專利名稱：：低糖分、穩(wěn)定的、不含白蛋的一種重組體凝血因子制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及rFVIII藥用制劑，尤其涉及其穩(wěn)定的、不含白蛋白的凍干制劑。凝血因子VIII是血液凝固過(guò)程必需的公知血漿蛋白。盡管凝血因子VIII通?？梢詮娜搜獫{中獲得，近年來(lái)已作出許多努力從重組體來(lái)源制備凝血因子VIII(rFVIII)，以便避免與血液制品有關(guān)的可能污染。此外，凝血因子VIII的重組體來(lái)源可提供實(shí)際上無(wú)限量的凝血因子，因而避免與使用自愿捐獻(xiàn)血漿作為原料有關(guān)的供應(yīng)能力的限制。因?yàn)閞FVIII產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)之一是它不來(lái)自于人血漿，因而避免了由人血漿原因引起的可能污染，所以，rFVIII制備當(dāng)中的目標(biāo)是開發(fā)穩(wěn)定的rFVIII制劑，它完全不含任何人血原料。不幸的是，像許多其它的治療性蛋白一樣，rFVIII是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在貯存期間它可變得不穩(wěn)定。為克服其不穩(wěn)定性，常用方法是將人血清白蛋白加入該產(chǎn)品中作為穩(wěn)定劑。已發(fā)現(xiàn)白蛋白是FVIII的良好的穩(wěn)定劑并用在市場(chǎng)上的許多銷售產(chǎn)品中。但是，使用人體白蛋白作為rFVIII穩(wěn)定劑，首先，重組體產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)之一(即避免任何含人血原料)便喪失了。最近一直有報(bào)導(dǎo)，關(guān)于使用氯化鈉、氯化鈣和組氨酸作為緩沖離子的低離子強(qiáng)度介質(zhì)和高離分強(qiáng)度介質(zhì)的不含白蛋白的凝血因子VIII制劑。此外，已經(jīng)使用堿性氨基酸例如賴氨酸和糖例如甘露糖醇、蔗糖或麥芽糖。為達(dá)到不含白蛋白的凝血因子VIII制劑的穩(wěn)定性，同時(shí)保留其用于治療目的所必需的等滲性，在該無(wú)白蛋白制劑中大約使用了10％的糖。例如參見(jiàn)美國(guó)專利第4877608號(hào)(低離子強(qiáng)度制劑)。歐洲專利第0314095號(hào)公開另一具有高離子強(qiáng)度和以組氨酸作為緩沖劑的不含白蛋白制劑。美國(guó)專利第4877608號(hào)涉及其溶液而不涉及凍干產(chǎn)品，后者必須能經(jīng)受對(duì)制備該產(chǎn)品是必需的凍干循環(huán)過(guò)程。歐洲專利第314095號(hào)介紹包括較高含量的氯化鈉并主要以液體制劑形式使用的凝血因子VIII制劑。其它關(guān)于凝血因子VIII制劑的專利包括美國(guó)專利第5399670號(hào)，它介紹精氨酸在含白蛋白凍干制劑中的用途。也參見(jiàn)WO95/01804，它介紹不包含蔗糖或甘氨酸的制劑，美國(guó)專利第4440679號(hào)和美國(guó)專利第4623717號(hào)(申請(qǐng)人均為Fernandes等人)顯示一起使用至少30％(重量)糖與氨基酸，以便使液體狀態(tài)的FVIII在巴氏殺菌條件下(60℃，至少10小時(shí))穩(wěn)定。除了上述凝血因子VIII制劑外，還有其它幾篇涉及凝血因子VIII純化和/或穩(wěn)定化的專利。它們包括美國(guó)專利第5288853號(hào)，它涉及包括在加入甘氨酸后使用結(jié)合肝素柱(heparin-coupledcolumn)以便生成純化凝血因子VIII產(chǎn)品的多步驟制備過(guò)程。美國(guó)專利第5399670號(hào)涉及制備增加溶解度的凍干凝血因子VIII制劑的方法，它要求在凍干前，加入精氨酸到凝血因子VIII溶液中。美國(guó)專利第5259951號(hào)涉及使用離子交換柱從血漿中純化凝血因子VIII的多步驟方法。美國(guó)專利第4758657號(hào)涉及從血漿中分離凝血因子VIIIC的多步驟方法，其中至少有一個(gè)步驟要求將凝血因子VIIIC吸附在疏水的相互作用基質(zhì)上。除上述專利外，最近公開了與本發(fā)明rFVIII制劑似乎類似的凝血因子IX(FIX)制劑。參見(jiàn)Abstract244，作者L.Bush等，Hemophilia，第2卷，副刊1，64頁(yè)(1996年6月)。FIX為可轉(zhuǎn)變成活性分解蛋白酶的酶原。另一方面，F(xiàn)VIII作為輔助因子與其它凝血成分一起影響血液凝固過(guò)程。FVIII的分子量約340000道爾頓，而FIX的分子量約為56000-57000道爾頓。FVIII對(duì)分解蛋白過(guò)程非常敏感，同時(shí)損失其促凝血活性。眾所周知，凝血因子VIII本身比FIX更不穩(wěn)定，且各個(gè)凝血因子的凍干濃縮物都顯示出在不同溫度貯存過(guò)程中穩(wěn)定性方面的顯著差異。與FVIII不同，F(xiàn)IX包括獨(dú)特的12N末端谷氨酸殘基r-羧化作用，所以提供了作為不同穩(wěn)定性可能的基礎(chǔ)。所以，不必要將FIX制劑假定為FVIII制劑。在PharmaceuticalResearch，12卷，第6期，831-837頁(yè)(1995年)中，也公開了與下文所公開制劑類似的穩(wěn)定的重組體人白細(xì)胞間素-1受體拮抗劑制劑。不管過(guò)去和現(xiàn)在為開發(fā)能夠順利地凍干，然后用水以可迅速?gòu)?fù)制的、穩(wěn)定的rFVIII制劑所作的一切努力，到目前為止，提供一種不僅可避免使用人體產(chǎn)物例如白蛋白，而且滿足適合的凍干過(guò)程和能迅速?gòu)?fù)制及等滲性的要求，同時(shí)具長(zhǎng)期穩(wěn)定性包括藥學(xué)上可接受的貯存期限的rFVIII制劑是困難的。使人感到驚奇的是，我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該類制劑是能夠得到的。在開發(fā)該制劑的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有技術(shù)中作為緩沖劑來(lái)介紹和使用的組氨酸實(shí)際上對(duì)不含白蛋白的凍干制劑具有失穩(wěn)效應(yīng)。但是，已發(fā)現(xiàn)所述組氨酸的失穩(wěn)效應(yīng)通過(guò)新的含鹽、甘氨酸和蔗糖的制劑可以有效地得以克服，發(fā)現(xiàn)該組合在穩(wěn)定rFVIII方面具有有益的作用。該混合物也保護(hù)rFVIII經(jīng)歷凍干過(guò)程中的多次冰凍熔化循環(huán)，并為加水迅速?gòu)?fù)制該凍干產(chǎn)物提供保證。與基本上是非晶體的大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)制劑不同，所述制劑包含晶體和非晶體成分。本發(fā)明制劑在室溫下，以液體狀態(tài)保持穩(wěn)定至少達(dá)24小時(shí)。以下詳細(xì)介紹本發(fā)明制劑及其用途。本改進(jìn)的rFVIII制劑是藥學(xué)上可接受的不含白蛋白凍干產(chǎn)品，它在水中可以迅速?gòu)?fù)制(在30秒鐘內(nèi))，并用于治療血友病。所述凍干制劑為包含鹽、氨基酸和蔗糖的新的混合物。本產(chǎn)品在室溫下穩(wěn)定，并與現(xiàn)有技術(shù)制劑不同，含有較低含量的糖。當(dāng)用水復(fù)制后，本發(fā)明制劑包含下列成分甘氨酸約65-400mM，優(yōu)選290mM，組氨酸最高可達(dá)約50mM，優(yōu)選1mM-50mM特別優(yōu)選20mM，蔗糖約15-60mM，優(yōu)選30mM，NaCl最高可達(dá)約50mM，優(yōu)選1mM-50mM特別優(yōu)選30mM，CaCl2最高可達(dá)約5mM，優(yōu)選0.1-5mM，特別優(yōu)選2.5mM，和rFVIII約50-1500IU/ml在優(yōu)選的凍干制劑中，殘留水分應(yīng)該約為1-3％(重量)，優(yōu)選約1％(重量)附圖為比較具較低糖含量的本發(fā)明制劑(上方曲線)與具較高糖含量的現(xiàn)有技術(shù)所述制劑(下方曲線)在40℃下藥效對(duì)時(shí)間的圖解。本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)不含白蛋白的制劑，它使經(jīng)歷不同加工步驟例如超濾/diafiltration、大量冷凍貯存、冰凍-熔化操作和凍干過(guò)程的rFVIII具有穩(wěn)定性(藥效損失極小或約低于20％)。此外，要求它在復(fù)制后液體狀態(tài)下穩(wěn)定的速溶產(chǎn)品。最后，要求它是用短時(shí)冷凍干燥過(guò)程可以凍干、具合適的貯存期限、藥物學(xué)上可接受的凍干產(chǎn)品。在凍干過(guò)程中蛋白質(zhì)不結(jié)晶。干燥過(guò)程的目的應(yīng)該是將蛋白質(zhì)水溶液轉(zhuǎn)變成為非晶相，以便保護(hù)該蛋白質(zhì)免受由于結(jié)晶(或全部失去水分)環(huán)境引起化學(xué)和/或構(gòu)象的不穩(wěn)定性。所以，常包含大量的白含蛋白(最高可達(dá)1％)以便提供可使所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定的非晶相(成分)。根據(jù)上述全部的目的，開發(fā)了包括便于迅速凍干的晶狀成分和可使rFVIII穩(wěn)定的非晶形成分的制劑。在此所表達(dá)的包括非晶形成分的結(jié)晶體表示所述制劑包含兩個(gè)或兩個(gè)以上不同相，其中至少一相是晶狀的和至少一相是非晶形的。固體可以以晶狀或非晶形形式存在。晶狀物質(zhì)的特征為具有明確的結(jié)構(gòu)、化學(xué)計(jì)量組成和熔點(diǎn)。相反，非晶形物質(zhì)無(wú)明確分子結(jié)構(gòu)并可以稱作具有極高粘度的過(guò)冷液體，例如粘彈“橡膠”或非常剛性易碎的玻璃。據(jù)認(rèn)為其它一些糖例如麥芽糖、海藻糖和麥芽三糖可以包括在制劑中起所述非晶形成分的作用。也可以包括甘露糖醇，起制劑晶狀成分的作用。用于確定藥學(xué)上可接受的不含白蛋白的rFVIII制劑的程序如下(a)原料是用正交層析方法純化的高度純化的rFVIII。上述方法定義為按不同方法和原理操作并一般連續(xù)使用的層析方法。因此，通過(guò)使用更有效的不同純化方法，可以迅速純化蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的凝血因子VIII為至少90％純度(用凝膠電泳)并具高于2000IU/mg比活性的蛋白質(zhì)。rFVIII的理論純度一直是爭(zhēng)論的課題，但據(jù)認(rèn)為是約3500-5000IU/mg蛋白質(zhì)。(b)通過(guò)超濾/diafiltration(UF/DF)將所述蛋白制成制劑，并研究經(jīng)UF/DF的回收率、對(duì)冰凍-熔化的敏感性和在不同保溫溫度下液體的穩(wěn)定性。(c)通過(guò)DSC(示差掃描量熱法)進(jìn)一步顯示可能的制劑在熱性能方面的特征。測(cè)定玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg1)、反玻璃化溫度(Td1)和低共熔溫度(Te1)。該資料用于確定能迅速凍干和用于進(jìn)一步研究的制劑。(d)使用迅速的冷凍干燥循環(huán)過(guò)程將上述重要制劑凍干，并在標(biāo)準(zhǔn)及加速貯存溫度下完成穩(wěn)定性分析。(e)在不同時(shí)刻，從在40℃下貯存的樣品中，可以容易地確定出穩(wěn)定的制劑。在分析導(dǎo)致本發(fā)明制劑的許多研究結(jié)果的過(guò)程中，使用多變量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)策略和程序比例篩選中氨基酸、鹽和糖的混合物所組成的一組成分。使用需要專門操作技術(shù)的程序分析所述結(jié)果，以便分析成分之間的任何相互作用，產(chǎn)生對(duì)所述數(shù)據(jù)的多變量響應(yīng)表面分析(multi-variableresponse-surfaceanalysis)。使我們感到吃驚的是，發(fā)現(xiàn)組氨酸(常用在現(xiàn)有技術(shù)中)實(shí)際上對(duì)rFVIII制劑具有失穩(wěn)效應(yīng)。這導(dǎo)致需要產(chǎn)格審查我們認(rèn)為最后可接受的制劑中各種成分的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例1通過(guò)滴定包含150mMNaCl、2.5mMCaCl2和165mM甘露糖醇的rFVIII混合物中不同含量的組氨酸來(lái)研究組氨酸對(duì)凍干rFVIII穩(wěn)定性的影響。其結(jié)果列于下表1中。表1在組氨酸存在下，40℃貯存兩周后，相當(dāng)初始藥效的百分率</tables>從以上數(shù)據(jù)可以看出，增加組氨酸的用量導(dǎo)致按照劑量決定關(guān)系的復(fù)制凍干rFVIII藥效下降。該結(jié)果提示組氨酸在使凍干狀態(tài)的FVIII穩(wěn)定的過(guò)程中不起作用。實(shí)施例2rFVIII在高糖份和低糖份制劑中的穩(wěn)定性。將重組體凝血因子VIII制成兩種制劑。在40℃加速貯存條件下研究其不穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術(shù)制劑類似，所述高糖份制劑是非晶形制劑，在用水復(fù)制后，它含50mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、5mM組氨酸和10％(重量)的麥芽糖。本發(fā)明的含低糖份制劑是包括用于穩(wěn)定所述蛋白質(zhì)的1％蔗糖(30mM蔗糖)非晶形成分的晶狀體。在用WFI復(fù)制后，該制劑含30mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、20mM組氨酸、290mM甘氨酸和大約200IU/ml的rFVIII。在附圖中將該制劑與現(xiàn)有技術(shù)制劑進(jìn)行比較，其中可以看出，在超出規(guī)定時(shí)間情況下，本發(fā)明低糖份rFVIII制劑比現(xiàn)有技術(shù)的高糖份穩(wěn)定產(chǎn)品在時(shí)間上更穩(wěn)定得多。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以已知的本發(fā)明進(jìn)行大量的各種修改。所以，上述實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明范圍只受到下列權(quán)利要示書的限制。權(quán)利要求1.穩(wěn)定的、不含白蛋白的、凍干rFVIII制劑，當(dāng)用水復(fù)制后，含約65-400mM甘氨酸，最高可達(dá)50mM組氨酸，15-60mM蔗糖，最高可達(dá)50mMNaCl，最高可達(dá)5mMCaCl2，和50-1500IUrFVIII/ml。2.穩(wěn)定的、不含白蛋白的、凍干rFVIII制劑，當(dāng)用水復(fù)制后，含約290mM甘氨酸，20mM組氨酸，30mM蔗糖，30mMNaCl，2.5mMCaCl2，和50-1500IUrFVIII/ml。3.權(quán)利要求1的凍干制劑，其中殘留的水分約為1-3％(重量)。4.權(quán)利要求2的凍干制劑，其中殘留水分約為1％(重量)。全文摘要當(dāng)用水復(fù)制后,包括晶狀和非晶形成分凍干形式、穩(wěn)定的、不含白蛋白的重組體凝血因子Ⅷ(rFⅧ)制劑含約65—400mM甘氨酸、最高可達(dá)50mM組氨酸、15—60mM蔗糖、最高可達(dá)50mMNaCl、最高可達(dá)5mMCaCl文檔編號(hào)A61K47/16GK1181974SQ97114668公開日1998年5月20日申請(qǐng)日期1997年7月11日優(yōu)先權(quán)日1996年7月12日發(fā)明者R·納亞爾申請(qǐng)人:美國(guó)拜爾公司