碱惖乃芤簼舛葋?lái)控制。(Int.J.Pharm.22，207-218，1984，EP 0551626A1號(hào))。
從以上所述可見(jiàn)，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類有作為醫(yī)藥用載體的優(yōu)異資質(zhì)，也已經(jīng)進(jìn)行了與局部麻醉劑、抗癌劑等低分子量藥物組合(Int.J.Pharm.8，89-99，1981和Chem.Pharm.Bull.32，4205-4208，1984)和混合間白細(xì)胞素等高分子量生理活性蛋白質(zhì)的嘗試(Pharm.Res.9，425-434，1992)。
本發(fā)明涉及含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類和骨誘導(dǎo)因子的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，并涉及作為聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類構(gòu)成成分的聚丙二醇的分子量在約1500～4000范圍內(nèi)且環(huán)氧乙烷含量在約40～80％/分子的范圍內(nèi)的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。如果在這種構(gòu)成成分范圍內(nèi)，就會(huì)成為能表現(xiàn)出本發(fā)明普郎尼克特性的溫度依賴型溶膠-凝膠可逆變化的普郎尼克。
進(jìn)而，本發(fā)明還涉及呈水溶液形態(tài)、以上所述聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類水溶液濃度為約10～50％的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。也已知，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的可逆變化溫度一般是以水溶液的配制濃度等而異的，而且處于上述構(gòu)成成分范圍內(nèi)的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類在體溫附近即37℃左右能引起凝膠化的水溶液濃度范圍為約10～90％。作為最好的實(shí)例，配制了聚丙二醇分子量3850、環(huán)氧乙烷含量為70％的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類(普郎尼克F-127)的15～30％水溶液。
所謂骨誘導(dǎo)因子(Bone morphogenetic proteinBMP)，系指具有能使未分化間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞并形成骨組成的活性的蛋白質(zhì)。
作為本發(fā)明中使用的骨誘導(dǎo)因子的實(shí)例，可以列舉屬于TGF-β基因超級(jí)家族的BMP-2～BMP-9等一系列蛋白質(zhì)，稱之為MP-52的蛋白質(zhì)、稱之為GDF-5的蛋白質(zhì)等，但不限于這些。作為BMP-2，是按照Wang等人報(bào)告的遺傳工程技術(shù)用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamsterovary，CHO)細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)BMP-2(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2220-2224，1990和US4877864號(hào))，而作為MP-52，是按照本發(fā)明者等人提出的遺傳工程技術(shù)制造的新型蛋白質(zhì)MP-52(特愿平7-93644號(hào))，這些都是特別好的。這種新型蛋白質(zhì)可以按如下得到構(gòu)筑一種質(zhì)粒，使之含有在能使從MP-52產(chǎn)生的序列表中1號(hào)序列所述氨基酸序列編碼的DNA序列的N末端上加成了能使甲硫氨酸編碼的密碼子的DNA；使該質(zhì)粒在大腸菌中發(fā)生形質(zhì)轉(zhuǎn)換；培養(yǎng)該大腸菌，得到一種內(nèi)含體；使該內(nèi)含體增溶、精制，得到一種單體蛋白質(zhì)；然后使該蛋白質(zhì)再生成二聚體，再將其精制。
把以BMP-2和MP-52為有效成分的15-30％聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類水基溶液注射到小鼠大腿部肌肉內(nèi)，給藥后使MP-52保持在給藥部位，然后觀察異位軟骨/骨形成能力。
這樣由聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類與骨誘導(dǎo)因子的組合組成的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用注射材料迄今為止未見(jiàn)報(bào)告，且作為軟骨/骨修復(fù)、尤其骨折治療劑是有效的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有骨誘導(dǎo)因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的軟骨/骨修復(fù)劑。
此外，本發(fā)明還涉及軟骨/骨修復(fù)治療方法，其中包括在人體或動(dòng)物的骨折或骨缺損部位施用含有骨誘導(dǎo)因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的軟骨/骨修復(fù)劑。
附圖簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是ADEKA普郎尼克分類圖。橫座標(biāo)以重量％表示聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類總分子中的環(huán)氧乙烷含量，縱座標(biāo)表示聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的構(gòu)成成分中聚丙二醇的分子量。
圖2是實(shí)施例4得到的小鼠右后足大腿部的骨/軟骨石灰化組織的軟X射線照片。(a)只注射ADEKA普郎尼克F-127，(b)注射含有MP-52的ADEKA普郎尼克F-127，分別在給藥后2周拍攝的照片。肌肉內(nèi)顯黑的部分是異位形成的骨基質(zhì)。
圖3是實(shí)施例4得到的小鼠右后足大腿部的非脫灰切片組織染色顯微鏡照片?？梢源_認(rèn)，在von-Kossa染色(a)中有骨基質(zhì)形成，而在蘇木精-曙紅染色(b)中有伴隨著骨芽細(xì)胞的骨基質(zhì)形成和骨髓形成。
圖4是參考例1(2)得到的蛋白質(zhì)MP52表達(dá)載體(pKOT245)的質(zhì)粒圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施形態(tài)以下提供實(shí)施例和參考例，以具體地說(shuō)明本發(fā)明的效果。要注意的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例限制。
實(shí)施例1 含有BMP-2的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料的制備方法已經(jīng)知道ADEKA普郎尼克F-127(旭電化工業(yè)公司)是聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類中毒性最小的之一(制藥工場(chǎng)6，875-880，1986)。這種ADEKA普郎尼克F-127 3.0g在冰冷卻下溶解于注射用蒸餾水7.0g中，配制30％ADEKA普郎尼克F-127水溶液。在冰冷卻下把ADEKA普郎尼克F-127水溶液以360μl/孔分注于96孔滴板中，并向各孔中滴加含有80μg BMP-2的0.01N HCl 40μl，混合后在4℃通過(guò)0.22μm過(guò)濾器滅菌，制成總量約400μl的BMP-2注射劑(ADEKA普郎尼克F-127的最終濃度是27％)。同樣也制作ADEKA普郎尼克F-127的最終濃度為10％、15％、18％和22.5％的BMP-2注射劑。
其結(jié)果，ADEKA普郎尼克F-127最終濃度27％的可以在5℃以下注射，ADEKA普郎尼克F-127最終濃度22.5％的可以在10℃以下注射，ADEKA普郎尼克F-127最終濃度10％～18％的可以在25℃以下注射，而在37℃能相變成凝膠狀的ADEKA普郎尼克F-127注射劑是最終濃度為15％以上的制劑。因此，在室溫呈液狀而在37℃顯示凝膠狀的ADEKA普郎尼克F-127最終濃度18％的制劑是最好的。
實(shí)施例2含有MP52的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料的制備方法同實(shí)施例1使用BMP-2的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料的制備方法一樣，制作ADEKA普郎尼克F-127最終濃度為10％、15％、18％、22.5％和27％的MP52注射劑，其結(jié)果，即使用MP52，也能得到同BMP-2的情況一樣的注射劑，即ADEKA普郎尼克F-127最終濃度27％可以在5℃以下注射、ADEKA普郎尼克F-127最終濃度22.5％可以在10℃以下注射、ADEKA普郎尼克F-127最終濃度10％-18％可以在25℃以下注射的制劑。
實(shí)施例3 活體中軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料給藥后的MP52殘留性在麻醉下，用23G針，對(duì)雄性小鼠(ICR品系，8周齡)的右后足大腿部經(jīng)肌肉內(nèi)給藥在實(shí)施例2的處方中添加125I標(biāo)記MP52、以同樣方式制作的18％、22.5％和27％ADEKA普郎尼克F-127最終濃度的125I標(biāo)記MP52注射劑100μl(約37KBq125I-MP52/部位)，觀察0.5、2和8小時(shí)后右后足放射性衰減殘存率。作為對(duì)照，用125I-MP52水溶液注射劑。結(jié)果列于表2中。
表2ADEKA普郎尼克F-127制劑(最終濃度18％ADEKA普郎尼克F-127)或水溶液劑給藥后在右后足中125I-MP52的殘存率時(shí)間(小時(shí))普郎尼克制劑水溶液劑0.5 60.5％ 32.7％2 19.7％ 13.8％8 14.9％ 7.9％
從表2可以看出，在用聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類作為醫(yī)藥用載體的情況下，與在只注射MP52水溶液的情況下比較，顯然能保持更多的殘存MP52藥物。此外，即使對(duì)于實(shí)施例1的注射劑，也得到了同樣的結(jié)果。
實(shí)施例4異位軟骨/骨形成能力的藥效試驗(yàn)在麻醉下，用23G針，對(duì)雄性小鼠(ICR品系，8周齡)的右后足大腿部經(jīng)肌肉內(nèi)給藥實(shí)施例2制作的18％ADEKA普郎尼克F-127最終濃度的MP52注射劑100μl(20μg MP52/部位)。此時(shí)作為對(duì)照，使用了不含有MP52的ADEKA普郎尼克F-127注射劑。軟骨/骨形成的判斷在給藥2周后進(jìn)行。小鼠用頸椎脫臼法宰殺后，切出有給藥部位的右后足，用軟X射線照射器拍攝照片，確認(rèn)給藥部位有無(wú)骨形成。結(jié)果列于圖2中(n＝5)。軟X射線照像的結(jié)果表明，當(dāng)只有ADEKA普郎尼克F-127(圖2-a)時(shí)，在有給藥部位的肌肉內(nèi)沒(méi)有觀察到陰影，但在用含有MP52的ADEKA普郎尼克F-127(圖2-b)進(jìn)行試驗(yàn)的動(dòng)物中，80％以上可以確認(rèn)有明顯陰影。
此外，在軟X射線照像結(jié)束后，把樣本保存在10％福爾馬林中，并實(shí)施組織學(xué)檢查。圖2-b中顯示的5只小鼠中右端小鼠的組織染色顯微鏡照片表示在圖3中。圖3中從von-Kossa染色(圖3-a)可以觀察到陰影部分有鈣沉積，而從蘇木精-曙紅染色(圖3-b)的結(jié)果可以確認(rèn)能分辨出骨芽細(xì)胞、骨基質(zhì)和骨髓的骨形成。而且沒(méi)有觀察到炎癥反應(yīng)。圖中的BM、OB和MA分別表示骨基質(zhì)、骨芽細(xì)胞和骨髓。
對(duì)于實(shí)施例1制作的18％ADEKA普郎尼克F-127最終濃度的BMP-2注射劑實(shí)施同樣的試驗(yàn)時(shí)，得到了同樣的結(jié)果。
從以上結(jié)果可以確認(rèn)使用聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類作為骨形成因子的載體時(shí)的安全性、有用性。
參考例 新型蛋白質(zhì)MP52的制備1.載體(vector)的制作(1)變異型MP52成熟型部分的分離人體MP52 cDNA是以含有WO 93/16099中所述cDNA的質(zhì)粒載體(pSK52s)作為模板DNA，只使成熟部分發(fā)生聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)增幅的。
按照通過(guò)提高起始密碼子ATG周圍的AT含量來(lái)提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率的方法{M、Nobuhara等人的報(bào)告(Agric.Biol.Chem.，52(6)，1331-1338，1988)}，使成熟型MP52基因的一部分DNA置換。
置換方法是用2號(hào)序列順向PCR引物，以PCR法進(jìn)行的。PCR引物的DNA序列用2號(hào)序列所示DNA作為順向引物而用3號(hào)序列所示DNA作為逆向引物。
PCR是通過(guò)在同一試管中一起添加模板DNA(10納克)、順向和逆向PCR引物各50皮摩爾、dNTP(0.2毫摩爾)和MgCl2(1.5毫摩爾)以及Taq DNA聚合酶(5U)進(jìn)行的。
進(jìn)行30周期的PCR，每個(gè)周期都包括變性(94℃，1分鐘)、引物退火(55℃，1分鐘)和引物伸長(zhǎng)(72℃，2分鐘)(以下的PCR都在這種條件下進(jìn)行)。
PCR反應(yīng)的生成物在1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖(FMC公司)中進(jìn)行電泳分離，切出由相當(dāng)于1號(hào)序列的氨基酸序列的約360bp組成的DNA(以此作為片斷1)。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)的大腸菌表達(dá)載體的構(gòu)筑為了提高質(zhì)粒的復(fù)制數(shù)，把復(fù)制源從pBR細(xì)胞系改變成pUC細(xì)胞系。用市購(gòu)大腸菌表達(dá)載體pKK223-3(購(gòu)自Pharmacia Biotech公司)的tac啟動(dòng)區(qū)限制酶SspI和EcoRI消化后，用綠豆核酸酶(寶酒造公司，產(chǎn)品目錄號(hào)2420A)處理，在片斷1的起始密碼子一側(cè)結(jié)合T4DNA連接酶(寶酒造公司，產(chǎn)品目錄號(hào)2011A)，用pKK223-3的rrnBT1T2終止區(qū)限制酶Sal I和Ssp I消化，通過(guò)結(jié)合到用Sal I消化的片斷1的終止密碼子一側(cè)和組入pUC18的Sma I部位，便構(gòu)筑了用于本發(fā)明蛋白質(zhì)生產(chǎn)的表達(dá)載體(pKOT245)(圖4)。這種載體于1995年4月14日寄存在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)(日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))，寄存號(hào)為FERMP-14895號(hào)，1996年4月10日移交基于布達(dá)佩斯條約的寄存(FERMBP-5499)。pKOT245的DNA長(zhǎng)度為3.7kb。制作的本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)載體是借助于Pharmacia ALF DNA定序機(jī)進(jìn)行其堿基序列測(cè)定的。
(3)形質(zhì)轉(zhuǎn)換形質(zhì)轉(zhuǎn)換按照Kushner等人的氯化銣法(Genetic Engineering，p17，Elsevier(1978))進(jìn)行。即，按照以上提到的程序使pKOT245移入宿主大腸菌W3110M中，制成能生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的大腸菌。
2.培養(yǎng)(1)培養(yǎng)本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)大腸菌用改進(jìn)SOC培養(yǎng)基(Bacto胰蛋白胨20g/l，Bacto酵母提取物5g/l，NaCl 0.5g/l，MgCl2·6H2O2.03g/l，葡萄糖3.6g/l)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。相對(duì)于生產(chǎn)用培養(yǎng)基(Bacto胰蛋白胨5g/l，檸檬酸4.3g/l，K2HPO44.675g/l，KH2PO41.275g/l，NaCl 0.865g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O 100mg/l，CuSO4·5H2O lmg/l，MnSO4·nH2O 0.5mg/l，CaCl2·2H2O 2mg/l，Na2B4O7·10H2O0.225mg/l，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.1mg/l，ZnSO4·7H2O2.25mgl，CoCl2·6H2O 6mg/l，MgSO4·7H2O 2.2g/l，硫胺素·HCl 5.0mg/l葡萄糖3g/l)5L而言添加菌體懸浮液100ml，在10L培養(yǎng)槽中邊通氣攪拌邊培養(yǎng)，在達(dá)到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)前期(OD550＝5.0)階段以1mM的濃度添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，進(jìn)一步培養(yǎng)直至OD550達(dá)到150為止。培養(yǎng)中，溫度控制在32℃，添加氨使pH控制在7.15，為防止溶解氧濃度降低，通過(guò)提高攪拌速度把溶解氧濃度控制在空氣飽和的50％。而且，為了達(dá)到高菌體濃度，以溶解氧濃度急激上升為指標(biāo)，邊以0.2％濃度添加50％葡萄糖邊培養(yǎng)。
(2)大腸菌內(nèi)含體的制備用上述方法得到的培養(yǎng)液離心分離回收菌體，然后懸浮在含有10mM乙二胺四乙酸的25mM Tris-HCl緩沖液(pH7.3)中，用菌體破碎裝置(Gohlin公司制)使細(xì)菌破碎，再次離心分離，回收含有內(nèi)含體的沉淀。
3.精制(1)大腸菌內(nèi)含體的增溶大腸菌內(nèi)含體用1％Triton X-100洗滌3次后，以3000xg在4℃離心分離30分鐘，得到的沉淀物在超聲波作用下用20mMTris-HCl緩沖液(pH8.3)、8M脲、10mM DTT、1mM EDTA增溶。
(2)單體精制其增溶液以20000xg在4℃離心分離30分鐘，回收其上清液。得到的上清液通過(guò)用20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)、6M脲、1mMEDTA平衡的SP-Sepharose FF(Pharmacia公司)，用同溶液洗滌后，用含有0.5M食鹽的同溶液溶出。溶出液中添加Na2SO3和Na2S4O6，使其最終濃度分別為111mM、13mM，在4℃進(jìn)行15小時(shí)磺化?；腔芤阂杂?0mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)、6M脲、0.2M食鹽、1mM EDTA平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia公司)進(jìn)行凝膠過(guò)濾，得到單一磺化的本發(fā)明蛋白質(zhì)單體。
(3)再折疊(Refolding)向磺化的本發(fā)明蛋白質(zhì)單體溶液中添加9倍量的50mM甘氨酸鈉緩沖液(pH9.8)、0.2M氯化鈉、16mM CHAPS、5mM EDTA、2mM GSH(還原型谷胱甘肽)、1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)之后，在4℃攪拌1天，進(jìn)行再折疊。
(4)二聚體精制再折疊的試樣用純水稀釋2倍，加6N鹽酸使pH達(dá)到約7.4，進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀。沉淀物以3000xg離心分離20分鐘收集后，溶解在30％乙腈、0.1％TFA中。其溶液用純水稀釋2倍，通過(guò)用0.05％TFA、25％乙腈平衡的逆相HPLC的RESOURCE RPC柱(Pharmacia公司)，用0.05％TFA、25～45％乙腈梯度洗脫。洗脫液用吸光度光度計(jì)借助于280nm吸光度監(jiān)測(cè)，得到精制的本發(fā)明蛋白質(zhì)二聚體級(jí)分。用Speedback Concentrator(Servan公司)使其冷凍干燥。
(5)精制的本發(fā)明蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)測(cè)定(a)N末端氨基酸序列分析上述得到的精制的本發(fā)明蛋白質(zhì)用476A型氨基酸定序機(jī)(AppliedBiosystems公司)分析時(shí)，確認(rèn)了序列表中1號(hào)序列所示從N末端到第30個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
(b)氨基酸組成分析用氨基酸分析儀〔PICO TAG系統(tǒng)(Waters公司)〕考察以上得到的精制的本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸組成。其結(jié)果列于表3中。表中所列的數(shù)值表示每一個(gè)單體的氨基酸殘基數(shù)。
表3氨基酸 實(shí)測(cè)值 期待值A(chǔ)sx 11.5 12Glx 10.9 11Ser 8.4 9Gly 4.3 4His 4.0 4Arg 7.7 7Thr 5.4 6Ala 7.3 7Pro 10.2 10Tyr 2.9 3Val 5.7 7Met 5.1 4Cys2.6 7Ile 4.9 6Leu 10.0 10Phe 4.0 4Lys 5.9 6Trp -2序列長(zhǎng)度 119一不可能檢出(c)電泳分析采用非還原條件下的SDS-PAGE確認(rèn)上述得到的精制的本發(fā)明蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，顯示約28KDa的分子量。
以上(a)、(b)和(c)顯示的結(jié)果表明，本發(fā)明蛋白質(zhì)是N末端單一地從Pro開(kāi)始的119個(gè)殘基組成的蛋白質(zhì)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料可在一種不需要外科手術(shù)的骨折療法中施用于患部，因其在活體內(nèi)吸收性高、與有效成分骨誘導(dǎo)因子的親合性良好、能發(fā)生溫度依賴型溶膠-凝膠可逆變化而操作簡(jiǎn)便，不會(huì)給患者帶來(lái)外科手術(shù)的痛苦。本發(fā)明還能提供骨誘導(dǎo)因子藥效持久、進(jìn)而副作用少的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。
序列表序列序號(hào)1序列長(zhǎng)度119序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)直線狀序列種類肽片斷類型N末端片斷起源生物名人類(homo sapiens)組織種類人類胎兒序列特征存在位置其它信息MP52氨基酸序列從第383號(hào)到第501號(hào)的氨基酸序列。
序列CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala5 10 15CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp20 25 30GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu35 40 45GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His50 55 60GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro65 70 75 80CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe85 90 95ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val100 105 110GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg115序列序號(hào)2序列長(zhǎng)度27序列類型核酸鏈數(shù)一條鏈拓?fù)鋵W(xué)直線狀序列種類其它核酸起源無(wú)生物名無(wú)株名無(wú)序列特征MP52成熟型分離用順向PCR引物。序列ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27序列序號(hào)3序列長(zhǎng)度26序列類型核酸鏈數(shù)一條鏈拓?fù)鋵W(xué)直線狀序列種類其它核酸起源無(wú)生物名無(wú)株名無(wú)序列特征MP52成熟型分離用逆向PCR引物。序列CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 2權(quán)利要求
1.軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，其中包含聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類和骨誘導(dǎo)因子。
2.權(quán)利要求1所述的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，其中作為聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類構(gòu)成成分的聚丙二醇的分子量在約1500～4000的范圍內(nèi)，環(huán)氧乙烷含量在約40～80％/分子的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求2所述的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，呈水溶液形態(tài)，且聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類在水溶液中的濃度是約10～50％。
4.權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所述的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，其中骨誘導(dǎo)因子是蛋白質(zhì)BMP-2。
5.權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所述的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料，其中骨誘導(dǎo)因子是蛋白質(zhì)MP52。
6.骨折/骨缺損治療劑，其中包含聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類與骨誘導(dǎo)因子。
7.骨折或骨缺損的治療方法，包括把含有聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類與骨誘導(dǎo)因子的骨折/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料施用于人類或動(dòng)物的骨折或骨缺損部位。
全文摘要
含有骨誘導(dǎo)因子和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的軟骨/骨誘導(dǎo)性修復(fù)用材料。在一個(gè)特別好的實(shí)例中,構(gòu)成聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類的聚丙二醇的分子量在約1,500～4,000的范圍內(nèi),環(huán)氧乙烷單元的重量比在約40～80%/分子的范圍內(nèi),聚氧乙烯單元的重量比在約40～8090分子的范圍內(nèi),聚氧乙烯聚氧丙烯二醇類在水溶液的濃度是約10～50%。這些材料可用于軟骨/骨誘導(dǎo)方法而無(wú)需任何手術(shù)。由于其組成為一種骨誘導(dǎo)因子和一種在活體內(nèi)容易吸收、可與骨誘導(dǎo)因子高度兼容且能發(fā)生溫度依賴型可逆溶膠—凝膠變化的載體,因而它們可高度適用于骨折和骨缺損部位,從而產(chǎn)生優(yōu)異的治療效果。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1207047SQ96199564
公開(kāi)日1999年2月3日 申請(qǐng)日期1996年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月17日
發(fā)明者志村武貞, 鳥山五月 申請(qǐng)人:赫斯·馬里恩·魯索株式會(huì)社