專利名稱：抗菌活性多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療的新多肽以及它們的功能衍生物和藥用可接受鹽。新的多肽各自本身或者一種或多種肽的結(jié)合具有抗細(xì)菌或真菌的用途。
蛙的皮膚分泌物含有許多不同類型的抗細(xì)菌肽(Barra，D.&Simmaco，M.(1995)在生物技術(shù)動(dòng)態(tài)(Trends Biotechnol.)13，205-209發(fā)表了綜述兩棲動(dòng)物的皮分泌物抗菌肽的潛在資源)。特別是，已經(jīng)從蛙屬的幾個(gè)種中分離到多種這樣的肽。它們?cè)诳拷麮OOH-末端都含有2個(gè)半胱氨酸殘基，形成分子內(nèi)的二硫化物鍵?？梢詫⑦@些肽區(qū)分為4種不同的類型。一類是brevinin 1系列，包括來自Ranabrevipoda porsa的brevinin 1(Morikawa，N.，Hagiwara，K.&Nakajima，T.(1992)從蛙Rana brevipoda porsa皮中獲得的獨(dú)特的抗菌肽Brevinin 1和Brevinin 2，Biochem.Biophys.Res.Commun.189，184-190)，從側(cè)褶蛙(Rana esculenta)中獲得的Brevinin 1E(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽.編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)269，11956-11961)，從牛蛙(Rana catesbeiona)中獲得的ranalexin(Clark，D.P.，Durell，S.，Maloy，W.L.& Zasloff，M.(1994)，Ranalexin，來自牛蛙(Rana catesbeiana)皮的一種新的抗菌肽，結(jié)構(gòu)上類似細(xì)菌抗生素，多粘菌素，J.Biol.Chem.269，10849-10855)，以及從粗皮蛙(Rana rugosal)中獲得的gaegurin 5和6(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，從朝鮮蛙，粗皮蛙皮中獲得的抗菌肽生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)205，948-954)。這些肽是由20-24個(gè)氨基酸殘基組成。除它們有抗菌活性外，Brevinin 1E和ranalexin也有高溶血活性。第2類是Brevinin 2肽，其含有29-34個(gè)氨基酸。除來自R.brevipoda porsa的Brevinin 2外(Morikawa，N.，Hagiwara，K.& Nakajima，T.(1992)，從蛙Rana brevipoda porsa皮中獲得的獨(dú)特的抗菌肽Brevinin-1和Brevinin-2，Biochem.Biophys.Res.Commun.189，184-190)，從側(cè)褶蛙中獲得的幾種肽(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)，從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽。編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，gaegurins 1-3(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)從朝鮮蛙，粗皮蛙皮中獲得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.205，948-954)以及從粗皮蛙中獲得的皺褶菌素A和B(Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)，新的抗菌肽，從粗皮蛙皮中獲得的皺褶菌素A，B和C的分離和鑒定，Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)都屬于這一類。第3類是從側(cè)褶蛙中獲得的37個(gè)殘基的肽esculentin 2(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)，從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽.編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離，J.Biol.Chem.269，11956-11961)和gaegurin 4(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，從朝鮮蛙，粗皮蛙皮中獲得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.205，948-954)以及從粗皮蛙中獲得的皺褶菌素C(Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)，新的抗菌肽，從粗皮蛙皮中獲得的皺褶菌素A，B和C的分離和鑒定，Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)。最后一類是從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的esculentin 1(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽。編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，它是目前已鑒定的所有蛙屬肽中抗菌活性最高的46個(gè)氨基酸的肽。此外，它對(duì)白色念珠菌(Candidaalbicans)，釀酒酵母(Saccharomyces core visiae)和綠膿桿菌(Pseudomonas areuginosa)也有抗菌活性。
本發(fā)明的目的之一是提供相對(duì)小的抗菌活性多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有抗細(xì)菌或真菌用途的新的多肽。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有包含在藥用可接受載體中的一種或多種這樣多肽的藥用組合物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種抑制動(dòng)物如哺乳動(dòng)物包括人體內(nèi)微生物生長(zhǎng)的方法。
對(duì)于通過以下本發(fā)明內(nèi)容公開所明了的本發(fā)明的這些目的以及其他目的提供下面新的肽F L P L I G R V L S G I L-酰胺L L P I V G N L L K S L L-酰胺L L P I L G N L L N G L L-酰胺L L P I V G N L L N S L L-酰胺V L P I I G N L L N S L L-酰胺F L P L I G K V L S G I L-酰胺F F P V I G R I L N G I L-酰胺L S P N L L K S L L-酰胺L L P N L L K S L L-酰胺F V Q W F S K F L G R I L-酰胺以下是特別優(yōu)選的多肽F L P L I G R V L S G I L-酰胺L L P I V G N L L K S L L-酰胺F L P L I G K V L S G I L-酰胺F F P V I G R I L N G I L-酰胺F V Q W F S K F L G R I L-酰胺上述多肽的功能性衍生物和藥用可接受鹽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明多肽各自本身可單獨(dú)使用或與兩種或多種多肽結(jié)合使用。
這類多肽可應(yīng)用于治療，例如抗菌使用，包括抗細(xì)菌或真菌使用。
本發(fā)明也提供了使用一種或多種上述公開的多肽來制造抗菌活性藥物。
而且，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括活性組分即有效劑量的一種或多種上述多肽和藥用可接受載體或稀釋劑。所說的載體或稀釋劑適于口服，靜脈，肌肉或皮下給藥。
本發(fā)明也提供了cDNA克隆，其序列是選自以下公開的克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17所顯示的序列。
最后，本發(fā)明提供了一種抑制動(dòng)物如哺乳動(dòng)物包括人體內(nèi)微生物生長(zhǎng)的方法，包括給與抗微生物侵染引起紊亂的動(dòng)物受者抗菌量的一種或多種上述多肽或其組合物的步驟。
這種方法可以通過口服給藥緩釋形式的上述組合物直接作用于腸。此方法也可以通過注射可注射劑量形式的組合物給藥。
關(guān)于“它們的功能衍生物”的表述，已知在本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域使用小的氨基酸替代物制成的多肽并不影響或?qū)嶋H上并不影響多肽的功能。根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法成功地確定可接受的替代物。這樣，所有的多肽具有實(shí)際上同樣的氨基酸序列，實(shí)質(zhì)上同樣的螺旋結(jié)構(gòu)和實(shí)質(zhì)上一樣的生物活性，例如抗菌和溶解活性，這些都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明多肽的藥用可接受鹽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些鹽可由技術(shù)人員以常規(guī)方法制成。例如根據(jù)常規(guī)方法可制備多肽的堿鹽。當(dāng)包括權(quán)利要求書的本發(fā)明公開中使用術(shù)語多肽時(shí)，是指包括多肽的功能性衍生物和藥用可接受鹽。
依據(jù)本發(fā)明活性多肽可以配制在人或獸藥中使用，用于治療或預(yù)防用途。活性制劑通常以口服，直腸或非經(jīng)腸道給藥，例如通過藥物制劑形式或組合物形式注射，所述藥物制劑或組合物包含活性成分與藥用可接受載體結(jié)合，載體可以是固體，半固體或液體，或如口服給藥時(shí)使用膠囊形式。也可以采用局部用藥方式。藥物制劑的實(shí)例可以是已知的片劑，滴劑，溶液和栓劑。通常，活性成分構(gòu)成制劑的小部分，例如約0.1-約50％重量份。
為制備應(yīng)用于口服的劑量單位形式的藥物組合物，本發(fā)明多肽可以與固體，粉末或其他載體混合，例如乳糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉如馬鈴薯淀粉，玉米淀粉，millopectine，纖維素衍生物或明膠，以及可以包括潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或鈣，或由聚乙二醇蠟壓縮成片劑或糖衣藥丸。劑量單位也可以腸溶衣包被形式存在。
使用幾層載體或稀釋劑可制成緩釋片劑。
將口服或注射使用的液體制劑做成elexirs，糖漿或懸浮液形式，例如含有0.1-20％重量份的活性物質(zhì)，糖以及乙醇，水，甘油，丙二醇和可能的其它常規(guī)類型的添加劑的混合物溶液。
活性成分的給藥劑量在一寬范圍內(nèi)變化并且取決于不同因素例如紊亂的嚴(yán)重程度，病人的年齡和體重，并且可以分別進(jìn)行調(diào)整。
根據(jù)本發(fā)明，在尋找新的多肽過程中，使用了哈士蟆(Ranatempororia)皮，這種動(dòng)物是一種在歐洲中部許多地方發(fā)現(xiàn)的紅色蛙。從這種蛙皮中獲得的cDNA文庫是用編碼來自側(cè)褶蛙的esulentin 1前體信號(hào)肽DNA片段篩選的。由此方法用潛在編碼新肽前體的插入片段分離出幾個(gè)克隆。從哈士蟆皮分泌物中分離得到的新肽稱為temporins，發(fā)現(xiàn)其自身或協(xié)同結(jié)合使用時(shí)有生物活性如抗細(xì)菌活性。
通過下面公開的非限定實(shí)施例描述本發(fā)明。參見附圖解釋發(fā)明內(nèi)容，其中

圖1表示3個(gè)克隆的核苷酸序列和存在其中的插入片段以及推導(dǎo)出的氨基酸序列；和圖2表示哈士蟆皮分泌物的反相HPLC圖。
材料和方法酶和試劑。Merck公司的分析純化學(xué)試劑，Carlo Erba公司的HPLC用溶劑，Perkin Elmer公司的序列分析用化學(xué)試劑。Difco公司的抗菌測(cè)定培養(yǎng)基，Sigma公司的瓊脂糖(A6013)。Boehringer Mannheim公司的限制性內(nèi)切酶和DNA修飾酶，Pharmacia公司的脫氧核糖核苷酸。DNA序列用“序列測(cè)定試劑盒”(version 2.0，U.S.Biochemicals)測(cè)定，使用[a-35S]dATP。合成的肽買自TANA實(shí)驗(yàn)室(Huston，USA)。
RNA的分離和克隆方法。為此研究，使用了2個(gè)樣品的哈士蟆皮。通過oligo(dT)-纖維素親和色譜法分離出富含poly(A)的RNA以及根據(jù)Richter等人的方法(1990b)獲得cDNA文庫(Richter，K.，Egger，R.& Kreil，G.(1990b)編碼Bombina variegata皮中韓蛙皮素前體的cDNA分子克隆，F(xiàn)EBS Lett.262，353-355.)。
包括約10000個(gè)克隆的cDNA文庫是用Hind III酶切esculentin 1cDNA獲得的240bp片段篩選出的(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)，從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽。編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離(J.Biol.Chem.269，11956-11961)。這一片段編碼esculentin 1前體的前區(qū)(prepro-region)。探針用隨機(jī)引物法標(biāo)記(Boehringer Mannheim)。55℃在100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2，含850mMNaCl，1mMEDTA，10xDenhardt’s溶液，0.1％SDS和100mg/ml酵母tRNA進(jìn)行雜交16小時(shí)。在50℃用SSPE(0.3M NaCl，20mM磷酸鈉，pH7.4，2mMEDTA)，0.2％SDS沖洗濾紙(Whatman 541，11cm×11cm)兩次，每次15分鐘。選擇陽性克隆并用限制性內(nèi)切酶裂解分析和進(jìn)行核苷酸測(cè)序。
RNA印跡分析。用含0.8M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離出富含Poly(A)RNA(5mg)(Arrand，J.E.(1985)在核酸雜交中制備核酸探針實(shí)驗(yàn)方法(Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds)pp 17-45，IRL Press，Oxford)并直接雜交到Nytran sheets(Schleicher & Schuell)。Rt-17克隆的插入片段用隨機(jī)引物法標(biāo)記并用作RNA印跡的探針。在55℃用0.1x SSPE，0.1％SDS沖洗濾紙，然后作放射自顯影。
皮分泌物的收集和提純。在奧地利薩耳斯堡捕獲哈士蟆的3個(gè)樣品(每個(gè)30-35g)。在實(shí)驗(yàn)室的terrarium中保存1年，喂養(yǎng)黃粉蟲幼蟲。用溫和電擊法(12V，腳到頭)每間隔3周收集皮分泌物。通過用10ml 0.05％(體積比)乙酸清洗每只蛙的背部區(qū)域，從蛙的體表面收集分泌物。3只蛙的分泌物合并并凍干。通過Beckman model 332系列的HPLC分餾適合等分，使用反相柱(Aquapore RP-300，7mm×250mm.Applied Biosystems)，用含10-70％乙腈/異丙醇(4∶1)的0.2％(體積比)三氟乙酸梯度洗脫，流速1.8ml/min。肽的洗脫液在220nm用Beckman 165分光光度計(jì)檢測(cè)。收集峰部分的洗脫液并冷凍干燥。取少量的各峰部分的洗脫液作丹磺酰氯衍生作用和反相HPLC分離后進(jìn)行N-末端分析(Simmaco，M.，De Biase，D.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1990b)，使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反相高壓液相色譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸自動(dòng)分析和酰胺化殘基測(cè)定(J.Chromatogr.504，129-138)。使用大孔的C18柱(4.6mm×150mm，Supelco)，上述同樣溶劑系統(tǒng)作適當(dāng)改變的梯度進(jìn)行肽的進(jìn)一步提純。
結(jié)構(gòu)分析。氨基酸分析是在6 N HCl汽相水解肽(1-2nmol)24小時(shí)后進(jìn)行，采用Beckman System Gold分析儀，其裝有離子交換柱和水合茚三酮衍生裝置。用Perkin-Elmer model AB476A測(cè)序儀自動(dòng)控制的Edman降解確定肽的序列。在某些情況下，通過質(zhì)譜分析和/或羧基肽酶Y消化確定C-末端的酰胺化狀態(tài)(Simmaco，M.，De Biase，D.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1990b)使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反相高壓液相色譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸自動(dòng)分析和酰胺化殘基測(cè)定，J.Chromatogr.504，129-138)。
抗菌檢測(cè)。抑菌活性是檢測(cè)抗巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)BMll，金黃色釀膿葡萄球菌(Staphyloco ccus aureus)Cowahl，釀膿鏈球菌(Strepto coccus pyogenes)b溶血型A，綠膿假單胞菌(Pseudomonasa eruginosa)ATCC 15692，大腸桿菌(Escherichiacoli)D21，大腸桿菌D21e7，大腸桿菌D21f1，大腸桿菌D21f2和大腸桿菌D22，采用抑菌圈試驗(yàn)，在LB肉湯/1％瓊脂糖平板接種2×105活菌(Hultmark，D.，Engstrom，.，Andersson，K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman，H.G.(1983)昆蟲免疫物質(zhì).Attacin，來自Hyulophora cecropin的抗菌蛋白系列，EMBO J.2，571-576)。白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10261的新鮮培養(yǎng)物接種于WB肉湯培養(yǎng)基，pH6.5，并在37℃下培養(yǎng)到OD600大約為0.6。培養(yǎng)物稀釋300倍然后接種涂平板，加入測(cè)試肽，其濃度是通過氨基酸分析確定的，37℃過夜。測(cè)量抑菌圈和使用在(Hultmark，D.，Engstrom，.，Andersson，K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman，H.G.(1983)昆蟲免疫物質(zhì).Attacin，來自Hyulophora cecropin的抗菌蛋白系列，EMBO J.2，571-576)中的公式，通過對(duì)測(cè)試物質(zhì)系列稀釋后獲得的抑菌圈的直徑計(jì)算致死濃度(LC，抑制生長(zhǎng)的最低濃度)。致死濃度值用至少5個(gè)試驗(yàn)樣本的平均值表示，誤差小于1個(gè)稀釋度。
圓二色性測(cè)量采用裝有DP 520信息處理器的Jasco J710分光光度計(jì)，使用2mm光程的石英比色皿，在20℃進(jìn)行圓二色性測(cè)量即CD測(cè)量。CD光譜值是3個(gè)系列記錄的平均值。橢圓率作為平均摩爾濃度殘基橢圓率(q)，以deg cm2dmol-1表示。氨基酸分析確定肽濃度。
結(jié)果編碼前體的cDNA克隆分析。編碼信號(hào)肽和前部分esculentin 1前體的240bp Hind III酶切片段用作探針篩選由哈士蟆皮中獲得的cDNA文庫。檢測(cè)到6個(gè)陽性克隆。存在于克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17中的插入片段序列顯示于圖1。除poly(A)尾部外，這些cDNAs各自含有323，356和329個(gè)核苷酸。在第1個(gè)甲硫氨酸密碼子之后，它們含有開放閱讀框架可翻譯成含有58(Rt-6)或61個(gè)氨基酸(Rt-5和Et-17)的多肽。所有推導(dǎo)的序列都有典型的肽前體特點(diǎn)。它們開始于含有疏水殘基簇的信號(hào)肽。信號(hào)肽酶的裂解位置最可能定位在半胱氨酸殘基后的位置22(von Heine，G.(1983)靠近信號(hào)序列裂解位置的氨基酸圖譜，Eur.J.Biochem.133，17-21)。推斷的成熟肽序列先于賴氨酸-精氨酸，典型的激素原轉(zhuǎn)化酶加工位置。所有這些前體多肽終止于甘氨酸-賴氨酸序列。通過羧基肽酶E水解將暴露C-末端甘氨酸，這要求形成COOH-末端酰胺。對(duì)于克隆Rt-5和Rt-17預(yù)期的最終產(chǎn)品將是含有13個(gè)氨基酸的酰胺化肽，而Rt-6在此區(qū)域有9bp的缺失，這樣編碼得到僅是十肽。
RNA印跡分析。在來自哈士蟆皮的富含Poly(A)RNA中，來自克隆Rt-17的探針識(shí)別出大量信息，檢測(cè)到一個(gè)單一的400-500范圍內(nèi)的核苷酸的相當(dāng)寬的帶。同樣條件下，從其它的兩棲類物種如側(cè)褶蛙，爪蛙(Xenopus laevis)和Bufo viridis皮中沒有獲得信號(hào)。
皮分泌物中肽的分離和分析。哈士蟆的3個(gè)樣本在受電刺激后，獲得大約20mg的冷凍干燥材料。在初步HPLC提純后(圖2)，每一級(jí)分都進(jìn)行N-末端分析，以鑒定預(yù)計(jì)來自cDNA序列的帶有亮氨酸或苯丙氨酸的氨基酸末端的那些。相關(guān)的部分用HPLC進(jìn)一步提純并進(jìn)行氨基酸和序列分析。根據(jù)這一方法，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)預(yù)測(cè)的肽確實(shí)存在于分泌物中。也分離到結(jié)構(gòu)上與這些肽相關(guān)的其它分子。這些肽的序列列于表1，定名為temporins。在表中也記錄了從分泌物中收集到的每一種肽的量。在圖2中所示的HPLC分布型，表示各種肽的洗脫位置。如表中所示temporin E的結(jié)構(gòu)，在它的N-末端帶有纈氨酸，其部分與temporin D洗脫。Temporins在它的C-末端均酰胺化，如前體(參見前述)結(jié)構(gòu)所預(yù)期的，并含有大量的疏水氨基酸。除temporins H和K有10個(gè)殘基長(zhǎng)外，這些肽中的每一個(gè)都含有13個(gè)氨基酸殘基。除temporins C，D，和E外，所有這些肽至少有一個(gè)堿性殘基(賴氨酸或精氨酸)。在分析的過程中，在皮分泌物中也發(fā)現(xiàn)了22-殘基肽(見表1)。它的序列與蜂毒肽有些相似，蜂毒肽是來自蜜蜂毒液的一種溶血肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黃蜂毒液，Science 251，1481-1485)。這樣將其命名為類蜂毒肽(MLP)。
生物活性測(cè)定。首先檢測(cè)提純的temporins對(duì)巨大芽孢桿菌和大腸桿菌D21的抑菌活性。Temporins A，B，F(xiàn)，G和L對(duì)兩個(gè)菌株都有活性，而temporins C，D，E，H和K僅對(duì)最敏感細(xì)菌巨大芽孢桿菌表現(xiàn)一些活性。
一些Temporins的回收率太低，不能允許詳細(xì)地鑒定它們的生物特性。為確定結(jié)構(gòu)和獲得更多材料可化學(xué)合成Temporins A，B，D和H。合成的Temporins A和B的抑菌活性用致死濃度值表示，以及和血紅細(xì)胞溶解獲得的結(jié)果一起記錄于表2。參考包括來自側(cè)褶蛙的esulentin 1(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F(xiàn).(1994)從側(cè)褶蛙皮分泌物中獲得的抗菌肽。編碼esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分離，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，來自昆蟲血淋巴的cecropin(Steiner，H.，Hultmark，D.，Engstrm，，Bennich，H.& Boman，H.G.(1981)在昆蟲免疫中涉及的兩個(gè)抗菌蛋白序列和特異性，Nature 292，246-248)和來自蜜蜂毒液的蜂毒肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黃蜂毒液，Science251，1481-1485)。
合成的Temporins A和B與它們的天然對(duì)應(yīng)物表現(xiàn)同樣的活性，而發(fā)現(xiàn)Temporins D和H自身或作為其它蛙屬肽的增強(qiáng)物都沒有任何生物活性。對(duì)金黃色釀膿葡萄球和釀膿鏈球菌，Temporin A抗菌活性大約是Temporin B的3倍多。另一方面，這兩種Temporins對(duì)大腸桿菌D21的抗菌活性很低，對(duì)于綠膿假單胞菌則完全沒有活性。這表明Temporin A和B特異性抗格蘭氏陽性菌。
如cecropins的線性元硫抗菌肽是對(duì)真菌沒有活性的而防御素(帶有3個(gè)S-S鍵)表現(xiàn)抗真菌活性。Temporin A和B對(duì)白色念珠菌有抗菌活性以及它們的效力等效于報(bào)道的來自南美蛙PhyllomedusaSauvagei的dermaseptin(Mor，A.，Hani，K.& Nicolas，P.(1994)脊椎動(dòng)物肽抗生素dermaseptins有重疊結(jié)構(gòu)特性而靶標(biāo)特定的微生物，J.Biol.Chem.269，31635-61641)。
同時(shí)檢測(cè)Temporin A和B對(duì)大腸桿菌D21的D21e7，D21f1和D21f2 3個(gè)菌株的抗菌活性，連續(xù)突變?nèi)笔г黾恿薒PS中側(cè)鏈數(shù)量(Boman，H.G.& Monner，D.A.(1975)來自大腸桿菌K12突變株脂多糖的鑒定，J.Bacteriol.121，455-464)。由于在envA基因處的突變，菌株D22產(chǎn)生可滲透性外膜(Normark，S.，Boman，H.G.&Matsson E.(1969)，大腸桿菌突變株，有不正常的細(xì)胞分裂和降低游離和染色體介導(dǎo)的對(duì)氨芐青霉素和幾種抗生素抗性的能力，J.Bacteriol.97，1334-1342)。存在或不存在基礎(chǔ)培養(yǎng)基E的情況下檢測(cè)Temporins的活性(Vogel，H.J.& Bonner，D.M.(1956)大腸桿菌的N-α-乙酰鳥氨酸酶部分提純和某些特性，J.Biol.Chem.218，97-106)。
表3的結(jié)果顯示培養(yǎng)基E增加了所有檢測(cè)菌株的tempors活性。然而，沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)格蘭氏陽性菌的類似作用。CD光譜顯示活性的增加與螺旋結(jié)構(gòu)的增加有關(guān)，如先前發(fā)現(xiàn)的FALL-39(Ageberth，G.，Gunne，H.，Odeberg，J.，Kogner，P.，Boman，H.G.& Gudmundsson，G.H.(1995)FALL-39，推斷的人的肽抗生素，是無半胱氨酸和在骨髓和睪丸中表達(dá)的，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，195-199)。
在此使用的術(shù)語“功能性衍生物”包括有游離羧基的肽和酸加成鹽。因此本發(fā)明并不局限于發(fā)明公開的這些具體的肽。
表1哈士蟆皮肽序列和在分泌物中得到的相應(yīng)量。用星號(hào)標(biāo)注的是根據(jù)cDNAs預(yù)測(cè)的肽相應(yīng)前體的結(jié)構(gòu)。a表示酰胺化的COOH-末端。MLP，類似蜂毒肽的肽。相同的殘基用黑體表示。間隔(-)是完全相同的插入片段。
肽序列 產(chǎn)量nmol/mgTemporin A FLPLIGRVLSGILa 14.5Temporin B*LLPIVGNLLKSLLa 19.4Temporin C LLPILGNLLNGLLa 37.5Temporin D LLPIVGNLLNSLLa 1.1Temporin E VLPIIGNLLNSLLa 1.2Temporin F FLPLIGKVLSGILa 13.5Temporin G*FFPVIGRILNGILa 16.8Temporin H*LSP---NLLKSLLa 8.7Temporin K LLP---NLLKSLLa 9.8Temporin L FVQWFSKFLGRILa 3.6MLP FIGSALKVLAGVLPSVISWVK---Qa 5.1蜂毒肽 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQa
表2哈士蟆肽的抗菌和溶解活性。通過接種各有機(jī)體的瓊脂糖平板上的抑菌圈計(jì)算致死濃度。Cecropin的數(shù)據(jù)取自Hultmark等人(1983)。釀膿鏈球菌β溶血型A和綠膿假單胞菌ATCC 15692是臨床分離物，由Dr.Paolo Visca，Institute of Microbiology，University of Rome La Sapienza惠贈(zèng)。NT，表示沒有檢測(cè)。有機(jī)體和菌株 致死濃度Temporin A Temporin B Esculentin 1 Cecropin A MLP 蜂毒肽μM巨大芽孢桿菌Bmll 1.2 2.8 0.1 0.5 NT0.6金黃色釀膿葡萄球菌Cowan2.3 6.0 0.4 ＞200 NT0.2Y.pseudotubercolosis 7.0 7.0 NT0.5 NTNT釀膿鏈球面β溶血型A2.0 7.0 NTNT NTNT大腸桿菌D2111.921.00.2 0.3 NT0.8綠膿假單胞菌 ＞360 ＞360 0.7 NT NTNTATCC15692白色念球菌 3.4 4.0 0.5 NT NTNT人紅細(xì)胞 ＞120 ＞120 ＞200 ＞400 0.5 0.9
表3Temeporins A和B對(duì)大腸桿菌D21和相關(guān)的LPS修飾菌株的抗菌活性。試驗(yàn)在LB肉湯/1％瓊脂糖，有或無培養(yǎng)基E(Vogel & Bonner 1956)下進(jìn)行。細(xì)菌菌株是由Prof.H.G.Boman，University of Stockholm惠贈(zèng)。
致死濃度化合物D21D21e7D21f1 D21f2 D22μMTemporin A11.9 1.4 0.94.83.4Temporin A+ 培養(yǎng)基E 5.31.4 3.02.00.4Temporin B21.0 13.2 10.0 3.311.2Temporin B+ 培養(yǎng)基E 3.44.2 3.59.312.2
序列克隆 Rt-51 ACAATTCTGAGCCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGM F T L K K S L61 TTACTCCTCTTTTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCAL L L F F L G T I N L S L C E E E R N A121 GAAGAAGAAAGAAGAGATGAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTTAE E E R R D E P D E R D V Q V E K R L L181 CCAATTGTTGGAAACCTGCTCAAGAGCTTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATGP I V G N L L K S L L G K +241 GAATTGGAAATCATCTGATGTGGAATATCATTTAGCTAAATGAGCAACAGATGTCTTATT301 TAAAAAAATAAATATGTTCCATC克隆 Rt-61 GCTTTGTAGGATAGACCTGCACTGAAGTCTTCCAGCCGTCTACATTCTGAGCACCAACTG61 AACTACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGTTACTCCTCTTTTTCCTTM F T L K K S L L L L F F L121 GGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCAGAAGAAGAAAGAAGAGATG T I N L S L C E E E R N A E E E R R D181 GAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTCACCAAACCTGCTCAAGAGCE P D E R D V Q V E K R L S P N L L K S241 TTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATGGAATTG6AAATCATCTGATGTGGAATAL L G K +301 TCATTTAGCTAAATGCGCAACAGATGTCTTATTTAAAAAATAAATATGTTGCATAC克隆 Rt-171 CCCCTCCAGCTGTCTACATTCTCATAACCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCACM F T61 CTTGAAGAAATCCCTCTTACTCCTTTTCTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAL K K S L L L L F F L G T I N L S L C E121 GGAAGAGAGAGATGCCGATGAAGAAAGAAGAGATGATCTCGAAGAAAGGGATGTTGAAGTE E R D A D E E R R D D L E E R D V E V181 GGAAAAGCGATTTTTTCCAGTGATTGGAAGGATACTCAATGGTATTTTGGGAAAATAACCE K R F F P V I G R I L N G I L G K +241 AAAAAAAGTTAAAACTTTGGAAATGGAATTGGAAATCATCTAATGTGGAATGTCATTTAG301 CTAAATGCACATCAAATGTCTTATAAAAA
權(quán)利要求
1.多肽，選自下列肽F L P L I G R V L S G I L-酰胺L L P I V G N L L K S L L-酰胺L L P I L G N L L N G L L-酰胺L L P I V G N L L N S L L-酰胺V L P I I G N L L N S L L-酰胺F L P L I G K V L S G I L-酰胺F F P V I G R I L N G I L-酰胺L S P N L L K S L L-酰胺L L P N L L K S L L-酰胺F V Q W F S K F L G R I L-酰胺和它們的功能性衍生物以及藥用可接受鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種或多種多肽用于治療用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種或多種多肽用于抗菌的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求4的一種或多種多肽用于抗細(xì)菌或真菌的用途。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的一種或多種多肽用于制造有抗菌活性藥物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所說的藥物具有抗細(xì)菌或抗真菌活性。
7.一種藥用組合物，包含作為活性成分的有效劑量的權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽和藥用可接受載體或稀釋劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥用組合物，其中所說劑量是可產(chǎn)生抗菌活性的量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥用組合物，其中所說劑量是可產(chǎn)生抗細(xì)菌或抗真菌活性的量。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一權(quán)利要求的藥用組合物，其中所說的載體或稀釋劑適合口服，靜脈，肌肉或皮下給藥。
11.cDNA克隆，其序列是選自克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17所示的序列。
12.一種抑制動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物包括人體內(nèi)微生物生長(zhǎng)的方法，包括給與抵抗微生物侵染引起紊亂的動(dòng)物受者以抗菌量的權(quán)利要求1的一種或多種多肽或根據(jù)權(quán)利要求7-10的任一權(quán)利要求的組合物的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用于抑制細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的方法。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，包括用可注射劑量形式注射權(quán)利要求7-10的任一權(quán)利要求的組合物給藥。
全文摘要
選自肽(Ⅰ)的多肽和它的功能衍生物以及藥用可接受鹽；包括一種或多種這些多肽的藥物組合物；以及使用此類多肽抑制動(dòng)物體內(nèi)微生物生長(zhǎng)的方法。FLPLIGRVLSGIL－酰胺，LLPIVGNLLKSLL－酰胺，LLPILGNLLNGLL－酰胺，LLPIVGNLLNSLL－酰胺，VLPIIGNLLNSLL－酰胺，F(xiàn)LPLIGKVLSGIL－酰胺，F(xiàn)FPVIGRILNGIL－酰胺，LSPNLLKSLL－酰胺，LLPNLLKSLL－酰胺，F(xiàn)VQWFSKFLGRIL－酰胺。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1246126SQ9718178
公開日2000年3月1日 申請(qǐng)日期1997年12月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月13日
發(fā)明者D·巴拉, M·西馬科 申請(qǐng)人:Sbl疫苗有限公司