專利名稱：用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增加基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法。在諸如醫(yī)學、細胞技術(shù)、遺傳工程和發(fā)育技術(shù)等各種技術(shù)領(lǐng)域以及一系列相關(guān)技術(shù)中，該方法能夠有效轉(zhuǎn)化靶細胞。
現(xiàn)有技術(shù)由于對人類許多疾病機制的理解以及在重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)方面的迅速發(fā)展，近來有關(guān)體細胞基因治療的方案已經(jīng)建立以治療嚴重的遺傳病。另外，目前已經(jīng)嘗試將基因治療不僅應(yīng)用于治療遺傳病，而且也用于治療如AIDS等病毒感染疾患和癌癥。
迄今為止，幾乎所有的在人體內(nèi)進行的、經(jīng)過食品藥品管理局(FDA)批準的基因轉(zhuǎn)移實驗都是通過重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將所需要的外源基因有效地轉(zhuǎn)入細胞，使外源基因穩(wěn)定地整合到染色體DNA中，因此，對于需要長期基因表達的基因治療來說，這些載體是特別優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)移手段。采用各種方法設(shè)計這樣的載體以避免對所轉(zhuǎn)導(dǎo)的有機體產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。例如，缺失載體的增殖功能以預(yù)防由于將基因轉(zhuǎn)入細胞所用的載體的自我增殖而產(chǎn)生的無限重復(fù)感染(轉(zhuǎn)導(dǎo))。因為這些載體(增殖缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)沒有自我增殖的能力，所以，一般地，包裝在病毒顆粒中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是用逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細胞(包裝細胞)來進行制備的。
另一方面，骨髓細胞是體細胞基因治療的良好靶細胞，因為骨髓細胞易于體外操作而且含有能夠自我增殖的造血干細胞。另一種選擇，人臍帶血以前也被證實含有大量的包括造血干細胞在內(nèi)的原始祖細胞。當通過基因轉(zhuǎn)入靶細胞并移植入活體中進行基因治療時，這樣轉(zhuǎn)入的基因長期在血細胞中表達以達到終生治愈疾病的效果。
然而，盡管許多研究小組進行了深入的研究，但是造血干細胞是難以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞之一。迄今為止，與小鼠和其它動物造血干細胞有關(guān)的最有效的基因轉(zhuǎn)移方案是造血干細胞同逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細胞共培養(yǎng)。然而，對人類的臨床基因治療而言，由于考慮到生物安全性，無細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)是最可取的。不幸地是，如果不與逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細胞共培養(yǎng)，一般來說，基因有效地轉(zhuǎn)入造血干細胞是不可能的。
最近有人報道細胞外基質(zhì)的一種成分，纖維結(jié)合素，或它的片段單獨就可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移效率(《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)93，1451-1457頁(1994)；《血液》(Blood)，88，855-862頁(1996))。另外，人們也發(fā)現(xiàn)通過遺傳工程制備的纖維結(jié)合素片段具有相同的特性，并且通過利用它們，可以將外源基因有效轉(zhuǎn)入造血干細胞(WO95/26200)。有人提出纖維結(jié)合素的肝素結(jié)合區(qū)與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合與纖維結(jié)合素提高基因轉(zhuǎn)移效率有關(guān)。在所有的這些利用纖維結(jié)合素和其片段的方法中，細胞在已固化有纖維結(jié)合素或其片段的培養(yǎng)板中用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
發(fā)明目的已考慮過利用在同一分子上具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)的纖維結(jié)合素或它的片段，來完成上述利用纖維結(jié)合素和其片段的基因轉(zhuǎn)移方法(《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)，2，876-872頁(1996))。因此，為了利用上述方法將基因有效轉(zhuǎn)入各種靶細胞中，有必要根據(jù)分別不同的特定細胞來制備在同一分子上具有病毒和靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料，并且它作為一種普遍的基因轉(zhuǎn)移方法，仍然存在一個問題。
進一步說，通過將纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段固化在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染時用于培養(yǎng)靶細胞的培養(yǎng)板表面來進行上述的基因轉(zhuǎn)移方法。然而，這需要復(fù)雜的步驟以在培養(yǎng)板上進行固化，并且這遠不能說是一種簡單和方便的基因轉(zhuǎn)移方法。
再者，用于上述基因轉(zhuǎn)移方法的功能材料限于那些含有來源于纖維結(jié)合素、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的肝素結(jié)合區(qū)的材料。這樣，找到任何其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合物質(zhì)有可能建立一種改良的基因轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明的目的是解決該問題并提供更方便和有效的基因轉(zhuǎn)移方法。
發(fā)明概述發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使當具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的區(qū)域和具有細胞結(jié)合區(qū)的區(qū)域不在同一個分子上存在時，利用一種功能材料，一般是纖維結(jié)合素或其片段進行的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可以得到提高。這就是說，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過利用有效量的與含有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料混合的包含逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)即使當功能材料沒有固化到培養(yǎng)板表面時，也可觀察到利用功能材料增強的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染活性。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，在功能材料固化于珠子的情況下，使逆轉(zhuǎn)錄病毒與靶細胞接觸可以提高基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
此外，發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)了一種不含來源于纖維結(jié)合素的肝素結(jié)合區(qū)的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合材料，同時也發(fā)現(xiàn)該材料和其衍生物有利于用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞。再者，發(fā)明人已成功地創(chuàng)建了有利于用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的功能材料。至此，完成了本發(fā)明。
這樣，本發(fā)明的第一方面涉及增加逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法。該方法針對于用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，其特征為在有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料混合物存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞以使基因轉(zhuǎn)入靶細胞。
在本發(fā)明的第一方面中所采用的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料不是特別限定的，例如，它是選自以下的一種功能材料纖維結(jié)合素的肝素II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸和其功能性等價物。具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料可以是含有能夠與靶細胞結(jié)合的配體的材料。至于配體，則可以是細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和靶細胞代謝產(chǎn)物等。粘附蛋白的例子包括纖維結(jié)合素細胞結(jié)合區(qū)的多肽。至于纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)，則可以是與VLA-5和/或VLA-4結(jié)合的結(jié)合區(qū)多肽。再者，配體的其它實例包括紅細胞生成素。
在本發(fā)明的第一方面中所用的功能材料可以不進行固化而使用，或進行固化而使用，并且，當它們固化于珠子上時，可以方便地使用。另外，當靶細胞特異的配體被選為具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料時，本發(fā)明的第一方面使預(yù)定靶細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)方便地進行。
正如上所述，在WO 95/26200和《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)中所公開的常規(guī)方法中，將逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞同時定位在于同一分子上既有病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的一種功能材料上，這是提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的基本機制。然而，根據(jù)本發(fā)明，基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率可以采用下述方法進行提高，在有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料混合物存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞。
本發(fā)明的第二方面涉及一種用于逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的靶細胞培養(yǎng)基，它包括有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物。
通過利用本發(fā)明第二方面的培養(yǎng)基，本發(fā)明的第一方面可以方便地進行。
本發(fā)明的第三方面涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，該方法的特征為將逆轉(zhuǎn)錄病毒與有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物相接觸，然后孵育含有上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的第四方面涉及用于進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)入靶細胞的試劑盒，該試劑盒包括(a)有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和/或有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料；(b)用于孵育靶細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒的人造材料；以及(c)用于預(yù)先刺激靶細胞的靶細胞生長因子。
通過運用本發(fā)明第四方面的試劑盒，本發(fā)明的第一和第三方面可以方便地進行。
本發(fā)明的第五方面涉及提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法，該方法的特征為于同一分子上同時具有靶細胞結(jié)合區(qū)以及來自成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸，或其功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的有效量的功能材料存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞以進行靶細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在WO 95/26200和《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)中所述的上述常規(guī)方法中，纖維結(jié)合素片段被公開為能用于改善逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因入靶細胞的最有效方法中的材料。然而，關(guān)于除纖維結(jié)合素片段之外的其它功能材料，沒有特別公開說明何種功能材料能用于逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的高效方法中。更具體地說，在常規(guī)方法中，只有纖維結(jié)合素12-14重復(fù)序列被公開為逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)與纖維結(jié)合素12-14重復(fù)序列沒有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸等也可以有效地用于提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法中。因此，這些材料的任何功能性等價物，即，任何具有功能上等價于這些材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)并能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的材料都可用于本發(fā)明的第五方面中。
在本發(fā)明的第五方面中，具有與靶細胞結(jié)合的配體的材料被用作靶細胞結(jié)合區(qū)，并且該材料與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)相偶聯(lián)。
配體的實例包括細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物，靶細胞的代謝產(chǎn)物等。細胞粘附蛋白的實例包括纖維結(jié)合素細胞結(jié)合區(qū)的多肽。例如，結(jié)合于VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽可用于本發(fā)明中。再者，其它的配體實例包括紅細胞生成素。
在本發(fā)明的第五方面中，用作逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的成纖維細胞生長因子，例如，可以選自序列表中SEQ.ID No.3所表示的一種成纖維細胞生長因子、該因子的功能性等價物和包含該因子或其功能性等價物的多肽。
這些功能材料的實例包括那些含有序列表中SEQ.ID No.4和5所表示的氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第五方面中，被用作逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的膠原包括，例如選自下述的膠原含有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的膠原片段，該片段的功能性等價物和含有該片段或其功能性等價物的多肽。另外，該片段的實例包括含有序列表中SEQ.ID No.6所表示的氨基酸序列的片段。
這些功能材料的實例包括那些序列表中SEQ.ID No.7和8所表示的多肽。
在本發(fā)明的第五方面中，被用作逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的聚賴氨酸是一種L-賴氨酸的聚合物，例如，具有適當聚合程度的聚合物可選自商業(yè)上可購買的產(chǎn)品并進行使用。
如果來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)同時具有靶細胞的結(jié)合區(qū)，在存在有效量的來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的情況下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。如果靶細胞是粘附細胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞分別結(jié)合和粘附于功能材料，并且在存在有效量的來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的情況下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
人們也發(fā)現(xiàn)，如果序列表中SEQ.ID No.1所表示的多肽(此后稱之為H-271)同時具有靶細胞結(jié)合區(qū)，這就是說，如果靶細胞結(jié)合于多肽，H-271，在存在有效量的多肽的情況下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
這就是說，盡管在上述《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)中所公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)僅僅是纖維結(jié)合素的12-14重復(fù)序列，但是發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)特定的一種靶細胞，該H-271可有效地作為靶細胞結(jié)合區(qū)，結(jié)果提高基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。另外，若靶細胞為粘附細胞，靶細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒分別結(jié)合并粘附于多肽，在有效量的多肽存在下，通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞可以提高用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
在本發(fā)明的第五方面中，盡管靶細胞是粘附細胞的情況下優(yōu)選功能材料是固化的，但它可以在沒有固化的情況下使用。
本發(fā)明的第六方面涉及用于逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的靶細胞培養(yǎng)基，它包括有效量的一種功能材料，該功能材料在同一分子上既有靶細胞結(jié)合區(qū)也有來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸或它們的功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
本發(fā)明的第七方面涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，它包括孵育含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，并且該病毒與有效量的含有來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的功能材料接觸。這些功能材料可被有效地用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位以改善利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞基因轉(zhuǎn)移。
再者，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒定位方法包括孵育同有效量的功能材料接觸的逆轉(zhuǎn)錄病毒，該功能材料在同一分子上既有靶細胞結(jié)合區(qū)也有來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸或它們功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
本發(fā)明的第八方面是用于進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶細胞基因轉(zhuǎn)移的試劑盒，該試劑盒包括(a)有效量的在同一分子上含有來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸或它們的功能性等價物的靶細胞結(jié)合區(qū)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料；
(b)用于孵育同逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸的人造材料；以及(c)用于預(yù)先刺激靶細胞的靶細胞生長因子。
為了實際應(yīng)用本發(fā)明第一和第五方面的任一方法，第二和第六方面的任一培養(yǎng)基，第三和第七方面的任一方法，以及第四和第八方面的任一試劑盒，可以適當使用固化在珠子上的功能材料。
本發(fā)明的第九方面涉及提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法，并且其特征為在存在有效量的固化于珠子上的選自基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或它們的混合物的功能材料的情況下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞以進行利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的第十方面也涉及提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法，并且其特征為在存在有效量的未固化的選自基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或它們的混合物的功能材料的情況下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞以進行利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
上述已公開于WO 95/26200和《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)的常規(guī)方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞應(yīng)定位于同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料上，這是提高逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移效率的基本機制。在這些方法中，通過將在同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料固化于培養(yǎng)材料上，逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞同時定位于同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料上首先成為可能。
然而，根據(jù)本發(fā)明，即使當使用基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或它們的混合物時，意外的是，通過應(yīng)用沒有固化于培養(yǎng)材料上的在同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料，可以有效提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
在本發(fā)明的第一、五、九和第十方面中所用的靶細胞，例如，可以使用選自下列細胞的細胞干細胞、造血細胞、非粘附的低密度單核細胞、粘附細胞、骨髓細胞、造血干細胞、外周血干細胞、臍帶血細胞、胎兒造血干細胞、胚胎形成的干細胞、胚胎細胞、原始胚細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵細胞、精母細胞、精子、CD34+細胞、C-kit+細胞、多能造血祖細胞、單能造血祖細胞、紅細胞前體細胞、淋巴細胞前體細胞、成熟血細胞、淋巴細胞、B細胞、T細胞、成纖維細胞、成神經(jīng)細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝細胞、成肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞和白血病細胞。
在本發(fā)明的第一、三、五、七、九和第十方面中所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒，可以使用含有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒可為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。再者，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒可為增殖缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明的第十一方面涉及通過本發(fā)明第一、五、九或第十方面所獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。
本發(fā)明的第十二方面涉及將本發(fā)明第十一方面的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞移植入脊椎動物的細胞移植方法。
本發(fā)明的第十三方面涉及能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的序列表中SEQ.ID No.13所表示的多肽或其功能等價物。
本發(fā)明的第十四方面涉及編碼本發(fā)明第十三方面中的多肽的基因?；虻膶嵗ㄐ蛄斜碇蠸EQ.ID No.17所表示的基因，或者在嚴緊條件下能與上述基因雜交并編碼能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
上述已公開于WO 95/26200和《自然醫(yī)學》(Nature Medicine)的常規(guī)方法中，用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的最有效的肽是CH-296。另一方面，發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)沒有VLA-5結(jié)合區(qū)和VLA-4結(jié)合區(qū)的同一種多肽可以用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的第十五方面涉及能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的序列表中SEQ.ID No.30所表示的多肽或其功能性等價物。
本發(fā)明的第十六方面涉及編碼本發(fā)明第十五方面中多肽的基因。基因的實例包括序列表中SEQ.ID No.33所表示的基因，或者在嚴緊條件下能與上述基因雜交并編碼能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
本發(fā)明的第十七方面涉及能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的序列表中SEQ.ID No.5所表示的多肽或其功能性等價物。
本發(fā)明的第十八方面涉及編碼本發(fā)明第十七方面中多肽的基因?；虻膶嵗⊿EQ.ID No.26所表示的基因，或者能與上述基因雜交并編碼能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
發(fā)明詳述對于本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移方法，通常使用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且增殖缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體尤其適合。使載體缺失增殖能力是為了預(yù)防在感染的細胞中進行自我增殖，所以載體是非致病性的。這些載體能夠侵入諸如脊椎動物細胞等宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞，以使插入到載體的外源基因穩(wěn)定整合到宿主細胞的染色體DNA中。
在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)入細胞的外源基因可以通過插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，在適當?shù)膯幼拥目刂葡逻M行使用，所述啟動子如在逆轉(zhuǎn)錄病毒中的LTR啟動子或外源啟動子。另外，為了使外源基因轉(zhuǎn)錄，在載體中也有與啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點協(xié)作的其它調(diào)控元件，例如增強子。再者，插入的基因優(yōu)選在其下游有終止序列。被轉(zhuǎn)入細胞的外源基因可為天然基因或人工構(gòu)建基因，并且可含有通過連接或本領(lǐng)域已知的其它手段與其偶聯(lián)的其它異源DNA分子。
用于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒的外源基因可為任何感興趣的基因。例如，外源基因可以編碼與要治療的一種疾病相關(guān)的酶、蛋白質(zhì)、反義核酸、核酶或錯配引物(見，如WO 90/13641)、細胞內(nèi)抗體(如WO94/02610)、生長因子等。
本發(fā)明中所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有標志基因以使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞易于篩選。作為標志基因，例如，可以使用為轉(zhuǎn)化的細胞提供抗生素抗性的耐藥基因或者為轉(zhuǎn)化的細胞提供用于檢測的酶活性的報告基因。
至于所用的載體，有一些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如已知的MFG載體(ATCC號69754)、α-SGC(ATCC號68755)等。另外，此后的實例中所用的N2/ZipTKNEO載體(TKNEO，《血液》(Blood)，78卷，310-317頁(1991))和PM5neo載體(《實驗血液學》(Exp.Hematol.)23卷，630-638頁(1995))都含有新霉素抗性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)作為它們的標志基因。這樣，用載體轉(zhuǎn)化的細胞可被識別為具有抗生素(新霉素，G418等)抗性的細胞，這些抗生素是被基因產(chǎn)物所滅活的。再者，這些載體可制備成含有用已知的包裝細胞株包裝的載體的病毒顆粒，包裝細胞例如PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、在美國專利5,278,056中所述的細胞株，GP+E-86(ATCC CRL-9642)，GP+envAm-12(ATCC CRL-9641)等。
此處所用的功能材料的“有效量”這個術(shù)語是指在用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞中，靶細胞轉(zhuǎn)化所需要的量。通過采用此處所描述的方法，可以根據(jù)特定的功能材料，逆轉(zhuǎn)錄病毒和特定種類的靶細胞來選擇該量。此處所用的術(shù)語“基因轉(zhuǎn)移效率”是指轉(zhuǎn)化效率。
正如此后實施例中所公開的，通過常規(guī)試驗可以證實功能材料與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的能力，如，本發(fā)明中功能材料的效率和有效性。
這些試驗可以測定逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與功能材料結(jié)合的程度，功能材料固化于本發(fā)明所用的基質(zhì)中以免從基質(zhì)上洗脫下來。例如，簡而言之，含病毒的上清可孵育于含有固化的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料的培養(yǎng)孔中。然后用生理鹽水徹底沖洗該培養(yǎng)孔，接著在該孔中孵育靶細胞以測定在該孔中剩余的病毒的感染活性水平。評估相對于最初的病毒上清的感染活性的降低或滴度并與相似對照(如采用BSA包被的培養(yǎng)孔)的對應(yīng)參數(shù)進行比較。與對照培養(yǎng)孔相比，在含功能材料的培養(yǎng)孔中所保持的顯著增高的滴度表明該材料可以用作本發(fā)明的功能材料。
為了使篩選過程容易進行，病毒載體可含有可選擇的標志基因。
通過這些試驗可以篩選用于本發(fā)明的含有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。
作為這樣一種具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料，是具有來源于纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。
用于本發(fā)明的功能材料的細胞結(jié)合區(qū)與細胞的結(jié)合，即含有靶細胞結(jié)合配體的材料與細胞的結(jié)合，用常規(guī)方法同樣可以進行測定。例如，這樣的方法包括在《自然》(Nature)352438-441(1991)中所描述的那些。
簡而言之，具有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料被固化于培養(yǎng)板上并且要測定的細胞群體在培養(yǎng)基中重疊生長，隨后孵育30分鐘到2小時。孵育之后，未粘附于功能材料的細胞被回收，計數(shù)并測定活性。粘附于功能材料的細胞用胰酶或細胞分離緩沖液(如，Gibco)也進行回收、計數(shù)并測定其活性。在一些情況下，例如造血生成集落形成細胞的情況，細胞進一步培養(yǎng)12到14天以確定細胞的集落形成特性。然后計算粘附細胞的百分比并與標準品或諸如固化于培養(yǎng)板的牛血清白蛋白(BSA)等標準對照進行比較。靶細胞與所測定的功能材料的大量結(jié)合提供證據(jù)表明功能材料/細胞組合適合本發(fā)明并且具有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料能與具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料共存或偶聯(lián)。隨后測定靶細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染以構(gòu)建用于本發(fā)明的功能材料。
如上所述，作為能用于本發(fā)明的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料是具有來源于纖維結(jié)合素肝素II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。所有的具有等價于上述的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)并且通過與具有靶細胞結(jié)合區(qū)的配體偶聯(lián)或共存能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的材料均包括于來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能性等價物中。
在所選擇的偶聯(lián)于或共存于具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料存在下，在本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)移方法中利用靶細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后根據(jù)上述方法評估基因轉(zhuǎn)移效率的提高，通過以上手段可以測定用于本發(fā)明的功能材料的有效量。
此后，將詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明的一個方面是提高用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法。該方法特征是在具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效地提高用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料混合存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染活的靶細胞。
該方法可用于獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細胞并且將細胞移植入個體中，使基因轉(zhuǎn)移入個體中。
在該方法中所用的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料不是特別限定的，其實例包括纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸等。同樣，其功能性等價物，如具有肝素結(jié)合區(qū)的功能材料也可使用。另外，也可使用功能材料的混合物、含有功能材料的多肽、功能材料的聚合物、功能材料的衍生物等?？蓮奶烊淮嬖诘漠a(chǎn)物，或人造產(chǎn)物(如通過遺傳工程技術(shù)或化學合成制備的產(chǎn)物)獲得這些功能材料。再者，它們可通過自然存在的產(chǎn)物與人造產(chǎn)物結(jié)合來進行制備。
只要保持此處所述的能獲得高效基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和/或靶細胞結(jié)合區(qū)，使用的功能材料可以是天然存在的多肽的氨基酸序列中有突變的那些材料。在本發(fā)明中，即使一個或多個，例如多達幾個氨基酸缺失、替代、插入和/或添加到天然存在的多肽的氨基酸序列中，只要保持所需要的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和/或靶細胞結(jié)合區(qū)，這些多肽被稱為具有天然存在的氨基酸序列的多肽的功能性等價物。通過制備編碼功能性等價物的基因以制備這些等價物并確證它們的生物活性后可以獲得這些功能材料。
關(guān)于這方面，相關(guān)的生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展到在需要的功能區(qū)可以常規(guī)進行氨基酸的缺失、替代、插入或進行其它修飾的這種階段。然后常規(guī)篩選所得到的氨基酸序列以獲得所需要的細胞結(jié)合活性或病毒結(jié)合活性。
通過尋找能夠與上述功能材料的編碼基因雜交的基因可以獲得編碼功能性等價物的編碼基因。
這就是說，編碼上述功能材料或其部分核苷酸序列的基因可用作雜交的探針或PCR等基因擴增方法的引物以篩選編碼與功能材料有相似活性的蛋白質(zhì)的基因。在該方法中，有時候會獲得只含有部分所需基因的DNA片段。在這種情況下，當證實所獲得的DNA片段是所需基因的一部分后，通過用該DNA片段或其部分片段作為探針來進行雜交或用根據(jù)DNA片段的核苷酸序列合成的引物來進行PCR，可獲得全長的所需基因。
例如，上述雜交可在下列條件下進行。
這就是說，在含有0.5％ SDS、0.1％的BSA、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone)、0.1％ Ficoll 400和0.01％變性鮭精DNA的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl、0.015檸檬酸鈉，pH7.0)中，有DNA固定在上面的薄膜與探針一起在50℃共育12到20小時。孵育后，首先用含0.5％ SDS的溫度為37℃的2×SSC溶液沖洗，然后濃度改變?yōu)?.1×SSC并且溫度上升至50℃進行沖洗，直至已固定的DNA所表示的信號能與背景區(qū)分為止。
另外，測定根據(jù)上述方法所獲得的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性可以確定這樣獲得的基因是否是所需要的基因。
如上述WO 95/26200所述，纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)是含有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的多肽。盡管成纖維細胞生長因子、膠原和聚賴氨酸與纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)不具有任何的結(jié)構(gòu)相似性(如，氨基酸序列的相似性)，但是發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些材料具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
用于本發(fā)明的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料也不是特別限定的，并且它是具有能與靶細胞結(jié)合的配體的材料。配體的實例包括細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗細胞表面抗原的抗體、多糖、在糖蛋白或糖脂中的糖鏈和靶細胞的代謝產(chǎn)物等。另外，也可以使用含有功能材料的多肽、功能材料的聚合物、功能材料的衍生物、功能材料的功能性等價物等。這些功能材料可來源于天然存在的產(chǎn)物或人造產(chǎn)物(如，遺傳工程技術(shù)或化學合成技術(shù)所制備的產(chǎn)物)。再者，它們也可以通過天然存在的產(chǎn)物與人造產(chǎn)物結(jié)合來進行制備。
所用的細胞粘附蛋白可以是，例如，纖維結(jié)合素或其片段。例如，與Pro1239-Ser1515相對應(yīng)的人纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)，如在美國專利號5,198,423中所述，它已被證實具有與此處公開的C-274多肽等價的功能并能與包括BHK和B16-F10細胞(Kimizuka等，《生物化學雜志》(J.Biochem.)110卷，285-291頁(1991))在內(nèi)的細胞結(jié)合。在這些多肽中存在的由RGDS四個氨基酸組成的序列是VLA-5受體的配體。在眾多種類的細胞中可見VLA-5受體的表達并且它在未分化細胞中的表達優(yōu)于分化細胞中的表達。另外，已知纖維結(jié)合素的CS-1區(qū)是VLA-4受體的配體并且能與表達該受體的細胞結(jié)合(T細胞、B細胞、單核細胞、NK細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性細胞、胸腺細胞、骨髓單核細胞、紅細胞生成的前體細胞、淋巴細胞前體細胞、黑色瘤瘤細胞、肌細胞等)。在JP-A3-284700中所述、由SEQ.ID No.29所代表的多肽(此后稱為C277-CS1)是具有VLA-5和VLA-4受體配體的多肽并能用于具有這些受體的細胞的基因轉(zhuǎn)移。再者，已經(jīng)證實肝素-II區(qū)能與成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞結(jié)合。在具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料的多肽存在下，肝素-II區(qū)的細胞結(jié)合區(qū)的多肽序列有助于引導(dǎo)病毒感染靶細胞。
具有細胞特異性活性的激素和細胞因子適合作為本發(fā)明中含有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料。例如，在造血系統(tǒng)中為一種細胞因子的紅細胞生成素可用于紅細胞的基因轉(zhuǎn)移。根據(jù)已知的方法可以制備紅細胞生成素并可進行使用。另外，也可以使用紅細胞生成素的功能性等價物和含有紅細胞生成素或其功能性等價物的多肽。
正如后面的實施例中所述，當具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能材料(如，H-271和成纖維細胞生長因子)與具有來源于纖維結(jié)合素等的細胞結(jié)合活性的多肽C-274混合使用時，可獲得高效基因轉(zhuǎn)移。在這些實驗中所用的NIH/3T3細胞表達能與C-274結(jié)合的VLA-5受體并且它們之間的相互作用有助于提高基因轉(zhuǎn)移效率。
進一步說，在表達紅細胞生成素受體的TF-1細胞的基因轉(zhuǎn)移中，當存在紅細胞生成素的衍生物時，也可以觀察到同樣的現(xiàn)象。(《血液》(Blood)，73卷375-380頁(1989))。再者，在不表達任何紅細胞生成素受體的細胞中觀察不到該效果。
從這些結(jié)果中很明顯地看出，在具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與具有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料共存下，可發(fā)生細胞特異的基因轉(zhuǎn)移效率的增加。
在本發(fā)明的這個方面中，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料以與具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料混合的形式進行使用。因此，與功能材料有親和力的靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率被明顯地提高。因為基因轉(zhuǎn)移效率提高了，所以可避免與病毒生產(chǎn)細胞的共培養(yǎng)，這是本發(fā)明的優(yōu)點之一。
選擇性將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法很有用，并且已經(jīng)進行了各種各樣的研究。例如，有一種非病毒載體(分子連接載體)，其中與細胞表面存在的受體結(jié)合的材料偶聯(lián)于DNA結(jié)合材料上。用這種載體進行基因轉(zhuǎn)移的實例包括用脫唾液酸糖蛋白將基因轉(zhuǎn)入肝癌細胞(《生物與化學雜志》(J.Biol.Chem.)，262卷，4429-4432頁(1987))，用轉(zhuǎn)鐵蛋白將基因轉(zhuǎn)入成淋巴細胞(《國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89卷6099-6103頁(1992))，用抗EGF受體抗體將基因轉(zhuǎn)入癌細胞(《FEBS通訊》(FEBS Letters)338卷，167-169頁(1994))等。從被轉(zhuǎn)入的基因的長期基因表達方面來看，采用非病毒載體的這些基因轉(zhuǎn)移方法是不可取的，因為被轉(zhuǎn)入的基因不整合到細胞的染色體DNA中。已經(jīng)嘗試許多研究以采用廣泛用作載體的能夠?qū)⒒虿迦氲饺旧w中的逆轉(zhuǎn)錄病毒來感染特異的細胞。例如，通過直接的化學修飾將逆轉(zhuǎn)錄病毒偶聯(lián)到乳糖上將基因轉(zhuǎn)入肝細胞(《生物與化學雜志》(J.Biol.Chem.)266卷，14143-14146頁(1991))，利用重組病毒顆粒將基因轉(zhuǎn)入表達紅細胞生成素受體的細胞，該病毒具有外殼蛋白，該蛋白是與紅細胞生成素的融合蛋白(《科學》(Science)，266卷1373-1376頁(1994))等，這些均已研究成功。然而，為了達到此目的，有必要根據(jù)特定的靶細胞制備特異的蛋白質(zhì)顆粒。另外，病毒顆粒的化學修飾需要復(fù)雜的步驟并且易于滅活病毒。再者，關(guān)于通過遺傳工程修飾的病毒外殼，一直沒有得到具有所需功能的(與靶細胞結(jié)合和構(gòu)建病毒顆粒)所需要的產(chǎn)物。
上述的WO 95/26200提出，在與具有細胞結(jié)合活性的適當配體共價偶聯(lián)的纖維結(jié)合素片段的存在下，沒有進行任何特異修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可轉(zhuǎn)移入細胞中。然而，這種方法使用既有病毒結(jié)合活性又有細胞結(jié)合活性的功能分子，因此應(yīng)該根據(jù)特定的細胞種類制備個體特異的功能材料。另外，目前不知道所制備的功能材料是否保持兩種活性。
本發(fā)明中具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料組合使用可為眾多種類的細胞提供一種用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。為此目的，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料不需要與有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料共價偶聯(lián)。因此，不需要根據(jù)特定細胞種類制備具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料共價偶聯(lián)的這種個體特異的功能材料，而且靶細胞的基因轉(zhuǎn)移可以方便高效地進行。
采用本發(fā)明的方法將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的實例是造血系統(tǒng)的細胞基因轉(zhuǎn)移。已知上述纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)有助于造血干細胞的基因轉(zhuǎn)移。再者，也已知，除了上述紅細胞生成素之外，各種其它的細胞特異性細胞因子與造血細胞的分化有關(guān)，并且利用它們可以進行靶細胞(細胞系)的特異性基因轉(zhuǎn)移。例如，當使用G-CSF時，成巨核細胞和粒細胞前體細胞可用作轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細胞。
當使用特異性或主要與惡性細胞結(jié)合的材料作為具有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料時，可以將基因轉(zhuǎn)入這樣的靶細胞。
例如，已知稱為HER-2和HER-4的受體表達于某些乳腺癌細胞(《國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92卷9747-9751頁(1995))。因此，通過組合應(yīng)用受體的配體Heregulin和具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料，有可能能夠控制乳腺癌細胞的生長。
另外，含碘的功能材料用于甲狀腺(癌)細胞或含高密度脂蛋白(HDL)、脫唾液酸糖蛋白或其一部分的功能材料用于肝(癌)細胞，通過上述方法，這些細胞可用作轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細胞。
再者，通過使用抗細胞表面抗原的抗體，適當使用單集落抗體作為具有細胞結(jié)合活性的功能材料，任何能獲得抗體的細胞均可用作靶細胞。這樣，通過利用本發(fā)明所公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和靶細胞的定位方法，眾多種類的細胞可用作靶細胞。
在特別優(yōu)選的方面中，利用新型的功能材料可以增加用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率。
迄今為止，只有纖維結(jié)合素的肝素-II區(qū)已知是有助于逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。
如上所述，區(qū)域本身有與某些細胞結(jié)合的活性，在某些情況下，根據(jù)某些靶細胞這種活性是不需要的。在這種情況下，用另外的細胞結(jié)合區(qū)置換該結(jié)合區(qū)可以獲得需要的結(jié)果。在這種方法中，可使用具有不同特性的多種功能材料并且這使得更廣泛應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的基因治療成為可能，而且易于進行預(yù)定靶細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明提供的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的新型功能材料包括成纖維細胞生長因子、含有該因子的多肽、膠原片段、該片段的混合物，含有該片段的多肽和功能材料的聚合物等。聚賴氨酸也用于本發(fā)明的此目的。這些功能材料可來自天然存在的產(chǎn)物或來自人造產(chǎn)物(如，通過遺傳工程或化學合成制備的產(chǎn)物)。再者，它們也可以通過組合天然存在的產(chǎn)物和化學合成的產(chǎn)物來進行制備。功能材料可以用于本發(fā)明第一方面的基因轉(zhuǎn)移方法，并且功能材料和其它具有細胞結(jié)合區(qū)的功能材料的嵌合分子也可用于基因轉(zhuǎn)移。
上述所有的功能材料均有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性。然而，這些材料不包括WO 95/26200中所述的人纖維結(jié)合素的肝素-II區(qū)或有相似氨基酸序列的多肽。
成纖維細胞生長因子，可以使用基本純化的天然存在的產(chǎn)物或者使用遺傳工程技術(shù)制備的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，可使用序列表中SEQ.IDNo.3所代表的成纖維細胞生長因子并且也可使用保持多肽功能的修飾衍生物。成纖維細胞生長因子衍生物的實例包括序列表中SEQ.ID No.4所代表的多肽(此后稱為C-FGF·A)。該多肽是纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽偶聯(lián)于SEQ.ID No.3所代表的成纖維細胞生長因子的N-端，并且可通過遺傳工程技術(shù)來制備，正如美國專利號5,302,701中所一般公開描述的。采用已在上述美國專利中公開的大腸桿菌FERM P-12637可以獲得該多肽，并且根據(jù)布達佩斯條約將其保藏于國立生命科學和人體技術(shù)研究所(NIBH)，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號FERM BP-5278(原始保藏日，1991年12月9日)。
根據(jù)此處所述的方法，利用根據(jù)布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號為FERM BP-5654(原始保藏日，1996年9月6日)的大腸桿菌可以獲得具有來源于纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)的上述C-FGF·A的多肽衍生物，由SEQ.ID No.5代表(此后稱為C-FGF-CS1)。該C-FGF-CS1尤其有助于將基因轉(zhuǎn)入具有CS-1結(jié)合特性的靶細胞，尤其是造血干細胞。
膠原片段，可以使用通過酶或化學裂解天然膠原所獲得的基本純化的片段，或者使用通過遺傳工程技術(shù)制備的那些膠原片段。另外，可使用保持其功能的這些片段的修飾物。在這些膠原中，人V型膠原具有強的胰島素結(jié)合活性(JP-A 2-209899)。具有胰島素結(jié)合區(qū)的多肽實例之一是含有序列表中SEQ.ID No.28所代表的氨基酸序列的多肽(JP-A5-97698)，例如，序列號中SEQ.ID No.6所代表的多肽(此后稱ColV)。根據(jù)此處實例中所公開的方法可以制備ColV。含有ColV并由SEQ.IDNo.7所代表的多肽(此后稱為C277-ColV)是這樣的多肽，其中纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽偶聯(lián)于ColV的N-末端，并且根據(jù)上述的JP-A 5-97698通過遺傳工程技術(shù)可以制備。利用在JP-A 5-97698公開的保藏號為FERM P-12560的大腸桿菌可以獲得C277-ColV，該大腸桿菌根據(jù)布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號為FERM BP-5277(原始保藏日1991年10月7日)。
按如下步驟可以制備來源于SEQ.ID No.8所代表的并且含有來源于纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)的C277-ColV的多肽(此后稱為C-ColV-CS1)。用上述質(zhì)粒pCH102作為模板和引物CS1-S(核苷酸序列由序列表中SEQ.ID No.9表示)與M4通過PCR擴增分離出一段DNA片段，然后用限制性酶NheI和SalI酶解，其中該質(zhì)粒pCH102由根據(jù)布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號為FERM BP-2800(原始保藏日1989年5月12日)的大腸桿菌制備。
另一方面，用質(zhì)粒pTF7520 ColV作為模板以及引物CF和CNR通過PCR擴增分離出一段DNA片段，并用限制酶Acc III和NheI酶切，其中該質(zhì)粒含有編碼C277-ColV的基因并由上述大腸桿菌制備。CF和CNR的核苷酸序列由序列表中SEQ.ID No.10和12表示。將上述兩個DNA片段混合并與限制酶Acc III和SalI酶切質(zhì)粒pTF7520 ColV所獲得的大約4.4kb的DNA片段連接。所得到的質(zhì)粒編碼含有C277-ColV C端的CS-1細胞粘附區(qū)的多肽C-ColV-CS1，并且在多肽中從ColV C末端起的第二個谷氨酸和C末端的蘇氨酸分別被丙氨酸和絲氨酸置換。當培養(yǎng)了用這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌后，可以從培養(yǎng)物中獲得所需要的多肽。該C-ColV-CS1尤其有助于將基因轉(zhuǎn)入具有CS1結(jié)合特性的靶細胞，尤其是干細胞。
如上所述，具有適當聚合程度的聚賴氨酸可選自商業(yè)上可購買的聚賴氨酸并且使用。
本發(fā)明中所用的功能材料包括上述功能材料的衍生物。其實例包括上述C-FGF-CS1或其功能性等價物和C-ColV-CS1或其功能性等價物。另外，通過聚合功能材料的多個分子得到的聚合物和根據(jù)已知的方法進行功能材料修飾(添加糖鏈等)所得到的修飾材料也可用于本發(fā)明中。利用編碼聚合物的基因和編碼它們功能性等價物的基因，通過遺傳工程技術(shù)可以制備這些聚合物和它們的功能性等價物。另外，通過在功能材料的氨基酸序列中添加、插入和替代半胱氨酸可以制備用于制備功能材料聚合物的添加了半胱氨酸的功能材料。此外，為添加了半胱氨酸的功能材料并具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的分子容易偶聯(lián)于另一個為添加了半胱氨酸的功能材料并且具有靶細胞結(jié)合區(qū)的分子上。再者，利用添加了半胱氨酸的功能材料的半胱氨酸殘基的活性可以制備偶聯(lián)于其它功能材料的材料。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，利用能增加逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的纖維結(jié)合素的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的聚合物來進行基因轉(zhuǎn)移。
功能材料是如上面WO 95/26200所述的在同一分子中具有多個人纖維結(jié)合素肝素-II結(jié)合區(qū)的多肽或多肽的衍生物。只要其保持與功能材料相同的活性，部分氨基酸序列不同于天然存在產(chǎn)物的序列的功能性等價物也可包括在內(nèi)。
功能材料聚合物的實例包括通過酶或化學聚合上述來源于纖維結(jié)合素的多肽或通過遺傳工程技術(shù)獲得的那些聚合物。在分子中具有兩個來源于纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)的多肽實例包括具有序列表中SEQ.ID No.13所表示的氨基酸序列的多肽(此后稱為H2-547)。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，利用根據(jù)布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號為FERM BP-5656(原始保藏日1996年9月6日)的大腸桿菌可以獲得H2-547。具有序列表中SEQ.ID No.14所表示的氨基酸序列的多肽是含有偶聯(lián)于H2-547 N末端的纖維結(jié)合素的細胞粘附多肽的多肽衍生物(此后稱CH2-826)。根據(jù)本發(fā)明所公開的方法可以獲取該多肽。再者具有序列表中SEQ.ID No.30所表示的氨基酸序列的多肽是含有偶聯(lián)于H2-547 C-末端的纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)的多肽衍生物(此后稱為H2S-573)。根據(jù)本發(fā)明中所述的方法，利用根據(jù)布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本，保藏號為FERM BP-5655(原始保藏日1996年9月6日)的大腸桿菌可以獲得該多肽。具有CS-1細胞粘附區(qū)的H2S-573有助于造血干細胞的基因轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，當被固化于珠子上的能夠有效地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因轉(zhuǎn)入細胞的效率的功能材料存在時，用增殖缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染活的靶細胞。
將功能材料固化到用于病毒感染細胞的容器(細胞培養(yǎng)板)上來進行利用上面的WO 95/26200和《自然醫(yī)學》(Natural Medicine)中所述的功能材料以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的效率的常規(guī)方法。這些方法需要復(fù)雜的步驟，如用含功能材料的溶液處理培養(yǎng)板后沖洗過量的功能材料。
然而，利用有功能材料固化于其上的培養(yǎng)板的基因轉(zhuǎn)移方法難以說是一種方便的方法。另一方面，利用功能材料固化于珠子上的方法有如下優(yōu)點。
與培養(yǎng)板相比，固化于珠子上可以在相對狹小的空間中進行并且珠子能在密封的容器中進行處理。因為功能材料固化于其上的培養(yǎng)板的表面暴露于空氣中，所以在功能材料穩(wěn)定性低的情況下有必要仔細預(yù)防由于儲存過程中的干燥而引起的功能下降等。然而，珠子可以懸浮在溶液中進行儲存，這樣可以避免這種問題。再者，使用珠子可以擴大功能材料的表面積，因此，與培養(yǎng)板相比，可以獲得更高的基因轉(zhuǎn)移效率。
功能材料的固化可以用常規(guī)方法進行，例如，功能材料包括被靶細胞培養(yǎng)容器，或者例如，功能材料固化于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)珠上。根據(jù)預(yù)定的用途可以選擇原材料和珠子的種類。例如，珠子可具有環(huán)狀或球狀核心作為中央部分并且用疏水的聚合物包被核心的表面。原材料的實例和核心與聚合物的種類見JP-A 8-501092所述。例如，有功能材料固化于其上的可生物降解的珠子可以用于活體。另一種選擇，一種有效的方法是應(yīng)用下列兩者的混合物，即具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的分子固化于其上的珠子和具有靶細胞結(jié)合區(qū)的分子固化于其上的珠子。
當功能材料不進行固化而使用時，例如，靶細胞培養(yǎng)容器可以用一種材料預(yù)先處理，該材料預(yù)防功能材料粘附于容器上，如牛血清白蛋白(BSA)。這樣，功能材料使用時不會非特異地粘附于容器上。
根據(jù)本發(fā)明，即使在本發(fā)明的功能材料沒有固化而使用的系統(tǒng)中，也可以高效地進行基因轉(zhuǎn)移。
另外，如下所述，利用特異為實施本發(fā)明的方法而設(shè)計的試劑盒，可以非常方便地進行基因轉(zhuǎn)移。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的轉(zhuǎn)化細胞可移植入活體中，因而可以進行在活體中表達外源基因的基因治療。
例如，當造血干細胞被用作靶細胞時，按下列步驟可以進行基因治療。首先，從供者中收集含有造血干細胞的材料，例如，骨髓組織、外周血、胎兒臍帶血等。這些材料可以作為靶細胞。然而，通常用密度梯度離心等制備含有造血干細胞的單核細胞部分。另一種選擇，可以利用細胞表面諸如CD34和/或C-kit等標志純化造血干細胞。含有造血干細胞的材料可以任選是否用適當?shù)募毎L因子等預(yù)先刺激，然后用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染細胞，該載體是已根據(jù)本發(fā)明的方法，尤其是在含有干細胞結(jié)合活性的功能材料存在下，將預(yù)定的基因插入其中的。這樣獲得的轉(zhuǎn)化細胞可以移植入受者中，比如，通過靜脈給藥的方法。優(yōu)選受者是自體供者，但也包括同種異體移植，后者尤其適合臍帶血用于移植的情況。
利用造血干細胞作為靶細胞的基因治療是為了彌補患者的缺陷或異?；?，其實例包括ADA缺陷和高歇病。另外，有時候進行耐藥基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)以緩解在癌癥、白血病等的治療中所用的化療而引起的造血干細胞失調(diào)。
已知造血干細胞表達VLA-4受體，因此利用本發(fā)明所公開的具有CS-1細胞粘附區(qū)的功能材料可以高效地進行基因轉(zhuǎn)移。再者，如上所述，在造血干細胞表面表達諸如CD34和C-kit這樣的分子，因而將抗這些分子的抗體或者為C-kit配體的干細胞因子與具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料組合起來應(yīng)用，可以提高基因轉(zhuǎn)移效率。
再者，作為癌癥的基因治療，對腫瘤疫苗療法已經(jīng)進了研究，在該治療中將細胞因子基因轉(zhuǎn)入癌細胞，使其喪失了生長力后，將細胞重輸入患者體內(nèi)以增加腫瘤免疫力(《人基因治療》(Human Gene Therapy)5卷153-164(1994))。采用本發(fā)明的方法利用對癌細胞有高親和力的功能材料，也可以高效地進行這些治療。
另外，已知嘗試了許多方法以達到基因治療AIDS的目的。在這種情況下，已有人提議將編碼抑制HIV增殖或基因表達的核酸分子(如反義核酸，核酶等)的基因轉(zhuǎn)入已感染了引起AIDS的HIV的T細胞(《病毒學雜志》(J.Virol.)69卷4045-4052頁(1995))。通過本發(fā)明中利用功能材料的方法可以完成T細胞的基因轉(zhuǎn)移，這些功能材料例如，能與T細胞表面存在的分子相結(jié)合的CD4抗體等。
這樣，作為基因治療的靶細胞，只要本發(fā)明中具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料能夠獲得或能進行制備，任何細胞都能使用。
再者，本發(fā)明的方法適合于臨床基因治療的方案，因為該方法不需要在逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細胞的存在下培養(yǎng)靶細胞并且在缺乏溴化己二甲胺(其應(yīng)用在臨床上不利于人體)的情況下也可以進行本發(fā)明的方法。
再進一步，本發(fā)明能應(yīng)用于基因治療之外的技術(shù)領(lǐng)域，例如，將胚胎形成的干細胞、原始胚細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵細胞、精母細胞、精子等用作靶細胞，可以簡單地制備脊椎動物的轉(zhuǎn)基因動物。
即，作為一方面，本發(fā)明提供了細胞移植的方法，該方法包括通過本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)化體細胞移植入脊椎動物細胞。轉(zhuǎn)化體細胞移植的脊椎動物的實例包括哺乳動物(如，小鼠、大鼠、兔、山羊、豬、馬、狗、猴、猩猩、人等)，鳥類(如，雞、火雞、鶉、鴨、野鴨等)，爬行動物(如，蛇、短吻鶚、龜?shù)?，兩棲動物(如，蛙、火龍、蠑螈等)，魚類(如，狗鯖、鯖魚、鱸魚、笛鯛、石斑魚、
鮪、鮭、鱒魚、鯉魚、香魚、鰻、鰈、鯊魚、虹、鱘魚等)。
這樣，根據(jù)本發(fā)明的這個方面，正如基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或它們的混合物，通過本發(fā)明中所應(yīng)用的功能材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)可以高效地進行使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移。因而，本發(fā)明能夠提供將遺傳材料轉(zhuǎn)入脊椎動物細胞的技術(shù)而沒有常規(guī)技術(shù)的任何限制。
在本發(fā)明進一步的方面中，使用有效量的如下材料作為功能材料，即在同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)并且其功能等價于基本純化的纖維結(jié)合素，基本純化的纖維結(jié)合素片段或其混合物的材料。
這樣的功能材料是這樣一種功能材料，能夠以與纖維結(jié)合素、纖維結(jié)合素片段或其混合物相同的效率進行基因轉(zhuǎn)移。典型情況是，這是一種在同一分子上同時具有本發(fā)明的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料。在應(yīng)用這些材料的情況下，考慮逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞至少與一種功能材料相結(jié)合。
在同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病結(jié)合區(qū)又有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料的實例包括序列表中SEQ.ID No.21和22所表示的多肽(此后分別稱為CHV-181和CHV-179)。
這些肽包括在H-271中所包含的III型相似序列(III-12，III-13和III-14)。在CHV-181中，將III-12和III-13序列，以及在HCV-179中，將III-13和III-14序列通過蛋氨酸添加到細胞粘附多肽(Pro1239-Ser1515)的C-末端。表達多肽CHV-181的質(zhì)粒可以通過，例如以下步驟進行構(gòu)建。
首先，從大腸桿菌HB101/pHD101(FERM BP-2264)中制備含有編碼纖維結(jié)合素的肝素結(jié)合多肽(H-271)的DNA片段的質(zhì)粒pHD101。通過定點突誘變在該質(zhì)粒編碼III-13序列C-末端的區(qū)域中引入Hind III位點，隨后用Nco I和Hind III酶切以獲得編碼III-12和III-13序列的DNA片段。另一方面，用Hind III和Sal I酶切質(zhì)粒載體pIN III-ompA1以獲得編碼脂蛋白末端終止子區(qū)的DNA片段。
接著，從大腸桿菌JM 109/pTF7021(FERM BP-1941)中制備含有編碼纖維結(jié)合素的細胞粘附多肽(C-279)的DNA片段的質(zhì)粒pTF7021，并且通過定點誘變在質(zhì)粒C-279的終止密碼子緊鄰的上游引入Nco I位點以獲得質(zhì)粒pTF 7520。該質(zhì)粒用Nco I和Sal I酶切，隨后與編碼III-12和III-13序列的DNA片段和編碼脂蛋白終止子區(qū)的DNA片段混合，將它們連接起來以獲得表達多肽CHV-181的質(zhì)粒pCHV181。在質(zhì)粒pCHV181中編碼多肽CHV-181的區(qū)域的核苷酸序列見于序列表中SEQ.ID No.27。
表達多肽CHV-179的質(zhì)粒，例如，可通過下述步驟進行構(gòu)建。
首先，通過定點誘變在質(zhì)粒pHD101上III-13序列N末端的編碼區(qū)中引入Nco I位點，隨后用Nco I和Hind III酶切以獲得編碼III-13和III-14序列的DNA片段。該片段與編碼上述脂蛋白終止子區(qū)的DNA片段和Nco I和Sal I酶切的質(zhì)粒pTF 7520混合以使其連接獲得表達多肽CHV-179的質(zhì)粒pCHV179。
培養(yǎng)分別用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，然后對所獲得的培養(yǎng)物進行純化，可以獲得CHV-181和CHV-179。
這些功能材料可以通過固化進行使用，例如固化在上述的珠子上，或者不進行固化而使用。
在另一方面中，本發(fā)明提供了用于逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的靶細胞的培養(yǎng)基，它包括(1)上述有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物或者(2)有效量的在同一分子上同時具有上述新型逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料。功能材料可以固化也可以不固化而使用。
本發(fā)明中培養(yǎng)基的其它成分就其用于培養(yǎng)靶細胞而言，它們不是特別限定的，并且也可以使用商業(yè)上可購買的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基也可含有血清，靶細胞的生長所必需的細胞生長因子，預(yù)防微生物感染的抗生素等。例如，在NIH3T3細胞的情況下，可以使用含有10％胎牛血清(Gibco)，50單位/ml的青霉素和50μg/ml鏈霉素(均來自Gibco)的Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM，JRH Bioscience)。
在進一步的方面中，本發(fā)明提供了逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，該方法包括孵育含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，該逆轉(zhuǎn)錄病毒與以下材料相接觸，(1)上述含有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的分子與含有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一分子的混合物，(2)上述在同一分子上具有本發(fā)明的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料，或者(3)上述具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。
如上所述，功能材料可以固化或者不固化而進行使用。根據(jù)常規(guī)方法，比如，于37℃ CO2濃度為5％以及濕度為99.5％的條件下，來進行孵育。這些條件可以根據(jù)所用的特定靶細胞加以適當調(diào)整，并且根據(jù)特定的細胞和目的也可以改變培養(yǎng)時間。
通過利用本發(fā)明的方法，病毒顆?？梢怨潭ㄔ诟鞣N構(gòu)建物上，這些構(gòu)建物將病毒傳遞給靶細胞。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)入靶細胞的試劑盒。該試劑盒包括(a)有效量的(1)具有上述逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的分子和具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一分子的混合物或者(2)在同一分子上具有本發(fā)明的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)和靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料；(b)用于孵育與靶細胞接觸的逆轉(zhuǎn)錄病毒的人造材料；和(c)預(yù)先刺激靶細胞的靶細胞生長因子。(a)的功能材料可進行固化或者不進行固化。該試劑盒進一步包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，必要的緩沖液等。
作為人造材料，可以使培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞，也可以使用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶等。這些培養(yǎng)器皿可由聚苯乙烯制成。
為了避免靶細胞是Go期細胞而不能進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，因此，優(yōu)選預(yù)先刺激細胞使細胞進入細胞周期。為了達到該目的，在用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染之前，靶細胞于適當細胞生長因子的存在下進行培養(yǎng)。例如，在基因轉(zhuǎn)入骨髓細胞和造血干細胞的情況下，可以使用白介素-6或者干細胞因子等靶細胞生長因子。
根據(jù)本來已知的方法，試劑盒的各個組成成份還可以制備成除水溶液之外的凍干制品、顆粒和片劑的形式。
通過應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒，例如，可以獲得已轉(zhuǎn)化的存活靶細胞培養(yǎng)物并且可易于進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明也包括利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法，其中功能材料選自基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段和它們的混合物，或者它們的聚合物，該功能材料固化在珠子上或不進行固化而使用。
本發(fā)明包括上述的CH2-826和其功能性等價物。另外，本發(fā)明提供了編碼CH2-826的基因。它的實例之一是序列表中SEQ.ID No.20所表示的基因。本發(fā)明也包括該基因的功能性等價物。
再者，本發(fā)明提供了上述的CHV-181并包括其功能性等價物。另外，本發(fā)明提供了編碼CHV-181的基因。該基因的實例之一是序列表中SEQ.ID No.27所表示的基因。本發(fā)明也包括該基因的功能性等價物。
本發(fā)明也提供了含有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的聚合物和/或靶細胞結(jié)合區(qū)的聚合物的聚合物。聚合物的特定實例是成纖維細胞生長因子的聚合物和含有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的多肽的聚合物。
正如此后所述，雖然本發(fā)明不受限于任何理論，但據(jù)信通過逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞分別結(jié)合到功能材料上可以促進逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入細胞，即轉(zhuǎn)化。
作為與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的在本發(fā)明中有效的這樣一種功能材料，有基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或它們的混合物。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中具有與基本純化的纖維結(jié)合素等基本上相同的功能的功能材料能夠提高基因轉(zhuǎn)移效率，即逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞轉(zhuǎn)化效率。
此處所述的纖維結(jié)合素片段可以是天然的也可以是合成的，并且可從天然存在的材料中制備基本上純化的該片段，例如按照如下所述的方法進行制備，Ruoslahti等(1981)《生物與化學雜志》(J.Biol.Chem.)2567277；Patel和Lodish(1986)《細胞生物學雜志》(J.Cell.Biol.)102449；和Bernardi等(1987)《細胞生物學雜志》(J.Cell.Biol.)105489。在這一方面，此處提及基本純化的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段意思是指這些材料基本上不含有與纖維結(jié)合素天然共存的其它蛋白質(zhì)。
通過遺傳工程技術(shù)，例如，按照美國專利號5,198,423中所概括描述的方法，也可以制備此處所述的基本純化的纖維結(jié)合素或纖維結(jié)合素片段。尤其是，在下面的實例中鑒定為H-271、H-276、CH-271(SEQ.IDNo.23)和CH-96(SEQ.ID No.24)的重組片段，以及獲得這些片段的方法被詳細描述于該專利中。按照美國專利號5,102,988所述獲得在下面的實施例中所用的C-274片段。也如美國專利號5,198,423所述，這些片段或常規(guī)衍生的片段可通過培養(yǎng)大腸桿菌獲得，該大腸桿菌按照布達佩斯條約保藏于NIBH，1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki-ken，保藏號如下FERM P-10721(H-296)(原始保藏日1989.5.12)，F(xiàn)ERMBP-2799(通過蛋氨酸結(jié)合于H-271的C-277)(原始保藏日1989.5.12)；FERM BP-2800(通過蛋氨酸結(jié)合于H-296的C-277)(原始保藏日1989.5.12)和FERM BP-2264(H-271)(原始保藏日1989.1.30)。
另外，關(guān)于此處可用的纖維結(jié)合素片段或者關(guān)于這些片段起始材料的有用資料可見于Kimizuka等，《生物與化學雜志》(J.Biol.Chem.)110，284-291(1991)，它進一步報道了關(guān)于上述重組片段的內(nèi)容，見《EMBO雜志》(EMBO J.)4卷，1755-1759(1985)，它報道了人纖維結(jié)合素基因的結(jié)構(gòu)；以及見《生物化學》(Biochemistry)，25，4936-4941(1986)，它對人纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)進行了報道。在目前的工作中人們發(fā)現(xiàn)含有CS-1細胞粘附區(qū)和肝素-II結(jié)合區(qū)的纖維結(jié)合素片段能夠明顯增加造血細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
可以這樣理解，此處所述的纖維結(jié)合素有關(guān)的多肽將提供具有纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)中細胞結(jié)合活性的氨基酸序列以及與病毒結(jié)合的纖維結(jié)合素中肝素-II結(jié)合區(qū)的氨基酸序列。
在WO 95/26200中所公開的用來增加逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒結(jié)合多肽包括(i)與人纖維結(jié)合素中肝素-II結(jié)合區(qū)的Ala1690-Thr1960相對應(yīng)的第一段氨基酸序列，由通用序列表示(SEQ.ID No.1)Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr ProThr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu ThrGly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro MetLys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val SerGly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala LeuLys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr ThrLeu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp AlaThr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu ThrIle Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln ThrPro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr IleThr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr ThrLeu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala SerThr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr ThrPro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg IleThr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro Pro ArgGlu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr IleThr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile AlaLeu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys LysThr；或者與其足夠相似、表現(xiàn)出與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合能力的氨基酸序列；以及(ii)與人纖維結(jié)合素中III CS結(jié)合區(qū)的一部分相對應(yīng)的第二段氨基酸序列(CS-1)；由通用序列表示(SEQ.ID No.2)Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu HisGly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr；或者表現(xiàn)出與諸如原始祖細胞和/或長期種群恢復(fù)(干)細胞等造血細胞有結(jié)合能力的與其足夠相似的氨基酸序列。
上述SEQ.ID No.1(H-271)所表示的多肽的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性表現(xiàn)出濃度依賴，并且如在下面的實施例8中所表明的，在高濃度它表現(xiàn)出與CH-271基本相同的活性。這就是說，在高濃度的H-271存在下，逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞第一次至少結(jié)合1分子的H-271。
病毒與本發(fā)明中功能材料的病毒結(jié)合區(qū)牢固結(jié)合可用于構(gòu)建針對各種細胞類型的適合病毒介導(dǎo)的基因治療的運載系統(tǒng)。為達到此目的，含有本發(fā)明中功能材料的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的多肽可以偶聯(lián)于含有細胞結(jié)合區(qū)的使構(gòu)建系統(tǒng)對靶細胞有特異性的任何一種材料，或者也可以與含有細胞結(jié)合區(qū)的材料共同定位。這就是說，結(jié)合病毒的多肽可以共價偶聯(lián)于結(jié)合細胞的材料或者兩者可為不同的分子。
該方法將避開以前為每一種靶細胞構(gòu)建特異的逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞系的必要性，并且有利于根據(jù)特定種類的靶細胞選擇具有最適靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料。因此，利用本發(fā)明的功能材料，可易于進行靶細胞特異的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且尤其是，本發(fā)明的方法，應(yīng)用具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料的混合物，對特定靶細胞的所需基因的轉(zhuǎn)移是特別有效的。另外，對于提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法和相關(guān)技術(shù)的方法而言，本發(fā)明提供的新型功能材料是特別有效的。
下面的實施例進一步詳細說明本發(fā)明，并不是限定本發(fā)明的范圍。
實施例1(1)制備病毒上清含有具有新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒PM5neo的GP+E-86生產(chǎn)細胞(ATCC CRL-9642)(《實驗血液病學》(Exp.Hemtol.)23，630-638(1995))培養(yǎng)于含有10％胎牛血清(FCS，Gibco)和50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素(均購自Gibco)的Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，JRH Bioscience)中。此后所用的所有DMEM均含50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素。將4ml含10％FCS的DMEM加到半?yún)R合的培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)后，收集含PM5 neo病毒的培養(yǎng)上清。回收的培養(yǎng)基用0.45微米的濾膜(Millipore)過濾以獲得病毒上清，將其保藏在-80℃直至應(yīng)用它。
另外，關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒TKNEO載體(《血液》(Blood)，78，310-317(1991))，根據(jù)上述相同的步驟用GP+envAm-12細胞制備TKNeo病毒上清。
(2)測定上清的病毒滴度按照標準方法(《病毒學雜志》(J.Virol)62，1120-1124(1988))用NIT/3T3細胞測定上清的病毒滴度。即，將DMEM和每孔2000個NIT/3T3細胞加入到6孔的組織培養(yǎng)板中。過夜培養(yǎng)后，將系列稀釋的病毒上清加入到每孔中，同時加入終濃度為7.5μg/ml的溴化己二甲胺(由Aldrich制造的聚凝胺)。將其于37℃孵育24小時，然后用含終濃度為0.75mg/ml的G418(Gibco)的培養(yǎng)基替換原來的培養(yǎng)基。培養(yǎng)板進一步孵育。10-12天后長出的G418抗性(G418r)集落用結(jié)晶紫染色以記錄細胞數(shù)。每孔的集落數(shù)乘上稀釋倍數(shù)計算出每1ml的上清中所含的感染性顆粒數(shù)(cfu/ml)，將其作為上清滴度以確定在隨后的實驗中所加的病毒上清量。
實施例2(1)制備來源于纖維結(jié)合素的多肽根據(jù)美國專利號5,198,423中所公開的方法，來源于人纖維結(jié)合素的多肽，H-271(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.1)制備于含有編碼多肽的DNA的重組質(zhì)粒pHD101所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌HB101/pHD101(FERM BP-2264)。
多肽，CH-271(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.23)制備如下。即，根據(jù)上述專利中所描述的方法培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCH101(FERMBP-2799)，并從培養(yǎng)菌中獲得CH-271。
多肽，CH-296(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.24)制備如下。即，根據(jù)上述專利所描述的方法培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCH102(FERMBP-2800)，并從培養(yǎng)菌中獲得CH-296。
多肽，C-274(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.25)制備如下。即，根據(jù)美國專利號5,102,988中所描述的方法培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)，并從培養(yǎng)菌中獲得C-274。
再者，多肽，C277-CS1(氨基酸序列見序列表中SEQ.ID No.29)制備如下。即，根據(jù)上述專利中所述的方法培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCS25，并從培養(yǎng)菌中獲得C277-CS1，該大腸桿菌在JP-A 3-284700中公開為FERM P-11339，并且按照布達佩斯條約保藏于上述1-1-3，Higashi，Tsukubashi，Ibaraki-Ken的NIBH(原始保藏日1990，3，5)。
(2)制備C-FGF·A多肽，C-FGF·A(氨基酸序列示于序列表中的SEQ.ID No.4)制備如下。即，含有編碼上述多肽的DNA的重組質(zhì)粒pYMH-CF·A所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，即大腸桿菌JM109/pYMH-CF·A(FERM BP-5278)于37℃在含有100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時。該預(yù)培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)基接種入500ml含有100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的LB肉湯培養(yǎng)基中并于37℃過夜培養(yǎng)。回收培養(yǎng)菌，懸浮于10ml含有1mM PMSF(苯基甲基氟硫鎓)和0.05％的Nonidet P-40的PBS中(磷酸緩沖鹽溶液)，并超聲破碎細菌細胞。離心該混合物以獲得上清。加入1ml 5％的聚乙烯亞胺使上清在260nm的吸收值為4,000，然后離心混合物以獲得上清。將上清上樣至PBS平衡的HiTrap-肝素柱(Pharmacia)。用PBS沖洗掉非吸附的部分后，用含有0.5M-2M NaCl梯度的PBS洗脫柱中吸附的部分。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫液。表明存在兩部分含有47kd的多肽。其中在較高NaCl濃度下洗脫的部分收集起來并上樣至用含1.5M NaCl的PBS平衡的Superose 6柱(Pharmacia)。通過SDS-PAGE分析洗脫液并且回收含大約47kd多肽的部分以獲得用于以下步驟的純化C-FGF·A。
(3)制備C-FGF-CS1首先，在作為宿主的大腸桿菌中構(gòu)建表達多肽，C-FCF-CS1(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.5)的質(zhì)粒。
培養(yǎng)大腸桿菌HB 101/pCH102(FERM BP-2800)并通過堿-SDS法從所獲得的培養(yǎng)菌中制備質(zhì)粒pCH102。用該質(zhì)粒作為模板以及引物M4(Takara Shuzo Co.，Ltd)和引物CS1-S來進行PCR，引物核苷酸序列示于序列表中的SEQ.ID No.9，然后用乙醇沉淀回收反應(yīng)液中擴增的DNA片段。所獲得的DNA片段用Nhe I和Sal I(均購自Takara shuzo Co.，Ltd)酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠回收大約970bp的DNA片段。
然后培養(yǎng)大腸桿菌JM 109/pYMH-CF·A(FERM BP-5278)并通過堿-SDS法從所獲得的培養(yǎng)菌中制備質(zhì)粒pYMH-CF·A。用該質(zhì)粒作為模板以及引物CF(其核苷酸序列示于SEQ.ID No.10)和引物FNR(其核苷酸序列示于序列表中SEQ.ID No.11)來進行PCR，然后用乙醇沉淀從反應(yīng)液中回收擴增的DNA片段。所獲得的DNA片段用Eco 52I(Takara Shuzo Co.，Ltd)和Nhe I酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收大約320bp的DNA片段。
用Eco 52I和Sal I酶切質(zhì)粒pYMH-CF·A并進行瓊脂糖凝膠電泳所分離的大約4.1kb的DNA片段與上述970bp的DNA片段和大約320bp的DNA片段混合，將它們連接起來以獲得插入到大腸桿菌JM109中的重組質(zhì)粒。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒并篩選出含有1分子上述三段DNA片段的質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pCFS100。用質(zhì)粒pCFS100轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109稱為大腸桿菌JM109/pCRS100。質(zhì)粒pCFS100具有位于C-FGF·AC末端的來源于纖維結(jié)合素的CS-1細胞粘附區(qū)，并編碼多肽，C-FGF-CS1，其中FGF C末端的第二個賴氨酸替換為丙氨酸。
多肽，C-FGF-CS1制備如下。即，上述大腸桿菌JM109/pCFS100在5ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)8小時。該預(yù)培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)基接種至500ml含100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的LB肉湯培養(yǎng)基中并于37℃過夜培養(yǎng)直至收集培養(yǎng)菌。所獲得的培養(yǎng)菌懸浮于10ml含0.5M NaCl、1mM PMSF和0.05％ Nonidet P-40的PBS中，然后超聲破碎細菌并離心以獲得上清。該上清上樣至用含有0.5M NaCl的PBS預(yù)先平衡的HiTrap-肝素柱中，用含0.5mM NaCl的PBS沖洗掉非吸附的部分，用含有0.5M-2M濃度梯度NaCl的PBS洗脫吸附的部分。洗脫液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并回收含有大約50kd多肽的部分以獲得用于隨后步驟的純化C-FGF-CS1。
研究純化的C-FGF-CS1從N-末端到第五個氨基酸的氨基酸序列并發(fā)現(xiàn)與序列表中SEQ.ID No.5所示的序列相一致。另外，通過質(zhì)譜測定的純化C-FGF-CS1的分子量與從上述氨基酸序列中所預(yù)期的分子量一致。
(4)制備C 277-ColV多肽，C277-ColV(氨基酸序列示于序列表中SEQ.ID No.6)按如下方法純化。即，含有編碼上述多肽的DNA的重組質(zhì)粒pTF 7520 ColV所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109/pTF 7520 ColV(FERM-5277)在5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)6.5小時。預(yù)培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)基接種入500ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中并于37℃培養(yǎng)。當在660nm的吸收值達到0.6時，IPTG加入到肉湯培養(yǎng)基中至終濃度1mM，然后培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)直至收集細菌。所獲得的培養(yǎng)菌懸浮于10ml含1mM EDTA，0.05％ Nonidet P-40和2mM PMSF的PBS中，超聲破碎細菌10分鐘。離心細胞破碎液并將所獲得的上清上樣至ResourceQ柱(Pharmacia)以獲得含有所需多肽的非吸附部分。該部分上樣至PBS平衡的HiTrap-肝素柱。用PBS沖洗掉非吸附部分后，用含0.1M-0.5M梯度NaCl的PBS洗脫吸附部分。洗脫液用SDS-PAGE分析并回收含48kd多肽的部分以獲得用于隨后步驟中的純化C277-ColV。
(5)制備ColV首先在作為宿主的大腸桿菌中構(gòu)建用于表達多肽，ColV(氨基酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.6)的質(zhì)粒。
培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pTF 7520 ColV(FERM BP-5277)并且用堿-SDS法從所獲得的細菌細胞中制備質(zhì)粒pTF 7520 ColV。該質(zhì)粒用NcoI和BamHl(均購自Takara Shuzo有限公司)進行酶切，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳從凝膠中回收大約0.58kb的DNA片段。該片段與已經(jīng)用NcoI和BamHI預(yù)切的質(zhì)粒載體pET8C(Novagen)混合，以將它們連接起來。所獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21以獲得轉(zhuǎn)化體，從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，并篩選出僅含一分子上述大約0.58kb的DNA片段的質(zhì)粒，命名為pET ColV。
用上述質(zhì)粒pETColV轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21，即，大腸桿菌BL21/pETColV于37℃在10ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。該預(yù)培養(yǎng)液0.2ml接種到100ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中，隨后于37℃培養(yǎng)。當在600nm的吸收達到0.4時，加入IPTG至終濃度1mM，然后過夜培養(yǎng)以收集細菌細胞。所得的細菌細胞懸浮于5ml含1mM EDTA，0.05％ Nonidet P-40，10μg/ml抑酶肽，10μg/ml亮抑酶肽，和2mM PMSF的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中，超聲破碎細菌，隨后離心收集上清。該上清加樣于PBS平衡的HiTrap肝素柱，用PBS沖洗掉柱中非吸附的部分，用含0.5MNaCl的PBS洗脫柱中吸附的部分。洗脫液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并證實為幾乎均一的大約18kb的多肽。這樣獲得的純化ColV用于下列步驟中。
(6)制備H2-547用于表達多肽H2-547(氨基酸序列見于序列表中的SEQ.IDNo.13)的質(zhì)粒構(gòu)建如下。培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCH101(FERM BP-2800)并且用堿-SDS法從所獲得的細胞中制備質(zhì)粒pCH102。用該質(zhì)粒作為模板以及用引物12S(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.IDNo.15)和引物14A(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.16)來進行PCR，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳從凝膠中回收編碼纖維結(jié)合素肝素結(jié)合區(qū)多肽的大約0.8kb的DNA片段，所獲得的DNA片段用NcoI和BamHI(均購自Takara Shuzo有限公司)進行酶切，并與NcoI-BamHI酶切的pTV118N(Takara Shuzo CO.，Ltd.)混合，將它們連接起來并導(dǎo)入大腸桿菌JM109中。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒并篩選出含有上述DNA片段的質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pRH1。
質(zhì)粒載體，pINIII-ompA1(《EMBO雜志》(EMBO Journal)，3，3437-2442(1984))用BmHI和HincII(Takara Shuzo有限公司)酶切以回收含有脂蛋白終止子區(qū)的大約0.9kb的DNA片段，它與BamHI-HincII酶切的質(zhì)粒pRH1混合，將它們連接起來，以獲得按順序含有乳糖啟動子、編碼肝素結(jié)合區(qū)多肽的DNA片段和脂蛋白終止子的質(zhì)粒pRH1-T。
分別制備通過NheI和ScaI(均購自Takara Shuzo有限公司)酶切質(zhì)粒pRH1-T所獲得的大約3.1kb的DNA片段以及通過SpeI(TakaraShuzo有限公司)和ScaI酶切質(zhì)粒pRH1-T所獲得的大約2.5kb的DNA片段，將這兩個片段連接起來以獲得按順序含有乳糖啟動子、編碼含有兩個肝素結(jié)合多肽首尾連接的多肽的開放閱讀框架和脂蛋白終止子的質(zhì)粒pRH2-T。上述開放閱讀框架的核苷酸序列見于序列表中的SEQ.IDNo.17。
多肽，H2-547制備如下。準備四個500ml有蓋的錐形燒瓶，加入120ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基，孵育用上述質(zhì)粒pRH2-T轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HB101，這就是說，在37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pRH2-T。從培養(yǎng)物中離心收集細菌細胞，懸浮于40ml裂解液中(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，150ml NaCl 1mM DTT，1mM PMSF，pH7.5)并且超聲破碎細菌。離心獲得的上清加樣于已用純化緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡的高捕獲(High trap)肝素柱(Pharmacia)。用同樣的緩沖液沖洗掉柱中非吸附的部分，隨后用含有0-1M濃度梯度NaCl的純化緩沖液洗脫。洗脫液用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并收集含有分子量大約60,000的多肽的樣品部分以獲得純化的H2-547制品。用牛血清白蛋白作為標準，利用BCA蛋白試驗試劑(Pierce)分析所得制品中所含的蛋白含量，結(jié)果表明獲得了10mgH2-547。
研究這樣獲得的純化H2-547的從N-末端到第五殘基的氨基酸序列，并發(fā)現(xiàn)其與序列表中SEQ.ID No.17所示的核苷酸序列預(yù)期的N-末端減去蛋氨酸的H2-547的氨基酸序列一致(序列見于序列表中SEQ.ID No.13)。通過質(zhì)譜測定的純化H2-547的分子量與序列表中SEQ.ID No.13所示的氨基酸序列預(yù)期的分子量一致。
(7)制備CH2-286用于表達多肽，CH2-826(氨基酸序列見于序列表中的SEQ.IDNo.14)的質(zhì)粒構(gòu)建如下。用上述質(zhì)粒pCH102作為模板以及用引物CLS(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.18)和引物CLA(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.19)來進行PCR，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳中回收編碼纖維結(jié)合素細胞粘附多肽的大約0.8kb的DNA片段。所獲得的DNA片段用NcoI和BglII(均購自Takara Shuzo有限公司)進行酶切，并與NcoI-BamHI酶切的pTV118N混合，將它們連接起來并引入大腸桿菌JM109。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒并篩選出含有上述DNA片段的質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pRC1。通過SpeI和ScaI酶切質(zhì)粒pRC1所獲得的大約2.5kb的DNA片段與通過NheI和ScaI酶切上述質(zhì)粒pRH2-T所獲得的大約3.9kb的DNA片段混合，將它們連接起來以獲得編碼含有兩個肝素結(jié)合多肽首尾連接到細胞粘附多肽C-末端的多肽的質(zhì)粒pRCH2-T。編碼這個多肽的質(zhì)粒pRCH2-T的開放閱讀框架見于序列表中的SEQ.ID No.20。
根據(jù)實施例2(6)中所述的用于多肽H2-547的相同方法制備多肽CH2-826。從高捕獲肝素柱的洗脫液中收集含有分子量大約90,000的多肽的樣品部分以得到純化的CH2-826。
(8)制備H2S-537用于表達多肽，H2S-537(氨基酸序列見于序列表中的SEQ.IDNo.30)的質(zhì)粒構(gòu)建如下。用上述質(zhì)粒pCH102作為模板以及用引物CS1S(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.31)和引物CS1A(其核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.32)來進行PCR，隨后通過瓊脂糖凝膠電泳中回收編碼纖維結(jié)合素細胞粘附多肽的大約0.1kb的DNA片段。所獲得的DNA片段用NcoI和BamHI(均購自Takara Shuzo有限公司)進行酶切，并與NcoI-BamHI酶切的pTV118N混合，將它們連接起來并引入大腸桿菌JM109。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒并篩選出含有上述DNA片段的質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒pRS1。
質(zhì)粒載體，pINIII-ompA1用BamHI和HincII酶切以回收含有脂蛋白終止子區(qū)的大約0.9kb的片段。它與BamHI-HincII酶切的質(zhì)粒pRS1混合，將它們連接起來，以獲得按順序含有乳糖啟動子、編碼CS-1區(qū)多肽的DNA片段和脂蛋白終止子的質(zhì)粒pRS1-T。
制備用NheI和ScaI酶切質(zhì)粒pRS1-T所獲得的大約2.4kb的DNA片段與用SpeI、ScaI和PstI(Takara Shuzo有限公司)酶切上述質(zhì)粒pRH2-T所獲得的大約3.3kb的DNA片段。將它們連接起來以獲得質(zhì)粒pRH2S-T，其按順序含有乳糖啟動子、編碼具有兩個肝素結(jié)合多肽首尾連接以及CS-1區(qū)進一步連接到其C-末端這樣結(jié)構(gòu)的多肽的開放閱讀框架和脂蛋白終止子。上述開放閱讀框架的核苷酸序列見于序列表中的SEQ.ID No.32。
根據(jù)實施例2(6)中所述的用于多肽H2-547的相同方法制備多肽H2S-573。從高捕獲肝素柱的洗脫液中收集含有分子量大約60,000的多肽樣品部分以得到純化的H2S-573。
(9)功能材料固化至培養(yǎng)板中為了在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的實驗中使用功能材料固化于其上的培養(yǎng)板(6孔組織培養(yǎng)板，F(xiàn)alcon)，根據(jù)以下步驟進行固化。即，上述實施例中所述的每一種功能材料以合適的濃度溶于PBS的溶液按每孔2ml的量加入到培養(yǎng)板中(底面積9.6cm2)，室溫下無蓋培養(yǎng)板在紫外光下照射1小時，然后加蓋再照射1小時。隨后多肽液改成2ml含2％牛血清白蛋白(BSA，Boehringer Mannheim)的PBS并室溫下孵育30分鐘。培養(yǎng)板用含25mM HEPES的PBS沖洗。除了不進行與多肽的孵育之外，根據(jù)與上述相同的方法制備BSA固化于其上的對照包被的培養(yǎng)板。
在下列實施例中的基因轉(zhuǎn)移(病毒感染)實驗中，如果沒有指明，均使用上述6孔組織培養(yǎng)板。當指明在培養(yǎng)板用于固化的功能材料的濃度時，培養(yǎng)孔每單位底面積的多肽量描述為用作單位的pmol/cm2(和μg/cm2)。例如，當用2ml的48μg/ml的H-271溶液在上述培養(yǎng)板(底面積9.6cm2)上進行固化時，該描述為“用H-271 333pmol/cm2(10μg/cm2)進行固化”。再者，轉(zhuǎn)導(dǎo)后用于培養(yǎng)非粘附細胞(TF-1，HL-60)的CH-296固化培養(yǎng)板是根據(jù)上述步驟通過48pmol/cm2(3μg/cm2)的CH-296溶液進行固化所制備的培養(yǎng)板。在下述的實施例中，靶細胞的病毒感染總是在沒有聚凝胺的培養(yǎng)基中進行。當指明病毒，細胞和培養(yǎng)基等的量時，如果沒有另外指出，是指每孔的量。
實施例3(1)用功能材料的混合物進行的基因轉(zhuǎn)移在結(jié)合細胞的材料和結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的材料混合物被固化于培養(yǎng)板上時，進行下列實驗來研究對基因轉(zhuǎn)移的效果。根據(jù)與實施例2(9)中所述的相同方法，用32pmol/cm2(1.5μg/cm2)C-FGF·A，32pmol/cm2(1μg/cm2)C-274和32pmol/cm2(0.5μg/cm2)FGF的混合物或32pmol/cm2(0.5μg/cm2)FGF(Becton Dickinson)將每一種多肽固化到培養(yǎng)板上。分別在培養(yǎng)板和BSA包被的對照培養(yǎng)板中于37℃預(yù)先孵育2ml含1,000cfu PM5neo病毒的病毒上清之后，用PBS徹底沖洗培養(yǎng)板。于每個培養(yǎng)板中加入2ml含2,000NIH/3T3細胞的DMEM培養(yǎng)基并于37℃在無聚凝胺的情況下孵育2小時。通過傾析收集非粘附細胞，粘附到培養(yǎng)板上的細胞通過胰蛋白酶處理使之與培養(yǎng)板分離來收集。將這些細胞混合。所獲得的細胞懸液分成兩半。一半培養(yǎng)于DMEM中，另一半培養(yǎng)于含有終濃度為0.75mg/ml的G418的DMEM中。兩部分均在37℃孵育10天并對出現(xiàn)的集落進行計數(shù)。將G418抗性(G418r)集落數(shù)與不含G418的培養(yǎng)基中所獲得的集落數(shù)的比例看作基因轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果見

圖1。在圖1中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖1所示，在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染2小時的情況下，盡管FGF單獨使用時的基因轉(zhuǎn)移效率比C-FGF·A的轉(zhuǎn)移效率低，但當使用C-274和FGF的混合物時，幾乎以與C-FGF·A相同的基因轉(zhuǎn)移效率獲得G418r集落。
為了詳細研究，將C-274和FGF單獨固化的效果與它們的混合物進行固化的效果相比較。即，分別用32pmol/cm2(1μg/cm2)C-274，32pmol/cm2(0.5μg/cm2)FGF和32pmol/cm2C-274與32pmol/cm2FGF的混合物制備培養(yǎng)板，根據(jù)實施例2(9)所述的相同方法對各培養(yǎng)板進行評估。結(jié)果示于圖2。在圖2中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖2所示，當使用C-274和FGF的混合物進行固化的培養(yǎng)板時，其基因轉(zhuǎn)移效率高于使用只有FGF固化的培養(yǎng)板時的轉(zhuǎn)移效率。再者，在沒有任何逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的C-274所固化的培養(yǎng)板上沒有G418r集落出現(xiàn)。這表明，組合使用具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的FGF和具有細胞結(jié)合區(qū)的C-274，與單獨使用FGF時相比較可以獲得更高的基因轉(zhuǎn)移效率，并且不需要精心創(chuàng)造出這種多肽組合效果的多肽的共價偶聯(lián)。
(2)使用功能材料的混合物進行基因轉(zhuǎn)移除了用ColV替換具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的多肽外，根據(jù)實施例3(1)所述的相同方法進行評估。在該實驗中，通過以各種不同摩爾比例混合C-274和ColV來研究基因轉(zhuǎn)移效果。即，根據(jù)實施例2(9)所述的相同方法，分別用以下材料固化培養(yǎng)板330pmol/cm2(6μg/cm2)ColV、330pmol/cm2(10μg/cm2)C-274與330pmol/cm2ColV的混合物(C-274∶ColV的摩爾比＝10∶10)、100pmol/cm2(3μg/cm2)C-274和330pmol/cm2ColV的混合物(3∶10)、33pmol/cm2(1μg/cm2)C-274與330pmol/cm2ColV的混合物(1∶10)、330pmol/cm2(16μg/cm2)C277-ColV與330pmol/cm2(10μg/cm2)C-274。使用這樣制備的培養(yǎng)板，根據(jù)上述相同的方法研究逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效果。結(jié)果見圖3。在圖3中橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖3所示，在感染2小時的情況下，盡管ColV和其1/10量(指分子數(shù))C274的混合物所進行固化的培養(yǎng)板的感染效率與C277-ColV固化培養(yǎng)板的效率相同，但是ColV固化培養(yǎng)板的感染效率不到C277-ColV固化培養(yǎng)板感染效率的1/2。這樣，如同在FGF的情況下所觀察到的，C-274增強逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的活性是確定的。在C-274分子的量相對于ColV分子的量增加時，該效率有相當程度的下降。當含有相同量的ColV和C-274的混合物被包被時，在混合物和單獨使用Colv之間沒有明顯的差異。
(3)用功能材料的混合物進行基因轉(zhuǎn)移進行以下實驗以研究含有細胞結(jié)合區(qū)的材料與含有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的材料的混合物進行固化時對基因轉(zhuǎn)移效率的影響。首先，根據(jù)實施例2(9)所述的相同方法，分別用以下材料固化培養(yǎng)板32pmol/cm2(1μg/cm2)C-274，333pmol/cm2(10μg/cm2)H-271以及32pmol/cm2(1μg/cm2)C-274和333pmol/cm2(10μg/cm2)H-271的混合物。當在分別的培養(yǎng)板中預(yù)孵育2ml含1,000cfu PM5neo病毒的病毒上清30分鐘后，用PBS徹底沖洗培養(yǎng)板。每塊培養(yǎng)板中加入2ml含2,000 NIH/3T3細胞的DMEM培養(yǎng)基并于37℃孵育2小時。傾析收集非粘附細胞。胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離，然后收集。將細胞混合。所得的細胞懸液分成兩半。一半在DMEM中培養(yǎng)，另一半在含終濃度為0.75mg/ml G418的DMEM中培養(yǎng)。兩部分均在37℃孵育10天并計數(shù)出現(xiàn)的集落。將G418r集落數(shù)與沒有G418的培養(yǎng)基中所獲得的集落數(shù)的比值看作基因轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果示于圖4。在圖4中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖4所示。當使用C-274和H-271(摩爾比＝1∶10)的混合物所固化的培養(yǎng)板時，感染效率明顯增加。在C-274固化的培養(yǎng)板中未觀察到基因轉(zhuǎn)移。
(4)用C 277-CS1進行基因轉(zhuǎn)移進行以下實驗以研究使用C277-CS1作為具有細胞結(jié)合區(qū)的材料并且它與具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的材料的混合物進行固化時對感染效率的影響。使用聚賴氨酸[(Lys)n，聚-L-賴氨酸氫溴化物，分子量50,000-100,000，Wako Pure Chemical Co.，Ltd]和H-271作為與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的材料。使用非粘附細胞，TF-1細胞(ATCC CRL-2003)作為細胞。首先，根據(jù)實施例2(9)中所述的相同方法，分別用以下溶液對培養(yǎng)板進行固化C-277-CS1(33pmol/cm2，1.1μg/cm2)，聚賴氨酸(133pmol/cm2，10μg/cm2)，C-277-CS1(33pmol/cm2)和聚賴氨酸(133pmol/cm2)的混合物，H-271(333pmol/cm2，10μg/cm2)和C-277-CS1(33pmol/cm2)與H-271(333pmol/cm2)的混合物以及CH-296(33pmol/cm2，2.1μg/cm2)每塊培養(yǎng)板中加入含1×104cfu TKNEO病毒、1×104TF-1細胞的RPMI 1640培養(yǎng)基[含5ng/ml GM-CSF(PetroTech)，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素]，并且于37℃孵育24小時。孵育后，傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離，然后進行收集。將這些細胞混合。所獲得細胞懸液的五分之一分別轉(zhuǎn)化兩個用CH-296包被的培養(yǎng)板并孵育24小時。然后一塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)基更換成上述培養(yǎng)基，另一塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)基更換成含終濃度為0.75mg/ml G418的上述培養(yǎng)基。兩塊板均于37℃孵育8天并計數(shù)出現(xiàn)的集落，根據(jù)有和無G418的情況下所出現(xiàn)的集落數(shù)計算出G418r集落的發(fā)生率(基因轉(zhuǎn)移效率)。
結(jié)果見圖5。在圖5中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。在圖5中(a)表示用聚賴氨酸作為逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合材料以及(b)表示使用H-271。與只有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合材料所固化的培養(yǎng)板相比，使用聚賴氨酸或同時使用H-271和具有細胞結(jié)合區(qū)的C277-CS1可以顯著增加基因轉(zhuǎn)移效率。
(5)制備來源于紅細胞生成素的多肽為了用于具有紅細胞生成素受體的細胞的基因轉(zhuǎn)移，制備了紅細胞生成素與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合(GST-Epo)的多肽衍生物。氨基酸序列見序列表中SEQ.ID No.34。在該序列中，從233個氨基酸到第398個氨基酸之間的氨基酸序列與紅細胞生成素相對應(yīng)。
首先，按以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒來表達GSF-Epo。用來自人胎兒肝的cDNA文庫(Clonetech)作為模板以及引物EPF1和EPR1(引物EPF1和EPR1的核苷酸序列見于序列表中SEQ.ID No.35和36)來進行PCR。取出一部分反應(yīng)混合物，用它作為模板以及引物EPF2和EPR2(引物EPF2和EPR2的核苷酸序列見序列表中SEQ.ID No.37和38)來進行另外的PCR。從反應(yīng)混合物中回收擴增的DNA片段，用EcoRI和Bam HI(均購自Takara Shuzo Co.，Ltd)酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳以回收含有紅細胞生成素編碼區(qū)的大約520bp的DNA片段。所獲得的片段與已用EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd)和BamHI酶切過的質(zhì)粒載體pTV118N(Takara Shuzo Co.，Ltd)混合，將其連接到質(zhì)粒上。然后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中篩選出含有上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體以制備該質(zhì)粒并稱為質(zhì)粒pEPO。隨后，這樣獲得的質(zhì)粒pEPO用EcoRI和SalI(Takara Shuzo Co.，Ltd)酶切并進行瓊脂糖凝膠電泳以回收大約0.5kb的DNA片段。該片段與已用EcoRI和Sal I酶切過的質(zhì)粒載體pGEX5X-3(Pharmacia)混合以將它們連接起來。用所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從所獲得的轉(zhuǎn)化體中篩選出含有上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體以制備該質(zhì)粒并稱之為pGSTEPO。該質(zhì)粒編碼GST-EPO，其中紅細胞生成素的氨基酸序列連接到來自載體的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的C末端。在質(zhì)粒pGSTEPO中編碼GST-EPO的核苷酸序列見序列表中的SEQ.ID No.39。
按如下步驟制備多肽GST-Epo。提供7個培養(yǎng)管，每個加入5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基，用上述質(zhì)粒pGSTEPO轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，大腸桿菌JM109/pGSTEPO，接種至每個培養(yǎng)管中，隨后37℃過夜培養(yǎng)。接著，提供7個2升的錐形燒瓶，每個含有500ml相同的肉湯培養(yǎng)基，將上述5ml培養(yǎng)菌接種至燒瓶中，隨后37℃培養(yǎng)。開始培養(yǎng)后3.5小時，加入IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)另外的3.5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，從培養(yǎng)基中離心收集培養(yǎng)菌，懸浮于含1mMPMSF和1mM EDTA的100ml PBS中，超聲破碎。破碎液中加入100ml含1mM PMSF、1mM EDTA和2％ Triton X-100的PBS中。將該混合物冰浴30分鐘，然后離心收集上清。所獲得的上清用0.45μm的濾膜(Millipore)過濾，然后上樣至用PBS平衡的谷胱甘肽-Sephallose 4B柱(Pharmacia，3ml)。用PBS沖洗柱子后，用50mM含10mM谷胱甘肽的Tris-HCl(pH8.0)洗脫柱子。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析洗脫液并收集含有分子量大約44,000的多肽的樣品部分。該樣品用PBS透析。將透析樣品上樣至PBS平衡的Resource Q柱(Pharmacia)。用PBS沖洗該柱后，用含有0M-0.6M梯度NaCl的PBS洗脫該柱。按照上述的相同方法，用50mM含有谷胱甘肽的Tris-HCl(pH8.0)洗脫該柱以收集含有分子量大約44,000的多肽的部分。將其用Centricon 10(Amicon)超濾，使其濃縮至大約50μl。進一步，它用UltrafreeC3GVSTRL(Millipore)過濾并將濾液用Superdex 200柱(Pharmacia，PBS平衡的)進行凝膠過濾層析。收集含有分子量大約44,000的多肽的洗脫樣品并將其用作隨后實驗中的GST-Epo多肽溶液。在該GST-EPO溶液中，大約50％的總蛋白質(zhì)為GST-Epo。
(6)基因轉(zhuǎn)移進表達紅細胞生成素受體的細胞采用兩類細胞，表達紅細胞生成素受體的TF-1和不表達紅細胞生成素受體的HL-60(ATCC-CCL-240)來研究用紅細胞生成素作為具有細胞結(jié)合活性的材料時對基因轉(zhuǎn)移的影響。在該研究中，上述紅細胞生成素的多肽衍生物(GST-Epo)被用作紅細胞生成素，并且聚賴氨酸被用作結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的材料。首先，根據(jù)實施2(9)中所述的相同方法，分別用34pmol/cm2(1.5μg/cm2)的GST-Epo，聚賴氨酸(133pmol/cm2，10μg/cm2)，GST-Epo(34pmol/cm2)與聚賴氨酸(133pmol/cm2)的混合物對培養(yǎng)板進行固化。每塊培養(yǎng)板中加入含1×104cfu TKNEO病毒和1×104個細胞的培養(yǎng)基，然后于37℃孵育24小時。RPMI 1640培養(yǎng)基(含5ng/ml GM-CFS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)被用作TF-1的培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基(Nissui，含10％ FCS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素)被用作HL-60的培養(yǎng)基。孵育后，傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離，然后收集。將細胞混合。所獲得細胞懸液的五分之一分別轉(zhuǎn)入兩個CH-296固化的培養(yǎng)板中并孵育24小時。接著一個培養(yǎng)板的培養(yǎng)基替換成上述培養(yǎng)基，另一培養(yǎng)板的培養(yǎng)基替換成含終濃度為0.75mg/ml的G418的上述培養(yǎng)基。兩者均在37℃孵育8天并計數(shù)出現(xiàn)的集落。根據(jù)有和無G418的情況下所出現(xiàn)的集落數(shù)計算出G418r集落的發(fā)生率(基因轉(zhuǎn)移效率)。
結(jié)果圖6所示。在圖6中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。如圖6(a)所示，在使用TF-1細胞的情況下，盡管在只有聚賴氨酸固化的培養(yǎng)板中在某種程度上有基因轉(zhuǎn)移發(fā)生，但是在GST-Epo存在的情況下可獲得更高的基因轉(zhuǎn)移效率。另一方面，如圖6(b)所示，在使用HL-60的情況下，存在GST-Epo時未觀察到基因轉(zhuǎn)移效率的增加。這些結(jié)果表明通過利用紅細胞生成素使靶細胞特異的基因轉(zhuǎn)移成為可能。
另外，用H2-547替換逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合材料來進行TF-1細胞的基因轉(zhuǎn)移實驗。根據(jù)實施例2(9)中所述的相同方法，分別用H2-547(333pmol/cm2，20μg/cm2)，34pmol/cm2(1.5μg/cm2)的GST-Epo和GST-Epo(34pmol/cm2)與H2-547(333pmol/cm2，20μg/cm2)的混合物對培養(yǎng)板進行固化。同時，使用BSA固化的培養(yǎng)板來進行對照實驗。
結(jié)果見圖7所示。在圖7中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。如圖7所示，用H2-547的情況下，有GST-Epo存在時可增加TF-1細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
(7)采用功能材料的混合物固化于其上的珠子進行基因轉(zhuǎn)移通過利用具有細胞結(jié)合區(qū)的材料和具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的材料所固化的珠子或沒有固化的珠子來研究逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率是否得到提高。
根據(jù)下列步驟制備多肽固化于其上的珠子。使用直徑為1.14μm的聚苯乙烯珠子(Polybeads Polystrene Microsphere，由PolyScience制造)作為珠子。將80μl乙醇和2ml溶于PBS的各種多肽溶液加入到20μl 2.5％的上述珠子的懸液中，隨后4℃靜置過夜。該懸液中加入BSA和PBS以制備4ml 1％的BSA/PBS懸液。離心從懸液中收集珠子并再懸浮于5ml 1％的BSA/PBS中。然后該懸液于室溫靜置1小時以獲得多肽固化的珠子的懸液。100μg/ml的C-274，100μg/ml的H-271，100μg/ml的CH-271，100μg/ml的CH-296和100μg/ml H-271與10μg/ml C-274的混合物作為多肽溶液。根據(jù)相同的方法，制備2％BSA溶液包被的珠子作為對照。
從上述懸液中收集十分之一這樣制備的多肽固化的珠子并于37℃分別與2,000個TF-1細胞和1,000cfu TKNEO病毒上清共育?；厥占毎腋∮诤?.3％ Bacto瓊脂(Difco)的RPMI培養(yǎng)基〔含10％ FCS，5ng/ml GM-CFS(Petrotech)，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素〕，然后接種于已加入含0.5％ Bacto瓊脂的上述培養(yǎng)基的35mm培養(yǎng)板中。使用含0.75mg/ml G418和不含G418的兩種培養(yǎng)基。培養(yǎng)板在5％ CO2環(huán)境中于37℃培養(yǎng)14天。計數(shù)G418存在下和無G418存在下所出現(xiàn)的集落數(shù)并計算出G418r集落的出現(xiàn)比率(基因轉(zhuǎn)移效率)。
結(jié)果見圖8。在圖8中，橫坐標表示所用的功能材料和BSA，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。與只用H-271固化的珠子和用在同一分子上既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)又有細胞結(jié)合區(qū)的CH-271或CH-296分別固化的珠子相比較，當用H-271和C-274的混合物所固化的珠子時，可以獲得更高的基因轉(zhuǎn)移效率。
實施例4(1)用FGF和C-FGF·A的基因轉(zhuǎn)移利用NIH/3T3細胞的集落形成試驗來研究FGF(Becton Deckinson)和SEQ.ID No.4所表示的多肽(C-FGF·A)對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的影響。即，按照實施例2(9)所述的相同方法，通過將FGF(132pmol/cm2，2.25μg/cm2)和C-FGF·A(133pmol/cm2，6.3μg/cm2)分別固化到培養(yǎng)板上，并將BSA固化到對照培養(yǎng)板上來進行評估實驗。每塊培養(yǎng)板中加入2ml含1,000cfu PM5 neo病毒的病毒上清并于37℃預(yù)孵育30分鐘，隨后用PBS徹底沖洗。該培養(yǎng)板加入2ml含2,000NIH/3T3細胞的DMEM培養(yǎng)基并于37℃孵育24小時。隨后在含有0.75mg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中孵育10天，對集落進行染色并計數(shù)。結(jié)果見于圖9。在圖9中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示出現(xiàn)的G418r集落數(shù)。
如圖9所示，在BSA固化于其上的對照培養(yǎng)板中未長出集落。另一方面，當用FGF和C-FGF·A固化的培養(yǎng)板時，在兩培養(yǎng)板中出現(xiàn)的G418r集落是相等的。該結(jié)果表明FGF和C-FGF·A均具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)以及纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽所偶聯(lián)的C-FGF·A表現(xiàn)出更高的基因轉(zhuǎn)移。
(2)C-FGF·A的濃度與基因轉(zhuǎn)移效率的關(guān)系利用各種不同濃度的C-FGF·A所包被的培養(yǎng)板來比較基因轉(zhuǎn)移效率。除了應(yīng)用按照實施例2(9)中所述的方法用0.521pmol/cm2(0.0247μg/cm2)-5.21pmol/cm2(0.247μg/cm2)的C-FGF·A制備的培養(yǎng)板和BSA固化培養(yǎng)板(對照板)之外，根據(jù)與實施例4(1)中相同的方法來進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。病毒感染后，傾析收集非粘附細胞，胰酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離，然后收集它們。隨后將這樣收集的細胞混合。所獲得的細胞懸液分成兩半，一半用DMEM培養(yǎng)，另一半用含終濃度為0.75mg/ml的G418的DMEM培養(yǎng)。兩部分均于37℃孵育10天并計數(shù)出現(xiàn)的集落數(shù)。將G418r集落數(shù)與不含G418的培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的集落數(shù)之間的比率看作基因轉(zhuǎn)移效率。
結(jié)果見圖10。在圖10中，橫坐標表示用于固化培養(yǎng)板的C-FGF·A濃度，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。在多肽濃度為0μmol/cm2時也標明了對照培養(yǎng)板的實驗結(jié)果。如圖10所示，隨著C-FGF·A固化濃度的增加，基因轉(zhuǎn)移效率濃度依賴性地增加。
(3)HL-60細胞的基因轉(zhuǎn)移關(guān)于非粘附細胞HL-60細胞(ATCC CCL-240)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，根據(jù)如下步驟來研究各種不同多肽存在時的效果。即，根據(jù)實施例2(9)中的方法用100pmol/cm2C-FGF·A(48μg/cm2)或者C-FGF-CS1(5.1μg/cm2)制備培養(yǎng)板，用BSA固化對照培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板中加入2ml含1×104cfu TKNEO病毒和2,000個HL-60細胞的RPMI培養(yǎng)基(含10％ FCS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)，隨后于37℃孵育24小時。孵育后，傾析收集非粘附細胞，吹打收集粘附到培養(yǎng)板上的細胞，然后將細胞混合。所獲得細胞懸液的每1/2被轉(zhuǎn)移至CH-296包被的培養(yǎng)板，孵育24小時并將培養(yǎng)基替換成含終濃度為0.75mg/ml的G418的RPMI培養(yǎng)基。于37℃孵育12天后，計數(shù)出現(xiàn)的集落數(shù)。用每一種多肽所獲得的G418r集落數(shù)見圖11。在圖11中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示G418r集落數(shù)。
如圖11所示，當使用C-FGF·A或者C-FGF-CS1固化的培養(yǎng)板時，G418r集落數(shù)明顯增加，這表明這些多肽提高逆轉(zhuǎn)錄病毒對HL-60細胞的感染。
(4)小鼠骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移進行如下的實驗以研究FGF、C-FGF·A和C-FGF-CS1對小鼠骨髓細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的影響。
150mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-FU，Amlesco)腹腔注入6～8周齡的小鼠(C3H/HeJ)，用藥后2天分離股骨和脛骨以收集骨髓。用Ficoll-Hypaque(密度1.0875g/ml，Pharmacia)對所得的骨髓進行密度梯度離心以獲得用作小鼠骨髓細胞的低密度單核細胞。
按照luskey等人的方法(《血液》(Blood)80，396(1992))，在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染之前預(yù)先刺激小鼠骨髓細胞。即，小鼠骨髓細胞以1×106細胞/ml的細胞密度加入到α-EME(Gibco)中，該α-EME含有20％FCS，100單位/ml重組人白介素-6(rh IL-6，Amgen)，100ng/ml重組小鼠干細胞因子(rmSCF，Amgen)，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素，細胞加入后于37℃在5％ CO2中，孵育48小時。用吸管吹打來收集包括粘附到容器壁的那些細胞在內(nèi)的預(yù)刺激細胞。
每2ml含1×106預(yù)刺激細胞和1×104cfu PM5neo病毒的上述預(yù)刺激中所用的培養(yǎng)基分別加入到根據(jù)實施例2(9)中所述方法用236pmol/cm2(4μg/cm2)FGF、169pmol/cm2(8μg/cm2)C-FGF·A或159pmol/cm2(8μg/cm2)C-FGF-CS1所制備的培養(yǎng)板中，以及加入到BSA所固化的培養(yǎng)板(對照培養(yǎng)板)中，隨后37℃孵育。2小時后，含有相同量病毒的培養(yǎng)基(2ml)加入到每個培養(yǎng)板中，然后繼續(xù)孵育22小時。孵育結(jié)束后，傾析收集非粘附細胞，粘附到培養(yǎng)板上的細胞用細胞分離緩沖液(CDB，不含酶，Gibco)分離后進行收集，然后將這些細胞混合起來，并用同一緩沖液沖洗兩次。計數(shù)細胞。用所收集的細胞進行HPP-CFC(高增殖潛能-集落形成細胞)試驗。
按照Bradley人所述的方法P83進行HPP-CFC試驗(Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，44，287-293(1966))。含有或不含有終濃度1.5mg/ml G418的1％/0.66％分層軟瓊脂培養(yǎng)基被用作培養(yǎng)基。已感染的細胞以1×104細胞/孔的量加入到各培養(yǎng)孔中。隨后于37℃在10％CO2中孵育。孵育結(jié)束后，用倒置顯微鏡觀察所出現(xiàn)的集落并計數(shù)從HPP-CFC中所獲得的高密度集落(具有不小于0.5mm的直徑)數(shù)以計算G418r集落的發(fā)生率(基因轉(zhuǎn)移效率)。結(jié)果見圖12。在圖12中，橫坐標表示所用的功能材料和BSA，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖12所示，在BSA包被的作為對照的培養(yǎng)板中沒有出現(xiàn)G418r集落，然而，當使用上述多肽分別固化的培養(yǎng)板時可以獲得G418r集落。按FGF、C-FGF·A和C-FGF-CS1的順序，基因轉(zhuǎn)移效率依次增加，這表明存在來自纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)和具有細胞區(qū)結(jié)合活性CS-1多肽時能增加骨髓細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
(5)C277-ColV用于培養(yǎng)板固化的濃度與基因轉(zhuǎn)移效率的關(guān)系按如下步驟，通過各種不同C277-ColV濃度所包被的培養(yǎng)板來比較基因轉(zhuǎn)移效率。根據(jù)實施例2(9)中所述的方法用0.1pmol/cm2(0.1μg/cm2)-416pmol/cm2(20μg/cm2)C277-ColV來制備培養(yǎng)板。2ml含1,000cfu PM5neo病毒的病毒上清加入到分別制備的培養(yǎng)板中并于37℃進行預(yù)孵育30分種，然后用PBS徹底沖洗。2ml含2,000 NIH/3T3細胞的DMEM培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)板中并于37℃孵育24小時。傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板的細胞使它們與培養(yǎng)板分離并收集，然后將細胞混合。所獲得的細胞懸液分或兩半，一半于DMEM中培養(yǎng)，另一半于含有終濃度為0.75mg/ml G418的DMEM中于37℃孵育10天，然后計數(shù)出現(xiàn)的集落。將G418r集落數(shù)與不含G418的培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的集落數(shù)之間的比率看作基因轉(zhuǎn)移效率。結(jié)果見圖13。在圖13中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖13所示，當使用C277-ColV固化的培養(yǎng)板時，基因轉(zhuǎn)移效率增加依賴于C277-ColV用于固化的濃度。
(6)用聚賴氨酸的基因轉(zhuǎn)移如下步驟研究聚賴氨酸[(Lys)n]與逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)合。使用多聚L-賴氨酸氫溴化物(分子量50,000-100,000，Wako Pure Chmical)用作聚賴氨酸，并根據(jù)實施例2(9)中所述的相同方法，用溶于PBS的133pmol/cm2(10μg/cm2)聚賴氨酸溶液固化于培養(yǎng)板上。按照實施例4(2)中所述的相同方法來評估該培養(yǎng)板和BSA固化的對照培養(yǎng)板的基因轉(zhuǎn)移效率。結(jié)果見圖14。在圖14中，橫坐標表示功能材料?？v坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。如圖14所示，在BSA包被的對照培養(yǎng)板中沒有出現(xiàn)集落，而在聚賴氨酸固化的培養(yǎng)板中出現(xiàn)了G418r集落，這表明，沖洗之后，逆轉(zhuǎn)錄病毒殘留在培養(yǎng)板上，因為逆轉(zhuǎn)錄毒與固化在培養(yǎng)板上的聚賴氨酸相結(jié)合。
實施例5(1)用多肽聚合物的基因轉(zhuǎn)移在沒有多肽固化到培養(yǎng)板上的情況下，用多肽聚合物進行基因轉(zhuǎn)移。在根據(jù)實施例2(9)所述的方法用BSA預(yù)包被的培養(yǎng)板中加入2ml含1,000cfu PM5neo病毒，2,000NIH/3T3細胞以及終濃度為0.63nmol/ml的每種多肽(H-271、CH-271、H2-547和CH2-826)，然后孵育24小時。傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離并收集。然后，將這些細胞混合。按照相同的方法進行沒有任何多肽的相同基因轉(zhuǎn)移實驗作為對照。所得到的細胞懸液分成兩半并且一半在DMEM中培養(yǎng)。另一半在含終濃度為0.75mg/ml G418的DMEM中培養(yǎng)。兩部分均于37℃孵育10天并計數(shù)出現(xiàn)的集落。將G418r集落數(shù)與沒有G418的培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的集落數(shù)之間的比率看作基因轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果見圖15。在圖15中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
從圖15中可以看出，存在H2-547時的基因轉(zhuǎn)移效率明顯高于存H-271時的轉(zhuǎn)移效率，并且，存在CH2-826時基因轉(zhuǎn)移效率等于或高于CH-271所獲得的轉(zhuǎn)移效率。
再者，除了CH-271、CH-296和H2-547均以0.126nmol(終濃度0.063nmol/ml)和1.26nmol(終濃度0.63nmol/ml)的量用作多肽來固化培養(yǎng)板之外，按上述的相同方法進行更詳細的研究。結(jié)果見圖16。在圖16中，橫坐標表示所用的功能材料及其用量，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
從圖16中可以看出，當使用H2-547時，基因轉(zhuǎn)移效率明顯高于CH-271和CH-296以兩種多肽量中任一量時的轉(zhuǎn)移效率。
(2)用H2S-573進行小鼠骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移為了研究H2S-573對骨髓細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的影響，根據(jù)實施例4(4)中所述的相同方法進行小鼠骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移實驗。
按照上述實施例所述的相同方法制備小鼠骨髓細胞并且預(yù)先刺激細胞。
除H2S-573(160pmol/cm2，10μg/cm2)固化的培養(yǎng)板之外，CH-296(132pmol/cm2，8.3μg/cm2)固化的培養(yǎng)板也用作逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的培養(yǎng)板，另外，BSA固化的培養(yǎng)板用作對照培養(yǎng)板。HPP-CFC試驗所獲得的結(jié)果見圖17。在圖17中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖17所示，在BSA包被的對照培養(yǎng)板中沒有出現(xiàn)G418r的高密度集落。盡管在CH-296固化的培養(yǎng)板中獲得大約50％的基因轉(zhuǎn)移效率，但是在使用H2S-573固化的培養(yǎng)板時可以更高的效率獲得G418r高密度集落。
實施例6(1)使用非固化功能材料的基因轉(zhuǎn)移按下列步驟研究多肽不進行固化而存在于培養(yǎng)板中時對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率的影響。即，按實施例2(9)中所述的方法用BSA預(yù)先包被的培養(yǎng)板中加入2ml含100cfu PM5neo病毒，2,000個NIH/3T3細胞和終濃度為10、40、250μg/ml(每個濃度對應(yīng)0.158、0.632和3.950nmol/ml)CH-296的DMEM培養(yǎng)基，然后孵育24小時。傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之與培養(yǎng)板分離并收集。將這些細胞混合。所得的細胞懸液轉(zhuǎn)入10cm細胞培養(yǎng)板，隨后孵育24小時。培養(yǎng)基換成含終濃度為0.75mg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基，然后孵育另外的10天。分別制備沒有CH-296的培養(yǎng)板，和32pmol/cm2(2μg/cm2)或127pmol/cm2(8μg/cm2)CH-296固化的培養(yǎng)板作為對照，并按上述步驟加入病毒上清和細胞。計數(shù)所獲得的G418r集落數(shù)，結(jié)果總結(jié)于表1。
表1培養(yǎng)板 CH-296G418r集落數(shù)BSA - 5BSA 10μg/ml 41BSA 40μg/ml 66BSA 250μg/ml 92CH-296(32pmol/cm2) - 55CH-296(127pmol/cm2)- 47如表1所示，當細胞、病毒和CH-296同時存在于溶液中時，與缺乏CH-296的情況相比，G418r集落數(shù)明顯增加。該數(shù)目等于或高于使用CH-296包被培養(yǎng)板時所獲得的數(shù)目。此外，以上述各種濃度分別將CH-296溶液加入到BSA包被的培養(yǎng)板并靜置片刻后，沖洗培養(yǎng)板并用于病毒感染實驗，所獲得的G418r集落數(shù)與沒有加入CH-296的情況下所獲得的集落數(shù)相似。從上述結(jié)果可以看出CH-296不能與固化的BSA結(jié)合。因此，認為CH-296提高上述逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效率不是因為孵育時溶液中的CH-296粘附到培養(yǎng)板上所致。
(2)使用非固化功能材料的基因轉(zhuǎn)移按下列步驟研究當多肽不進行固化存在于培養(yǎng)板時對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率的影響。即，于按照實施例2(9)中所述的方法用BSA預(yù)先包被的培養(yǎng)板中加入2ml含1,000cfu PM5 neo病毒，2,000個NIH/3T3細胞和終濃度分別為1.67nmol/ml C-FGF·A、ColV和C277-ColV的DMEM培養(yǎng)基，然后于37℃孵育24小時。傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附細胞使之與培養(yǎng)板分離并收集。將這些細胞混合。所得的細胞懸液分成兩半，一半于DMEM中培養(yǎng)，另一半于含終濃度為0.75mg/mlG418的DMEM中培養(yǎng)。兩部分均于37℃孵育10天并計數(shù)出現(xiàn)的集落數(shù)。G418r集落數(shù)與不含G418的培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的集落數(shù)之間的比率看作基因轉(zhuǎn)移效率。結(jié)果見圖18。在圖18中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖18所示，當病毒感染于每一種多肽存在的情況下進行時，可以獲得更高的基因轉(zhuǎn)移效率。這樣，很清楚地看出，即使當多肽不固化到培養(yǎng)板時，也可以提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
(3)使用不固化的功能材料而進行非粘附細胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)按下列步驟研究多肽不固化時對非粘附細胞基因轉(zhuǎn)移效率的影響。即，根據(jù)實施例2(9)中所述的相同方法用333pmol/cm2(10μg/cm2)H-271制備的每一塊培養(yǎng)板和BSA固化于其上的對照培養(yǎng)板中分別加入2ml含1×104cfu TKNEO病毒和1×104TF-1細胞的RPMI培養(yǎng)基(含5ng/ml GM-CSF，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)。對BSA固化的培養(yǎng)板進一步加入H-271至終濃度50μg/ml(1.67nmol/ml)。每塊培養(yǎng)板均在37℃孵育24小時。孵育后，傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞并加以收集。將細胞混合。將所獲得細胞懸液的每1/5轉(zhuǎn)入CH-296包被的兩塊培養(yǎng)板中，孵育24小時。一塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)基換成上述培養(yǎng)基，另一塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)基換成上述含終濃度為0.75mg/ml G418的培養(yǎng)基。于37℃孵育8天后，計數(shù)出現(xiàn)的集落數(shù)。根據(jù)含或不含G418的培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的集落數(shù)計算出發(fā)生率(基因轉(zhuǎn)移效率)。結(jié)果見圖19。在圖19中，橫坐標表示功能材料和所用的形式，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖19所示，當使用沒有固化的H-271時，所獲得的基因轉(zhuǎn)移效率高于使用固化的H-271時所獲得的效率。這樣，結(jié)果表明，當使用H-271用于TF-1細胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時，優(yōu)選其非固化的形式。
(4)闡明多肽提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的機制進行以下實驗以確定上述實施例中所示的多肽不進行固化時對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的提高是來自細胞結(jié)合于多肽以及多肽與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合。首先，按照實施例2(9)中所述的方法用BSA固化的培養(yǎng)板中加入2ml含1,000 NIH/3T3細胞的DMEM，隨后于37℃孵育24小時。去除培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，分別加入2ml 1.67nmol/ml的H-271，CH-271和C-FGF·A以及作為對照的PBS，然后于37℃孵育2.5小時。培養(yǎng)板用含25mM HEPES的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS，Gibco)沖洗。2ml含1,000cfu PM5neo病毒的病毒上清加入到培養(yǎng)板中，隨后于37℃孵育30分鐘。培養(yǎng)板用PBS沖洗。對這些培養(yǎng)板中加入2ml DMEM，并于37℃孵育24小時。傾析收集非粘附細胞，胰蛋白酶處理粘附到培養(yǎng)板上的細胞使之分離并加以收集。分別將細胞混合。這樣獲得的每一種細胞懸液分成兩半，一半用DMEM培養(yǎng)，另一半用含終濃度為0.75mg/mlG418的DMEM培養(yǎng)。兩部分均于37℃孵育10天并計數(shù)出現(xiàn)的集落數(shù)。G418r集落數(shù)與不含G418的培養(yǎng)基中所獲得的集落數(shù)之間的比率看作基因轉(zhuǎn)移效率。結(jié)果見圖20。在圖20中，橫坐標表示所用的功能材料和對照，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖20所示，當上述多肽溶液處理了培養(yǎng)板中的細胞后再進行病毒感染時，可以觀察到感染效率明顯增加。結(jié)果提示通過多肽與細胞結(jié)合以及逆轉(zhuǎn)錄病毒與細胞上的多肽結(jié)合而增加感染效率。
除了加入的多肽分別換成0.29nmol/ml C-FGF·A和0.79nmol/mlCH-296之外，進行相同的實驗。結(jié)果見圖21。在圖21中，橫坐標表示所用的功能材料和對照，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。如圖21所示，在C-FGF·A和CH-296的情況下可以觀察到基因轉(zhuǎn)移效率增加。這樣，證實了C-FGF·A的上述活性。同時，結(jié)果表明CH-296通過相同機制具有提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的相同活性。
實施例7(1)使用固化到珠子上的功能材料進行的基因轉(zhuǎn)移按如下步驟研究使用功能材料包被的或沒有包被的珠子是否能夠增加逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效率。直徑1.14μm的聚苯乙烯珠子(PolybeadsPolystyrene Microsphere，PolyScience制造)用作珠子。將80μl乙醇加入到20μl 2.5％的上述珠子的懸液中，并加入2ml 40μg/ml CH-296，然后4℃放置過夜。該懸液中加入BSA和PBS以制備1％ BSA/PBS懸液(4ml)，離心回收珠子，并再制備5ml 1％ BSA/PBS懸液，使之于室溫下放置1小時來獲得CH-296固化的珠子懸液。除了用2％ BSA而不是CH-296溶液來進行固化之外，按相同的方法制備珠子作為對照。
從上述懸液中取出1/10(0.5ml)并離心收集珠子。加入含1,000cfuPM5neo病毒的DMEM，然后于37℃孵育30分鐘。用1％ BSA/PBS沖洗珠子兩次，懸浮于2ml DMEM中并將其中1ml轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中。加入1ml含3×105NIH/3T3細胞的DMEM，并于37℃在CO2中孵育24小時。之后，培養(yǎng)基換成含終濃度為0.75mg/ml G418的DMEM，再孵育10天。染色并計數(shù)出現(xiàn)的集落。結(jié)果見表2。
表2珠子 G418r集落數(shù)固化BSA(對照)0固化CH-296 264如表2所示，當使用CH-296包被的珠子時，出現(xiàn)264個G418r集落，而在使用BSA包被的對照珠子時卻沒有長出抗性集落。該結(jié)果提示CH-296固化在珠子上如同CH-296固化在培養(yǎng)板也有增加逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率的效果。
(2)使用功能材料固化于其上的珠子來進行小鼠骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移按如下步驟研究使用功能材料包被的珠子增加小鼠骨髓細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率的可能性根據(jù)實施例4(4)中所述的相同方法制備小鼠骨髓細胞并預(yù)先刺激。
每2ml含1×106預(yù)先刺激的細胞和1×104cfu PM5neo病毒的用于上述預(yù)先刺激的培養(yǎng)基加入到根據(jù)實施例2(9)中所述的相同方法用BSA包被的培養(yǎng)板中以及用BSA相似包被的加入了1/10實施例7(1)中所制備的CH-296固化珠子的培養(yǎng)板中，于37℃孵育。兩小時后，每塊培養(yǎng)板中重新加入含相同量病毒的培養(yǎng)基(2ml)，繼續(xù)孵育22小時，孵育后，傾析收集非粘附細胞，用細胞分離緩沖液(CDB，不含酶，Gibco)收集粘附到培養(yǎng)板上的細胞，將這些細胞混合并用同一種緩沖液沖洗。計數(shù)細胞數(shù)。根據(jù)實施例4(4)中所述的相同方法對所收集的細胞進行HPP-CFC試驗。
結(jié)果見圖22。在圖22中橫坐標表示所用的功能材料和其形式，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。如結(jié)果所示，通過使用CH-296固化的珠子也可以增加小鼠骨髓細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率。
實施例8(1)使用H-271和CH-271的基因轉(zhuǎn)移通過將病毒上清在用已知能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的H-271和CH-271分別包被的培養(yǎng)板中預(yù)先孵育來評估H-271對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效果，徹底沖洗培養(yǎng)板后，通過NIH/3T3細胞集落形成試驗測定病毒的剩余量并比較兩個培養(yǎng)板的結(jié)果。即，根據(jù)實施例2(9)中描述的相同方法，用各種濃度的H-271[67pmol/cm2(2ug/cm2)～333pmol/cm2(10ug/cm2)]和CH-271[67pmol/cm2(4ug/cm2)-333pmol/cm2(20ug/cm2)]分別制備培養(yǎng)板。每個培養(yǎng)板中加入2ml含1,000cfu PM5neo病毒的病毒上清并于37℃預(yù)先孵育30分鐘，然后用PBS徹底沖洗。每個培養(yǎng)板中加入2ml含2,000個NIH/3T3細胞的DMEM培養(yǎng)基并于37℃孵育24小時，隨后在含0.75mg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中孵育10天。染色并計數(shù)集落。結(jié)果見圖23。圖23是說明功能材料與基因轉(zhuǎn)移效率之間關(guān)系的圖。圖23中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示G418r集落的數(shù)目。
如圖23所示，當使用CH-271固化的培養(yǎng)板時，不管多肽的濃度如何，所出現(xiàn)的G418r集落數(shù)幾乎是相同的。另一方面，在H-271的情況下，隨著固化中使用的多肽濃度增加，所出現(xiàn)的集落數(shù)依賴于濃度而增加，并且用333pmol/cm2H-271制備培養(yǎng)板的情況下，所出現(xiàn)的集落數(shù)幾乎與CH-271相同。該結(jié)果提示，當用足夠的H-271固化培養(yǎng)板時，可以獲得與CH-271相當?shù)牟《靖腥拘省?br> (2)使用C-FGF·A的基因轉(zhuǎn)移通過NIH/3T3細胞集落形成試驗來研究C-FGF·A對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效果，即，除了使用根據(jù)實施例2(9)中描述的相同方法用127pmol/cm2(6μg/cm2)C-FGF·A，127pmol/cm2(7.6μg/cm2)CH-271和127pmol/cm2(8μg/cm2)CH-289制備的培養(yǎng)板以及BSA固化的對照培養(yǎng)板之外，根據(jù)實施例8(1)中描述的相同方法來進行評估。結(jié)果見圖24。圖24是說明功能材料與基因轉(zhuǎn)移效率之間關(guān)系的圖。在圖24中，橫坐標表示所用的功能材料和BSA，縱坐標表示基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖24所示，在BSA固化的對照培養(yǎng)板中沒有集落出現(xiàn)。另一方面，當使用C-FGF·A固化于其上的培養(yǎng)板時，證實有G418r集落出現(xiàn)并且集落數(shù)與CH-271和CH-296固化的培養(yǎng)板中的集落數(shù)相同。該結(jié)果提示，在FGF分子上存在與CH-271和CH-296的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)功能基本相當?shù)哪孓D(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
(3)使用C-FGF-CS1的基因轉(zhuǎn)移根據(jù)如下步驟來研究C-FGF-CS1多肽對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效果。即，根據(jù)實施例2(9)中描述的相同方法用133pmol/cm2C-FGF-CS1(6.7μg/cm2)，C-FGF·A(6.3μg/cm2)，CH-271(8μg/cm2)，和CH-296(8.4μg/cm2)分別制備培養(yǎng)板，使用這些培養(yǎng)板，按照實施例8(1)中描述的相同方法來進行NIH/3T3細胞集落形成試驗。結(jié)果見圖25。圖25是說明功能材料與基因轉(zhuǎn)移效率之間關(guān)系的圖。在圖25中，橫坐標表示所用的功能材料，縱坐標表示G418r集落數(shù)。
如圖25所示，在四種多肽分別固化的培養(yǎng)板中出現(xiàn)幾乎相同的集落數(shù)，這表明C-FGF-CS1具有與其他多肽相當?shù)哪孓D(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性。
(4)使用C277-ColV的基因轉(zhuǎn)移通過使用124pmol/cm2(6.4μg/cm2)C277-ColV制備的培養(yǎng)板以及BSA固化于其上的對照培養(yǎng)板，按照實施例8(1)中描述的相同方法來評估C277-ColV多肽對逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的效果。結(jié)果見圖26。圖26是說明功能材料與基因轉(zhuǎn)移效率之間關(guān)系的圖。在圖26中，橫坐標表示所用的功能材料和BSA，縱坐標表示G418r集落數(shù)。
如圖26所示，在BSA包被的對照培養(yǎng)板中沒有集落出現(xiàn)，另一方面，當使用C277-ColV固化的培養(yǎng)板時，出現(xiàn)G418r集落。該結(jié)果表明，因為在ColV分子上有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)，所以沖洗后逆轉(zhuǎn)錄病毒存留在培養(yǎng)板上。
如上所述，本發(fā)明提供了用逆轉(zhuǎn)錄病毒有效將基因轉(zhuǎn)入靶細胞的方法，當選擇適合靶細胞的細胞結(jié)合材料來進行本發(fā)明的方法時，不需要任何特定的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)化細胞即可以高效的基因轉(zhuǎn)移方便地獲得。通過將轉(zhuǎn)化的細胞移植入脊椎動物中，可以方便地制備轉(zhuǎn)化的動物，而且本發(fā)明在諸如醫(yī)學、細胞技術(shù)、遺傳工程和發(fā)育技術(shù)等各種技術(shù)領(lǐng)域中是有用的。另外，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的功能材料或其混合物的培養(yǎng)基以及進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶細胞基因轉(zhuǎn)移的試劑盒。應(yīng)用這些培養(yǎng)基和試劑盒，將逆轉(zhuǎn)錄病毒定位，可以方便有效地進行外源基因?qū)Π屑毎鹊霓D(zhuǎn)導(dǎo)。
附圖簡述圖1說明使用成纖維細胞生長因子、含有成纖維細胞生長因子的功能材料以及成纖維細胞生長因子與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖2說明使用成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物以及纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖3說明使用膠原片段、纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽與膠原片段的混合物、含有膠原片段的功能材料以及纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖4說明使用纖維結(jié)合素片段以及纖維結(jié)合素片段與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖5說明使用纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽、聚賴氨酸、聚賴氨酸與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物、纖維結(jié)合素片段以及纖維結(jié)合素片段與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖6說明使用紅細胞生成素衍生物、聚賴氨酸以及紅細胞生成素衍生物與聚賴氨酸的混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖7說明使用紅細胞生成素衍生物、纖維結(jié)合素片段聚合物以及紅細胞生成素衍生物與纖維結(jié)合素片段聚合物的混合物時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖8說明使用如下珠子時靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率，纖維結(jié)合素片段固化于其上的珠子，纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽固化于其上的珠子以及纖維結(jié)合素片段與纖維結(jié)合素的細胞粘附區(qū)多肽的混合物固化于其上的珠子。
圖9說明使用成纖維細胞生長因子和含有成纖維細胞生長因子的功能材料時靶細胞的轉(zhuǎn)化。
圖10說明含有成纖維細胞生長因子的功能材料所用的量與基因轉(zhuǎn)移效率之間的關(guān)系。
圖11說明使用含有成纖維細胞生長因子的功能材料時靶細胞的轉(zhuǎn)化。
圖12是說明使用含有成纖維細胞生長因子的功能材料時靶細胞轉(zhuǎn)化的另一副圖。
圖13說明含有膠原片段的功能材料所用的量與基因轉(zhuǎn)移效率之間的關(guān)系。
圖14說明使用聚賴氨酸的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率。
圖15說明使用纖維結(jié)合素片段和纖維結(jié)合素片段聚合物的靶細胞轉(zhuǎn)化。
圖16是說明使用纖維結(jié)合素片段和纖維結(jié)合素片段聚合物時靶細胞轉(zhuǎn)化的另一副圖。
圖17是說明使用纖維結(jié)合素片段和纖維結(jié)合素片段聚合物時靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率的另一副圖。
圖18說明使用含有成纖維細胞生長因子的功能材料、膠原片段和含有膠原片段的功能材料時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖19說明使用纖維結(jié)合素片段的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率。
圖20說明使用含纖維結(jié)合素片段和成纖維細胞生長因子的功能材料時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖21說明使用成含成纖維細胞生長因子和纖維結(jié)合素片段的功能材料時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
圖22說明使用纖維結(jié)合素片段固化的珠子的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率。
圖23說明纖維結(jié)合素片段的所用量與靶細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系。
圖24說明使用含成纖維細胞生長因子和纖維結(jié)合素片段的功能材料時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖25是說明使用含成纖維細胞生長因子和纖維結(jié)合素片段的功能材料時，靶細胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一副圖。
圖26說明使用含有膠原片段的功能材料的靶細胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
序列表SEQ.ID NO.1長度271類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro1 5 10 15Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr20 25 30Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met35 40 45Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser50 55 60Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu65 70 75Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr80 85 90Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala95 100 105Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr110 115 120Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr125 130 135Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile140 145 150Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr155 160 165Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser170 175 180Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr185 190 195Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile200 205 210Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg215 220 225Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile230 235 240Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala245 250 255Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys260 265 270ThrSEQ.ID NO.2長度25類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His1 5 10 15Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr20 25SEQ.ID NO.3長度155類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp1 5 10 15Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys20 25 30Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro35 40 45Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile50 55 60Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
65 70 75Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg80 85 90Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu95 100 105Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr110 115 120Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu125 130 135Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro140 145 150Met Ser Ala Lys Ser155SEQ.ID NO.4長度432類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr275 280 285Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro290 295 300Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly305 310 315Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg320 325 330Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu335 340 345Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu350 355 360Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr365 370 375Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn380 385 390Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys395 400 405Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln410 415 420Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser425 430SEQ.ID NO.5長度457類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr275280 285Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro290 295 300Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly305 310 315Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg320 325 330Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu335 340 345Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu350 355 360Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr365 370 375Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn380 385 390Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys395 400 405Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln410 415 420Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu425 430 435Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu440 445 450Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr455SEQ.ID NO.6長度186類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp1 5 10 15Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg20 25 30Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu35 40 45Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu50 55 60Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro65 70 75Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro80 85 90Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro95 100 105Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg110 115 120Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys125 130 135Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg140 145 150Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys155 160 165Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro170 175 180Gly Gln Arg Gly Glu Thr185SEQ.ID NO.7長度464類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly275 280 285Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly290 295 300Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly305 310 315Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly320 325 330Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly335 340 345Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly350 355 360Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly365 370 375Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly380 385 390Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly395 400 405Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly410 415 420Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly425 430 435Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
440 445 450Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Thr455 460SEQ.ID NO.8長度489類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg1 5 10 15Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu20 25 30Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu35 40 45Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu50 55 60Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln65 70 75His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp80 85 90Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe95 100 105Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly275 280 285Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly
290 295 300Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly305 310 315Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly320 325 330Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly335 340 345Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly350 355 360Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly365 370 375Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly380 385 390Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly395 400 405Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly410 415 420Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly425 430 435Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly440 445 450Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro Gly Gln Arg Gly Ala Ser Asp455 460 465Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly470 475 480Pro Glu lle Leu Asp Val Pro Ser Thr485SEQ.ID NO.9長度36類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AAACCATGGC AGTCAGCGAC GAGCTTCCCC AACTGG36SEQ.ID NO.10長度20類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AATTGACAAA CCATCCATGG20SEQ.ID NO.11長度33類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列CCATTAAAAT CAGCTAGCAG CAGACATTGG AAG 33SEQ.ID NO.12長度36類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列TCTAGAGGAT CCTTAGCTAG CGCCTCTCTG TCCAGG36SEQ.ID NO.13長度547類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln5 10 15Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val20 25 30Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr35 40 45Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val50 55 60Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val65 70 75Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val80 85 90Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val95 100 105Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys110 115 120Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn125 130 135Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser140 145 150Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr155 160 165Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile170 175 180Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu185 190 195Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg200 205 210Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser
215 220 225Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu230 235 240Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr245 250 255Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly260 265 270Arg Lys Lys Thr Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe275 280 285Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro290 295 300Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu305 310 315Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser320 325 330Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val335 340 345Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln350 355 360Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala365 370 375Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg380 385 390Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro395 400 405Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val410 415 420Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys425 430 435Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val440 445 450Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg455 460 465Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro470 475 480Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro485 490 495Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val500 505 510Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr515 520 525Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu530 535 540Ile Gly Arg Lys Lys Thr Ser545SEQ.ID NO.14長度826類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Ala Ala Ser Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp5 10 15Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr20 25 30Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val35 40 45Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr50 55 60Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val65 70 75Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr80 85 90Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala95 100 105Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr110 115 120Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro125 130 135Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr140 145 150Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu155 160 165Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr170 175 180Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro185 190 195Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg200 205 210Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val215 220 225Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser230 235 240Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val245 250 255Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile260 265 270Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Thr Ser Ala Ile Pro275 280 285Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu290 295 300Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg305 310 315Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile320 325 330Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met335 340 345Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr
350 355 360Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn365 370 375Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr380 385 390Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly395 400 405Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln410 415 420Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu425 430 435Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp440 445 450Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile455 460 465Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser470 475 480Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr485 490 495Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val500 505 510Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu515 520 525Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn530 535 540Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Ser Ala545 550 555Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr560 565 570Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly575 580 585Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys590 595 600Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly605 610 615Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys620 625 630Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu635 640 645Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr650 655 660Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile665 670 675Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro680 685 690Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr695 700 705Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu710 715 720Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
725 730 735Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro740 745 750Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr755 760 765Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu770 775 780Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr785 790 795Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu800 805 810Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr815 820 825SerSEQ.ID NO.15長度38類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AAACCATGGC AGCTAGCGCT ATTCCTGCAC CAACTGAC 38SEQ.ID NO.16長度36類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AAAGGATCCC TAACTAGTCT TTTTCCTTCC AATCAG36SEQ.ID NO.17長度1644類型核酸鏈型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(編碼人工多肽的DNA)序列ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA60AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240GACACTTTGA CAAGCAGACC 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120AAAAATGAGG AAGATGTTGC AGAGTTGTCA ATTTCTCCTT CAGACAATGC AGTGGTCTTA 180ACAAATCTCC TGCCTGGTAC AGAATATGTA GTGAGTGTCT CCAGTGTCTA CGAACAACAT 240GAGAGCACAC CTCTTAGAGG AAGACAGAAA ACAGGTCTTG ATTCCCCAAC TGGCATTGAC 300TTTTCTGATA TTACTGCCAA CTCTTTTACT GTGCACTGGA TTGCTCCTCG AGCCACCATC 360ACTGGCTACA GGATCCGCCA TCATCCCGAG CACTTCAGTG GGAGACCTCG AGAAGATCGG 420GTGCCCCACT CTCGGAATTC CATCACCCTC ACCAACCTCA CTCCAGGCAC AGAGTATGTG 480GTCAGCATCG TTGCTCTTAA TGGCAGAGAG GAAAGTCCCT TATTGATTGG CCAACAATCA 540ACAGTTTCTG ATGTTCCGAG GGACCTGGAA GTTGTTGCTG CGACCCCCAC CAGCCTACTG 600ATCAGCTGGG ATGCTCCTGC TGTCACAGTG AGATATTACA GGATCACTTA CGGAGAAACA 660GGAGGAAATA GCCCTGTCCA GGAGTTCACT GTGCCTGGGA GCAAGTCTAC AGCTACCATC 720AGCGGCCTTA AACCTGGAGT TGATTATACC ATCACTGTGT ATGCTGTCAC TGGCCGTGGA 780GACAGCCCCG CAAGCAGCAA GCCAATTTCC ATTAATTACC GAACAGAAAT TGACAAACCA 840TCCACTAGCG CTATTCCTGC ACCAACTGAC CTGAAGTTCA CTCAGGTCAC ACCCACAAGC 900CTGAGCGCCC AGTGGACACC ACCCAATGTT CAGCTCACTG GATATCGAGT GCGGGTGACC 960CCCAAGGAGA AGACCGGACC 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Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg110 115 120Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp125 130 135Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr140 145 150Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg155 160 165Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp170 175 180Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu185 190 195Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg200 205 210Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe215 220 225Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys230 235 240Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg245 250 255Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg260 265 270Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr275 280 285Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro290 295 300Ser ThrSEQ.ID NO.30長度573類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Met Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr5 10 15Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn20 25 30Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys35 40 45Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser50 55 60Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser65 70 75Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly80 85 90Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg95 100 105Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr110 115 120Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala125 130 135Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg140 145 150Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile155 160 165Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
170 175 180Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe185 190 195Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro200 205 210Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly215 220 225Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr230 235 240Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile245 250 255Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile260 265 270Gly Arg Lys Lys Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe275 280 285Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro290 295 300Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu305 310 315Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser320 325 330Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val335 340 345Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln350 355 360Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala365 370 375Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg380 385 390Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro395 400 405Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val410 415 420Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys425 430 435Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val440 445 450Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg455 460 465Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro470 475 480Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro485 490 495Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val500 505 510Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr515 520 525Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu530 535 540Ile Gly Arg Lys Lys Thr Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr
545 550 555Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro560 565 570Ser Thr SerSEQ.ID NO.31長度37類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AAACCATGGC AGCTAGCAAT GTCAGCCCAC CAAGAAG 37SEQ.ID NO.32長度37類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列AAAGGATCCC TAACTAGTGG AAGGAACATC CAAGATC 37SEQ.ID NO.33長度1722類型核酸鏈型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(編碼人工多肽的DNA)序列ATGGCAGCTA GCGCTATTCC TGCACCAACT GACCTGAAGT TCACTCAGGT CACACCCACA60AGCCTGAGCG CCCAGTGGAC ACCACCCAAT GTTCAGCTCA CTGGATATCG AGTGCGGGTG 120ACCCCCAAGG AGAAGACCGG ACCAATGAAA GAAATCAACC TTGCTCCTGA CAGCTCATCC 180GTGGTTGTAT CAGGACTTAT GGTGGCCACC AAATATGAAG TGAGTGTCTA TGCTCTTAAG 240GACACTTTGA CAAGCAGACC AGCTCAGGGT GTTGTCACCA CTCTGGAGAA TGTCAGCCCA 300CCAAGAAGGG CTCGTGTGAC AGATGCTACT GAGACCACCA TCACCATTAG CTGGAGAACC 360AAGACTGAGA CGATCACTGG CTTCCAAGTT GATGCCGTTC CAGCCAATGG CCAGACTCCA 420ATCCAGAGAA CCATCAAGCC AGATGTCAGA AGCTACACCA TCACAGGTTT ACAACCAGGC 480ACTGACTACA AGATCTACCT GTACACCTTG AATGACAATG CTCGGAGCTC CCCTGTGGTC 540ATCGACGCCT CCACTGCCAT TGATGCACCA TCCAACCTGC GTTTCCTGGC CACCACACCC 600AATTCCTTGC TGGTATCATG GCAGCCGCCA CGTGCCAGGA TTACCGGCTA CATCATCAAG 660TATGAGAAGC CTGGGTCTCC TCCCAGAGAA GTGGTCCCTC GGCCCCGCCC TGGTGTCACA 720GAGGCTACTA TTACTGGCCT GGAACCGGGA ACCGAATATA CAATTTATGT CATTGCCCTG 780AAGAATAATC AGAAGAGCGA GCCCCTGATT GGAAGGAAAA AGACTAGCGC TATTCCTGCA 840CCAACTGACC TGAAGTTCAC TCAGGTCACA CCCACAAGCC TGAGCGCCCA GTGGACACCA 900CCCAATGTTC AGCTCACTGG ATATCGAGTG CGGGTGACCC CCAAGGAGAA GACCGGACCA 960ATGAAAGAAA TCAACCTTGC TCCTGACAGC TCATCCGTGG TTGTATCAGG ACTTATGGTG 1020GCCACCAAAT ATGAAGTGAG TGTCTATGCT CTTAAGGACA CTTTGACAAG CAGACCAGCT 1080CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT 1140GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CACTGGCTTC 1200CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT CAAGCCAGAT 1260GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT CTACCTGTAC 1320ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC TGCCATTGAT 1380GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT ATCATGGCAG 1440CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG GTCTCCTCCC 1500AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC TGGCCTGGAA 1560CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA GAGCGAGCCC 1620CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGCGACGAG CTTCCCCAAC TGGTAACCCT TCCACACCCC 1680AATCTTCATG GACCAGAGAT CTTGGATGTT CCTTCCACTA GT1722SEQ.ID NO.34長度412類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln5 10 15Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu20 25 30His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys35 40 45Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
50 55 60Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile65 70 75Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala80 85 90Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly95 100 105Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val110 115 120Asp Phe Leu Sar Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp125 130 135Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His140 145 150Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met155 160 165Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys170 175 180Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser185 190 195Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe200 205 210Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly Arg215 220 225Gly Ile Pro Arg Asn Ser Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp230 235 240Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu245 250 255Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn260 265 270Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg275 280 285Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala290 295 300Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn305 310 315Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala320 325 330Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly335 340 345Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala350 355 360Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg365 370 375Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly380 385 390Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Leu Ala Met Asp Pro Leu Glu395 400 405Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser410SEQ.ID NO.35長度24類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列GCTCCCTCTG GGCCTCCCAG TCCT 24SEQ.ID NO.36長度24類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列GTTGGTGAGG GAGGTGGTGG ATAT 24SEQ.ID NO.37長度33類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列GGCCTCCCGA ATTCCGGTGC CCCACCACGC CTC 33SEQ.ID NO.38長度33類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(合成DNA)序列CCCACGTGGA TCCATGGCTA ATCTGTCCCC TGT 33SEQ.ID NO.39長度1239類型核酸鏈型雙鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸(編碼人工多肽的DNA)序列ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT60TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660CTGATCGAAG GTCGTGGGAT CCCCAGGAAT TCCGGTGCCC CACCACGCCT CATCTGTGAC 720AGCCGAGTCC TGCAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG CCGAGAATAT CACGACGGGC 780TGTGCTGAAC ACTGCAGCTT GAATGAGAAT ATCACTGTCC CAGACACCAA AGTTAATTTC 840TATGCCTGGA AGAGGATGGA GGTCGGGCAG CAGGCCGTAG AAGTCTGGCA GGGCCTGGCC 900CTGCTGTCGG AAGCTGTCCT GCGGGGCCAG GCCCTGTTGG TCAACTCTTC CCAGCCGTGG 960GAGCCCCTGC AGCTGCATGT GGATAAAGCC GTCAGTGGCC TTCGCAGCCT CACCACTCTG 1020CTTCGGGCTC TGGGAGCCCA GAAGGAAGCC ATCTCCCCTC CAGATGCGGC CTCAGCTGCT 1080CCACTCCGAA CAATCACTGC TGACACTTTC CGCAAACTCT TCCGAGTCTA CTCCAATTTC 1140CTCCGGGGAA AGCTGAAGCT GTACACAGGG GAGGCCTGCA GGACAGGGGA CAGATTAGCC 1200ATGGATCCTC TAGAGTCGAC TCGAGCGGCC GCATCGTGA 1239
權(quán)利要求
1.增加利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率的方法，其中改進包括在有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物存在下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞來進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料是選自纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸和其功能性等價物的功能材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料是與靶細胞特異結(jié)合的配體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中配體選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中細胞粘附蛋白是纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽是針對VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中配體是紅細胞生成素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中功能材料是固化的。
9.用于利用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行靶細胞基因轉(zhuǎn)移的靶細胞培養(yǎng)基，它包括有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的培養(yǎng)基，其中具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料是選自纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸和其功能等價物的功能材料。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的培養(yǎng)基，其中具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料是與靶細胞特異結(jié)合的配體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的培養(yǎng)基，其中配體選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的培養(yǎng)基，其中細胞粘附蛋白是纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽是針對VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的培養(yǎng)基，其中配體是紅細胞生成素。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-15任一項的培養(yǎng)基，其中功能材料是固化的。
17.逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，它包括孵育一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有與有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料的混合物相接觸的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的定位方法，其中具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料是選自纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸和其功能性等價物的功能材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的定位方法，其中具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料是與靶細胞特異結(jié)合的配體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的定位方法，其中配體選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的定位方法，其中細胞粘附蛋白是纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的定位方法，其中纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽是針對VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的定位方法，其中配體是紅細胞生成素。
24.根據(jù)權(quán)利要求17-23任一項的定位方法，其中功能材料是固化的。
25.進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶細胞基因轉(zhuǎn)移的試劑盒，它包括(a)有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料和/或有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的另一種功能材料；(b)孵育逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞的人造材料；和(c)預(yù)先刺激靶細胞的靶細胞生長因子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料是選自纖維結(jié)合素的肝素-II結(jié)合區(qū)、成纖維細胞生長因子、膠原、聚賴氨酸和其功能性等價物的功能材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料是與靶細胞特異結(jié)合的配體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中配體選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中細胞粘附蛋白是纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的試劑盒，其中纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽是針對VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其中配體是紅細胞生成素。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31任一項的試劑盒，其中功能材料是固化的。
33.逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，它包括孵育一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有與有效量的具有來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料相接觸的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的定位方法，其中功能材料是固化的。
35.增加利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率的方法，其中改進包括在有效量的功能材料存在下通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞來進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述功能材料同時具有靶細胞結(jié)合區(qū)和來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸或其功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中靶細胞結(jié)合區(qū)是與靶細胞特異結(jié)合的配體。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中配體選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝產(chǎn)物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中細胞粘附蛋白是纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中纖維結(jié)合素的細胞結(jié)合區(qū)多肽是針對VLA-5和/或VLA-4的結(jié)合區(qū)多肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中配體是紅細胞生成素。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中成纖維細胞生長因子選自序列表中SEQ.ID No.3所表示的成纖維細胞生長因子、該因子的功能性等價物和含有該因子或該因子的功能性等價物的多肽。
42.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.4或5所表示的氨基酸序列的多肽。
43.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中膠原選自具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段、該片段的功能性等價物和含有該片段或其功能性等價物的多肽。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段是含有序列表中SEQ.ID No.6所表示的氨基酸序列的片段。
45.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.7或8所表示的氨基酸序列的多肽。
46.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項的方法，其中功能材料是固化的。
47.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項的方法，其中功能材料不進行固化而使用。
48.用于利用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行靶細胞基因轉(zhuǎn)移的靶細胞培養(yǎng)基，它包括有效量的同一分子上具有靶細胞結(jié)合區(qū)和來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸，或其功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的培養(yǎng)基，其中成纖維細胞生長因子選自序列表中SEQ.ID No.3所表示的成纖維細胞生長因子、該因子的功能性等價物和含有該因子或該因子的功能性等價物的多肽。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的培養(yǎng)基，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.4或5所表示的氨基酸序列的多肽。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的培養(yǎng)基，其中膠原選自具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段、該片段的功能性等價物和含有該片段或該片段的功能性等價物的多肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求48的培養(yǎng)基，其中具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段是含有序列表中SEQ.ID No.6所表示的氨基酸序列的片段。
53.根據(jù)權(quán)利要求48的培養(yǎng)基，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.7或8所表示的氨基酸序列的多肽。
54.根據(jù)權(quán)利要求48-53任一項的培養(yǎng)基，其中功能材料是固化的。
55.逆轉(zhuǎn)錄病毒的定位方法，它包括孵育一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有與有效量的在同一分子上具有靶細胞結(jié)合區(qū)和來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸，或其功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料相接觸的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的定位方法，其中成纖維細胞生長因子選自序列表中SEQ.ID No.3所表示的成纖維細胞生長因子、該因子的功能性等價物和含有該因子或該因子的功能性等價物的多肽。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的定位方法，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.4或5所表示的氨基酸序列的多肽。
58.根據(jù)權(quán)利要求55的定位方法，其中膠原選自具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段、該片段的功能性等價物和含有該片段或該片段的功能性等價物的多肽。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的定位方法，其中具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段是含有序列表中SEQ.ID No.6所表示的氨基酸序列的片段。
60.根據(jù)權(quán)利要求55的定位方法，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.7或8所表示的氨基酸序列的多肽。
61.根據(jù)權(quán)利要求50-60任一項的定位方法，其中功能材料是固化的。
62.進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶細胞基因轉(zhuǎn)移的試劑盒，它包括(a)有效量的同一分子上具有靶細胞結(jié)合區(qū)和來源于成纖維細胞生長因子、膠原或聚賴氨酸，或其功能性等價物的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料；(b)孵育逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞的人造材料；和(c)預(yù)先刺激靶細胞的靶細胞生長因子。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的試劑盒，其中成纖維細胞生長因子選自序列表中SEQ.ID No.3所表示的成纖維細胞生長因子、該因子的功能性等價物和含有該因子或該因子的功能性等價物的多肽。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的試劑盒，其中功能材料是含有序列表鑒定號4或5所表示的氨基酸序列的多肽。
65.根據(jù)權(quán)利要求62的試劑盒，其中膠原選自具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段、該片段的功能性等價物和含有該片段或該片段的功能性等價物的多肽。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的試劑盒，其中具有來源于V型膠原的胰島素結(jié)合區(qū)的片段是含有序列表中SEQ.ID No.6所表示的氨基酸序列的片段。
67.根據(jù)權(quán)利要求62的試劑盒，其中功能材料是含有序列表中SEQ.ID No.7或8所表示的氨基酸序列的多肽。
68.根據(jù)權(quán)利要求62-67任一項的試劑盒，其中功能材料是固化的。
69.根據(jù)權(quán)利要求8或46的方法，其中功能材料固化于珠子上。
70.根據(jù)權(quán)利要求16或54的培養(yǎng)基，其中功能材料固化于珠子上。
71.根據(jù)權(quán)利要求24、34或61的定位方法，其中功能材料固化于珠子上。
72.根據(jù)權(quán)利要求32或68的試劑盒，其中功能材料固化于珠子上。
73.增加利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率的方法，其中改進包括在存在有效量的固化于珠子上的功能材料時用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞，所述功能材料選自基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或其混合物。
74.增加利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細胞基因轉(zhuǎn)移效率的方法，其中改進包括在有效量的未進行固化的功能材料存在時用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞，所述功能材料選自基本純化的纖維結(jié)合素、基本純化的纖維結(jié)合素片段或其混合物。
75.根據(jù)權(quán)利要求1-8、35-47、69、73和74任一項的方法，其中靶細胞是選自下列細胞的細胞干細胞、造血細胞、非粘附的低密度單核細胞、粘附細胞、骨髓細胞、造血干細胞、外周血干細胞、臍帶血細胞、胎兒造血干細胞、胚胎形成的干細胞、胚胎細胞、原始胚細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵細胞、精母細胞、精子、CD34+細胞、C-kit+細胞、多能造血祖細胞、單能造血祖細胞、紅細胞前體細胞、淋巴細胞前體細胞、成熟血細胞、淋巴細胞、B細胞、T細胞、成纖維細胞、成神經(jīng)細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝細胞、成肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞和白血病細胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求1-8、17-24、33-47、55-61、69、71和73-75任一項的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒包括外源基因。
77.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
78.根據(jù)權(quán)利要求76的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是增殖缺陷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
79.根據(jù)權(quán)利要求1-8、35-47、69和73-78任一項的方法所獲得的轉(zhuǎn)化細胞。
80.細胞移植的方法，它包括將根據(jù)權(quán)利要求79所獲得的轉(zhuǎn)化細胞移植入脊椎動物體內(nèi)。
81.序列表中SEQ.ID No.13所表示的多肽。
82.編碼根據(jù)權(quán)利要求81的多肽的基因。
83.序列表中SEQ.ID No.17所表示的根據(jù)權(quán)利要求82的基因，或者在嚴緊條件下能與之雜交并且編碼提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
84.序列表中SEQ.ID No.30所表示的多肽或者其功能性等價物。
85.編碼根據(jù)權(quán)利要求84的多肽的基因。
86.序列表中SEQ.ID No.33所表示的根據(jù)權(quán)利要求85的基因，或者在嚴緊條件下能與之雜交并且編碼提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
87.序列表中SEQ.ID No.5所表示的多肽或者其功能性等價物。
88.編碼根據(jù)權(quán)利要求87的多肽的基因。
89.序列表中SEQ.ID No.26所表示的根據(jù)權(quán)利要求88的基因，或者在嚴緊條件下能與之雜交并且編碼提高逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的多肽的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了增加逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因轉(zhuǎn)入靶細胞效率的方法。在本方法中,在有效量的具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)的功能材料與有效量的具有靶細胞結(jié)合區(qū)的功能材料的混合物,或者有效量的在同一分子中具有這些結(jié)合區(qū)的功能材料存在下,用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞。功能材料可以固化或不固化于珠子上進行使用。本方法可用于,如基因治療。
文檔編號A61K48/00GK1207774SQ96199613
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月13日
發(fā)明者淺田起代藏, 上森隆司, 上野高嗣, 小山信人, 橋野仁一, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社