專(zhuān)利名稱(chēng)：青藤堿在制備治療眼科免疫性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青藤堿的新制藥用途，具體說(shuō)是青藤堿在制備治療眼科免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。特別是青藤堿在制備防治自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎的藥劑中的應(yīng)用，青藤堿在制備防治自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)治療過(guò)程中具有抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎癥浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧化酶活性作用的藥劑當(dāng)中的應(yīng)用，以及青藤堿在制備治療內(nèi)源性葡萄膜炎藥劑中的應(yīng)用。
青藤堿(sinomenine)是從防已科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)R.et Wils的莖和根中提取的生物堿之一，是一種已知的藥用物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青藤堿具有多種藥理作用。概括起來(lái)講，目前已經(jīng)知道的青藤堿的主要藥理作用如下鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抑制中樞、抗心律失常等作用[張士善等，清風(fēng)藤堿甲的藥理作用I.鎮(zhèn)痛、消炎作用及急性毒性實(shí)驗(yàn)，藥學(xué)學(xué)報(bào)1960，8177；凌秀珍，等，藥學(xué)學(xué)報(bào)1962，9(7)393；趙德化，等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1985，20(11)856；張明發(fā)，陜西新醫(yī)藥，1981，10(10)57]；對(duì)機(jī)體非特異性免疫、細(xì)胞的功能有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是對(duì)T淋巴細(xì)胞的功能有較強(qiáng)的抑制作用[彭慧敏，等，青藤堿的免疫抑制作用，中國(guó)藥理學(xué)報(bào)1988，9(4)377-380]；青藤堿又是一種組織胺釋放劑(馮經(jīng)義，等，青藤堿的藥理作用VII。對(duì)胃腸活動(dòng)的影響及其機(jī)制，藥學(xué)學(xué)報(bào)1965；12492)；臨床上用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效顯著(張欣等，陜西中醫(yī)，1980，513；湖南省淑浦縣中醫(yī)院科研組，赤腳醫(yī)生雜志，1975，12612)；有人還對(duì)青藤堿治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行了研究[李嗣英，等，青藤堿對(duì)小鼠免疫功能的影響，中草藥，1992，23(2)81-83]。到目前為止，還沒(méi)有有關(guān)青藤堿治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的報(bào)道。
色素膜炎是常見(jiàn)多發(fā)性眼病，也是世界范圍內(nèi)的主要致盲眼病之一。在我國(guó)，色素膜炎占致盲眼病的第2-6位。因此，尋找有效、毒副作用小的治療藥物的色素膜炎研究的重點(diǎn)之一。近年來(lái)，對(duì)眼的免疫介導(dǎo)的炎癥，治療的注意力集中在免疫調(diào)節(jié)劑上，其出發(fā)點(diǎn)在于找到有效的、特異性的抑制涉及免疫病理的主要環(huán)節(jié)，而對(duì)整體的免疫功能無(wú)甚影響之藥物。對(duì)于自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)而言，理想的治療藥物最好是在自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的免疫應(yīng)答期就起作用，因?yàn)榇藭r(shí)恰恰平行于臨床病人的潛伏期。由于中藥成分毒副作用小，療效持久，較適于具有復(fù)發(fā)特征的色素膜炎的治療。
鑒于這種情況，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察，發(fā)現(xiàn)青藤堿在治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)方面具有很好的療效，并將其制成藥劑。
本發(fā)明的目的是提供青藤堿在制備治療眼科免疫性疾病的藥劑中的應(yīng)用，具體說(shuō)是青藤堿在制備防治自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的藥劑中的應(yīng)用，特別是青藤堿在制備自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)治療過(guò)程中具有抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎癥浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧化酶活性作用的藥劑當(dāng)中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的還在于提供青藤堿在制備治療內(nèi)源性葡萄膜炎藥劑中的應(yīng)用。
經(jīng)過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)研究表明，青藤堿，特別是鹽酸青藤堿，具有良好的治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的作用。特別是青藤堿在治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)過(guò)程中具有抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎癥浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧化酶活性等方面的作用。
經(jīng)過(guò)我們的臨床研究表明，青藤堿及其藥學(xué)上可接受的鹽在治療內(nèi)源性葡萄膜炎方面具有良好的醫(yī)療效果。
青藤堿作為一種治療藥物，已經(jīng)有產(chǎn)品出售，例如，湖南黔陽(yáng)地區(qū)制藥廠生產(chǎn)的青藤堿(sinomenine，SIN)，武漢市中聯(lián)制藥廠生產(chǎn)的鹽酸青藤堿粉劑，等。
因此，青藤堿作為治療眼科免疫性疾病的藥物，按照常規(guī)的制劑方法，可以制備成適合于臨床上使用的任何藥物劑型，例如，片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液、乳劑、混懸劑、注射劑、栓劑、膏劑，等。
除了本發(fā)明所說(shuō)的青藤堿之外，青藤堿的藥物學(xué)上可接受的鹽，例如，鹽酸青藤堿，同樣具有治療眼科免疫性疾病的作用，因此，青藤堿及其藥物上可接受的鹽用于制備治療眼科免疫性疾病的藥物，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在用于制備治療眼科免疫性疾病的藥物時(shí)，可以添加藥物學(xué)上常用的賦性劑，如，粘合劑、崩解劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、增溶劑、防腐劑、調(diào)味劑、溶劑、乳化劑，等。
青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在用于制備治療眼科免疫性疾病的藥物時(shí)，也可以和其他相容的治療藥物一起制成藥劑。
實(shí)施例1鹽酸青藤堿粉劑25000mg，購(gòu)自武漢市中聯(lián)制藥廠，藥用淀粉250mg，酒精適量造粒，干燥，進(jìn)壓片機(jī)壓片，制成1000片，每片片重為275mg，含鹽酸青藤堿25mg。
實(shí)施例2鹽酸青藤堿粉劑20000mg，淀粉180mg，二者充分混合，裝膠囊，制成2000粒膠囊，每粒0.1g重，含鹽酸青藤堿10mg。
本發(fā)明公開(kāi)了青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)常規(guī)的制劑技術(shù)，可以將青藤堿、鹽酸青藤堿等制成各種藥劑，用于治療治療自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)。


圖1是用于說(shuō)明青藤堿以50mg/kg劑量治療Wistar大鼠EAU21天的療效對(duì)照?qǐng)D。其中圖1a是對(duì)照組，圖1b是治療組。
圖2是用于說(shuō)明青藤堿以100mg/kg劑量治療Wistar大鼠EAU21天的療效對(duì)照?qǐng)D，其中圖2a是對(duì)照組，圖2b是治療組。
圖3是用于說(shuō)明青藤堿以150mg/kg劑量治療Wistar大鼠EAU21天的療效對(duì)照?qǐng)D，其中圖3a是對(duì)照組，圖3b是治療組。
實(shí)驗(yàn)例1_青藤堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)防治作用的藥效學(xué)研究。
材料與方法(一)試劑與動(dòng)物完全福氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant)購(gòu)于GIBCO公司，百日咳桿菌疫苗(pertussis)90億個(gè)/ml購(gòu)自北京生物制品研究所，胎牛血清(Fetus Bovin Serum)購(gòu)于GIBCO公司，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。鹽酸青藤堿為本院天然與仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供的Wistar大鼠，雄性，體重約150g，健康無(wú)眼病。
(二)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎大鼠模型的誘發(fā)。兔視網(wǎng)膜S抗原100μg(1mg/ml)，與等體積完全福氏佐劑混合乳化，動(dòng)物雙后底皮下注射，同時(shí)尾靜脈注射百日咳桿菌疫苗0.2ml。
(三)動(dòng)物模型的分組與治療經(jīng)S抗原免疫的動(dòng)物模型，隨機(jī)分為三組，分別用50mg/kg，100mg/kg及150mg/kg的鹽酸青藤堿腹腔注射治療(鹽酸青藤堿溶液用0.9％滅菌氯化鈉溶液新鮮配制，Φ0.25μ微孔濾漠除菌，即刻應(yīng)用)。對(duì)照組用0.9％滅菌氯化鈉腹腔注射。正常對(duì)照組不做任何治療，飼養(yǎng)條件與模型動(dòng)物一致。治療自抗原免疫后第二天開(kāi)始，每日注射一次，至第二十一天末。
S抗原免疫后的動(dòng)物每日用裂隙燈觀察。臨床分度參考Wacker WB等的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修改。
0度(-)正常。
I(+)角膜緣血管明顯的充血，虹膜明顯充血，瞳孔縮小，光反應(yīng)遲緩，瞳孔區(qū)晶體前囊膜表面有細(xì)小點(diǎn)狀滲出物。
II(++)前房或玻璃體內(nèi)有明顯滲出。
III(+++)前房積膿或漿液性視網(wǎng)膜脫離出現(xiàn)。
(四)酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA)測(cè)定抗體的水平在S抗原免疫后第十四天及二十一天分別經(jīng)尾靜脈采血，分離血清測(cè)定S抗原抗體水平。方法采用酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA)，簡(jiǎn)之為將2μg/ml的S抗原抗體溶液300μl加入96孔平底培養(yǎng)板內(nèi)，4℃過(guò)夜。將抗原液吸出后，用0.02MoL/L，pH7.4磷酸緩沖液(含0.05％TWeen-20)沖洗三次。每孔加入稀釋血清樣品300μl(稀釋液為上述緩沖液內(nèi)含0.5％牛血清清蛋白)。37℃保溫1小時(shí)后，吸出樣品，用磷酸緩沖液沖洗三次。加入300μl(HRP-LgG)辣根過(guò)氧化物酶lgG(200倍稀釋)，于37℃保溫1小時(shí)。吸出樣品，用磷酸緩沖液沖洗三次。加入0.04％鄰苯二胺(OPD)溶液0.3ml，室溫30分鐘，8M硫酸0.05ml終止反應(yīng)，495nm測(cè)定OD值。正常Wistar大鼠血清作為正常對(duì)照。
(五)淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化測(cè)定于S抗原免疫后第14及21天，取大鼠眼眶血，分離淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，用S抗原作為刺激物，培養(yǎng)及測(cè)定方法同前。觀察指標(biāo)刺激指數(shù)(SI)。計(jì)算方法
結(jié)果1、青藤堿對(duì)S抗原所誘發(fā)的EAU的防治作用。
三種劑量的青藤堿均不同程度地降低了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)的發(fā)生比率。從表1-1及圖1可以看出，用青藤堿50mg/kg體重治療后，EAU的發(fā)生比率由對(duì)照組的90.91％下降至80.56％，下降了10.35％，其中三度病變者下降了約4.3％，二度病變下降了約4.1％，一度病變下降了約1.9％。但統(tǒng)計(jì)學(xué)上，對(duì)照組與治療組比較，差異尚無(wú)顯著意義。當(dāng)青藤堿治療劑量增加至100mg/kg體重時(shí)，EAU的發(fā)生比率明顯下降，結(jié)果見(jiàn)表1-2及圖2。治療后EAU的發(fā)生比率由對(duì)照組的93.48％下降至68.18％。其中三度病變由對(duì)照組的47.8％下降至20.5％，二度病變由21.7％下降至9.1％。以對(duì)照組與治療組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，P＜0.05。從表1-3及圖3可以看出當(dāng)青藤堿的治療劑量增至150mg/kg體重時(shí)，EAU的發(fā)生比率同樣明顯下降。對(duì)照組的發(fā)生比率是90.48％，治療組為63.64％，減少了26.84％。其中三度病變由對(duì)照組的19.0％下降至治療組的15.9％，二度病變由對(duì)照組的42.9％下降至治療組的4.5％。對(duì)照組與治療組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異，P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青藤堿治療可以明顯降低S抗原誘的EAU發(fā)生比率。
2.青藤堿治療對(duì)EAU大鼠抗S抗原之抗體水平的影響。
用酶聯(lián)免疫吸附法，對(duì)EAU大鼠抗S抗原水平進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1-4。S抗原免疫后，抗S抗原之抗體水平升高，在第14天時(shí)，OD值由正常對(duì)照的0.246增加至0.385，升高了約56.5％，到免疫后第21天時(shí)OD值增加至0.758，升高了大約3倍，與正常對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異，P＜0.05和P＜0.01.經(jīng)青藤堿治療后，EAU大鼠抗原之抗體水平雖然仍高于正常對(duì)照組，但比未治療組有不同程度地下降。其中第14天時(shí)OD值由對(duì)照組的0.385降至治療組0.291，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異，P＞0.05；第21天時(shí)，由對(duì)照組的0.758降至治療組0.614，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，P＜0.05。以上結(jié)果表明，青藤堿治療第三周后對(duì)抗S抗原之抗體的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。
3.青藤堿對(duì)EAU大鼠淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的影響見(jiàn)表1-5。在抗原免疫后第14天，對(duì)照組的刺激指數(shù)為3.94，治療組刺激指數(shù)為2.29，下降約41.9％。第21天后，對(duì)照組的刺激指數(shù)為4.69和3.21。治療組刺激指數(shù)下降約31.6％。兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異，P＜0.05。以上結(jié)果表明青藤堿治療二周后，EAU大鼠淋巴細(xì)胞體外對(duì)S抗原刺激所發(fā)生的增殖反應(yīng)有明顯抑制作用。
表1-1用青藤堿(50mg/kg，治療21天)治療Wistar大鼠EAU的療效觀察例數(shù)發(fā)生比率組別 總數(shù)pn p n對(duì)照組 30 3 3390.91 9.09治療組 29 7 3680.56 19.44總計(jì) 59 106985.51 14.49p陽(yáng)性(+～+++)n陰性(-)表1-2青堿(100mg/kg，療程21天)治療Wistar大鼠EAU的療效觀察例數(shù) 發(fā)生比率組別 總數(shù)pn p n對(duì)照組 43 3 46 93.48 6.52治療組 30 1444 68.11 31.82總計(jì)73 1790 81.11 18.88p陽(yáng)性(+～+++)n陰性(-)表1-3青藤堿(150mg/kg，療程21天)治療Wistar大鼠EAU的療效觀察例數(shù)發(fā)生比率組別 總數(shù)pn p n對(duì)照組 384 42 90.48 9.52治療組 281644 63.64 36.36總計(jì) 662086 76.74 23.26p陽(yáng)性(+～+++)n陰性(-)表1-4以ELISA測(cè)定的青藤堿治療EAU Wistar大鼠血清中抗-S抗原的抗體(100mg/kg)OD 492nm (X±SD)組別14天(n) 21天(n)對(duì)照組 0.385±0.017(4) 0.758±0.013(4)治療組 0.291±0.010(4) 0.614±0.056* (4)正常 0.246±0.027(4)* 對(duì)照組與治療組 p＜0.05
表1-5青藤堿治療的EAU Wistar大鼠中對(duì)S-抗原刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(100mg/kg)S-抗原(20μg/ml)14天 21天組別 cpm(X±SD)SI(X±SD) cpm(X±SD)SI(X±SD)對(duì)照組17232±3310 3.94±1.37 19331±4121 4.69±1.93治療組11817±3767 2.29±1.01* 11936±3673 3.21±1.21*SI刺激指數(shù)每組中的樣本數(shù)是4*對(duì)照組與治療組P＜0.05討論本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果表明，青藤堿能夠有效地抑制S抗原所誘發(fā)的大鼠EAU的發(fā)生。抗原免疫后，隨之給動(dòng)物腹腔注射青藤堿，其EAU的發(fā)生比率及臨床病變的嚴(yán)重程度均明顯下降(100mg/kg及150mg/kg劑量)，而且在治療過(guò)程中，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有體重下降等不良反應(yīng)。以往報(bào)道，用青風(fēng)藤干燥提取物治療變形性退行性骨疾患，每次300mg口服，每日三次，即使持續(xù)用藥百天，也未見(jiàn)患者有副作用，尿、血液及血液生化檢查均無(wú)異常。目前研究較多的治療EAU的藥物如環(huán)孢素A及FK506，大劑量時(shí)雖能夠完全抑制動(dòng)物EAU的發(fā)生，但是其造成的腎臟毒性、體重減輕以及血非蛋白氮升高的毒副作用，是過(guò)渡至臨床應(yīng)用所須解決的棘手問(wèn)題。相比之下，青藤堿為一安全有效的藥物，其這一特點(diǎn)可能更適用臨床上具有慢性復(fù)發(fā)過(guò)程的患者應(yīng)用。
僅就本實(shí)驗(yàn)的觀察尚不能確定青藤堿抑制S抗原誘發(fā)的大鼠EAU，是作用于其免疫反應(yīng)的傳入支(afferent arm)，(即感應(yīng)及反應(yīng)階段)，還是作用于其免疫反應(yīng)的傳出支(afferent arm)(即效應(yīng)階段)。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，青藤堿在抑制EAU發(fā)生的同時(shí)，也抑制了EAU大鼠對(duì)S抗原的體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中對(duì)細(xì)胞免疫的明顯抑制似乎在時(shí)間上先于體液免疫的抑制。目前在尋找治療EAU的免疫調(diào)節(jié)劑的研究中，要求理想的藥物除了毒副作用小以外，還希望能夠特異性抑制細(xì)胞免疫功能，對(duì)整體免疫無(wú)甚影響，而且抑制作用在免疫應(yīng)答期便產(chǎn)生。從這個(gè)觀點(diǎn)來(lái)看，青藤堿的免疫抑制作用的特異性尚不夠滿(mǎn)意。從免疫調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)理論來(lái)看，免疫系統(tǒng)內(nèi)的各個(gè)淋巴細(xì)胞克隆通過(guò)自我識(shí)別，相互刺激或相互制約，構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ)就是淋巴細(xì)胞表面Ig的獨(dú)特型及抗獨(dú)特型結(jié)構(gòu)。該理論說(shuō)明免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫、體液免疫及巨噬細(xì)胞的作用是相互關(guān)聯(lián)的。近年來(lái)的研究表明，抗獨(dú)特型抗體與EAU的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)有關(guān)。由于抗體能夠識(shí)別獨(dú)特型決定簇，因此可與S抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合部位，在一定程度上對(duì)EAU動(dòng)物起保護(hù)作用。另外獨(dú)特型免疫能夠激活調(diào)節(jié)通路，產(chǎn)生抗獨(dú)特型的抑制性T細(xì)胞，從而抑制EAU的病變過(guò)程。由此我們認(rèn)為如何調(diào)節(jié)已失衡的免疫系統(tǒng)，使之恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡，仍是一個(gè)需要探討的問(wèn)題。
討論我們以視網(wǎng)膜S抗原誘發(fā)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)模型，采用腹腔注射給藥的途徑，研究了中藥青藤堿對(duì)EAU的防治作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青藤堿可以明顯抑制S抗原誘發(fā)的大鼠EAU的發(fā)生。對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)無(wú)不良影響。在抑制EAU發(fā)生的同時(shí)，青藤堿對(duì)大鼠的細(xì)胞免疫及體液免疫均有明顯抑制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為青藤堿可有效的抑制EAU的產(chǎn)生。
實(shí)驗(yàn)例2青藤堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎的視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化產(chǎn)物及抗氧化酶類(lèi)的影響。
材料與方法1.試劑與動(dòng)物四乙氧基丙烷(1，1，3，3-tetraethoxy propane TEP)購(gòu)自Fluka公司，鄰聯(lián)二茴香胺(O-dianisidine)購(gòu)自華美公司；還原型谷胱甘肽(GSH glutathione)、還原型輔酶II(NADPH)，谷胱甘肽還原酶(glutathione reduetase)及疊氮鈉(NaN3)均購(gòu)自Sigma公司。余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。鹽酸青藤堿為北醫(yī)大仿生與天然藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室純化提供。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系本院動(dòng)物部的Wistar純系大鼠，雄性，體重約150g，健康無(wú)眼病。動(dòng)物EAU模型的誘發(fā)及給藥途徑同前。大鼠在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，斷頸處死后，立即取出眼球，冰浴下剝脫其整個(gè)視網(wǎng)膜組織，制備組織勻漿或者置-80℃冰箱內(nèi)保存待用。
(一)視網(wǎng)膜組織共軛二烯的測(cè)定參考Buege等方法稍加改良。在顯微鏡下仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織，用冰冷的0.05mol/L磷酸緩沖液pH7.2(含0.5mmol/L的EDTA)，用玻璃勻漿器制備成10％(W/V)的勻漿，備用。將3ml氯仿甲醇(1∶2V/V)混合液內(nèi)加入0.2ml勻漿液，振蕩2分鐘，再加入氯仿甲醇混合液1亳升，振蕩1分鐘。加入1ml酸化水(雙蒸水用0.1N鹽酸調(diào)至pH2.5)，再振蕩1分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，10分鐘；將下層液1ml取出，通入氮?dú)獯蹈?，加?ml乙醇，搖勻后，在233nm處測(cè)OD值，磷酸緩沖液做空白對(duì)照。
(二)丙二醛含量測(cè)定取上述勻漿液0.2ml，加入8.1％SDS溶液0.2ml，20％醋酸溶液1.5ml及0.8％硫代巴比妥酸溶液1.5ml，振蕩搖勻5分鐘后，置于95℃水浴中，1小時(shí)后取出，放入冰浴中終止反應(yīng)；冷卻后離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，加入正丁醇吡啶5ml，振蕩抽提2分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘分層；吸取正丁醇吡啶層，在螢光光度計(jì)上測(cè)定螢光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)(Ex)為515nm，發(fā)射光波長(zhǎng)(Em)為553nm。同時(shí)以四乙氧基丙烷1nmoL/L溶液做為標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算丙二醛含量。Bradford法則定蛋白含量(下同)。
(三)螢光色脂類(lèi)(flurescent chromolipid)含量的測(cè)定取0.2ml勻漿液，加入甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)3.5ml，振蕩5分鐘，再加入2ml酸化水(同前)。振蕩5分鐘；離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘。分層后將甲醇水相層取出。測(cè)定螢光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)(Ex)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)(Em)為430nm。同時(shí)用硫酸奎寧溶液(1μg/ml溶于0.1NH2SO4中)做標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算色脂類(lèi)含量。
(四)脂類(lèi)氫過(guò)氧化物(lipid hydroperoxides)的測(cè)定，參考Peter A.ward等方法。
取0.5ml勻漿液，加入3.5ml甲醇氯仿混合液(1∶2V/V)，振蕩2分鐘，離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘；分層后吸取下層液2ml，通氮?dú)獯蹈扇缓蠹尤氪姿崧确禄旌弦?3∶2/V/V)1.0ml，避光條件下，加入12.8％碘化鉀溶液0.05ml，振蕩5分鐘后，加入0.5％乙酸鎘3.0ml，振蕩1分鐘；離心1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，取上層液，在353nm測(cè)定吸光值。
(五)髓過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定用50mmol/L，pH6.0的磷酸鉀緩沖液(含0.5％溴化十六烷基三甲銨)，在玻璃勻漿液器中，將視網(wǎng)膜組織制成10％(W/V)的勻漿，冰浴下超聲破碎10秒鐘。反復(fù)冰融3次后，再次超聲破碎10秒。離心4000g，4℃，15分鐘。取0.2ml上清液，加入2.8ml磷酸緩沖液(含0.167mg/ml鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸鹽及0.005％過(guò)氧化氫，搖勻后即在460處連續(xù)監(jiān)測(cè)。髓過(guò)氧化物酶活性25℃條件下，每分鐘消耗1μmoL過(guò)氧化氫為1個(gè)活性單位)。
(六)超氧化物歧化酶活性的測(cè)定參考鄧碧玉等的方法。取上述勻漿液，離心4000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，取上清做提取液，取適量的提取液，加入4.5ml 50mmol/L，pH8.30K2HPO4緩沖液，10μ150mmol/L連苯三酚溶液(用10mmol/L HCl新鮮配制)迅速混勻，連續(xù)測(cè)量325nm處吸光度的改變。反應(yīng)以加入連苯三酚溶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)溫度25℃，總反應(yīng)體積4.6ml.1個(gè)單位酶活性定義為。在25℃條件下，每毫升反應(yīng)液每分鐘抑制連苯三酚自氧化率達(dá)50％的酶量。
(七)過(guò)氧化氫分解，過(guò)氧化氫酶能催化過(guò)氧化氫分解，使體系中過(guò)氧化氫含量不斷減少，過(guò)氧化氫在240nm處吸光值隨之逐漸下降，利用此原理可測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活性。樣品分析液中含0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.4，加入一定量過(guò)氧化氫及適量的酶提取液，反應(yīng)體積為1ml，以加入提取液為反就時(shí)，連續(xù)觀察240nm處吸光度的變化。1個(gè)單位酶活性定義為在37℃條件下，每分鐘催化1μmol作用物所需的酶量。
(八)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定參考Paglia等的偶聯(lián)谷胱甘肽還原酶的方法。樣品分析液中含0.05mol/L磷酸緩沖液(含3mmol/L EDTA)，pH7.2，10mmol/L還原型谷胱甘肽，0.3mmol/L還原型輔酶II，1mmol/L疊氮鈉，1單位的谷胱甘肽還原酶及適量酶提取液?；靹蚝?0℃保溫，加入過(guò)氧化特丁烷至終濃度為1mol/L，反應(yīng)總體積1ml。反應(yīng)以加入過(guò)氧化特丁烷開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)定340nm處吸收光度的變化。1個(gè)單位酶活性定義為在30℃條件下，每分鐘氧化1μmol的還原型輔酶II所需的酶量。
結(jié)果一、青藤堿治療EAU大鼠對(duì)其視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化產(chǎn)物水平的影響1.共軛二烯結(jié)果如表2-1所示，經(jīng)S抗原免疫后第九天，視網(wǎng)膜中共軛二烯水平明顯增高，約為正常大鼠的4.2倍，第十四天時(shí)約為正常大鼠的4.8倍，到二十一天時(shí)，共軛二烯水平增至正常大鼠的6.8倍。由此看出，其水平在觀察期內(nèi)，呈上升趨勢(shì)，與正常組比較均有極顯著性差異，P＜0.01；經(jīng)青藤堿治療后，視網(wǎng)膜共軛二烯的水平比對(duì)照組有所下降，第九天時(shí)下降了約8.9％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，P＜0.05，以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，視網(wǎng)膜共軛二烯水平升高，青藤堿治療可以抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜共軛二烯水平的升高。
2.丙二醛從表2-2可以看出，EAU大鼠視網(wǎng)MDA水平變化與共軛二烯相同步，均呈升高趨勢(shì)。第9天時(shí)，為正常組的2.27倍，第14天時(shí)，為正常組的3.28倍，到第21天時(shí)，升高至正常組的3.39倍。與正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有極顯著性差異，P＜0.01。經(jīng)青藤堿治療后，視網(wǎng)膜MDA水平較對(duì)照組不同程度下降。第9天時(shí)，下降了約8.4％，第14天時(shí)，下降了約41.2％，第21天時(shí)，下降了約45.8％。治療組與對(duì)照組比較的結(jié)果，除第9天組外，其它二組均在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異，P均＜0.01，以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，視網(wǎng)膜丙二醛水平升高，青藤堿治療能夠抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜丙二醛水平升高的程度。
3.螢光色脂類(lèi)螢光色脂類(lèi)含量變化如表2-3所示，從中可以看出EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類(lèi)含量的升高，從時(shí)間上滯后于共軛二烯及MDA的變化，在第9天和第14天時(shí)，對(duì)照組雖比正常組有所升高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異，P＜0.05，在EAU的第21天時(shí)，其含量明顯升高，約為正常組的7.3倍，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異，P＜0.01。經(jīng)青藤堿治療后，EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類(lèi)較對(duì)照組，不同程度地下降，分別為12％(第9天)、6.3％(第14天)和5.10％(第21天)。兩者比較的結(jié)果，第9天和第14天組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異，p＞0.05，第21天組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異，p＞0.01。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變中，開(kāi)始2周視網(wǎng)膜螢光色脂類(lèi)無(wú)明顯變化，之后才明顯升高，青藤堿治療可以抑制EAU大鼠視網(wǎng)膜螢光色脂類(lèi)含量的升高。
4、脂類(lèi)氫過(guò)氧化物脂類(lèi)氫過(guò)氧化物水平的改變，不同于前三種產(chǎn)物。從表2-4中可以看出，第9天時(shí)，其水平明顯升高，約為正常的2.49倍，在第14天及第21天時(shí)，分別為正常組的2.03和1.84倍，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異，p＜0.05。經(jīng)青藤堿治療后，各時(shí)間組的脂類(lèi)氫過(guò)氧化物水平有一定程度下降，分別為19.7％(第9天)、25.2％(第14天)和5.3％(第21天)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)顯著性差異，p＞0.05。以上結(jié)果表明在大EAU病變中，視網(wǎng)膜脂類(lèi)氫過(guò)氧化物水平升高，青藤堿治療后EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類(lèi)氫過(guò)氧化物水平升高程度減低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上有無(wú)顯著性差異。
二、青藤堿治療EAU大鼠對(duì)其視網(wǎng)膜相關(guān)酶水平的影響1、髓過(guò)氧化酶從表2-5中可以看出，在免疫后14天內(nèi)，EAU大鼠視網(wǎng)膜髓過(guò)氧化物酶活性不斷增高，其中第二周內(nèi)增高最為顯著，之后又逐漸下降。經(jīng)青藤堿治療后，髓過(guò)氧化物酶活性較對(duì)照組不同程度下降，其中第9天下降了9.7％，第14天下降了36.5％，第21天下降了17.1％。兩者比較的結(jié)果，第14天組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異，p＜0.01，其余兩組均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異的程度，p＞0.05。以上結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過(guò)程中，視網(wǎng)膜髓過(guò)氧化物酶活性升高，第14天時(shí)為高峰，青藤堿治療能夠減少其酶活性的增高程度。
2、超氧化物歧化酶EAU大鼠視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶活性變化見(jiàn)表2-6。在免疫后的第9天，超氧化物歧化酶的活性增高，約為正常的1.29倍。之后下降，在第14天時(shí)降低最顯著，活性只有正常值的46.2％。第21天時(shí)較前略有升高，活性只有正常值的69.5％。經(jīng)青藤堿治療后，在第9天時(shí)，與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。在第14天及第21天時(shí)明顯高于對(duì)照組，兩者比較的結(jié)果在統(tǒng)計(jì)這上有顯著性差異，p均＜0.05。結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過(guò)程中，視網(wǎng)膜超氧化物歧化酶活性先短暫升高，之后下降，青藤堿治療后2周至3周，其酶活性的下降程度得到抑制。
3、過(guò)氧化氫酶結(jié)果見(jiàn)表2-7。從中可以看出，EAU大鼠視網(wǎng)膜過(guò)氧化氫酶活性隨時(shí)間呈漸降趨勢(shì)，與正常組比較，分別下降了22.4％(第9天)、45.6％(第14天)及52.0％(第21天)。各時(shí)間點(diǎn)中對(duì)照組與治療組比較的結(jié)果，后者的過(guò)氧化氫酶活性均高于前者，其中第14天及第21天時(shí)，兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性差異，p＜0.01及p＜0.05。上述結(jié)果表明，在大鼠EAU病變過(guò)程中，視網(wǎng)膜過(guò)氧化氫酶活性下降。青藤堿治療能夠減少其酶活性下降的程度。
4、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶EAU大鼠視網(wǎng)膜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的變化見(jiàn)表2-8。與過(guò)氧化氫酶活性變化不同的是，在觀察早期(第9天及第14天)其活性與正常對(duì)照組比較變化不大，至第21天時(shí)其變化方較明顯，比正常對(duì)照組下降了約為20.9％，但兩者比較的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異尚未達(dá)到顯著的程度。p＞0.05。青藤堿治療組的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的變化趨勢(shì)相似于未治療組。雖然其各時(shí)間點(diǎn)的酶活性稍高于未治療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，p＞0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EAU大鼠視網(wǎng)膜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，在觀察早期無(wú)明顯變化，第三周有所下降。青藤堿治療組與未治療組之間無(wú)顯著差異。
表2-1 青藤堿治療組和未治療組中EAU大鼠視網(wǎng)膜中軛二烯(D)的CD X±SD(nmol/mg蛋白)組別n 未治療組 治療組9天 86.19±0.525.63±0.9514天87.10±0.406.19±1.2521天810.04±3.10 8.06±1.15*正常組(4)1.47±0.36*p＜0.05表2-2青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中丙二醛(MDA)的改變MDA X±SD(nmol/mg蛋白)組別n 未治療組治療組9天 8 0.427±0.0350.391±0.04214天8 0.617±0.1020.361±0.033*21天8 0.738±0.1050.400±0.065*正常組(4)1.88±0.013*p＜0.01表2-3青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中熒光色脂類(lèi)(FL)的變化FL X±SD(μg/mg蛋白)組別n 未治療組 治療組9天 8 0.025±0.007 0.022±0.00614天8 0.016±0.005 0.015±0.00521天8 0.102±0.035 0.050±0.013**正常組(4)0.014±0.004*p＜0.01表2-4青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中脂類(lèi)氫過(guò)氧化物的(LH)變化LH X±SD(nmol/mg蛋白)組別 n未治療組治療組9天 4 0.386±0.1000.310±0.12014天 4 0.314±0.1400.235±0.08521天 4 0.285±0.0840.270±0.064正常組(4)0.155±0.046
表2-5青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性髓過(guò)氧化物酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)組別 n 未治療組治療組9天 60.031±0.0060.028±0.00514天 60.115±0.0150.073±0.007**21天 60.041±0.0040.034±0.004*p＜0.01表2-6青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中SOD活性SOD活性(u/mg蛋白)(X±SD)組別 n 未治療組 治療組9天 79.92±0.829.8±0.7414天 73.56±0.934.83±0.77*21天 75.36±1.696.27 ±1.54*正常組(4)7.71±0.25*p＜0.05表2-7青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中過(guò)氧化氫酶活性過(guò)氧化氫酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)組別 n 未治療組治療組9天 8 0.097±0.0270.109±0.01414天 8 0.068±0.0060.099±0.016*21天 8 0.060±0.0060.076±0.006*正常組(4)0.125±0.016*p＜0.05**p＜0.01表2-8青藤堿治療組和未治療組中EAUwistar大鼠視網(wǎng)膜中GSH過(guò)氧化物酶的活性GSH過(guò)氧化物酶活性(u/mg蛋白)(X±SD)組別 n 未治療組治療組9天 40.315±0.0310.324±0.03014天 40.307±0.0140.314±0.05021天 40.261±0.0410.274±0.039正常組(4)0.330±0.041討論在本實(shí)驗(yàn)中，我們所觀察的共軛二烯、丙二醛、脂類(lèi)氫過(guò)氧化物及螢光色脂類(lèi)，被認(rèn)為是脂類(lèi)過(guò)氧化過(guò)程中不同階段的產(chǎn)物。
在脂類(lèi)過(guò)氧化的初始階段，自由基從不飽和脂肪酸中奪走氫，使之形成共軛二烯(其在233mm處有特征吸收峰)，隨之后者與氧發(fā)生反應(yīng)，形成脂類(lèi)過(guò)氧化物，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)質(zhì)內(nèi)過(guò)氧化物。脂類(lèi)內(nèi)過(guò)氧化物可與多種化合物(包括羥類(lèi))反應(yīng)形成烷基自由基及脂類(lèi)氫過(guò)氧化物，或形成丙醛及丙二醛，后者與磷脂及芳香苯胺的氨基，以及蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合可形成共軛席夫堿，該物質(zhì)具有特殊的螢光另外，氫過(guò)氧化物可反應(yīng)生成丙二醛。
我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在S抗原誘發(fā)的EAU大鼠視網(wǎng)膜中，多種脂類(lèi)過(guò)氧化產(chǎn)物均不同程度的增高，反映出在EAU的病程中，自由基介導(dǎo)的脂類(lèi)過(guò)氧化的過(guò)程加劇，其產(chǎn)生的損傷作用也隨之加重。
對(duì)EAU的病理?yè)p傷機(jī)制之研究發(fā)現(xiàn)，盡管T細(xì)胞是病變的介導(dǎo)因素，但是視網(wǎng)膜的氧化損傷則是多形核白細(xì)胞(PMNs)所致。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞內(nèi)有比其它任何器官組織含量都高的多不飽和脂肪酸(PUFAs)，因而最易受到自由基介導(dǎo)的脂類(lèi)過(guò)氧化的損傷。在EAU的急性期，PMNs聚積至炎癥部位，同時(shí)被激活，隨之發(fā)生以氧消耗增加、戊糖旁路激活及活性氧產(chǎn)物釋放為特征的呼吸爆發(fā)(Respiratory burst)過(guò)程。其中活性氧產(chǎn)物主要是超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基經(jīng)歧化過(guò)程可產(chǎn)生H2O2，隨之通過(guò)Haber-Weiss反應(yīng)及Featon反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的羥自由基(.OH)。這些活性氧在組織內(nèi)增多，可造成脂類(lèi)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)及DNA等的損傷。
近年來(lái)在EAU動(dòng)物模型誘發(fā)時(shí)，普遍應(yīng)用卡介苗及百日咳桿菌或百日咳桿菌毒素作為雙佐劑與抗原一起來(lái)免疫動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙佐劑免疫后的動(dòng)物模型，其PMNs浸潤(rùn)程度增加，視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化損傷加劇[159]。利用化學(xué)反光的方法發(fā)現(xiàn)EAU的高峰期超氧陰離子自由基及羥自由基明顯增高。由此認(rèn)為不論在EAU的初始期，還是持續(xù)期，氧自由基在視網(wǎng)膜氧化損傷中起主要作用，并最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，EAU大鼠視網(wǎng)膜共軛二烯及丙二醛水平的增高，在時(shí)間上基本同步，百螢光色脂類(lèi)水平的增高滯后于前兩者，在第二周后才顯著增高。脂類(lèi)氫過(guò)氧化物水平的增高在第一周末便達(dá)高峰，之后雖明顯高于正常對(duì)照，但卻呈不斷下降趨勢(shì)。
從脂類(lèi)過(guò)氧化的過(guò)程推測(cè)，由于螢光色脂類(lèi)是由丙二醛與磷脂、芳香苯胺及蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)后生成的產(chǎn)物，可能該反應(yīng)的速率相對(duì)遲緩，加之組織中對(duì)醛類(lèi)的活性代謝，均可能成為螢光色脂類(lèi)滯后的原因。
在脂類(lèi)過(guò)氧化的引發(fā)階段所產(chǎn)生脂類(lèi)氫過(guò)氧化物(LHOOH)，可發(fā)生裂解(fragmentation)，產(chǎn)生烷氧基自由基(.LHO)及羥自由基(.OH)。在脂類(lèi)過(guò)氧化的擴(kuò)展階段，二價(jià)鐵離子(Fe++)可催化LHOOH反應(yīng)成烷氧基自由基。由此我們推測(cè)，在EAU病變的某一階段LHOOH的分解大于生成，可能導(dǎo)致其含量在第一周后逐漸下降。
經(jīng)過(guò)青藤堿治療以后，EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成受到不同程度的抑制，同時(shí)病理檢查證實(shí)多形核白細(xì)胞的浸潤(rùn)程度也減輕。從我們前面體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，青藤堿本身就能清除超氧陰離子自由基及羥自由基，并有抗脂類(lèi)過(guò)氧化的作用。以往的實(shí)驗(yàn)業(yè)已證明，細(xì)胞膜的氧化損傷，可能導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，激活磷脂酶，引起游離的花生四烯酸生成增加，后者可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成前列腺素，另外脂類(lèi)氫過(guò)氧化物也能夠?qū)е禄ㄉ南┧岬难趸?，在這兩種反應(yīng)過(guò)程中，均可促成炎性細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生，加重局部炎性浸潤(rùn)程度。因此，我們認(rèn)為青藤堿減輕EAU炎癥反應(yīng)的作用可能與其清除自由基抗脂類(lèi)過(guò)氧化，從而抑制炎性趨化因子產(chǎn)生有關(guān)。
髓過(guò)氧化物酶(MPO)在中性白細(xì)胞的嗜苯胺顆粒中濃度非常高，一直被作為中性白細(xì)胞的標(biāo)志酶。在本實(shí)驗(yàn)的觀察中，EAU大鼠的視網(wǎng)膜MPO活性在免疫后第9天便已升高，第14天時(shí)達(dá)高峰，之后下降，在第21天時(shí)仍高于第9天。這種結(jié)果相似于Goto.H等的實(shí)驗(yàn)觀察。
眾所周知，在正常眼組織中存在著三種抗氧化損傷的保護(hù)機(jī)制一是抗氧化酶系統(tǒng)，能夠防止活性氧產(chǎn)生；二是自由基清除劑；三是氧化損傷的修復(fù)機(jī)制。三種機(jī)制中，首當(dāng)其沖的是抗氧化酶系統(tǒng)，它主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶及過(guò)氧化物酶系。
SOD被認(rèn)為是抗氧酶系的首要成份，它能夠?qū)Ｒ恍缘厍宄蹶庪x子自由基(.O2-)。F過(guò)氧化氫酶不僅可以清除過(guò)氧化氫(H2O2)，而且能夠減少羥自由其的生成，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是一個(gè)含硒酶，可催化谷胱甘肽與過(guò)氧化氫及過(guò)氧化物起反應(yīng)，以消除氧化物的毒性作用。
在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了SOD、過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SOD的活性在動(dòng)物免疫后第9天首先升高，之后隨病程迅速下降，在炎癥的高峰期(第14天)活性降至最低點(diǎn)，以后有所回升。有實(shí)驗(yàn)證明，視網(wǎng)膜SOD主要定位于感光細(xì)胞的內(nèi)段及視網(wǎng)膜SOD的活性遠(yuǎn)大于晶狀體。因此我們推測(cè)，在EAU病變初期，視網(wǎng)膜SOD活性反應(yīng)升高，以消除不斷增多的.O2，當(dāng)O2的產(chǎn)生超過(guò)SOD活性明顯下降。另外有研究發(fā)現(xiàn)，組織中過(guò)多的過(guò)氧化氫產(chǎn)生會(huì)造成Cu-Zn SOD的重要輔基Cu++的還原，從而抑制SOD的活性。
我們對(duì)EAU大鼠視網(wǎng)膜過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性測(cè)定的結(jié)果表明，二者活性變化不同于SOD，在觀察期內(nèi)一直呈下降趨勢(shì)，其過(guò)氧化氫酶活性下降的更為明顯。二者活性的下降，勢(shì)必導(dǎo)致組織中過(guò)多的H2O2及過(guò)氧化物不能有效清除。這不僅可以直接帶來(lái)組織的損傷，而且更重要的是過(guò)多的H2O2可反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的羥自由基，從而活脂類(lèi)過(guò)氧化過(guò)程，加重組織損傷。
利用青藤堿治療以后，反映組織中中性白細(xì)胞浸潤(rùn)程度的髓過(guò)氧化物酶活性的升高得到了抑制，SOD及過(guò)氧化氫酶活性下降程度明顯減輕。眾所周知，正常機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧機(jī)制維持著動(dòng)態(tài)平衡?？寡趸到y(tǒng)中，抗氧化酶系具有反應(yīng)迅速、活性高的特點(diǎn)，因此成為抗氧化機(jī)制中主要的成份。從我們前面對(duì)EAU大鼠視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化產(chǎn)物的觀察結(jié)果可以看出，在EAU過(guò)程中視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化過(guò)程加劇。這種自由基介導(dǎo)的脂類(lèi)過(guò)氧化是一鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，有不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，其損傷作用會(huì)不斷加重，只有通過(guò)抗氧化機(jī)制去打斷反應(yīng)鏈，才能中止或減輕其損傷。因此我們認(rèn)為在EAU中，保護(hù)體內(nèi)抗氧化酶的活性及從體外給予抗氧化劑或抗氧化酶，是減輕EAU脂類(lèi)過(guò)氧化損傷的有效方法。一些作者也利用具有清除自由基及抗脂類(lèi)過(guò)氧化作用的鐵離子絡(luò)合劑及抗氧化酶(如SOD)治療EAU，取得明顯療效。
總而言之，在EAU的病程中視網(wǎng)膜脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)抗氧化酶系的活性下降。青藤堿治療，對(duì)抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎性浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧酶活性是有效的。
實(shí)驗(yàn)例3 鹽酸青藤堿對(duì)內(nèi)源性葡萄膜炎患者的治療作用一、材料和方法(一)一般臨床資料1、觀察對(duì)象；同仁醫(yī)院眼科門(mén)診葡萄膜炎患者，初發(fā)與復(fù)發(fā)者不限，患者隨機(jī)分為三組第一組為單純青藤堿治療，第二組為單純皮質(zhì)激素治療組，第三組為青藤堿加皮質(zhì)激素治療組，患者主要選擇內(nèi)源性前部葡萄膜炎病人，建立病歷檔案。
2、治療方案1)青藤堿組療程三個(gè)月，急性期(發(fā)病后二周內(nèi)，以下同)給予鹽酸青藤堿注射液(商品名正清風(fēng)痛寧注射液，湘衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1985)第023025，批號(hào)960404C)1ml(25mg)結(jié)膜下注射，每日1次連續(xù)3-7天，同時(shí)滴用1％鹽酸青藤堿滴眼液(眼研所內(nèi)部制劑)，每小時(shí)1次，口服鹽酸青藤堿片(商品名正清風(fēng)痛寧片，湘衛(wèi)藥準(zhǔn)字(92)23-092，批號(hào)960404C)；首三日，每次40mg，每日三次，之后80mg/每次，每日三次，癥狀控制后，停結(jié)膜下注射，點(diǎn)眼改為每2-4小時(shí)一次，口服藥不變，持續(xù)二周，點(diǎn)眼改為每日3-4次，口服藥改為40mg/每次，每日三次，至療程完畢。
2)皮質(zhì)激素組療程三個(gè)月，急性期口服強(qiáng)的松20-30mg，每日一次，F(xiàn)D眼液，強(qiáng)地松龍+0.1％地塞米松(眼研所內(nèi)部制劑)，或1％QDSL(醋酸強(qiáng)地松懸液)，每小時(shí)點(diǎn)眼1次，地塞米松2-3mg結(jié)膜下注射，每日一次，連續(xù)3-7天，癥狀控制后強(qiáng)地松改為10mg每日1次，點(diǎn)眼改為每2-3小時(shí)一次，持續(xù)二周，之后，強(qiáng)地松改為5mg，每日1次，點(diǎn)眼每日2-3次，至療程完畢。
3)聯(lián)合治療組治療三個(gè)月，急性期內(nèi)口服強(qiáng)地松20-30mg每日一次，鹽酸青藤堿片80mg/次，每日三次，局部滴用FD和1％鹽酸青藤堿滴眼液，每小時(shí)1次，個(gè)別嚴(yán)重患者給予地塞米松2-3mg結(jié)膜下注射，或鹽酸青藤堿結(jié)膜下注射1ml(25mg)，每日一次，連續(xù)3天，癥狀控制后，強(qiáng)地松減量10mg，每日一次，青藤堿片口服劑量，滴眼減為2-3小時(shí)1次，持續(xù)二周，之后，強(qiáng)地松減為5mg，每日一次，青藤堿片口服劑量不變，滴眼改為3-4次/日，鞏固一個(gè)月后，停強(qiáng)地松口服，滴眼2-3次/日，繼續(xù)口服青藤堿至療程完畢。
3、觀察指標(biāo)1)充血程度(睫狀充血及混合充血)。
2)角膜水腫混濁程度。
3)KP多少。
4)房閃及滲出(包括積膿)程度。
5)虹膜結(jié)節(jié)數(shù)量。
6)瞳孔粘連程度。
7)強(qiáng)玻璃體渾濁程度。
8)視力部分病人檢測(cè)HLA-B27，眼B超檢查及螢光眼底造影檢查。
4、療效標(biāo)準(zhǔn)1)睫狀充血或混合充血消失者為顯效，減少++者為有效，減少+者為好轉(zhuǎn)，無(wú)減輕者為無(wú)變化。
2)Kp消失或全部轉(zhuǎn)為棕色為顯效，減少++者為有效，減少+者為好轉(zhuǎn)，無(wú)減少者為無(wú)變化。
3)房閃或前房纖維性滲出或積膿完全消失或吸收為顯效，減少++者為有效，減少+者為好轉(zhuǎn)，無(wú)減少者為無(wú)變化。
5、各組病人情況1)青藤堿組患者共30例，39只眼。女性14例，20只眼。男性16例，19只眼。年齡9-51歲，平均37歲。其中女性年齡9-51，平均34.0歲。男性20-57歲，平均40.0歲。雙眼患者9例，單眼患者21例。30例患者中前葡萄膜炎的25例(其中Reitr’s綜合癥1例，F(xiàn)uch’s綜合癥1例)，全葡萄膜炎5例，隨訪時(shí)間為2周至一年三個(gè)月，平均4個(gè)月。
2)皮質(zhì)激素組患者共15例，21只眼。女性9例，14只眼。男性6例，7只眼。年齡14-70歲，平均37.7歲。其中女性14-70歲，平均34.8歲。男性20-70歲，平均42.2歲。雙眼患者6例，單眼患者9例。15例患者中前葡萄膜炎的13例，全葡萄膜炎2例。隨訪時(shí)間1周至8周，平均4周。
3)聯(lián)合治療組患者共34例，46只眼。女性20例，28只眼。其中女性19-66歲，平均42.1歲，男性11-69歲，平均34.1歲，雙眼患病者12例，單眼患者22例。34例患者中前葡萄膜炎27例，全葡萄膜炎7例，隨訪時(shí)間2至28周，平均6.7周。
二、結(jié)果(一)總有效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3
表3 青風(fēng)藤治療內(nèi)源性葡萄膜炎患者有效率觀察分組 例數(shù) 顯效例數(shù)有效例數(shù) 好轉(zhuǎn)例數(shù) 無(wú)變化例數(shù) 總有效青藤堿組 3012(40％)5(16.6％) 3(10％) 10(33.6％) 66.6％皮質(zhì)激素組 158(53.3％) 0 3(20％) 4(26.6％) 73.3％聯(lián)合治療組 3428(82.4％) 4(11.8％) 0 2(5.9％)94.2％合計(jì)79注總有效率顯效例數(shù)+有效例數(shù)+好轉(zhuǎn)例數(shù)/各組總例數(shù)三、討論從我們的臨床驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看，青藤堿對(duì)于內(nèi)源性的葡萄膜炎，尤其是前部葡萄膜炎，確實(shí)有治療作用。單獨(dú)利用該藥總有效率在66.6％。而且該藥的局部應(yīng)用安全性大。在我們的觀察中滴用1％青藤堿眼液達(dá)一年之久的患者，其角膜透明性，晶體透明性未發(fā)現(xiàn)異常改變。在我們觀察的病例中有4例患者有不同眼別發(fā)病時(shí)，分別給予青藤堿和激素治療都達(dá)到顯效的結(jié)果，其中有一位女性患者同時(shí)雙眼發(fā)病，右眼給予強(qiáng)地松在結(jié)膜下注射，F(xiàn)D眼液滴眼；左眼給予青藤堿結(jié)膜下注射，青藤堿滴眼，均達(dá)到顯效的結(jié)果。
青藤堿局部治療沒(méi)有任何升高眼壓的作用，對(duì)青藤堿組患者眼壓的追測(cè)均未發(fā)現(xiàn)異常，即便個(gè)別患者由于瞳孔閉鎖發(fā)生繼發(fā)性青光眼，青藤堿的應(yīng)用也不升高其眼壓，這一點(diǎn)對(duì)繼發(fā)性青光眼的葡萄膜炎患者意義可能較大，這些患者大多病程較長(zhǎng)，屬慢性過(guò)程，需要較長(zhǎng)期用藥，同時(shí)又應(yīng)避免激發(fā)眼壓升高，這樣有時(shí)便限制了激素的應(yīng)用，而利用青藤堿治療，或聯(lián)合用藥(減少激素用量)便顯示良好的適應(yīng)癥。在聯(lián)合用藥組中，有一名患者，雙眼全葡萄膜炎二十余年，激素服用了二十余年，每次試圖停用激素均導(dǎo)致雙眼炎癥復(fù)發(fā)，自服用青藤堿片后，將激素撤去了，至今已數(shù)月，雙眼炎癥沒(méi)有復(fù)發(fā)，經(jīng)服青藤堿片后患者感皮膚瘙癢和發(fā)現(xiàn)背部四肢小丘疹，但未能停用，激素仍然堅(jiān)持服用。
在青藤堿組，有40％的患者既往有風(fēng)濕性或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎史(包括強(qiáng)直性柱炎)，在應(yīng)用青藤堿治療后，除眼部炎癥控制外關(guān)節(jié)炎癥狀亦減輕。因此，我們以為對(duì)有較明確的風(fēng)濕與類(lèi)風(fēng)濕史的葡萄膜炎患者，應(yīng)用青藤堿治療(單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合其他藥物應(yīng)用)，在控制全身及局部癥狀方面有很大益處。
青藤堿治療組中無(wú)變化的有10例，占33.3％。其中慢性肉芽腫型葡萄膜炎占7例，均有激素治療史，因此我們認(rèn)為對(duì)于慢性肉芽腫型葡萄膜炎應(yīng)采用青藤堿聯(lián)合其它藥物應(yīng)用。
青藤堿聯(lián)合激素治療比較單純應(yīng)用青藤堿或激素者，對(duì)于控制葡萄膜炎的炎癥，有更好的效果?？傆行蔬_(dá)94.2％。其中確切的機(jī)制尚不清楚，但其協(xié)同作用已在初步觀察中顯現(xiàn)出來(lái)。而且在34例聯(lián)合治療的患者中，有25例只在青藤堿治療方案上加了FD眼液，就可以達(dá)到良好的效果而無(wú)需激素局部注射，由于內(nèi)源性葡萄膜炎病因復(fù)雜。而且隨著病程其病變機(jī)理亦不盡相同，故聯(lián)合用藥是治療內(nèi)源性葡萄膜炎的方向所在。
權(quán)利要求
1.青藤堿及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療眼科免疫性疾病的藥劑中的應(yīng)用。
2.青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備防治自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的青藤堿的藥物學(xué)上可接受的鹽是鹽酸青藤堿。
4.青藤堿在制備防治自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎的藥物中的應(yīng)用。
5.青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎治療過(guò)程中具有抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎癥浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧化酶活性作用的藥劑當(dāng)中的應(yīng)用。
6.青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備治療內(nèi)源性葡萄膜炎的藥劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于青藤堿及其藥物學(xué)上可接受鹽的新用途,具體說(shuō)是青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備防治眼科免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。特別是青藤堿及其藥物學(xué)上可接受的鹽在制備自身免疫性視網(wǎng)膜色素膜炎(EAU)治療過(guò)程中具有抑制脂類(lèi)過(guò)氧化、減少炎癥浸潤(rùn)、保護(hù)抗氧化酶活性作用的藥劑當(dāng)中的應(yīng)用,以及在制備治療內(nèi)源性葡萄膜炎的藥劑中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P27/00GK1199623SQ97104310
公開(kāi)日1998年11月25日 申請(qǐng)日期1997年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月19日
發(fā)明者孫旭光, 仇萍, 黃宇明, 吳飛馳, 詹晶明, 陳志強(qiáng) 申請(qǐng)人:白云山正清制藥股份有限公司