專利名稱：新的三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其在抗乙肝病毒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)，尤指一種能于二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA的寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其在抗乙型肝炎病毒中的應(yīng)用。
80年代，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的均聚嘌呤或均聚嘧啶序列雙鏈DNA可以反折過(guò)來(lái)，其中一條鏈與5’上游的均聚嘌呤或均聚嘧啶的雙鏈DNA形成三鏈DNA，而與之配對(duì)的另一條鏈則成為單鏈，而且三鏈DNA還參與了基因表達(dá)的調(diào)控(Lyamichev VI,Mirkin SM,et al.J Biomol St ruct Dyn,1986,3:667-9.Larsen A,Weintraub H,et al.Cell,1982,29:609-22.HtunH,Dahlberg JE.Science,1989,243:1571-76.)。在體外也可以通過(guò)寡核苷酸與特異的靶DNA識(shí)別，形成三鏈DNA，一條均聚嘌呤或均聚嘧啶的寡核苷酸鏈能夠以堿基配對(duì)的方式特異地識(shí)別相應(yīng)的均聚嘌呤/均聚嘧啶的雙鏈DNA序列，以Hoogsteen鍵或反Hoogsteen鍵與雙鏈DNA中的嘌呤鏈結(jié)合形成穩(wěn)定的三鏈DNA結(jié)構(gòu)。與雙鏈DNA形成三鏈DNA的寡核苷酸片段則稱為三鏈形成寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide,TFO),三鏈DNA的形成可以阻抑蛋白因子與DNA結(jié)合。用末端帶有EDTA-Fe2+的TFO與特異的靶序列識(shí)別形成三鏈DNA還能在三鏈DNA形成的位置特異地切斷靶雙鏈DNA(Moser HE,Dervan PB.Science 1987,2 38:645-50.)。因此通過(guò)三鏈DNA的形成，有望在DNA水平抑制基因表達(dá)，即所謂的抗基因策略(Antigene Strategy)。它與反義技術(shù)及核酶相比，有其優(yōu)越性。三鏈形成寡核苷酸是以雙鏈DNA的特定序列為結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)與特定的雙鏈DNA序列形成三鏈DNA或在三鏈DNA的位置上切斷靶DNA，抑制基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。反義核酸及核酶均是以mRNA為作用靶，通過(guò)與mRNA結(jié)合以阻斷翻譯或促進(jìn)mRNA降解的方式來(lái)達(dá)到阻斷基因表達(dá)的目的。在細(xì)胞中，一個(gè)考貝DNA可以轉(zhuǎn)錄出多個(gè)mRNA考貝。因此，在DNA水平阻斷基因的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄方面可能更為有效。根據(jù)三鏈DNA形成的原理及配對(duì)規(guī)則，在某一特定基因的啟動(dòng)子中設(shè)計(jì)三鏈形成寡核苷酸片段與靶基因的特定序列形成三鏈DNA，阻礙DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合或在某一特定部位設(shè)計(jì)三鏈形成寡核苷酸片段與其特定序列形成三鏈DNA，阻礙復(fù)制、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體通過(guò)，可以抑制基因的復(fù)制或表達(dá)。1988年Cooney等證實(shí)在人c-myc基因起始位點(diǎn)形成的分子間三鏈結(jié)構(gòu)可抑制c-myc的轉(zhuǎn)錄(Cooney,M.Science,1988,241:450-9)。然而，至今關(guān)于利用TFO抑制基因表達(dá)實(shí)際應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)還很少。有一項(xiàng)美國(guó)專利報(bào)道用TFO抑制雄激素受體基因的表達(dá)(US 5556956,1996年)。其主要原因是在基因的啟動(dòng)子或在某些特定區(qū)域中很少有足夠長(zhǎng)的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列。較短的TFO與較短的雙鏈靶DNA形成的三鏈DNA穩(wěn)定性和專一性不高，因而其抑制作用也不強(qiáng)，限制了抗基因策略的實(shí)際應(yīng)用。對(duì)于擴(kuò)大三鏈DNA形成的靶DNA范圍僅作了一些理論的研究，并無(wú)實(shí)際應(yīng)用。Horne和Dervan等設(shè)計(jì)了一種交替式的三鏈DNA，即兩段均聚嘌呤序列位于雙鏈DNA的兩條鏈上，TFO的一部分與雙鏈中的一條嘌呤鏈配對(duì)，而TFO的另一部分則與雙鏈中的另一條嘌呤鏈配對(duì)(Horne,D.A.,Dervan,P.B.J.Am.Chem.Soc.1990,112,2435-37.)。對(duì)于三鏈DNA形成的穩(wěn)定性，也有人進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)雖然含有單個(gè)錯(cuò)配堿基仍然可以形成三鏈DNA，但其穩(wěn)定性明顯降低。因此，研究新的TFO結(jié)構(gòu)并用于抑制有害基因的表達(dá)仍是要解決的問(wèn)題。也有人研究了TFO的化學(xué)修飾來(lái)提高TFO的穩(wěn)定性及抑制作用，包括硫磷酸修飾(Tu,et al.J.Biol.Chem.1995,270:28402-7),3’接一個(gè)氨基酸(McShan,W.M.et al.J.Biol.Chem.1992,267:5712-21),3’接膽固醇(Ing,N.H.et al.NucleicAcids Res.1993,21:2789-96.)。雖然一些化學(xué)修飾可以提高TFO的穩(wěn)定性及抑制作用，但TFO的長(zhǎng)度仍然是決定TFO的穩(wěn)定性的最主要的因素。
HBV是一種嗜肝性DNA病毒，其感染可引起急性或慢性肝炎。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者中，有80％是HBV感染者，受HBV慢性感染的人群患HCC的相對(duì)危險(xiǎn)性至少增加100倍。我國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，有大約8-10％的人群(約1億人口)為乙型肝炎(病毒)表面抗原(Hepatitis B(virus)Surface Antigen,HBsAg)的陽(yáng)性者。由HBV感染引起的乙型肝炎與其相關(guān)的HCC是世界性的主要健康問(wèn)題之一。但是，到目前為止，臨床上仍缺乏有效的治療方法。因此，發(fā)展抗HBV的三鏈形成寡核苷酸作為研究新的治療方法也是當(dāng)今的科研方向。但在HBV基因中沒有足夠長(zhǎng)的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列可以作為三鏈形成寡核苷酸的作用靶，所以尋找一種新的三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)是一個(gè)很有意義的科研工作。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種能與二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA的寡核苷酸結(jié)構(gòu)，以及該三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)用于抗乙型肝炎病毒，設(shè)計(jì)一種抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)及乙型肝炎病毒的繁殖的三鏈形成寡核苷酸，它包括二類分別能與HBV的DR區(qū)域及HBV adr亞型前S基因的二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合的三鏈形成寡核苷酸。它們還能通過(guò)3’單磷酸化修飾以提高穩(wěn)定性。該三鏈形成寡核苷酸可應(yīng)用于作為治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明提供一種能與二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA的寡核苷酸結(jié)構(gòu)。根據(jù)三鏈DNA形成的原理及HBV基因序列，針對(duì)HBV的DR區(qū)域及HBV adr亞型的前S基因上的二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，本發(fā)明設(shè)計(jì)了相應(yīng)的三鏈形成寡核苷酸，并在DNA合成儀上合成如下列所示相應(yīng)的三鏈形成寡核苷酸及3’單磷酸化修飾的三鏈形成寡核苷酸(參見

圖1和圖2)B1 5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17ntB2 5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17ntB3 5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17ntB4 5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17ntB5 5’AAG GAG GAG GA 3’ 11ntB11 5’AGA GGA GGG GG 3’11ntB12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21ntB13 5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3’21ntB14 5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3’21ntB15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21ntB1(3’P) 5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17ntB2(3’P) 5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17ntB3(3’P) 5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17nt
B4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17ntB5(3’P) 5’AAG GAG GAG GAp 3’11ntB11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11ntB12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21ntB13(3’P) 5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGGp 3’21ntB14(3’P) 5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGGp 3’21ntB15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt為了研究三鏈形成寡核苷酸與HBV的DR區(qū)域及HBV adr亞型前S基因的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合的能力，本發(fā)明用凝膠電泳條帶移位(Band mobility shift assays)的方法測(cè)定了三鏈DNA形成的熱力學(xué)參數(shù)。TFO B1-B5都能與HBV的前S基因的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合。其中TFO B1-B4強(qiáng)于B5,B4的作用最強(qiáng)。TFO B11,B1 2及B15都能與HBV的DR區(qū)域的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合，其中TFO B15和B12強(qiáng)于B11,B15的作用最強(qiáng)。B5和B11分別只與HBV adr亞型的前S基因及DR區(qū)域的一段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合，TFO B1-B4強(qiáng)于B5說(shuō)明TFO B1-B4能與HBV的前S基因的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合。TFOB15和B12強(qiáng)于B11，說(shuō)明TFO B15和B12能與HBV的DR區(qū)域的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合。這些結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的三鏈形成寡核苷酸可以與兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合形成三鏈DNA，而且，結(jié)合強(qiáng)的TFO中堿基也是以Hoogsteen鍵或反Hoogsteen鍵原則與靶雙鏈DNA配對(duì)的。本發(fā)明的新的三鏈形成寡核苷酸與HBV的DR區(qū)域及HBV adr亞型前S基因的兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合時(shí)靶雙鏈DNA結(jié)構(gòu)有從嘌呤到嘧啶到嘌呤的轉(zhuǎn)折。這一轉(zhuǎn)折雖然使三鏈DNA的穩(wěn)定性有所降低，但延長(zhǎng)了的三鏈形成寡核苷酸最終與靶雙鏈DNA結(jié)合的穩(wěn)定性及專一性都大大得到了提高，因而其抑制作用也更強(qiáng)。
為了研究三鏈形成寡核苷酸對(duì)于HBV基因表達(dá)及病毒自身繁殖的抑制作用，尋找可用于治療乙型肝炎的三鏈形成寡核苷酸，本發(fā)明采用含HBV基因的質(zhì)粒(p1.2Ⅱ)轉(zhuǎn)染到肝來(lái)源的HepG2細(xì)胞作為研究的模型來(lái)研究三鏈形成寡核苷酸的作用。質(zhì)粒(p1.2Ⅱ)含有1.2倍長(zhǎng)度的HBV(adr亞型)基因克隆，包括全長(zhǎng)的HBV基因組及1403～1983的重疊區(qū)，它能表達(dá)所有的HBV mRNA。p1.2Ⅱ轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中之后，可以產(chǎn)生完整的有感染活力的病毒顆粒。用已有的測(cè)定試劑盒測(cè)定HBsAg和HBeAg的表達(dá)量，觀察三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用，測(cè)定細(xì)胞中HBV病毒DNA的考貝數(shù)，觀察三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBV病毒繁殖的抑制作用?？紤]到血清中及細(xì)胞內(nèi)有較高活性的核酸水解酶，其中主要為3’→5’核酸外切酶，它要求3’端為OH基團(tuán)的核酸為底物。根據(jù)發(fā)明人以前的研究成果，采取了寡核苷酸3’單磷酸化修飾，當(dāng)寡核苷酸3’的OH基團(tuán)被磷酸化后，不能作為3’→5’核酸外切酶的底物，延長(zhǎng)了其在血清中及細(xì)胞內(nèi)的滯留時(shí)間，因此能夠更有效地與目的基因相結(jié)合。本發(fā)明選擇與靶序列結(jié)合最強(qiáng)的TFO B4(3’P)和TFO B15(3’P)為代表研究三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBV基因表達(dá)的抑制作用和對(duì)HBV病毒繁殖的抑制作用。研究結(jié)果證明本發(fā)明合成的三鏈形成寡核苷酸能夠抑制HBV基因的表達(dá)以及HBV病毒DNA的復(fù)制，從而抑制乙型肝炎病毒的繁殖，因此，可用作治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1．提供了一種能與兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA的寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其設(shè)計(jì)方法，可以提高形成三鏈DNA的穩(wěn)定性和專一性，擴(kuò)展了三鏈形成寡核苷酸的抗基因策略的應(yīng)用范圍。
2．提供了一種三鏈形成寡核苷酸，它能抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)及乙型肝炎病毒的繁殖。這是一種直接抑制乙型肝炎病毒基因的表達(dá)及病毒的繁殖的物質(zhì)，為乙型肝炎的治療提供了新的方法。
3．用三鏈形成寡核苷酸抑制HBV基因的表達(dá)及病毒的繁殖具有專一性高的特點(diǎn)，而不會(huì)對(duì)人體細(xì)胞本身產(chǎn)生影響。
4．本發(fā)明提供的三鏈形成寡核苷酸還可以通過(guò)在3’末端加上一個(gè)磷酸提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。使它們的抑制作用更加明顯。由于本發(fā)明三鏈形成寡核苷酸不含非天然的修飾成分，其降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
圖1 HBV前S基因的21bp雙鏈序列及設(shè)計(jì)的三鏈形成寡核苷酸序列。
序列上的數(shù)字表示有下劃線的堿基在HBV基因中的位置，粗斜體堿基為基因中插入的不同性質(zhì)配對(duì)及在TFO中相應(yīng)位置插入的堿基。
圖2 HBV DR區(qū)域的25bp雙鏈序列及設(shè)計(jì)的三鏈形成寡核苷酸序列。
序列上的數(shù)字表示有下劃線的堿基在HBV基因中的位置，粗斜體堿基為基因中插入的不同性質(zhì)配對(duì)及在TFO中相應(yīng)位置插入的堿基。
圖3 HBV前S基因的21bp雙鏈序列與TFO B1-B6形成三鏈DNA的凝膠電泳分析。A,B,C,D,E,F,G分別是TFOB1-B6和對(duì)照寡核苷酸(NC)與雙鏈DNA結(jié)合的結(jié)果。圖片旁的S,D,T分別表示單鏈、雙鏈和三鏈DNA的位置。圖片底部的S為不加TFO的單鏈DNA對(duì)照；D為不加TFO的雙鏈DNA對(duì)照；1-7中所用的TFO的濃度分別為1,2,3,4,5,6,7μmol/L。
圖4HBV前S基因的21bp雙鏈序列與TFO B1-B6形成三鏈DNA時(shí)三鏈DNA與雙鏈DNA之比f(wàn)/(b-f)與TFO濃度a的關(guān)系曲線。
圖5 HBV DR區(qū)域的25bp雙鏈序列與TFO B11-B15形成三鏈DNA的凝膠電泳分析。A,B,C,D,E分別是TFO B11-B15與雙鏈DNA結(jié)合的結(jié)果。其余同圖3。
圖6 HBV DR區(qū)域的25bp雙鏈序列與TFO B11-B15形成三鏈DNA時(shí)三鏈DNA與雙鏈DNA之比f(wàn)/(b-f)與TFO濃度a的關(guān)系曲線。
圖7三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBsAg表達(dá)抑制的時(shí)間曲線。
三鏈形成寡核苷酸或?qū)φ彰撗豕押塑账釢舛葹?0μmol/L。不加寡核苷酸(×)，加B4(3’P)(◆)，加B15(3’P)(■)，對(duì)照脫氧寡核苷酸(▲)。
圖8三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBeAg表達(dá)抑制的時(shí)間曲線。
三鏈形成寡核苷酸或?qū)φ彰撗豕押塑账釢舛葹?0μmol/L。不加寡核苷酸(×)，加B4(3’P)(◆)，加B15(3’P)(■)，對(duì)照脫氧寡核苷酸(▲)。
圖9 TFO B15(3’P)對(duì)預(yù)轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中HBsAg表達(dá)的抑制作用。三鏈形成寡核苷酸B15的濃度為10μmol/L。
圖10 TFO B15(3’P)對(duì)預(yù)轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中HBeAg表達(dá)的抑制作用。三鏈形成寡核苷酸B15的濃度為10μmol/L。
圖11點(diǎn)雜交檢測(cè)HepG2細(xì)胞中HBV DNA。
1不加寡核苷酸；2加TFO B4(3’P)；3加TFO B15(3’P)；4加對(duì)照寡核苷酸實(shí)施例1三鏈形成寡核苷酸的設(shè)計(jì)、合成及純化1-1三鏈形成寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)在乙型肝炎病毒adr亞型的3127-3143核苷酸的位置有一段17bp的序列，除其中第12位插入一個(gè)胞嘧啶外，均為嘌呤(如圖1所示)。根據(jù)三鏈DNA的配對(duì)規(guī)則，合成了兩條互補(bǔ)的乙肝病毒前S基因片段(片段Ⅰ，片段Ⅱ)、一系列三鏈形成寡核苷酸片段(TFO B1-B6)及對(duì)照寡核苷酸(NC)，其中TFO B1-B4在前S基因片段胞嘧啶的相應(yīng)位置分別采用胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鳥嘌呤，以確定哪個(gè)堿基能較好地與G-C配對(duì)，形成較穩(wěn)定的三堿基體，從而使其形成的三鏈DNA具有較高的穩(wěn)定性；TFO B6與TFO B1-B45’端的11個(gè)核苷酸相同，都是嘌呤核苷酸，可以與前S基因片段形成三鏈DNA，而TFO B6 3’端的8個(gè)核苷酸均為T，不能與前S基因片段形成三鏈DNA。通過(guò)比較TFO B1-B4及TFO B6與前S基因片段形成三鏈DNA的穩(wěn)定性，可以了解TFO B1-B4的3’端能否與前S基因片段形成三鏈DNA，從而知道在均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的雙鏈DNA中，如果有一個(gè)不同性質(zhì)的堿基插入時(shí)，三鏈DNA形成是否中斷，NC為對(duì)照寡核苷酸。
在乙型肝炎病毒基因組的DR區(qū)域，1734-1754位核苷酸的位置有一段21bp的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，其5’端11bp和3’端8bp為均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，在12、13位插入相反的兩個(gè)AT對(duì)(如圖2所示)。根據(jù)三鏈DNA的配對(duì)規(guī)則，合成了兩條互補(bǔ)的乙肝病毒Dr基因片段(片段Ⅲ,片段Ⅳ)及一系列三鏈形成寡核苷酸(TFO)片段B11-B15,TFO B12-B15在DR區(qū)域片段中TT的相應(yīng)位置分別采用AA,GG,CC或TT，以確定哪個(gè)堿基能較好地與兩個(gè)AT配對(duì)，形成較穩(wěn)定的三堿基體，從而使其形成的三鏈DNA具有較高的穩(wěn)定性；通過(guò)比較TFO B12-B15及B11與DR區(qū)域片段形成三鏈DNA的穩(wěn)定性，可以了解TFO B12-B153’端的8個(gè)堿基能否與DR區(qū)域片段形成三鏈DNA，從而知道在均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的雙鏈DNA中，如果有兩個(gè)不同性質(zhì)的堿基插入時(shí)，其兩側(cè)的堿基是否能同時(shí)與靶DNA形成三鏈DNA。
1-2三鏈形成寡核苷酸的末端修飾對(duì)上述TFO B1-B5及TFO B11-B15寡核苷酸采取3’單磷酸化修飾。
1-3三鏈形成寡核苷酸的合成及純化寡核苷酸在PE公司生產(chǎn)的DNA合成儀(ABI391-EP)上，用亞磷酸酰胺三酯法合成，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
1-3-1 3’-OH寡核苷酸的合成用0.2μmole固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，在ABI 391EP DNA合成儀上用0.2μmole合成順序合成。
1-3-2 3’單磷酸化修飾寡核苷酸的合成使用0.2μmole 3＇磷酸固相柱(3＇-phosphate CPG Glen Research公司產(chǎn)品，全稱2-[2-(4,4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰長(zhǎng)鏈烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsul-fomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG)，用相同的合成順序合成。
1-3-3本實(shí)驗(yàn)所合成的脫氧寡核苷酸包括片段Ⅰ 5’CA TTC CTC CTC CTG CCT CC AC 3’21nt片段Ⅱ 3’GT AAG GAG GAG GAC GGA GG TG 5’21ntB1 5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17ntB2 5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17ntB3 5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17ntB4 5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17ntB5 5’AAG GAG GAG GA 3’11ntB6 5’AAG GAG GAG GAT TTT TTT T 3’ 19ntB4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’ 17nt對(duì)照 5’GGG ATG CAG TGG TGG AAT TCC ACA 3’24nt片段Ⅲ 5’AA TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCC AG 3’25nt片段Ⅳ 3’TT AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG TC 5’25ntB11 5’AGA GGA GGG GG 3’ 11ntB12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21ntB13 5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3’21ntB14 5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3’21ntB15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt
B15(3’P) 5’ AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt實(shí)施例2三鏈形成寡核苷酸與靶雙鏈DNA結(jié)合2-1方法2-1-l寡核苷酸片段的標(biāo)記及32P標(biāo)記的雙鏈片段的純化取50pmol寡核苷酸片段Ⅰ(或Ⅲ)，加5μCi32p-ATP,2uT4多聚核苷酸激酶，1μl 10×反應(yīng)緩沖液，加雙蒸水至10μl,37℃保溫1小時(shí)，取4μl于冰浴中，另外6μl加入50pmol寡核苷酸片段Ⅱ(或Ⅳ)，100℃保溫5分鐘，緩慢退火，然后走15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，做好同位素標(biāo)記，放射自顯影，切割含寡核苷酸片段Ⅰ及Ⅱ(或Ⅲ及Ⅳ)雙鏈DNA條帶，壓碎凝膠，加500μl蒸餾水，在旋轉(zhuǎn)儀上浸泡過(guò)夜，過(guò)玻璃棉小柱，去除凝膠碎片，濾過(guò)液測(cè)定同位素放射性強(qiáng)度并加未標(biāo)記的雙鏈DNA片段至1pmol/μl,-20℃保存待用。
2-1-2三鏈DNA形成及凝膠電泳阻滯試驗(yàn)在10μl反應(yīng)體系中含0.1pmol/L32P標(biāo)記的雙鏈DNA片段，10mmol/LTris.HCl pH7.5,0.5mmol/L Spermidinc,10mmol/L MgCl2，分別加入0、1、2、3、4、5、6、7μmol/L不同的TFO，在37℃水浴中保溫4小時(shí)，冰浴10分鐘，走15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃、電壓100伏特，電泳4小時(shí)，然后放射自顯影。密度掃描計(jì)上分析各條帶的黑度。在研究外界條件對(duì)三鏈DNA形成的影響時(shí)改變?yōu)橄鄳?yīng)的條件，電泳條件相同。
2-1-3三鏈DNA形成的結(jié)合常數(shù)(Ka)、解離常數(shù)(Kd)及自由能變化(△G)的計(jì)算寡核苷酸與雙鏈DNA結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)式為TFO+雙鏈DNA=三鏈DNA，假設(shè)三鏈形成寡核苷酸與雙鏈DNA的起始濃度分別為a和b，平衡后三鏈DNA的濃度為f，那么，平衡后三鏈形成寡核苷酸及雙鏈DNA的濃度分別為(a-f)及(b-f)。那么，Ka=f(a-f)(b-f)]]>，當(dāng)a＞＞f時(shí)，a-f≈a，那么，Ka=fa(b-f),]]>(fb-f)=Ka×a,]]>以
對(duì)a作圖，可得一直線，其斜率為Ka。Kd=1Ka,]]>△G=-RTlnKa,R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，可計(jì)算三鏈DNA形成的自由能變化△G。
2-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析2-2-1 TFO與乙肝病毒前s基因兩段相近均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的作用2-2-1-1 TFO與標(biāo)記的乙肝病毒前S雙鏈基因片段形成三鏈DNA及凝膠阻滯分析寡核苷酸片段Ⅰ經(jīng)5’末端32P標(biāo)記后部分與片段Ⅱ復(fù)性，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化得到32P標(biāo)記的寡核苷酸單鏈及32P標(biāo)記的乙肝病毒前S基因雙鏈片段。用合成的寡核苷酸與32P標(biāo)記的乙肝病毒前S基因雙鏈片段進(jìn)行凝膠阻滯分析，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸除對(duì)照寡核苷酸NC之外，其它的寡核苷酸B1、B2、B3、B4、B5、B6均可與乙肝病毒基因片段形成三鏈DNA，如圖3所示。
2-2-1-2 TFO與乙肝病毒前S基因形成三鏈DNA的平衡常數(shù)、解離常數(shù)及自由能變化通過(guò)對(duì)放射自顯影結(jié)果進(jìn)行黑度掃描，計(jì)算出三鏈DNA形成反應(yīng)平街之后雙鏈DNA及三鏈DNA的濃度[b-f]及[f]，然后，以
對(duì)a作圖，可得一直線，其斜率為Ka(如圖4所示)。通過(guò)Ka值計(jì)算Kd及△G，Kd=1Ka]]>，△G=-RTlnKa。如表1所示。
表1．TFO與HBV前S基因片段形成三鏈DNA的熱力學(xué)參數(shù)
從結(jié)果可見，在與乙型肝炎病毒的前S基因從3127至3143位的17bp基因片段作用時(shí)，TFO B1-B4的5’端11個(gè)核苷酸及3’端5個(gè)核苷酸都是序列相同的多聚嘌呤核苷酸，可分別與靶序列的5’端11bp及3’端5bp相作用，寡核苷酸B6只有5’端11個(gè)核苷酸可與靶雙鏈DNA形成三鏈DNA，而其3’端的8個(gè)多聚T堿基不能與靶雙鏈DNA配對(duì)，結(jié)果如圖3、圖4及表1所示，TFO B6與乙肝病毒前s基因片段形成三鏈DNA的量及其Ka值要明顯少于寡核苷酸B1-B4，而與B5相近，說(shuō)明寡核苷酸B1-B4的5’端及3’端的核苷酸均可以與靶雙鏈DNA結(jié)合形成三鏈DNA。
TFO B1-B4的5’端11個(gè)核苷酸及3’端5個(gè)核苷酸均是同樣序列的多聚嘌呤核苷酸，只是其中第12位分別是T、C、A或G，通過(guò)它們分別與乙肝病毒基因前S片段形成三鏈DNA的穩(wěn)定性之間的差別，可以了解靶雙鏈DNA均聚嘌呤鏈中插入單個(gè)胞嘧啶時(shí)其第三鏈寡核苷酸中的相應(yīng)位置應(yīng)該用哪一種堿基與之配對(duì)。通過(guò)三鏈DNA形成及凝膠阻滯試驗(yàn)，結(jié)果顯示，TFO B4與乙肝病毒基因片段結(jié)合形成三鏈DNA最穩(wěn)定。因此，如果靶雙鏈DNA的均聚嘌呤鏈中間有C堿基插入時(shí)，在均聚嘌呤的TFO上應(yīng)用G堿基與之配對(duì)，形成GGC三堿基體較為穩(wěn)定。
TFO B5只有11個(gè)核苷酸，TFO B1-B4有17個(gè)核苷酸，寡核苷酸B5雖然能與靶序列形成三鏈DNA，但是穩(wěn)定性比TFO B1-B4差。所以，相對(duì)于同一個(gè)靶雙鏈DNA序列，TFO越長(zhǎng)，它們所形成的三鏈DNA越穩(wěn)定。
2-2-2 TFO與乙肝病毒DR區(qū)域兩段相近均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的作用2-2-2-1 TFO與標(biāo)記的乙肝病毒DR區(qū)域片段形成三鏈DNA及凝膠阻滯分析寡核苷酸片段Ⅲ經(jīng)5’末端32P標(biāo)記后部分與片段Ⅳ復(fù)性，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化得到32P標(biāo)記的寡核苷酸單鏈及32P標(biāo)記的乙肝病毒DR區(qū)域雙鏈片段。用合成的寡核苷酸與32P標(biāo)記的乙肝病毒DR區(qū)域雙鏈片段進(jìn)行凝膠阻滯分析，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸B11、B12、B13、B14、B15均可與乙肝病毒基因DR片段形成三鏈DNA，如圖5所示。
2-2-2-2寡核苷酸與乙肝病毒基因形成三鏈DNA，的平衡常數(shù)、解離常數(shù)及自由能變化通過(guò)對(duì)放射自顯影結(jié)果進(jìn)行黑度掃描，計(jì)算出三鏈DNA形成反應(yīng)平衡之后雙鏈DNA及三鏈DNA的濃度[b-f]及[f]，然后，以
對(duì)a作圖，可得一直線，其斜率為Ka，如圖6所示。通過(guò)Ka值計(jì)算Kd及△G，Kd=1Ka,]]>ΔG=-RTlnKa。如表2所示。
表2．TFO與HBV DR基因片段形成三鏈DNA的熱力學(xué)參數(shù)
乙型肝炎病毒DR區(qū)域的1734位至1754位的21bp基因片段的5’端11bp及3’端8bp是均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，中間第1745、1746位插入兩個(gè)A-T堿基對(duì)。TFO B11的11個(gè)均聚嘌呤堿基能與靶DNA的5’端第一段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合，TFO B12-B15的5’端11個(gè)核苷酸及3’端8個(gè)核苷酸的寡聚嘌呤核苷酸分別可與靶雙鏈DNA的兩段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列結(jié)合，而中間各插入兩個(gè)核苷酸AA、GG、CC和TT。通過(guò)它們分別與乙肝病毒基因片段形成三鏈DNA的穩(wěn)定性之間的差別，可以了解靶雙鏈DNA的均聚嘌呤鏈中存在兩個(gè)胸腺嘧啶時(shí)其第三鏈寡核苷酸中的相應(yīng)位置應(yīng)該用哪一種堿基與之配對(duì)。通過(guò)三鏈DNA形成及凝膠阻滯試驗(yàn)，結(jié)果表明，寡核苷酸B11-B15均可以與靶雙鏈DNA結(jié)合形成三鏈DNA，但是，它們的穩(wěn)定性卻不同。TFO B13與靶DNA結(jié)合形成三鏈DNA的穩(wěn)定性和B11與靶DNA結(jié)合形成三鏈DNA的穩(wěn)定性相近，說(shuō)明，TFO B13只有5’端的11個(gè)堿基參與三鏈DNA的形成，而TFO B15及B12與靶DNA形成三鏈DNA的穩(wěn)定性要明顯高于B11與靶DNA形成三鏈DNA的穩(wěn)定性，說(shuō)明TFO B15及B12的5’端11個(gè)核苷酸及3’端8個(gè)核苷酸均參與三鏈DNA的形成。而且，插入TT比插入從對(duì)在兩段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列上形成三鏈DNA的影響更小。TFO B14與靶DNA結(jié)合形成三鏈DNA的穩(wěn)定性比B11與靶DNA結(jié)合形成三鏈DNA的穩(wěn)定性差，表明CC的存在影響了兩側(cè)三鏈DNA的穩(wěn)定性。TFO B11只有11個(gè)核苷酸，TFO B15有21個(gè)核苷酸，它們都能與靶序列形成三鏈DNA，但是TFO B15與靶DNA形成三鏈DNA的穩(wěn)定性要明顯比TFO B11高。所以，相對(duì)于同一個(gè)靶雙鏈DNA序列，TFO越長(zhǎng)，它們所形成的三鏈DNA越穩(wěn)定。
實(shí)施例3三鏈形成寡核苷酸B4(3’P)和B15(3’P)對(duì)乙型肝炎病毒基因表達(dá)的影響3-1實(shí)驗(yàn)步驟3-1-1質(zhì)粒DNA(p1.2Ⅱ)及三鏈形成寡核苷酸共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于1×DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中，37℃，5％ CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染前2小時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液。配制溶液A0.8μg質(zhì)粒p1.2Ⅱ，及不同濃度的脫氧寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，脫氧寡核苷酸分別是0、40、80、120、160、200pmol。當(dāng)轉(zhuǎn)染體積是20μl時(shí)，脫氧寡核苷酸的終濃度分別是0、2、4、6、8、10μmol/L)，加DMEM至10μl，混勻；溶液B0.3μl lipofectin,9.7μl DMEM，混勻，室溫放置30分鐘。溶液A和溶液B混勻，室溫放置30分鐘。用DMEM洗細(xì)胞兩次，加入上述轉(zhuǎn)染混合液(每個(gè)樣孔做6次，其中3個(gè)樣品的上清用重復(fù)測(cè)定HBsAg，另三個(gè)樣品的上清用于重復(fù)測(cè)定HBeAg),37℃,5％ CO2培養(yǎng)5小時(shí)，加入100μl含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)120小時(shí)，取100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清用于HBsAg及HBeAg的測(cè)定。
3-1-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg及HBeAg的測(cè)定在包被抗HBs或HBe反應(yīng)板加入100μl待測(cè)標(biāo)本，并設(shè)HBsAg或HBeAg陽(yáng)性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，空白對(duì)照1孔，然后每孔加入酶結(jié)合物100μl(空白不加)，充分混勻，封板。37℃孵育1小時(shí)。棄去反應(yīng)板孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿每孔，靜置20秒鐘，甩干，反復(fù)5次。然后每孔加底物液100μl，封板。37℃孵育15分鐘，加終止液50μl。最后，在酶標(biāo)儀上用空白孔校零，讀取各孔反應(yīng)液在492毫微米的吸收A492值。
3-1-3三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBsAg及HBeAg抑制率的計(jì)算方法
3-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3-2-1三鏈形成寡核苷酸與HBV質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞時(shí)對(duì)HBV基因表達(dá)影響的時(shí)間效應(yīng)在12孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每個(gè)孔分別轉(zhuǎn)染帶有HBV基因質(zhì)粒p1.2Ⅱ10μg及10μmol/L的TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并每隔12小時(shí)取200μl培養(yǎng)液，其中100μl培養(yǎng)液用于測(cè)定HBeAg，另100μl培養(yǎng)液用于測(cè)定HBsAg，三次重復(fù)取平均值，結(jié)果如圖7、圖8所示。HBV基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，當(dāng)不加三鏈形成寡核苷酸時(shí)，HBeAg及HBsAg在第二天開始表達(dá)，隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量逐步升高。當(dāng)10μmol/LTFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)與HBV質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染時(shí)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)比不加TFO時(shí)要明顯降低，尤其是加入TFO B15(3’P)時(shí)，對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用尤其顯著，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量上升很慢。同時(shí)，當(dāng)加入對(duì)照寡核苷酸時(shí)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量也有些降低，這可能是由于DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的寡核苷酸影響了HBV DNA的轉(zhuǎn)染效率，因此，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量有所下降。但是，HBeAg及HBsAg表達(dá)量下降的幅度要明顯小于三鏈形成寡核苷酸對(duì)HBeAg及HBsAg表達(dá)的抑制作用。
3-2-2 TFO B15(3’P)在預(yù)轉(zhuǎn)染p1.2Ⅱ的HepG2細(xì)胞中，對(duì)HBV抗原表達(dá)影響的時(shí)間效應(yīng)在12孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每個(gè)孔分別轉(zhuǎn)染帶有HBV基因質(zhì)粒p1.2Ⅱ，然后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10μmol/L的TFO B15(3’P)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并每隔10小時(shí)取200μl培養(yǎng)液，其中100μl培養(yǎng)液用于測(cè)定HBeAg，另100μl培養(yǎng)液用于測(cè)定HBsAg，三次重復(fù)取平均值，結(jié)果如圖9、圖10所示。HBV基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，當(dāng)不加三鏈形成寡核苷酸時(shí)，HBeAg及HBsAg在第二天開始表達(dá)，隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量逐步升高。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中含10μmol/L TFO B15(3’P)時(shí)，HBsAg的表達(dá)比不加TFO時(shí)要明顯降低，但是對(duì)HBeAg的影響較小。
實(shí)施例4三鏈形成寡核苷酸對(duì)乙型肝炎病毒在HepG2細(xì)胞中繁殖的抑制作用4-1實(shí)驗(yàn)步驟4-1-1質(zhì)粒DNA及三鏈形成寡核苷酸的轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于1×DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中，于37℃，5％ CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天，接種細(xì)胞于12孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染前5小時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液。配制溶液A質(zhì)粒p1.2Ⅱ10μg，三鏈形成寡核苷酸在轉(zhuǎn)染混合液中的終濃度為10μmol/L，加不含血清的DMEM至110μl，混勻；溶液B6μl lipofectin,114μl不含血清的DMEM，混勻，室溫放置30分鐘。用不含血清的DMEM洗細(xì)胞兩次，加入上述轉(zhuǎn)染混合液(每個(gè)樣品重復(fù)3次)，37℃,5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃,5％ CO2培養(yǎng)5天。
4-1-2細(xì)胞DNA的抽提10μmol/L三鏈形成寡核苷酸作用5天后，用胰酶消化細(xì)胞，合并重復(fù)三次的細(xì)胞，在4℃以3000g離心2分鐘，收集細(xì)胞于1.5ml Eppendorf管中，加入1ml TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2～3分鐘，4℃ 1200g離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5ml Eppendorf管中，用于總RNA的抽提。在中層及下層有機(jī)相中加入0.3ml無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置5分鐘，然后10,000g離心5分鐘，棄上清，加入1ml 0.1mol/L檸檬酸鈉，10％乙醇溶液，室溫放置30分鐘，每5分鐘混勻一次，然后于4℃,10,000g離心5分鐘，重復(fù)用1ml 0.1mol/L檸檬酸鈉，10％乙醇溶液洗一次，懸浮于75％乙醇中，室溫放置20分鐘，每5分鐘搖動(dòng)一次，于4℃,10,000g離心5分鐘，置于空氣中干燥后，加入100μl 8mmol/L NaOH溶解。
4-1-3 HBV基因探針的制備質(zhì)粒p1.2Ⅱ用BamHⅠ酶切、電泳，純化出含3.2kb長(zhǎng)度的完整線性HBV DNA，用隨機(jī)六核苷酸引物法制備HBV DNA探針，(參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniatis著，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1986年，502-504)。
4-1-4用點(diǎn)雜交(Dot Blot)檢測(cè)HBV DNA用抽濾加樣器把變性的DNA樣品點(diǎn)到尼龍膜上，用紫外交聯(lián)于膜上，然后與32P標(biāo)記的HBV DNA探針雜交。(參見現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，盧圣棟主編，高等教育出版社，1993年，209-210)。
4-2結(jié)果三鏈形成寡核苷酸對(duì)HepG2細(xì)胞中HBV基因考貝數(shù)的影響在12孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每個(gè)孔分別轉(zhuǎn)染帶有HBV基因質(zhì)粒1.2Ⅱ和10μmol/L的三鏈形成寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，五天后消化細(xì)胞，抽提DNA做點(diǎn)雜交，結(jié)果如圖11所示。從圖中可以看出，用三鏈形成寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)作用的HepG2細(xì)胞中，其HBV DNA的考貝數(shù)要少于不加三鏈形成寡核苷酸及加不與HBV DNA配對(duì)的寡核苷酸的細(xì)胞中的考貝數(shù)(雜交點(diǎn)直徑小，黑度淺)，說(shuō)明三鏈形成寡核苷酸可以抑制HBV的繁殖。
權(quán)利要求
1．一種三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)，其特征在于它具有能與二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA的寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列是HBV的DR區(qū)域及HBV adr亞型的前S基因啟動(dòng)子區(qū)域，分別與之結(jié)合的是一種抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)基因表達(dá)及乙型肝炎病毒繁殖的三鏈形成寡核苷酸。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的三鏈形成寡核苷酸，其特征在于該三鏈形成寡核苷酸包括5條與HBV adr亞型的前S基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的三鏈形成寡核苷酸TFO B1-B5,3條與HBV的DR區(qū)域結(jié)合的三鏈形成寡核苷酸TFOB11,B12及B15。它們的序列如下B1 5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17ntB2 5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17ntB3 5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17ntB4 5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17ntB5 5’AAG GAG GAG GA 3’11ntB11 5’AGA GGA GGG GG 3’11ntB12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21ntB15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt。
4．根據(jù)權(quán)利要求2,3所述的三鏈形成寡核苷酸，其特征在于該三鏈形成寡核苷酸可以通過(guò)3’單磷酸化修飾得下列三鏈形成寡核苷酸B1(3’P) 5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17ntB2(3’P) 5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17ntB3(3’P) 5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17ntB4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17ntB5(3’P) 5’AAG GAG GAG GAp 3’11ntB11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11ntB12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21ntB15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt。
5．根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的三鏈形成寡核苷酸，其特征在于該三鏈形成寡核苷酸含有下列序列之一B1 5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17ntB2 5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17ntB3 5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17ntB4 5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17ntB5 5’AAG GAG GAG GA 3’11ntB11 5’AGA GGA GGG GG 3’11ntB12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21ntB15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt?？蓱?yīng)用于配制抑制乙肝病毒及治療乙型肝炎的藥物。
6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的三鏈形成寡核苷酸，其特征在于該三鏈形成寡核苷酸含有下列之一B1(3’P) 5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17ntB2(3’P) 5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17ntB3(3’P) 5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17ntB4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17ntB5(3’P) 5’AAG GAG GAG GAp 3’11ntB11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11ntB12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21ntB15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt可應(yīng)用于配制抑制乙肝病毒及治療乙型肝炎的藥物。
全文摘要
一種新的三鏈形成寡核苷酸結(jié)構(gòu),它能與二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三鏈DNA。用上述結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了分別能與乙型肝炎病毒的DR區(qū)域及前S基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的三鏈形成寡核苷酸。在其3’端也可用單磷酸化修飾。通過(guò)凝膠電泳阻滯試驗(yàn)證明本發(fā)明提供的三鏈形成寡核苷酸能與靶雙鏈DNA形成三鏈DNA。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明該三鏈形成寡核苷酸可應(yīng)用于抑制乙肝病毒及用作治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/711GK1215058SQ9710666
公開日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1997年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月21日
發(fā)明者陸長(zhǎng)德, 陳錦輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所