專利名稱:L-β-二氧戊環(huán)尿苷類似物和治療和預防病毒感染的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及新的L-β-二氧戊環(huán)尿苷類似物和其在預防和治療EB病毒(Epstein-Barr病毒),水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster病毒)和卡波西肉瘤病毒(Kaposi’s Sarcoma病毒),也稱為HV~8中的用途。
背景技術:
通過使用不斷開發(fā)的抗生素藥,人體細菌感染已經更容易控制和治療,而病毒感染則仍然是更困難和更不易治療的目標。尋找治療病毒感染的藥劑的重要性一直被放在首位。
EB病毒(EBV)是與單純皰疹病毒(HSV)相關的重要的人類病原體,Elliot Kieff,病毒學,第3版,B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley等編,EB病毒及其復制,第74章,p2343-2396和Alan B.Rickinson和ElliotKieff,出處同上,第75章,p2397-2446。EBV是Lumphocryptovirus屬的淋巴營養(yǎng)成員,屬于γ皰疹病毒科的亞家族。同屬于此家族的另一種人病毒新成員是與卡波西肉瘤相關的皰疹病毒(KSHV/HHV8),Chang等,科學,2661865-1869(1994);Cesarman等,新英格蘭醫(yī)學雜志,3321186-1191(1995);Soulier等,血液,861276-1280(1995)。已鑒定出EBV的兩種亞型,它們的基因組幾乎相同,但尚不清楚EBV相關疾病和EBV亞型之間的關系。Abdul-Hamid等,病毒學,190168-175(1992)和Sample等,病毒學雜志,644084-4092(1990)。裂解性的EBV基因組是由60mol%鳥嘌呤和胞嘧啶組成的線性的,雙鏈的,172Kbp的DNA。已測定基因組的序列,發(fā)現(xiàn)該序列能編碼大量病毒特有的蛋白質,包括參與EBV裂解性感染過程中病毒DNA合成的幾種酶。在體外,盡管EBV也可感染上皮細胞,但EBV感染一般局限于B-淋巴細胞,Sixbey等,自然,306480-483(1983)。在人類的B-淋巴細胞和T-淋巴細胞以及上皮細胞中可檢測到病毒基因組。EBV基因組以線性形式裂解性復制,也可作為超卷曲的環(huán)形DNA潛伏起來。EBV基因組在被裂解性感染的細胞中的表達與在被潛伏感染的細胞中的表達非常不同。EBV特有的DNA聚合酶,DNA酶和dThd激酶僅通過裂解性DNA復制在細胞中表達。細胞培養(yǎng)研究揭示出EBV特有的DNA聚合酶對裂解性感染過程中EBV DNA復制的重要作用,但未揭示出該酶對超卷曲EBV DNA在被潛伏感染的細胞中的維持的作用。在被潛伏感染或轉化的細胞中表達了特有的一套EBV蛋白質,包括EBVNA1,有時還包括EBNVLP,2,3A,3B,3C,LMP1,3B,3C,LMP以及LMP2,Elliot Kieff,病毒學,第3版,B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley等編,EB病毒及其復制,第74章,p2343-2396和Alan B.Rickinson和Elliot Kieff,出處同上,第75章,p2397-2446。
EBV的結構類似于其它皰疹病毒,它具有包含在核衣殼中的雙鏈DNA基因組,所述核衣殼被含有病毒糖蛋白的脂質包膜所包圍,間層蛋白占據了包膜和核衣殼之間的空間。
盡管EBV對嬰兒的初次感染幾乎無癥狀,但經血清學證實的青少年或年輕人中的一部分(在有些研究中達50%)初次感染顯示出傳染性的單核細胞增多癥(IM),也稱為“接吻病”。盡管有些EBV感染是通過輸血傳播的,但EBV主要通過唾液傳播。大部分(>85%)處于傳染性單核細胞增多癥急性期的病人分泌EBV。70年代中期,鑒定出EBV可在具有X-連鎖免疫缺損的男孩中導致致命的IM/X-連鎖的淋巴增殖性綜合征(XLP),Sullivan和Wood,免疫缺損評述,1325-347(1989)。還發(fā)現(xiàn)致命的EBV感染與未得到有效治療的非家族性單一巨噬細胞綜合征(VAHS)相關,Alan B.Rickinson和Elliot Kieff,病毒學,第3版,B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley等編,EB病毒及其復制,第75章,p2397-2446和Craig等,美國臨床病理學雜志,97189-194(1992)。
EB病毒也被看成是B細胞增殖性疾病的引發(fā)劑,它與多種疾病狀態(tài),包括罕見的進行性單核細胞增多癥-樣綜合征和AIDS患者口毛粘膜白斑病相關。EBV也與某些類型的癌癥相關,如Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,何杰金氏病,EBV-相關的T細胞淋巴瘤和鼻T細胞淋巴瘤。某些病人,特別是免疫系統(tǒng)受抑制的病人,如接受免疫抑制劑治療的AIDS病人和器官移植病人對EBV表現(xiàn),尤其是EBV相關淋巴瘤的發(fā)展特別易感。
Chu等人在PCT申請PCT/US95/01253中描述了許多用于治療乙肝病毒和EB病毒感染的L-核苷類似物。在該PCT申請中公開的一種藥劑,2’-氟-5-甲基-β-L-阿糖呋喃尿苷(L-FMAU),顯示出良好的抗EBV活性。值得注意的是,當L-FMAU的5-甲基被溴取得時,抗EBV活性降低。
幾種化合物已經顯示,在對細胞生長無毒的濃度,在培養(yǎng)時具有抗EBV復制活性。這些包括阿昔洛韋(ACV),更昔洛韋(DHPG),噴昔洛韋,D-FMAU和其類似物,5-溴乙烯基dUrd,膦酰基甲酸酯和硫代磷酸寡核苷。參見Lin等,Antimicrob.Agents and Chemo.(2月)32(2)265-267(1988);Lin等,Antimicrob.Agents and Chemo.32(7)1068-1072(1988);Cheng等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,802767-2770(1983);Datta等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,775163-5166(1980);Datta等,病毒學,11452-59(1981);Lin等,Antimicrob.Agents and Chemo.311431-1433(1987);Olka和Calendar,病毒學,104219-223(1980);Lin等,病毒學雜志,5050-55(1984);Yao等,Antimicrob.Agents and Chemo.371420-1425(1993)和Yao等,生化藥物,(51)941-947(1966)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供治療和/或預防在患者體內的EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染的化合物,藥物組合物和方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及這樣一個發(fā)現(xiàn),即某些含有尿嘧啶堿,優(yōu)選地為5-鹵素取代的尿嘧啶堿的β-L-二氧戊環(huán)尿苷類似物出乎意料地顯示出具有很高的抗EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)活性。具體地,本發(fā)明的化合物顯示出很強的病毒復制(病毒生長)抑制作用,而對宿主細胞(即,動物或人體組織)只有很低的毒性。
本發(fā)明的化合物首先可以用作抑制EBV,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生長或復制的藥劑。這些藥劑中的某些可以用于抑制其他病毒(例如,HSV)的生長或復制,或用于治療其他病毒感染和/或相關病癥。其他藥劑可以用作試驗目的的生物學探針,或在具有藥理活性的相關核苷化合物的合成中用作中間體。
本發(fā)明化合物在抗折磨動物的病毒感染中發(fā)現(xiàn)了特別的用途,尤其是患有EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染的人。本發(fā)明化合物作為目前幾乎沒有治療方案的病癥(EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染)的治療劑具有很大的潛力。本發(fā)明化合物可以單獨使用,或與藥劑或其他治療結合。
本發(fā)明化合物是含有L-構型(與大多數(shù)天然存在的核苷的天然D-構型相反)和尿嘧啶堿的二氧戊環(huán)尿苷類似物。優(yōu)選地,尿嘧啶堿在5-位被氟,氯,溴,碘,甲基或三氟甲基取代,而尿嘧啶堿在5-位的取代基以碘或溴是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明也涉及抑制EBV,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生長或復制的方法,包括使病毒與抑制有效量或濃度的至少一種所公開的L-核苷類似物接觸。此方法可以被用于比較試驗,如測定相關的抗-EBV,抗-VSV或抗-HV-8化合物的活性,以及測定患者的EBV,VSV或HV-8感染對本發(fā)明化合物之一的敏感性的試驗。本發(fā)明化合物優(yōu)選地被用于治療或預防人體的EBV,VSV或HV-8感染。
本發(fā)明的治療方面涉及治療或預防患者,優(yōu)選人類患者的EBV,VSV或HV-8感染的方法,包括施用抗病毒有效量的一種或多種本發(fā)明化合物,在被治療的動物或病人體內抑制病毒的生長或復制。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中,本組合物被用于預防或延緩EBV,VSV或HV-8感染在患者體內的發(fā)病,尤其是EBV相關的淋巴瘤或癌癥,包括患者體內的卡波西肉瘤,包括已經輸血的患者和免疫缺損或免疫損傷的患者,例如,AIDS病患者和移植患者,等等。
以這些新化合物為基礎的藥物組合物包含治療有效量的,治療病毒,一般是EBV,VSV或HV-8感染的一種或多種上述化合物,非強制性地與藥用添加劑,載體或賦性劑結合。
某些化合物,以藥物劑型,也可以用作抑制EBV,VSV或HV-8生長或復制的預防劑。這些特別適合于作為抗-EBV,抗-VSV或抗-HV-8劑。在某些藥物劑型中,前藥形式,例如,酰化的核苷或含有磷酸酯的核苷可能是優(yōu)選的。
不受理論限制的同時,我們相信,本發(fā)明化合物通過抑制病毒DNA聚合酶,或通過將核苷摻入病毒DNA中導致鏈終止,從而誘發(fā)其對于EBV,VSV或HV-8生長或復制的抑制作用。出人意料的是,本發(fā)明化合物,尤其是本發(fā)明的5-碘-L-核苷和5-溴-L-核苷類似物呈現(xiàn)出與任何已經在歷來的文獻中公開的其他核苷不同的抗病毒譜。可以對該獨一無二的抗病毒活性提出一個獨特的機理。
本發(fā)明化合物通過本專業(yè)已知的合成方法,并包括各種化學合成方法生產。
附圖簡要說明附
圖1,圖解1,描繪了二氧戊環(huán)基糖中間體5從L-古洛糖-γ-內酯1的化學合成。
附圖2,圖解2,描繪了乙?;跷飙h(huán)基糖衍生物10從1,6-脫水-β-L-古洛吡喃糖4的化學合成。
附圖3,圖解3,描繪了本發(fā)明的5-取代的β-L-二氧戊環(huán)基核苷類似物(11,13,15,17,19和21)從二氧戊環(huán)基糖衍生物10和保護的5-取代的尿嘧啶堿的化學合成。
附圖4是描繪在抗EBV系列中兩種最有活性的化合物,(2S,4S)-1-[(羥甲基)-1,3-二氧六環(huán)基-4-基]-5-溴代尿嘧啶(β-L-Br-OddU)和(2S,4S)-1-[(羥甲基)-1,3-二氧六環(huán)基-4-基]-5-碘代尿嘧啶(β-L-I-OddU)的劑量應答曲線。
附圖5是描繪由β-L-Br-OddU在雌性BDF1小鼠體內產生的藥物動力學數(shù)據。
附圖6是描繪由β-L-I-OddU在雌性BDF1小鼠體內產生的藥物動力學數(shù)據。
附圖7是描繪DNA雜交,β-L-I-OddU對DHPG抗HV-8的劑量應答圖。
發(fā)明詳細說明下列定義將用于整個說明書,描述本發(fā)明。
術語“患者”用于整個說明書,描述用根據本發(fā)明的組合物治療,包括預防性治療的動物,優(yōu)選人類。對于治療如人的具體動物,特定的感染,病癥或病情,術語患者指具體的動物。
術語“EB病毒”或(EBV)用于整個說明書描述在Burkitt’s淋巴瘤的細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的herpetovirus。結構上,EBV與其他herpetovirus類似-它具有在核衣殼內所含的雙螺旋DNA基因組,所述核衣殼被含有病毒糖蛋白的脂質包膜包圍。間層蛋白占據了包膜和核衣殼之間的空間。EBV是傳染性單核細胞增多癥的致病劑。EB病毒也被認識到是B-細胞增殖性疾病,淋巴增殖性綜合征,非家族性單一吞噬細胞綜合征的致病劑,并與許多病癥關聯(lián),包括罕見的進行性單核細胞增多癥樣綜合征和艾滋病患者的口毛粘膜白斑病。EBV也與某些類型的癌癥如Burkitt’s淋巴瘤,鼻癌,何杰金氏病,EBV-相關的T-細胞淋巴瘤和鼻T-細胞淋巴瘤。某些患者,尤其是免疫系統(tǒng)受抑制的患者,如接受免疫抑制劑治療的艾滋病患者和器官移植患者,對EBV表現(xiàn),特別是EBV-相關的淋巴瘤的發(fā)展尤其敏感。
術語“帶狀皰疹病毒”(VZV)用于描述herpesvirus Varicellae,也稱為水痘或帶狀皰疹。VZV是一種herpetovirus并與單純皰疹病毒在形態(tài)學上不同,在人體引起水痘或帶狀皰疹。水痘是由于病毒的初級感染引起的;帶狀皰疹是由于相同病毒的二級侵入引起的,或在許多情況下可以由潛伏幾年的感染再活化引起的。
術語“皰疹病毒8”或HV-8用于整個說明書描述據信在艾滋病患者體內的卡波西肉瘤的致病劑。HV-8和HHV-8(人皰疹病毒8)是同一種病毒。
術語“藥用衍生物”用于整個說明書描述核苷化合物的任何藥用鹽或前藥形式(如酯,磷酸酯或酯的鹽),根據對患者的給藥,直接或間接提供核苷化合物或核苷化合物的活性代謝物。一般地,由于尿嘧啶堿的存在,本發(fā)明化合物的游離核苷形式或酰基前藥形式不直接形成鹽。但是,本發(fā)明核苷化合物的一-,二-和三-磷酸酯形式將在磷酸部分形成鹽。藥用鹽包括從藥用的無機或有機堿和酸衍生的鹽。合適的鹽包括從堿金屬如鉀和鈉,堿土金屬如鈣,鎂和銨鹽衍生的鹽,其中大量的其他酸是藥學專業(yè)公知的。
術語“酰基”用于整個說明書描述在核苷類似物的5’-位(即在二氧戊環(huán)部分的游離羥基位)的基團,它含有C1至C20直鏈,支鏈或環(huán)烷基鏈。5’位的?;c5’位的羥基結合產生酯,給藥之后,該酯可以裂解產生本發(fā)明的游離核苷形式。根據本發(fā)明的?;山Y構
-表示,其中R2是C1至C20直鏈,支鏈或環(huán)烷基鏈,烷氧基烷基,芳氧基烷基,如苯氧基甲基,芳基,烷氧基,等等。優(yōu)選的?;瞧渲蠷2是C1至C3的?;8鶕景l(fā)明的?;舶?,例如,苯甲酰基,取代的苯甲酰基,如3-氯苯甲?;?,琥珀酸基,甲磺酰基,己?;?,己酸,月桂酸,肉豆蔻酸,棕櫚酸,硬脂酸或油酸的?;?,等等。本專業(yè)技術人員應該認識到,在本發(fā)明中具有用途的酰基要么能用于合成目標藥用化合物,要么能作為根據本發(fā)明的核苷的前藥。
術語“磷酸酯”用于整個說明書描述二氧戊環(huán)部分的的5’位的單磷酸酯基,它被二酯化而呈現(xiàn)中性,即具有中性電荷。用于本發(fā)明的磷酸酯包括由如下結構表示的酯
其中R3選自C1至C20直鏈,支鏈或環(huán)烷基,烷氧基烷基,芳氧基烷基,如苯氧基甲基,芳基,烷氧基,等等。用于本發(fā)明前藥形式的優(yōu)選的單磷酸酯是其中C1至C20是直鏈,支鏈烷基,最優(yōu)選C1至C3烷基的酯。根據本發(fā)明的磷酸酯也稱為“磷酸二酯(phosophodiester)”基團,該術語作為同意詞使用。
術語“抑制有效濃度”或“抑制有效量”用于整個說明書描述基本上或明顯抑制敏感病毒,尤其包括EBV,VZV和HV-8的生長或復制的本發(fā)明化合物的濃度或量。
術語“治療有效量”或“治療上有效的量”用于整個說明書描述在治療人體EBV,VZV和HV-8感染中治療有效的本發(fā)明化合物的濃度或量。
術語“預防有效量”用于整個說明書描述在人體內預防或延緩EBV,VZV和HV-8感染或相關病癥(特別是EBV相關的癌癥或淋巴瘤和卡波西肉瘤)的發(fā)病時預防有效的本發(fā)明化合物的濃度或量。
術語“L-構型”用于整個說明書描述本發(fā)明二氧戊環(huán)尿嘧啶核苷化合物的化學構型。本發(fā)明糖部分的L-構型與大多數(shù)天然存在的核苷如胞嘧啶核苷,腺苷,胸苷,鳥苷和尿苷的核糖的D-構型相反。
術語“對映體富集”用于整個說明書描述包括一種核苷的至少約95%,優(yōu)選地至少約96%,更優(yōu)選至少約97%,更優(yōu)選至少約98%,還更優(yōu)選至少約99%或更高的單個對映體的核苷。除非另外說明,當L-核苷出現(xiàn)在本說明書中時,核苷是對映體富集的核苷。
本發(fā)明涉及這一令人吃驚的發(fā)現(xiàn)含有二氧戊環(huán)部分,具有L-構型(與天然存在的D-構型相反)β-L-二氧戊環(huán)基核苷類似物出乎意料地顯示出很強的抗EB病毒(EBV),帶狀皰疹病毒(VZV)和卡波西肉瘤病毒(也稱為皰疹病毒8或HV-8)活性。特別地,本發(fā)明化合物顯示出對病毒很強的抑制作用,同時對宿主細胞(即動物或人體組織)具有很低的毒性。
本發(fā)明也涉及這一出人意料的發(fā)現(xiàn)(2S,4S)-1-[(羥基甲基)-1,3-二氧六環(huán)基-4-基]-5-溴代尿嘧啶(β-L-Br-OddU)和(2S,4S)-1-[(羥甲基)-1,3-二氧六環(huán)-4-基]-5-碘代尿嘧啶(β-L-I-OddU)是具有相對低毒性,極其有效的抗-EBV劑,尤其是與已經顯示抗-EBV活性的D-核苷類似物相比。
因此,本發(fā)明涉及如下結構的一組化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20?;蛎鸦?,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本發(fā)明的這方面,R優(yōu)選地是Br或I,R1是H。最優(yōu)選地,R是I。
本發(fā)明也涉及抑制EB病毒(EBV),帶狀皰疹病毒(VZV)和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生長或復制的方法,包括使病毒與抑制有效濃度的如下結構的化合物接觸
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20酰基或醚基,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本發(fā)明的這一方法方面,R優(yōu)選地是Br或I,R1最優(yōu)選地是H。
本發(fā)明也涉及治療患有由EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)引起的感染的患者的方法,該方法包括對所說的患者施用治療有效濃度或量的如下結構的化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20酰基或醚基,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本發(fā)明的此方法方面,R優(yōu)選地是Br或I,當被EBV感染時,最優(yōu)選I,當被VZV感染時最優(yōu)選Br,R1最優(yōu)選地是H。
本發(fā)明化合物最有用的是其抗-EBV,抗-VZV和抗-HV-8活性。本發(fā)明化合物也有用的是其他抗病毒活性。另外,這些組份也在作為其他核苷或核苷類似物的化學合成中間體時發(fā)現(xiàn)了用途,而這些其它核苷或核苷類似物則可用作治療劑或其他目的,包括在生物試驗中的用途,或作為生物學探針。優(yōu)選地,這些化合物用作新的抗-EBV,抗-VZV或抗-HV-8劑。
一般說來,最優(yōu)選的本發(fā)明抗病毒化合物包括對宿主細胞更少細胞毒性,而對靶病毒更有活性的化合物。某些化合物,以藥物劑型,可被用作預防劑。這些可能是特別合適的抗-EBV,抗-VZV或抗-HV-8劑。由于其對患者特別低的毒性和優(yōu)秀的抗病毒活性,對于治療和/或預防EBV,VZV和HV-8感染,β-L-Br-OddU和β-L-I-OddU是特別有效的抗-預防化合物。
本發(fā)明化合物通過本專業(yè)已知的合成方法生產,包括各種在下面的實施例中明顯地更詳細說明的合成方法。一般地,本發(fā)明化合物通過預先合成的核苷堿與合適的二氧戊環(huán)基合成子縮合而合成,將最終給出具有所需的L-構型的核苷類似物。在某些情況下,合成途徑可偏離特定核苷類似物的一般合成途徑。
在本發(fā)明各種組份的化學合成期間,本專業(yè)技術人員可以不需要過分試驗而實施本發(fā)明。具體地,本專業(yè)技術人員將認識在堿所需的位置引入特定取代基或在糖部分的所需位置引入取代基的各種步驟。另外,用于“保護”官能團如羥基或氨基等等,以及使該官能團“脫保護”的化學步驟,在合成的情況下將被認為是合適的。大量保護基可被用于本發(fā)明。在將任何一個或多個?;牒塑盏?’位(或尿嘧啶堿)的情況下,可用本專業(yè)公知的標準技術。5’-一,二-或三磷酸酯,或磷酸二酯(中性前藥形式),也可通過本專業(yè)公知的方法合成。
一般說來,本發(fā)明化合物的合成通過首先合成合適的二氧戊環(huán)合成子,然后使取代的堿與二氧戊環(huán)合成子縮合。用于合成本發(fā)明化合物的適當?shù)暮铣赏緩娇梢栽趫D解1-3中找到,并一般在實施例中描述。各種相當?shù)暮铣煞椒捎糜诤铣杀净衔铩?br>
本發(fā)明的治療方面涉及治療人體EBV,VZV或HV-8感染的方法,包括對需要治療的患者施用抗病毒有效量的本發(fā)明化合物,抑制病毒的生長或復制。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法方面,本發(fā)明組合物被用于預防或延緩EBV-相關的淋巴癌或癌癥或患者體內的卡波西肉瘤,包括已經輸血的患者和免疫缺損或免疫損傷的患者,例如,AIDS病患者和移植患者,等等。該方法包括這類患者施用預防有效量(一般與治療有效量相同)的一種或多種本發(fā)明組合物,延緩或預防EBV,VZV或HV-8的感染。
基于這些新化合物的藥物組合物包括用于治療病毒,尤其是EBV,VZV或HV-8感染,治療有效量的上述化合物,非強制性地與藥用添加劑,載體或賦性劑結合。本專業(yè)技術人員應該認識到,治療有效量將隨感染或被治療的病癥,其病情,所用治療方案,所用藥劑的藥物動力學,已經被治療的患者(動物或人)而變化。
在本發(fā)明的藥物方面,本發(fā)明化合物優(yōu)選地與藥用載體混合配制。一般地,藥物組合物以口服給藥的形式是優(yōu)選的,但某些制劑可以經腸胃外,靜脈內,肌內,經皮,頰內,皮下,栓劑或其他途徑給藥。靜脈內和肌內制劑優(yōu)選地在無菌食鹽水中給藥。當然,本專業(yè)技術人員可以在本說明書的指導下修改配方,提供許多特殊給藥途徑的制劑,不使本發(fā)明的組合物不穩(wěn)定或損害其治療活性。具體地,本發(fā)明化合物使其在水或其他載體中更易溶解的修飾,例如,可以容易地通過本專業(yè)技術人員公知的很小的修改(鹽配方,酯化,等等)而完成。修改給藥途徑和具體化合物的劑型以使本發(fā)明化合物的藥物動力學在患者體內達到最佳效果,也是普通技術人員已知的。
在某些藥物劑型中,化合物的前藥形式,特別包括?;?乙?;蚱渌?和醚衍生物,吡啶酯,磷酸酯和本發(fā)明化合物的各種鹽形式,是優(yōu)選的。本專業(yè)技術人員將知道如何將本發(fā)明化合物修飾為前藥形式以促進活性化合物在宿主器官或患者體內向靶位的輸送。按程序操作者也會采用前藥形式的有用的藥物動力學參數(shù)的優(yōu)點,如果可以應用,將本發(fā)明化合物輸送到宿主器官或患者體內的靶位以使化合物的效果達到最佳。
包括在本發(fā)明治療活性制劑內的化合物的量是治療感染或病癥,在優(yōu)選的方案中是EBV,VZV或HV-8感染有效量的。一般說來,本發(fā)明化合物在藥物劑型中的治療有效量通常在約0.1mg/kg至約100mg/kg或更高,更優(yōu)選地,略少于約1mg/kg至約25mg/kg患者體重,或者更重要地,取決于所用化合物,所治療的病癥或感染和給藥途徑。在用β-L-Br-OddU或β-L-I-OddU治療EBV,VZV或HV-8的情況下,根據藥劑在患者體內的藥物動力學,化合物優(yōu)選地以約1mg/kg至約25mg/kg患者體重范圍的量給藥。此劑量范圍一般產生活性化合物有效的血中濃度,其范圍為約0.05至約100微克/cc血液。本發(fā)明組合物的預防性或預防有效量與前面給出的治療有效量的濃度范圍相同,并且往往與治療有效量相同。
活性化合物的給藥可以在連續(xù)(靜脈滴注)至每天幾次口服給藥(例如,Q.I.D.)的范圍內,并包括口服,局部,腸胃外,肌內,靜脈內,皮下,經皮(可包括滲透促進劑),頰內和栓劑給藥,和其他給藥途徑。腸衣口服片劑也可用于在口服給藥途徑中促進化合物的生物共容性。
為了制備本發(fā)明的藥物組合物,優(yōu)選地根據常規(guī)藥物配合技術,將治療有效量的一種或多種本發(fā)明化合物與藥用載體充分混合而生產藥劑。載體可以根據需要給藥,例如口服或腸胃外的制劑形式,采取很多形式。在制備口服劑型的藥物組合物時,可以使用任何常用的藥物介質。因此,對于液體口服制劑如懸浮劑,弛劑和溶液,合適的載體和添加劑包括水,甘醇,油,醇,調味劑,防腐劑,著色劑等等可被使用。對于固體口服制劑如粉劑,片劑,膠囊,和對于固體制劑如栓劑,合適的載體和添加劑包括淀粉,糖載體,如葡萄糖,甘露糖醇,乳糖和相關載體,稀釋劑,成粒劑,潤滑劑,黏合劑,崩解劑等等也可使用。如果需要,片劑或膠囊可以包腸衣或通過標準技術緩釋。這些劑型的使用可以使化合物在患者體內的生物共容性明顯增加。
對于腸胃外制劑,載體通常包括無菌水或氯化鈉水溶液,盡管其他成分,包括幫助分散的成分,也可被包括。當然,在使用無菌水并保持無菌的同時,組合物和載體也必須被滅菌。也可制備可注射的懸浮液,在這種情況下,可以應用合適的液體載體,懸浮劑等等。
也可以通過常規(guī)方法制備脂質體懸浮液(包括瞄準病毒抗原的脂質體)以生產藥用載體。這對于輸送本發(fā)明核苷化合物的游離核苷,?;塑栈蛄姿狨デ八幮问绞呛线m的。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的方案中,化合物和組合物被用于治療,預防或延緩哺乳動物病毒感染的發(fā)病,尤其是人體EBV,VZV和HV-8感染。在其優(yōu)選的方案中,化合物被用于治療EBV,VZV和HV-8感染,尤其包括慢性EBV感染。優(yōu)選地,為了治療,預防或延緩EBV,VZV和HV-8感染的發(fā)病,組合物可被以口服劑型,以約250微克至最高約500mg或更高的量給藥,每天至少一次,優(yōu)選地,最高一天四次。本發(fā)明化合物優(yōu)選地被口服給藥,但可被腸胃外,局部或以栓劑形式給藥。
本發(fā)明化合物,由于其對宿主細胞的低毒性,可以有利地預防性應用,預防EBV,VZV和HV-8感染,或預防與病毒感染相關的臨床癥狀的發(fā)生。因此,本發(fā)明包括預防性治療病毒感染,尤其是EBV,VZV和HV-8感染的方法。在本發(fā)明的這一方面,本發(fā)明組合物被用于預防或延緩EBV,VZV和HV-8感染,或EBV-,VZV-或HV-8-相關的疾病如淋巴癌或癌癥,包括患者體內的卡波西肉瘤,包括已進行輸血的患者和免疫缺損或無免疫應答的患者,例如艾滋病患者和移植患者,等等。此預防方法包括對需要這類治療或處于EBV-,VZV-或HV-8-相關的病癥或疾病危險的患者施用對于減輕,預防或延緩病毒感染發(fā)病有效量的本發(fā)明化合物。在本發(fā)明的預防性治療中,所用抗病毒化合物是低毒性,優(yōu)選地對患者無毒是優(yōu)選的。在本發(fā)明的此方面,所用化合物是抗病毒最有效的,并且對患者顯示出最小的毒性是特別優(yōu)選的。在β-L-Br-OddU和β-L-I-OddU的情況下,更優(yōu)選地在EBV,β-L-I-OddU的情況下,更優(yōu)選地在VZV,β-L-Br-OddU的情況下,這些化合物可以在與作為預防EBV,VZV和HV-8增殖,或者延緩在臨床癥狀中顯示的EBV,VZV和HV-8感染的發(fā)作的預防劑相同的劑量范圍(即,約250微克至最高約500mg或更高,每天1至4次,口服劑型)給藥而用于治療。
另外,本發(fā)明化合物可以單獨給藥或與其他藥劑,特別包括本發(fā)明其他化合物結合給藥。本發(fā)明某些化合物對于通過降低代謝或使為些預定效應而共同給藥的其他化合物等失活而增加本發(fā)明某些藥劑的生物活性是有效的。
在特別優(yōu)選的藥物組合物和治療EBV,VZV和HV-8感染的方法中,抑制有效量的β-L-Br-OddU或β-L-I-OddU對患有這類感染的患者給藥,治療感染并減輕這類感染的病癥。
在特別優(yōu)選的藥物組合物和治療EBV感染的方法中,抑制有效量的β-L-I-OddU對患有EBV感染的患者給藥,抑制感染并減輕這類感染的病癥。
在特別優(yōu)選的藥物組合物和治療VZV感染的方法中,抑制有效量的β-L-Br-OddU對患有VZV感染的患者給藥,抑制感染并減輕這類感染的病癥。
在不受理論限制的同時,我們相信,本發(fā)明化合物首先通過抑制病毒DNA聚合酶,或通過將核苷化合物摻入病毒DNA中導致鏈終止,從而誘發(fā)其對病毒生長或復制的抑制作用。
本發(fā)明現(xiàn)在在下列實施例中,純粹以舉例說明的方式進行描述。本專業(yè)技術人員應該懂得,這些實施例不在任何意義上限制本發(fā)明范圍,細節(jié)的變化可以在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下進行。
實施例L-二氧戊環(huán)基嘧啶核苷的合成一般地,本發(fā)明化合物根據下述化學合成法合成。用于合成本發(fā)明化合物的合成化學方法學代表文獻方法的改進。在下面實施例中給出了參考,從該參考可以看出,相關的化學反應已經被改進以生產本發(fā)明化合物。
熔點在Mel-temp II實驗裝置上測定并且未經校正。NMR譜在Bruker250或Bruker 400 Fourier變換光譜儀上記錄;化學位移以每百萬分之幾(δ)報道,信號以s(單峰),d(雙峰),t(三重峰),q(四重峰),m(多重峰),和dd(雙倍雙峰)表示。UV譜用Beckman DU-7分光光度計獲得。旋光度用JASCO DIP-370數(shù)字旋光儀測量。TLC用從Analtech Co.購買的Uniplates(硅膠)進行。元素分析用Atlantic Microlab,Inc.,Norcross,GA進行。干燥的1,2-二氯乙烷,二氯甲烷,乙腈,苯和吡啶通過在使用之前從CaH2中蒸出而獲得。當溶液變紅紫時,干燥的THF通過從鈉和二苯酮中蒸出而獲得。
2,3,5,6-二異亞丙基-L-古洛糖酸-γ-內酯(2)的合成往配有機械攪拌器的5L三頸燒瓶中依次加入L-古洛糖酸(gulono)-γ-內酯1(100g,0.56mol),無水硫酸銅(279g)和無水丙酮(2.5L,用4分子篩干燥)。開始攪拌后加入濃硫酸(10ml)。反應混合物在氮氣氛中攪拌24小時。將混合物用固體碳酸鈉中和并過濾。濾液濃縮至干,殘余物分配在二氯甲烷(300mL×3)和水(300mL)之間。合并的有機層用水(300mL)和飽和碳酸鈉(250mL)洗滌,硫酸鈉干燥。過濾,濃縮至漿狀物,加入二氯甲烷(200mL)以溶解殘余物,然后將己烷加入直至溶液變渾。將固體濾出并用己烷洗滌。將三部分合并,真空干燥??偣驳玫?01.84g產品2(70.3%,Rf=0.77,氯仿/甲醇,10∶1)。
2,3,5,6-二異亞丙基-L-古洛糖酸-γ-乳醇(3)的合成往在烘箱中干燥然后用氮氣清洗的3L三頸燒瓶中加入無水THF(1L)和保護的內酯2(101.84g,0.39mol)。將溶液攪拌并用干冰-丙酮冷浴冷卻。溶液溫度降至-78℃后,在氮氣氛中通過滴液漏斗滴加DIBAL-H(500mL,1M己烷)。將混合物攪拌2小時,然后加入甲醇(140mL)淬滅反應。形成一個大白塊。加入飽和的酒石酸鈉鉀直至固體消失。分出有機層,水層用乙酸乙酯(300mL×2)萃取。合并的有機層用水(400mL),飽和碳酸氫鈉(250mL)和食鹽水(250mL)洗滌,無水硫酸鈉干燥。過濾,減壓蒸發(fā)溶劑,給出白色固體,將其用柱子(硅膠,甲醇/二氯甲烷,5-10%)純化給出產品3(95.05g,93%,Rf=0.64,甲醇/氯仿,1∶10)1,6-脫水-β-L-古洛吡喃糖(gulopyranose)(4)往2L燒瓶中加入乳醇3(95g,0.36mol)和0.5N鹽酸(950mL,0.47mol)。將溶液回流攪拌24小時,然后將混合物冷卻,并用Dowex-2樹脂(HCO3-型)中和至pH=6,并鼓入空氣以除去產生的二氧化碳。將混合物過濾,樹脂用水(1000mL)充分洗滌。將合并的濾液減壓濃縮至干,產生的殘余物與絕對乙醇共蒸發(fā),直至形成泡沫狀固體。將固體用柱子(硅膠,甲醇/二氯甲烷10-25%)純化給出淺黃色固體,將其從絕對乙醇中重結晶產生無色固體4(25.2g,42.2%,Rf=0.62,甲醇/氯仿1∶3,m.p.142-145℃)。用50%甲醇-二氯甲烷從柱子上洗下另一產物,L-古洛糖(Rf=0.25,甲醇/氯仿),并濃縮為黑色殘余物,將其在同樣反應條件下循環(huán)給出4(13.5g,22.6%)??偖a率為64.8%。1HNMR(DMSO-d6)δ3.22-3.68(m,4H,H-2,-3,-4,and-6a),3.83(d,J6b,6a=7.25Hz,1H,H-6b),4.22(pseudot,J5,6a=4.61 and 4.18Hz,1H,H-5),4.46(d,J2OH,2=6.59Hz,1H,2-OH可用D2O交換),4.62(d,J3OH,3=5.28Hz,1H,3-OH,可用D2O交換),5.07(d,J4-OH,4=4.84Hz,1H,4-OH,可用D2O交換hD2O),5.20(d,J1,2=2.19Hz,1H,H-1).
(1’S,2S,4S)-4-[(1,2-二羥基-1,2-O-異亞丙基)乙基]-2-(羥基甲基)二氧戊環(huán)(6)在0℃,10分鐘內,將NaIO4(5.5g,25.7mmol,1.4當量)水溶液通過滴液漏斗滴加到4(3g,18.5mmol)的甲醇(100ml)溶液中,將混合物機械攪拌15分鐘。加入硼氫化鈉(2.1g,56mmol),將反應混合物再攪拌10分鐘。濾出白色固體,并將固體用甲醇(100mL)洗滌。合并的濾液在0℃通過0.5N鹽酸中和,然后濃縮至干,殘余物與絕對乙醇(20mL×5)共蒸發(fā),再真空干燥過夜。加入甲醇(100mL)以溶解殘余物,濾出白色固體,將濾液濃縮至干,然后加入干燥的丙酮(300mL),p-TsOH.H2O(4g)。將反應混合物攪拌2小時,然后用三乙胺中和。過濾,濃縮為漿狀物,用柱子(硅膠,乙酸乙酯-己烷,1∶1)純化給出6(1.6g,42%,Rf=0.71,乙酸乙酯/Hx,2∶1)無色油狀物。1HNMR(DMSO-d6)δ1.25 and 1.31(2s,2x3H,異亞丙基),3-39(dd,JCH2OH,H2=3.86Hz,JCH2OH,OH=6.09Hz,2H,-CH2OH),3.61-4.10(m,6H,H-4,-5,-1′and-2′.),4.82(t,JH2,CH2OH=3.87Hz,1H,H-2),4.90(t,JOH,CH2OH=6.09Hz,1H,-OH,可用D2O交換)(1’S,2S,4S)-4-[(1,2-二羥基-1,2-O-異亞丙基)乙基]-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊環(huán)(7)在0℃,氮氣氛中,將苯甲酰氯(4.4mL,37.5mmol)經注射器滴加到6(5.7g,28mmol)的吡啶-二氯甲烷(1∶2,80mL)溶液中。將溫度升至室溫。攪拌2小時后,TLC指示反應完成,用甲醇(10mL)淬滅反應。將溶液濃縮至干,產生的殘余物溶于二氯甲烷(300mL),并用水(100ml×2),食鹽水(100mL)洗滌,硫酸鈉干燥,過濾,蒸發(fā)給出黃色漿狀物,通過硅膠柱層析(乙酸乙酯/Hx,5-20%)純化,給出7(7.39g,86%,Rf=0.48,乙酸乙酯/Hx,1∶3)無色油狀物。
1HNMR(CDCl3)δ1.35and 1.44(2s,2x3H,異亞丙基),3.77-4.51(m,8H,H-4,H-5,H-1′,CH2OBz),5.29(t,J=3.78Hz,1H,H-2),7.40-7.60,8.05-8.09(m,3H,2H,OBz).
(1’S,2S,4S)-4-(1,2-二羥基乙基)-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊環(huán)(8)攪拌下,往7(13.62g,45mmol)的甲醇(30mL)溶液中加入p-TsOH(1.3g,6mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時,TLC顯示反應完成。將溶劑蒸發(fā)至一半體積,加入甲醇(50mL)和p-TsOH(0.65g)。再攪拌1小時后,反應混合物用三乙胺中和并蒸發(fā)至干。將殘余物通過硅膠柱層析(乙酸乙酯/Hx,10-15%)純化給出8(9.8g,83%,Rf=0.31,乙酸乙酯/Hx,2∶1)無色油狀物。1HNMR(DMSO-d6)63.43(m,2H,H-2′),3.67-4.1(m,4H,H-4,-5,-1′),4.32(d,J=3.73Hz,2H,CH2OBz),4.60(t,J=5.72Hz,2'-OH,可用D2O交換),5.23(t,J=3.96H.z,1H,H-2),7.45-7.7,7.93-8.04(m,3H,2H,OBz).
(2S,4S)-和(2S,4R)-4-乙酰氧基-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊環(huán)(10)將NaIO4(10.2g,48mmol)的水(120mL)溶液通過滴液漏斗滴加到8(3.1g,11.0mmol)的四氯化碳-乙腈(1∶1,160mL)溶液中。然后加入RuO2.H2O(0.03g)。將反應混合物攪拌5小時,TLC顯示反應完成,用硅藻土墊濾出固體。將濾液蒸發(fā)至1/3體積,然后加入(150mL),分出有機層,水層用二氯甲烷(50mL×3)萃取。合并的有機層用食鹽水(100mL)洗滌,硫酸鎂干燥。用硅藻土墊過濾,然后蒸發(fā)至干。漿狀物與干燥的THF(20mL×5)共蒸發(fā),再真空干燥過夜給出粗產物9(2.9g)。
將粗產物9溶于干燥的THF(60mL),然后在氮氣氛中加入Pb(OAc)4(5.48g,12.4mmol)和吡啶(0.83mL,10.3mmol)?;旌衔飻嚢?小時后,TLC顯示反應完成。用硅藻土墊濾出固體并用乙酸乙酯(100mL)洗滌。將合并的有機層蒸發(fā)至干,然后通過硅膠柱層析(乙酸乙酯/Hx,30-35%)純化給出異頭物混合物10(1.93g,63%,Rf=0.64和0.54,己烷/乙酸乙酯,2∶1)無色油狀物。
1HNMR(CDCl3)δ1.998,2.11(2s,3H,Oac),3.93,4.33(m,2H,H-5),4.43,4.48(2d,J=3.73,3.74Hz,2H,CH2OBz),5.46,5.55(2t,J=4.18,3.63Hz,1H,H-2),6.42(m,1H,H-4),7.33-7.59,8.00-8.15(m,3H,2H,-OBz).
(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]尿嘧啶(11)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]尿嘧啶(12)將尿嘧啶(0.63g,5.6mmol)和HMDS(25mL),硫酸銨(5mg)的混合物在氮氣氛中攪拌5小時。所產生的清亮的溶液在無水條件下真空濃縮得到油狀物(甲硅烷基化的尿嘧啶),將其溶于干燥的DCE(10mL)。在氮氣氛中加入二氧戊環(huán)乙酸酯10(1g,3.7mmol),然后加入TMSOTf(1.4mL)?;旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時,然后通過加入飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)淬滅。將反應混合物再攪拌30分鐘?;旌衔镉盟?50mL)和二氯甲烷(100mL)稀釋。分出有機層,水層用二氯甲烷(80mL×3)萃取。合并的有機層飽和碳酸氫鈉水溶液(150mL),水(100mL)洗滌,干燥(硫酸鎂)。過濾,蒸發(fā)溶劑給出白色固體(0.936g,產率81%)。然后在室溫下將混合物用氨的甲醇溶液處理24小時,然后蒸發(fā)至干。殘余物通過硅膠柱層析純化,用甲醇/氯仿作洗脫劑給出13異構體11,異構體12和未分開的兩種異構體的混合物。β-異構體11Rf=0.31(MeOH/CHCI3,3∶10).UV(H2O)(pH7)261.0nm(ε10432),(pH11)260.5nm(ε7931),(pH2)261.0nm(ε10651)[(α]D25=E 20.93(c0.33,MeOH),1HNMR(DMSO-d6)δ11.32(s,NH),7.80(d,J=8.2Hz,1H,H-6),6.19(d,J=4.95Hz,1H,H-4′),5.61(d,J=7.98Hz,1H,H-5),5.18(t,1H,OH,可用D2O交換),4.90(t,J=2.75Hz,1H,H-2'),4.02-4.05(m,2H,H-5′),3.62(d,J=2.75Hz,2H,H-6′),計算值C8H10O5N2C,44.86;H,4.67;N,13.08.測定值C,44.94;H,4.78;N,13.02.α異構體12Rf=0.35(MeOH/CHCl3,3∶10).UV(H2O)(pH7)262.0nm(ε10684),(pH11)261.5nm(ε8246),(pH2)261.5nm(ε11208)[α]D25=-3.28(c0.72,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.37(br.s,NH),7.58(d,J=7.92Hz,1H,H-6),5.61(d,J=8.17Hz,1H,H-5),6.13(dd,J=5.43Hz,J=2.98Hz,1H,H-4′),5.43(t,J=3.6Hz,1H,H-2′),5.01(t,J=6.02Hz,OH,可用D2O交換),4.26(dd,J=5.6Hz,J=9.4Hz,1H,H-5'),4.05(dd,J=2.9Hz,J=9.3Hz,1H,H-5′),3.42(m,2H,H-6').計算值C8H10O5N2C,44.86;H,4.67;N,13.08.測定值C,44.77;H,4.65;N,13.00.
相同的工藝被用于類似地合成其他5-取代的核苷。
下面給出其余L-核苷類的分析數(shù)據(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-氟尿嘧啶(13)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-氟尿嘧啶(14)β-異構體13的數(shù)據Rf=0.54(MeOH/CHCI3 1∶4).UV(H2O)(pH7)268.0nm(ε9966);(pH11)268.0nm(ε7822);(pH2)268.0nm(ε10128).[α]D25=7.73(c0.25,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.85(NH),8.24(d,1H,J=7.17Hz,H-6),6.17(d,1H,J=5.58Hz,H-4'),5.33(t,1H,5′-OH 可用D2O交換),4.90(s,1H,H-2′),4.28(d,J=4.0Hz,1H,H-5′),4.04(dd,J=4.0,8.0Hz,1H,H-5′),3.68(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2FC,41.38;H,3.88;N,12.07.測定值C,41.62;H,4.01;N,11.82.α-異構體14的數(shù)據Rf=0.53(MeOH/CHCI3,1∶4).UV(H2O)(pH7)268.5nm(ε10214),(pH11)268.0nm(ε8212),(pH2)268.5nm(ε12223).[α]D25=5.81(c,0.29,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.90(NH),7.88(d,J=6.82Hz,1H,H-6),6.10(m,1H,H-4′),5.49(t,1H,J=3.87Hz,H-2′),5.00(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.03-4.29(m,2H,H-5′),3.33(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2FC,41.38;H,3.88;N,12.07.FoundC,41.45;H,3.87;N,12.04.
(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-氯尿嘧啶(15)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-氯尿嘧啶(16)β-異構體15的數(shù)據Rf=0.61(MeOH/CHCl3,1∶4).UV(H2O)(pH 7)275.0nm(ε9018),(pH11)274.5nm(ε7408),(pH2)276.0nm(ε10432).[α]D25=2.98(c 0.26,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)6 11.86(NH),8.37(s,1H,H-6),6.17(d,J=5.23Hz, H-4′),5.37(t,J=5.65Hz,1H,5′-OH,D2O可交換),4.92(s,1H,H2′),4.02-4.34(m,2H,H-5′),3.66(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2ClC,38.63;H,3.62;N,11.27.測定值C,38.39;H,3.78;N,11.02.α-異構體16的數(shù)據Rf=0.56(MeOH/CHCl3,1∶4).UV(H2O)(pH7)276.0nm(ε9448),(pH11)274.5nm(ε8276),(pH2)276.5nm(ε9509).[α]D25=5.28(c0.31,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.67(NH),7.68(s,1H,H-6),5.90(d,J=4.0Hz,1H,H-4′),5.31(t,J=4.0Hz,1H,H-2′),4.76(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.10(dd,J=4.0,8.0Hz,1H,H-5'),3.92(dd,J=4.0,8.0Hz,1H,H-5′),3.24(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2ClC,38.63;H,3.62;N,11.27.測定值C,38.45;H,3.75;N,11.13.
(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-溴尿嘧啶(17)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-溴尿嘧啶(18)β-異構體17的數(shù)據RF=0.61(MeOH/CHCI3,1∶4).UV(H2O)(pH7)277.0nm(ε7229),(pH11)276.0nm(ε6981),(pH2)278.5nm(ε9939).[α]D25=4.61(c0.28,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.83(NH),8.45(s,1H,H-6),6.16(d,J=5.05Hz,1H,H-4′),5.36(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.92(s,1H,H-2′),4.01-4.34(m,2H,H5′),3.66(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2Br0.7CH3OHC,33.10;H,3.74;N,8.87.測定值C,33.50;H,3.34;N,8.46.
α-異構體18的數(shù)據Rf=0.58(MeOH/CHCI3,1∶4).UV(H2O)(pH7)279.0nm(ε11825),(pH11)276.0nm(ε8438),(pH2)279.0nm(ε11801).D25=3.67(c0.29,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.88(NH),7.92(s,1H,H-6),6.07(dd,1H,J=3.17Hz,5.4z,H-4′),5.50(t,J=4.0Hz,1H,H-2′),5.01(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.27(m,2H,H-5′),3.41(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2BrC,32.77;H,2.73;N,9.56.測定值C,32.71;H,3.12;N,9.45.
(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-碘尿嘧啶(19)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-碘尿嘧啶(20)β-異構體19的數(shù)據Rf=0.77(MeOH/CHCl3,1∶4).UV(H2O)(pH7)285.0nm(ε6628),(pH11)279.0nm(ε5593),(pH2)287nm(ε7350).[α]D25=7.60(c0.25,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(NH),8.42(s,1H,H-6),6.16(d,1H,J=4.0Hz,H-4′),5.30(br.s,1H,5′-OH,D2O可交換),4.93(s,1H,H-2′),4.04-4.31(m,2H,H-5′),3.66(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2lC,28.23;H,2.65;N,8.24.測定值C,28.36;H,2.66;N,8.18.α-異構體20的數(shù)據Rf=0.75(MeOH/CHCl3,1∶4).UV(H2O)(pH7)287.5nm(ε8946),(pH11)278.5nm(ε6383),(pH2)287.5nm(ε9049).[α]D25=-6.75(c0.33,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(NH),7.75(s,1H,H-6),5.92(dd,1H,J=4.0Hz,H-4′),5.32(t,J=4.0Hz,1H,H-2′),4.78(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.12(dd,J=4.0,8.0Hz,1H,H-5′),3.95(dd,J=4.0,8.0Hz,1H,H-5′),3.25(m,2H,H-6′).
計算值 C8H9O5N2lC,28.23;H,2.65;N,8.24.測定值C,28.23;H,2.73;N,8.17.
(2S,4S)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-三氟甲基尿嘧啶(21)和(2S,4R)-1-[2-(羥基甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]-5-三氟甲基尿嘧啶(22)β-異構體21的數(shù)據Rf=0.60(MeOH/CHCl3,1∶4).UV(H2O)(pH 7)261.0nm(ε10657),(pH11)259.0nm(ε7334),(pH2)261.0nm(ε11036)[α]D25=-5.94(c0.27,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)6 11.88(NH),8.84(s,1H,H-6),6.17(d,J=4.9Hz,1H,H-4′),5.40(t,J=5.47Hz,1H,5′-OH,D2O可交換),4.94(s,1H,H-2′),4.03-4.39(m,2H,H-5′),3.68(m,2H,H-6′).
計算值 C9H9O5N2F3.0.2EtOHC,38.73;H,3.50;N,9.61.測定值C,38.92;H,3.36;N,9.54.
α-異構體22的數(shù)據Rf=0.58(MeOH/CHCI3,1∶4).UV(H2O)(pH7)260.5nm(ε12221),(pH11)259.5nm(ε6750),(pH2)261.0nm(ε12342).[α]D25=-2.59(c0.26,MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.76(NH),7.80(s,1H,H-6),5.91(dd,1H,J=4.0Hz,H-4′),5.32(t,J=4.0Hz,1H,H-2′),4.82(t,1H,5′-OH,D2O可交換),4.00-4.18(m,2H,H-5′),3.31(m,2H,H-6′).
計算值 C9H9O5N2F3.O.1H2O,38.05;H,3.24;N,9.86.測定值C,37.75;H,3.31;N,9.80.
L-核苷類似物的生物活性L-OddT被發(fā)現(xiàn)如L-FMAU一樣是抗EBV活性的。在我們的研究中,當L-FMAU的5-甲基被溴基團取代時,抗-EBV活性實際降低。這意味著鹵素取代尿嘧啶堿5-位的甲基將實際降低尿苷L-核苷的活性。相反地,當L-OddT的5-甲基被溴基團取代時,抗-EBV活性實際增加。這是一個出人意料的結果。更詳細的構效關系和L-I-OddU和L-Br-OddU的生物活性在下面給出。
操作細胞培養(yǎng)高產量的產生EBV的從人P3HR1細胞衍生的細胞系H1被用于此研究中。細胞在用10%透析過的胎牛血清和100μg/ml卡拉霉素補充的PRMI培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在37℃在含有5%CO2的潤濕的培養(yǎng)器中生長。
H1細胞與藥物接觸在開始處理之前,H1細胞保持對數(shù)期生長兩天。將H1細胞以每孔2×105的密度在有或沒有藥物處理的2ml新鮮培養(yǎng)基中被接種到24孔板上,并在37℃溫育5天。在藥物處理的周期之后,將細胞成丸并被用于通過狹線印跡鑒定測定藥物對EBV DNA的抑制作用。
狹線印跡鑒定用各種核苷類似物(如下給出)處理過的總共4×105H1細胞通過凍融3次溶解于400μl 10mM Tris-HCl(pH 7.5)中。將細胞溶胞產物用核糖核酸酶A(以50μg/ml的最終濃度)在37℃處理30分鐘,然后用蛋白酶K(以100μg/ml的最終濃度)在55℃處理2小時。通過在pH 8.2調節(jié)最終濃度為0.4N/10mMEDTA使樣品變性。在100℃水浴中加熱10分鐘,樣品用多支管點在帶正電荷的尼龍膜上。然后α-32P-dCTP標記的EBV ECORIC碎片被用作DNA雜交的探針。剝離EBV ECORIC探針后,同樣的膜用人AluDNA(BAMH1碎片)再探測。自體放射照相的結果通過密度計分析。在處理過的H1細胞中的EBV DNA的量根據EBV DNA與Alu DNA的比例,與未處理的對照H1細胞相比較而測定。除去Alu DNA探針后,同樣的膜被用于通過與線粒體DNA探針再雜交而鑒定對線粒體的毒性。參見,例如,Yao,et al.,Antimic.Agents and Chemo.,July,1993,p.1420-1425;Yao,et al.,Biochem.Pharm.,Vol.51,941-947(1996)(EBV檢測);Doong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,8495-8499(十月,1991);和Bridges,et al.,Biochem.Pharm.,Vol.51,731-736(細胞毒性和mt DNA檢測)。
L-Br-OddU和L-I-OddU在BDF1小鼠體內的藥物動力學小鼠通過口服(po),腹膜內(ip)和靜脈內(iv)給藥50mg/kg用L-Br-OddU處理。在附圖5指示的時間之后,將血液從雌性BDF1小鼠的后眶叢導入肝素化的毛細管。通過離心將血漿與形成的元素分離。然后將100μl血漿與等體積的30%三氯乙酸混合,并在冰中保持10分鐘。離心后,將上層清液移入一清潔的試管中,并將100μl三辛基胺∶氟利昂(45-55%)的混合物與樣品混合以萃取酸。將水相移入一清潔的試管中并再用三辛基胺∶氟利昂混合物萃取。然后將50μl中和過的水相注射到Perkin Elmer HPLC體系中。將樣品用水的isocratic溶劑體系以每分鐘2ml從Altech C18柱洗脫。未知樣品的濃度通過與標準的已知濃度比較而測定。
在L-I-OddU的情況下,雌性BDF1小鼠在時間為零時口服給藥10mg/kg L-I-OddU。然后在附圖6指示的時間,將肝素化的血液樣品從后眶叢抽出。離心除去形成的元素。然后通過加入三氯乙酸萃取血漿,上層清液通過混合的三辛基胺-氟利昂中和。含水樣品部分通過HPLC分離,用Beckman ODS柱,0.03N乙酸/2.5%乙腈作溶劑。然后將血漿中的濃度與可靠的對照比較。
(1)L-二氧戊環(huán)尿苷類似物抗EBV,細胞生長,和線粒體DNA(mtDNA)含量的構效關系因為L-OddT被發(fā)現(xiàn)與L-FMAU一樣的抗EBV活性,如上所述合成的含有取代5-CH3的鹵素或氫的結構類似物被用于研究其抗EBV細胞生長活性和對mt DNA(如上所述)的細胞毒性。主要結果示于如下,最有活性的兩種抗EBV化合物的劑量應答曲線示于附圖4。
表2縮寫R抗-EBV EC50EC50μM 細胞毒性 mt DNA含量μM IC50μMID50μML-OddU H >50 -->100 無活性L-F-OddUF 50-->100 無活性
L-Cl-OddU Cl 3 -->100 無活性L-Br-OddU Br 0.22.0 >100 無活性L-I-OddUI 0.10.4 >100 無活性L-CF3-OddU CF33 -->100 無活性L-OddT CH3-5 ------D-I-OddUI 無活性 ------D-Br-OddU Br 無活性 ------L-Br-OddC 無活性 ------ddC無活性 200.02DHPG 575無活性結論L-Br-OddU和L-I-OddU是被試驗的最有效的抗-EBV化合物。它們對于線粒體或核DNA合成幾乎沒有作用。這由其對線粒體DNA含量和細胞生長沒有作用和沒有誘導在藥物處理過的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中乳酸的積累而反映。其具有天然D-構型的對映體的抗EBV活性小得多。而且,L-Br-OddC和L-I-OddC也沒有抗EBV活性。
(2)L-I-OddU的抗病毒活性譜L-I-OddU抗其他病毒生長的活性被試驗。主要結果示于如下。
表3
用于HSV-1,HSV-2和CMV的蝕斑減少檢測已經被描述過。參見,Gao,et al.,Antimic.Agents and Chemo.,May,1990,p.808-812(HSV-斑);Cheng,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.80,2767-2770(May 1983)(CMV蝕斑減少鑒定)。試驗抗EBV,HBV,和HIV的方法如前所述應用。參見Yao,et al.,Antimic.Agents and Chemo.,July,1993,p.1420-1425;Yao,et al.,Biochem.Pharm.,Vol.51,941-947(1996)(EBV鑒定);Doong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,8495-8499(十月,1991);Mellors,et al.,Molecular Pharm.,41446-451(1992)和Bridges,et al.,Biochem.Pharm.,Vol.51,731-736(HIV鑒定)。
與抗EBV和HBV活性的L-FMAU不同,L-I-OddU只具有很高的抗EBV活性,其EC50值比L-FMAU至少低四倍。值得注意的是,L-I-OddU顯示出很低的抗HBV活性。L-I-OddU的抗病毒譜與至今文獻中所述的任何抗病毒化合物都不相同。也表示該化合物的作用是對EBV專一的。
(3)L-I-OddU和L-Br-OddU抗EBV復制的劑量應答將H1細胞以指示的劑量與這兩種化合物接觸5天。藥物處理過的細胞的EBV DNA含量通過如上所述的狹線印跡雜交技術估計,并與無藥物的細胞比較。L-I-OddU抗EBV DNA合成方面比L-Br-OddU稍強。這些類似物的劑量應答曲線在附圖4中給出。
(4)L-I-OddU和L-Br-OddU在不同pH的穩(wěn)定性為了試探用L-I-OddU和L-Br-OddU口服治療EBV-相關疾病的可能性,其在不同pH水平的穩(wěn)定性是重要的。L-I-OddU在37℃置于如所示的不同pH下3小時?;衔锉3譃長-I-OddU的百分數(shù)用HPLC以C18柱檢驗。
表4%保持L-I-OddU L-Br-OddUpH1 102 105pH2 102 --pH5 102 --pH7 99--pH9 100 --
此研究有力地說明,L-I-OddU和L-Br-OddU可以口服使用,因為其在pH2是穩(wěn)定的,因此能夠通過小腸上部(十二指腸,空腸,回腸),在該處容易吸收而不被胃酸明顯地失活。
(5)L-I-OddU和L-Br-OddU在小鼠體內的初步藥物動力學研究L-Br-OddU和L-I-OddU的藥物動力學在BDF1小鼠體內如前所述進行檢驗。我們通過如上更詳細描述的,口服(po),腹膜內(ip),和靜脈內(iv)給藥50mg/kg進行初步藥物動力學研究。對于L-Br-OddU,ip和iv組的多相濃度曲線是相似的,因此,為了簡潔,只給出了ip曲線。在L-I-OddU的情況下,口服給藥被顯示。對于1997年11月13日的各個藥物的血漿濃度由附圖5和6表示。
從藥物動力學可以概括出,L-Br-OddU和L-I-OddU可以采取口服給藥,效率約60%,好于L-FMAU。
5-鹵素取代的L-OddU衍生物的抗VZV活性Varicella-Zoster病毒(VZV)的蝕斑減少試驗使用前2天,人包皮纖維細胞(HFF)被鋪入六孔板內,并在37℃,帶5%CO2,90%濕度下溫育。在試驗日期,藥物被用2%FBS基于MEM制成,然后用六種藥物濃度在MEM中系列稀釋1∶5。初始濃度為100μg/ml最低0.03μg/ml。用于感染的病毒在含10%FBS的MEM中稀釋至所需的濃度,每孔給出20-30斑。將培養(yǎng)基從孔中吸出,往每孔中加入0.2ml病毒三份,0.2ml培養(yǎng)基被加入藥物毒性孔中。然后將板溫育1小時,每15分鐘搖動一次。溫育后,含有各種藥物濃度的MEM以2.0ml的體積被加入合適的孔中。第5天再加入另外的培養(yǎng)基,培養(yǎng)物總共溫育10天。最后,將液體吸出,用6%中性紅溶液染色6小時,洗滌,用立體顯微鏡數(shù)斑數(shù)。結果與未處理的對照比較,并計算EC50和CC50值。結果示于下表5中。
表5藥物抗Varicella-Zoster病毒的效力和毒性藥物aEC50bCC50L-Cl-OddU 27.9 >100L-Br-OddU 0.8 >100L-I-OddU4.2 >100ACV(acycloguanine) 0.6 >100
aVZV的Ellen菌株,在人包皮(HFF0細胞)上的蝕斑減少試驗b未感染的HFF細胞,中性紅攝取細胞毒性鑒定。
通過5-鹵代的β-L-OddU類似物的VZV抑制,特別是,L-Br-OddU證明此化合物對于抗VZV感染是特別有效的化合物。
L-I-OddU的抗HV8活性DNA雜交,劑量應答實驗往體腔B細胞-淋巴癌細胞(被HV-8感染),每ml 5×105個細胞的種子密度,加入TPA(氟波醇酯)至濃度為20ng/ml。往此樣品中加入DHPG(20μM或5μM)或L-IOddU(20μM,5μM,0.25μM,或0.125μM)。該樣品在37℃溫育48小時。然后收獲細胞,并通過將1ml DNAzoltm試劑加入107細胞中,并通過輕輕吸液溶解細胞,提取DNA。然后通過加入0.5%乙醇(100%)沉淀溶胞產物中的DNA。樣品通過倒置而混合并在室溫下貯存3分鐘。然后將DNA沉淀用1ml 95%乙醇洗滌兩次。然后將DNA晾干5-15分鐘,然后再懸浮于300μl 8mM氫氧化鈉中。一旦DNA溶解,馬上將溶液用44μl 0.1M HEPES中和。然后測量DNA濃度,將2.5μg各個樣品的DNA用BAMHI限制酶在37℃消化1小時。各個樣品消化過的DNA然后在1%瓊脂膠上蔓生,然后轉移到Hybond-N紙上過夜。DNA印跡與HV-8(HHV-8)探針雜交過夜。第二天,將印跡洗滌并暴露于x-射線膠片幾天。然后將膠片顯影,然后將磷酸圖象儀用于測定各個帶的密度。
上述實驗的結果在附圖7中給出。這些結果證明,L-IOddU在各種濃度下的DNA雜交抑制百分數(shù)明顯地高于DHPG的DNA雜交,因而在這些細胞系中,L-IOddU顯示出更高的抗HV-8活性。預計L-IOddU體內抗HV-8是有效的。應該注意到,DHPG在5μM濃度下不顯示雜交抑制作用。
本專業(yè)技術人員應該懂得,前面的說明書和實施例是舉例性地實施本發(fā)明,但不在任何意義上具有限制作用。本文出現(xiàn)的細節(jié)的改變可以在不偏離如下面權利要求書定義的本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行。
權利要求
1.如下結構的化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20酰基或醚基,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
2.根據權利要求1的化合物,其中R是H,Br或I。
3.根據權利要求1的化合物,其中R是Br或I。
4.根據權利要求1的化合物,其中R是I。
5.根據權利要求1的化合物,其中R1是C1至C3?;?。
6.如下結構的化合物
其中R是Br或I而R1是H。
7.根據權利要求6的化合物,其中R是I。
8.一種用于治療在患者體內的EBV,VZV或HV-8感染的藥物組合物,包括治療有效量的如下結構的化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20?;蛎鸦?,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基,與藥用添加劑,賦性劑或載體結合。
9.根據權利要求8的組合物,其中R是Br或I而R1是H。
10.根據權利要求9的組合物,其中R是I。
11.根據權利要求9的組合物,其中R1是C1至C3?;?。
12.一種藥物組合物,包括治療有效量的(2S,4S)-1-[(羥甲基)-1,3-二氧六環(huán)-4-基]-5-碘代尿嘧啶或(2S,4S)-1-[(羥甲基)-1,3-二氧六環(huán)-4-基]-5-溴代尿嘧啶與藥用添加劑,賦性劑或載體結合。
13.一種治療在患者體內由EB病毒,帶狀皰疹病毒和卡波西肉瘤病毒引起的病毒感染的方法,包括對所說的患者施用治療有效量的如下結構的化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20?;蛎鸦?,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
14.根據權利要求13的方法,其中R是H,Br或I。
15.根據權利要求13的方法,其中R是Br或I。
16.根據權利要求13的方法,其中所說的病毒感染是由EB病毒引起的,而R是I。
17.根據權利要求13的方法,其中R是C1至C3酰基。
18.根據權利要求13的方法,其中所說的病毒感染是由帶狀皰疹病毒引起的,而R是Br。
19.一種治療在患者體內EB病毒感染,帶狀皰疹病毒感染或HV-8感染的組合物,包括如下結構的化合物
其中R是Br或I而R1是H。
20.根據權利要求17的化合物,其中R是I。
21.預防或延緩患者體內的EBV-相關的淋巴癌或癌癥或卡波西肉瘤發(fā)病的方法,包括對處于患EBV-相關的淋巴瘤或癌癥或卡波西肉瘤危險的患者施用治療有效量的如下結構的化合物
其中R是H,F(xiàn),Cl,Br,I,CH3或CF3;和R1是H,C1至C20酰基或醚基,磷酸酯基,二磷酸酯基,三磷酸酯基或磷酸二酯基。
22.根據權利要求21的方法,其中所說的患者是免疫缺損的患者。
23.根據權利要求21的方法,其中所說的患者是器官移植患者。
24.根據權利要求21的方法,其中所說的患者被輸過血。
25.根據權利要求21的方法,其中R是I或Br。
全文摘要
本發(fā)明涉及這樣一個發(fā)現(xiàn),即某些含有尿嘧啶堿,優(yōu)選地為5-鹵素取代的尿嘧啶堿的β-L-二氧戊環(huán)核苷類似物出乎意料地顯示出具有很高的抗EB病毒,帶狀皰疹病毒和人皰疹病毒8(HV-8)活性。具體地,本發(fā)明的化合物顯示出很強的病毒復制(病毒生長)抑制作用,而對宿主細胞(即,動物或人體組織)只有很低的毒性?;衔锟捎糜谥委熑梭w的EBV,VZV和HV-8感染。
文檔編號A61K31/506GK1244799SQ97181404
公開日2000年2月16日 申請日期1997年11月14日 優(yōu)先權日1996年11月15日
發(fā)明者鄭永齊, 朱重光, 曲福成 申請人:耶魯大學, 佐治亞大學研究基金會