專利名稱：角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的蛋白酶的制作方法
背景技術(shù)：
蛋白酶是消化蛋白質(zhì)的酶。蛋白酶在其天然細(xì)胞環(huán)境外具有各種用途。
例如，在洗滌應(yīng)用中，蛋白酶用作為使污物降解為水溶性更強(qiáng)的簡(jiǎn)單形式化合物(然后其易于由水和洗滌劑除去)的有機(jī)催化劑；即，它們作為“洗滌劑”而起作用。
此外，據(jù)報(bào)道，一些蛋白酶可以提供某些皮膚調(diào)理益處。角質(zhì)層是表皮的最外層。角質(zhì)層的細(xì)胞(角膜細(xì)胞)表示表皮分化過(guò)程的末期。角膜細(xì)胞是具有高度抗性的無(wú)核細(xì)胞，其主要由被交聯(lián)的蛋白質(zhì)包膜圍繞的角蛋白絲組成。一小部分表皮細(xì)胞不斷離開(kāi)增殖基底層，并進(jìn)行分化。因而，角膜細(xì)胞不斷再生。在所謂的脫皮過(guò)程中，這通過(guò)皮膚表面的細(xì)胞脫落得到平衡，以產(chǎn)生恒定的和充分調(diào)節(jié)的角質(zhì)層厚度。角質(zhì)層的再生和脫皮速率之間的不平衡可能導(dǎo)致在皮膚表面上形成鱗片。在諸如牛皮癬和魚鱗病的疾病中通?？吹竭@樣的癥狀。人表皮總的周轉(zhuǎn)期是大約四至六周。每一個(gè)表皮細(xì)胞在角質(zhì)層中保持大約兩周。脫皮涉及淺層中的角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)聚力的消除。它必定會(huì)以不干擾深層的屏障功能的方式發(fā)生，其取決于強(qiáng)大的胞間內(nèi)聚力。據(jù)報(bào)道，蛋白酶可能有利于脫皮。
蛋白酶的其它已知用途包括用于食品加工，如使肉嫩化、生產(chǎn)乳酪以及調(diào)味；織物加工，如除去羊毛表面的“鱗狀物”以防止織物收縮；和用于除去照相膠片表面的明膠。
遺憾的是，這些已知蛋白酶的用途因它們能在敏感個(gè)體中造成過(guò)敏反應(yīng)而受到限制，和/或因它們?cè)诟鞣N環(huán)境中的功效有限而受到限制。這樣的過(guò)敏反應(yīng)是由敏感用戶使用蛋白酶，如使用護(hù)膚產(chǎn)品造成的。另一方面，過(guò)敏反應(yīng)可以發(fā)生于制造或包裝包含蛋白酶的產(chǎn)品(如洗衣用洗滌劑)而與蛋白酶密切接觸的個(gè)體之中。
基于以上所述，需要一種替代蛋白酶，該蛋白酶只有很少的免疫原性和/或者可以提供較高的蛋白分解特性。也需要包含這樣一種蛋白酶的組合物，如護(hù)膚和/或者洗衣用洗滌劑組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離的多肽，該多肽實(shí)質(zhì)上包含SEQ ID NO2所顯示的氨基酸序列，或者實(shí)質(zhì)上類似于由具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征的質(zhì)粒中的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及分離的多肽，該多肽實(shí)質(zhì)上包含SEQ ID NO1所顯示的氨基酸序列，或者實(shí)質(zhì)上類似于由包含具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征的質(zhì)粒中的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及包含上述多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及治療或防止脫皮的方法，該方法包括局部施用包含上述多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及特異地結(jié)合上述多肽的抗體。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，通過(guò)閱讀本發(fā)明的說(shuō)明書，本發(fā)明的這些和其它特征、方面以及優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。
發(fā)明詳述雖然說(shuō)明書后附的權(quán)利要求特別指出和清楚要求了本發(fā)明，但可以相信讀者將通過(guò)下列描述而對(duì)本發(fā)明有更好的了解。
所有引用的參考文獻(xiàn)以其整體與本文一并參考。任何參考文獻(xiàn)的引用不是對(duì)關(guān)于它作為現(xiàn)有技術(shù)可為本發(fā)明所利用的任何確定的承認(rèn)。
除非以其它方式特別說(shuō)明，否則所有百分比都是相對(duì)于整個(gè)組合物重量而言的。
除非以其它方式特別說(shuō)明，否則所有比率都是重量比。
在這里，“包括”意指可以加入的不影響最終結(jié)果的其它步驟和其它組分。這一術(shù)語(yǔ)包括術(shù)語(yǔ)“由…組成”和“基本上由…組成”。
在這里，“分離的”(關(guān)于本發(fā)明多肽或者編碼該多肽的多核苷酸)意指多肽或者多核苷酸在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中自然產(chǎn)生并在該環(huán)境之外存在，同時(shí)該多肽當(dāng)可操作地與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列連接時(shí)可由并不自然表達(dá)它的細(xì)胞中的多核苷酸表達(dá)。具體地說(shuō)，當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸(例如DNA)時(shí)，就DNA在其中自然產(chǎn)生的復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境而言，“分離的”意指DNA實(shí)質(zhì)上得到分離(即實(shí)質(zhì)上存在于該環(huán)境之外)，或者它僅僅存在于其自然產(chǎn)生(例如當(dāng)克隆或以限制片段形式存在時(shí))的不同核酸背景中。因此，本發(fā)明的多核苷酸或多肽可以存在于各種載體和/或各種宿主細(xì)胞(或其它環(huán)境，如緩沖液、病毒或者細(xì)胞提取物)和/或任何種類的組合物中；目前它們?nèi)匀辉谶@里所用的意義上來(lái)分離，其中這樣的載體、宿主細(xì)胞或組合物不是多核苷酸或者多肽的天然環(huán)境的一部分。
在這里，“KDP”意指角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的蛋白酶。
在這里，“實(shí)質(zhì)上如…所顯示的”或“實(shí)質(zhì)上類似于”，就多核苷酸來(lái)說(shuō)，意指在編碼所需的多肽或基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或核苷酸序列上是相同或足夠類似的；或者就多肽來(lái)說(shuō)，意指在起主要作用的結(jié)構(gòu)或氨基酸序列上是相同或足夠類似的。換句話說(shuō)，一具體的主題序列(氨基酸或核苷酸序列)，例如由誘變改變的序列，通過(guò)一或多個(gè)置換、缺失或增加而不同于參考序列，其凈效應(yīng)在于保持參考多肽的生物活性。另外，如果核苷酸序列因其在遺傳密碼中的簡(jiǎn)并性而編碼實(shí)質(zhì)上類似于參考氨基酸序列的氨基酸序列，那么核苷酸序列及其類似物“實(shí)質(zhì)上類似于”這里所公開(kāi)的特異性核苷酸序列。此外，“實(shí)質(zhì)上類似”意指多肽將與針對(duì)本發(fā)明的多肽或得自本發(fā)明多肽的肽而產(chǎn)生的抗體進(jìn)行反應(yīng)。
本發(fā)明涉及新近鑒定的多核苷酸，由這樣的多核苷酸編碼的多肽，這樣的多核苷酸和多肽的用途，這樣的多核苷酸和多肽的生產(chǎn)，以及包括這樣的多肽的組合物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包含在DH10B(pBSIISK(+)-KDP1)，一種攜帶包含編碼KDP多肽的DNA的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中。這一材料于1997年9月30日保藏在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)的生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1 chome Tsukuba-shi lbaraki-ken 305，日本)。所保藏的菌株的保藏號(hào)為FERM BP-6129。
這里所指的生物保藏物將按照國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的有關(guān)條文來(lái)保存。因此，該保藏物可按照此專利申請(qǐng)或其子申請(qǐng)所在國(guó)家的專利法的要求獲得。然而，申請(qǐng)人對(duì)保藏機(jī)構(gòu)發(fā)放保藏物樣品的許可并不意味或暗示許可實(shí)施在對(duì)主題專利申請(qǐng)頒發(fā)的任何專利或任何其它專利中所要求的發(fā)明。提供保藏物僅僅為方便本領(lǐng)域技術(shù)人員，而并不是承認(rèn)實(shí)施本發(fā)明必須有該保藏材料。在與本文序列的任何描述發(fā)生任何沖突的情況下，包含在保藏材料中的多核苷酸的核苷酸序列，以及由此編碼的多肽的氨基酸序列與本文一并參考。需要注意的是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員在由此書面公開(kāi)部分再現(xiàn)申請(qǐng)人的工作時(shí)，利用常規(guī)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)任何這樣的測(cè)序沖突。
A.多肽本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的多肽，該多肽包含實(shí)質(zhì)上顯示在SEQID NO2中的氨基酸序列，或者實(shí)質(zhì)上類似于保藏號(hào)FERM BP-6129(下文統(tǒng)稱為“KDP多肽”)的氨基酸序列。
在這里，“多肽”是指由共同連接而形成肽鍵(優(yōu)選形成“前原蛋白質(zhì)”、前蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或其片段)的氨基酸組成的聚合物。這里的“前原蛋白質(zhì)”意指由信號(hào)序列、前區(qū)和成熟區(qū)組成的多肽；而“前蛋白質(zhì)”則意指由前區(qū)和成熟區(qū)組成的多肽。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或者合成多肽。
在這里，“保藏號(hào)FERM BP-6129的氨基酸序列”意指由具有核苷酸序列的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，該核苷酸序列實(shí)質(zhì)上類似于包含在具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征的質(zhì)粒中的核苷酸序列。
KDP多肽的各種實(shí)施方案包括，但不限于，具有如下所示的氨基酸序列或片段的多肽SEQ ID NO2；以及SEQ ID NO2的1-227位置。附加的實(shí)施方案包括這樣的多肽，該多肽包含SEQ ID NO2的”催化三聯(lián)體”，即39-43、86-88和177-185位置；更優(yōu)選包含39-185位置。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，KDP多肽是與SEQ ID NO2所顯示的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所顯示的上述子序列)或保藏號(hào)FERMBP-6129的氨基酸序列有至少大約60％；優(yōu)選為至少大約75％；更優(yōu)選為至少大約90％；更優(yōu)選為至少大約95％；更優(yōu)選為至少大約99％同源性的氨基酸序列。優(yōu)選地，這樣的同源序列形成這樣的多肽，該多肽實(shí)質(zhì)上與具有SEQ ID NO2中所顯示的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所顯示的上述子序列)或者保藏號(hào)FERM BP-6129的氨基酸序列的多肽有相同的蛋白水解活性。
正如以下更詳細(xì)討論的，KDP多肽可以是自然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成過(guò)程的產(chǎn)物，或用重組技術(shù)由重組宿主產(chǎn)生的產(chǎn)物。KDP多肽可以是糖基化或非糖基化的，這取決于用于重組生產(chǎn)方法中的宿主。KDP多肽也可以包括起始甲硫氨酸的氨基酸殘基。
B.多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含實(shí)質(zhì)上顯示在SEQ ID NO1中的核苷酸序列，其實(shí)質(zhì)上類似于包含在具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征的質(zhì)粒中的核苷酸序列，或者其編碼KDP多核苷酸(下文將其統(tǒng)稱為KDP多肽)。
在這里，“多核苷酸”意指DNA或RNA的聚合物，該DNA或RNA可以是單或雙鏈的，可選擇地包含合成的、非天然的或者改變的核苷酸堿基，該堿基能夠摻入DNA或RNA聚合物中。多核苷酸可以是分離片段形式的，或作為大核苷酸序列構(gòu)建物的組分，該多核苷酸衍生于以一定的數(shù)量或者濃度分離至少一次的核苷酸序列，該數(shù)量或者濃度使利用標(biāo)準(zhǔn)生化方法(例如利用克隆載體)能夠進(jìn)行該序列及其組分核苷酸序列的鑒定、操作和回收。這樣的序列優(yōu)選以未被內(nèi)部非翻譯序列(內(nèi)含子)所間斷的開(kāi)放讀框形式提供，其中的內(nèi)部非翻譯序列典型地存在于真核基因(例如cDNA)中。也能利用包含有關(guān)序列的基因組DNA。非翻譯核苷酸的序列可以存在于開(kāi)放讀框的5′或3′端，其中相同的非翻譯核苷酸序列不干擾編碼區(qū)的操作或者表達(dá)。本發(fā)明提供的編碼多肽的多核苷酸可以自cDNA片段和短的寡核苷酸接頭或者一系列寡核苷酸裝配，以提供能夠在重組體轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)的合成基因。
本發(fā)明的多核苷酸包含具有任一只要能編碼KDP多肽的序列的核苷酸序列。由于在遺傳密碼中的簡(jiǎn)并性，任何特定的氨基酸序列可以由許多不同的核苷酸序列編碼。熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性考慮到不同的核苷酸序列以提供相同的多肽。在制備核苷酸序列(其編碼相同的肽但不同于天然的核苷酸序列)的某些情況下，提供各種優(yōu)點(diǎn)，其包括易于測(cè)序或合成，增加肽的表達(dá)，和/或優(yōu)先選擇用于某些密碼子的某些異源宿主。這些實(shí)際考慮都是為大家所熟知的，并且能夠提供有利于本發(fā)明的用戶的實(shí)施方案。因此，我們將清楚地推斷出天然核苷酸序列或列在序列表中的或與本文一并參考的核苷酸序列不是唯一的實(shí)施方案或由本發(fā)明設(shè)想的核苷酸序列。
KDP多核苷酸的各種實(shí)施方案包括，但不限于，顯示在下列序列或片段中的核苷酸序列SEQ ID NO1；以及SEQ ID NO1的291-1172位置，SEQ ID NO1的536-1172位置，SEQ ID NO1的1-1172位置，或SEQ ID NO1的291-1499位置。KDP多核苷酸的附加實(shí)施方案包括這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼SEQ ID NO2的“催化三聯(lián)體”，即編碼SEQ ID NO2的多肽的39-43、86-88和177-185位置。也就是說(shuō)，這樣的實(shí)施方案包括SEQ ID NO1的603-617、744-752和1017-1043位置；更優(yōu)選為這樣的實(shí)施方案包括SEQ ID NO1的603--1043位置。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，KDP多核苷酸是這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列與顯示在SEQ ID NO1中的、顯示在SEQ ID NO1的上述子序列中的或者包含在具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征的質(zhì)粒中的核苷酸序列有至少大約60％同源性；優(yōu)選為至少大約75％同源性；更優(yōu)選為至少大約90％同源性；更優(yōu)選為至少大約95％同源性；更優(yōu)選為至少大約99％同源性。優(yōu)選地，這樣的同源序列能夠編碼KDP多肽。
C.表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包括KDP多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)。這樣的表達(dá)系統(tǒng)包括包含KDP多核苷酸的重組表達(dá)載體，以及利用這樣的重組表達(dá)載體由遺傳工程產(chǎn)生的宿主(“重組宿主”)。
1.載體在這里，“重組表達(dá)載體”意指用來(lái)表達(dá)多核苷酸的DNA構(gòu)建體，該多核苷酸編碼所需多肽(例如KDP多肽)，并包括包含下列組分之集群的轉(zhuǎn)錄亞單位1)在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳因子，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，2)轉(zhuǎn)錄成mRNA且翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列。利用本領(lǐng)域熟知的方法，可以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體。載體的性質(zhì)不是本發(fā)明的關(guān)鍵，并且可以利用任何載體，包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體和轉(zhuǎn)座子。用于本發(fā)明中的可能的載體包括，但不限于，染色體的、非染色體的以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；得自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病)。其它的有用載體包括，但不限于對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)，有pcDNA-1(Invitrogen，San Diego，CA)和pSV-SPORT 1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)；對(duì)于昆蟲細(xì)胞來(lái)說(shuō)，有pBlueBac III或者pBlueBacHis桿狀病毒載體(Invitrogen，SanDiego，CA)；和對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，為pET-3(Novagen，Madison，WI)。也可以利用任何其它載體，只要它能在宿主中復(fù)制和生存。KDP多核苷酸可以存在于可操作地與調(diào)節(jié)元件連接的載體中。
可以利用各種各樣方法將KDP多核苷酸插入到載體中。一般地，利用本領(lǐng)域所熟知的方法可以將多核苷酸插入到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點(diǎn)中。一般認(rèn)為這樣的和其它的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的范圍之內(nèi)。
載體可以優(yōu)選包括表達(dá)元件或可操作地與KDP多核苷酸連接的元件，以提供合適水平的表達(dá)?？梢岳萌魏畏N類的表達(dá)元件。一個(gè)或多個(gè)表達(dá)元件可以例如選自啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、操縱子和激活序列。這樣的表達(dá)元件可以是可調(diào)節(jié)的，例如可誘導(dǎo)的(通過(guò)加入誘導(dǎo)物)。有用的啟動(dòng)子的代表性例子包括，但不限于LTR(得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列)或者SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體λPL啟動(dòng)子和其它啟動(dòng)子(已知其控制在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中的基因表達(dá))。表達(dá)載體也優(yōu)選包含翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。表達(dá)載體也可以包括擴(kuò)增表達(dá)的適當(dāng)序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包含一或多個(gè)可選擇的標(biāo)記基因以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性或者如用于原核細(xì)胞培養(yǎng)物的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
通過(guò)將具有合適的翻譯起始和終止信號(hào)的KDP多核苷酸體插入至具有功能啟動(dòng)子的可操作讀框中，可以構(gòu)建在細(xì)菌用途中有用的表達(dá)載體。載體將優(yōu)選包含一或多個(gè)表型的選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以確保載體的維持和(如果需要)提供在宿主體內(nèi)的擴(kuò)增。
作為一個(gè)代表性而非限制性的例子，在細(xì)菌用途方面有用的表達(dá)載體可以包括選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，該細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)得自包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的市售質(zhì)粒。這樣的商業(yè)載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，威斯康星，美國(guó))。這些pBR322“主鏈”區(qū)段與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和所要表達(dá)的KDP多肽結(jié)合。其它合適的細(xì)菌載體包括pQE70，pQE60和pQE9(Qiagen)；pbs，pD10，phagescript，psiXl74，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A和pNH47A(Stratagene)；以及ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(Pharmacia)。
在利用酵母方面有用的表達(dá)載體可以包括酵母復(fù)制起點(diǎn)或整合入宿主染色體DNA中所需要的DNA片段，選擇性標(biāo)記，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任一必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列和5′側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。合適的酵母表達(dá)載體包括，但不限于，pPIC3，pPIC3K，pPIC3.5K，pPIC9，pPIC9K，pAO815，pHIL-D2，pHIL-S1，pPICZaA，pPICZaB和pPICZaC(Invitrogen)(優(yōu)選用于巴斯德畢赤酵母)；pYES2(Invitrogen)，和pRS系列載體(STRATAGENE)(優(yōu)選用于釀酒酵母)。
哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將優(yōu)選包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，和任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5′側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可以用來(lái)提供必需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
合適的哺乳動(dòng)物載體，就其非限制例子來(lái)說(shuō)，包括pWLNEO，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。
2.宿主可以利用包含KDP多核苷酸以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或控制序列的重組表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，從而使重組宿主能夠表達(dá)KDP多肽。
重組宿主可以包括用本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，真菌，昆蟲，植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。重組宿主也可以包括用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的整個(gè)植物，昆蟲或非人哺乳動(dòng)物。用于體外生產(chǎn)的適當(dāng)?shù)乃拗鞯拇硇岳影?xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，枯草桿菌和屬于假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種物種，然而也可以使用其它宿主作為選擇的物質(zhì)；酵母或真菌細(xì)胞，如巴斯德畢赤酵母，博伊丁假絲酵母和釀酒酵母；昆蟲細(xì)胞，如果蠅屬和Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如猴子腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系(由Gluzman，細(xì)胞，23175(1981)描述)，C127(小鼠)，3T3(小鼠)，CHO(倉(cāng)鼠)和BHK(倉(cāng)鼠)；人細(xì)胞，如HeLa。另外，在非人哺乳動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)中有用的重組宿主包括，但不限于，母牛，山羊，豚鼠，倉(cāng)鼠，小鼠，豬，兔和綿羊；昆蟲(包括蠶幼蟲)；和植物。一般認(rèn)為根據(jù)本文的教導(dǎo)對(duì)適當(dāng)宿主的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的范圍之內(nèi)。
在這里，“轉(zhuǎn)化”意指將DNA引入細(xì)胞或有機(jī)體中，以便DNA或作為染色體外元件或通過(guò)染色體整合體復(fù)制。取決于所用的宿主細(xì)胞，利用適于這樣的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成轉(zhuǎn)化。描述在有關(guān)文獻(xiàn)(Cohen，S.N.，PROC.NATL.ACAD.Sci.(USA)，692110(1972)；Mandel等，生物化學(xué)雜志(J.MOL.BIOL.)，53154(1970)；和Lilgestrom等，基因，40241-246(1985))中的、使用氯化鈣的鈣處理技術(shù)一般用于原核生物或其它包含堅(jiān)固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。對(duì)于沒(méi)有這樣的細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Graham和van der Eb(病毒學(xué)，52456-457(1978))的磷酸鈣沉淀方法是優(yōu)選的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般內(nèi)容已經(jīng)由Axel描述在美國(guó)專利4,399,216(1983年8月16日授權(quán))中。典型地，按照van Solingen等，J.BACT.，130946(1977)和Hsiao等，PROC.NATL.ACAD.Sci.(USA)，763829(1979)的方法，實(shí)現(xiàn)向酵母的轉(zhuǎn)化。另外，通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者在《分子生物學(xué)基本方法》(D.L.Davis和I.M.Battey，(1986))中提出的電穿孔法可以將表達(dá)載體引入宿主中。然而，也可以利用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，如通過(guò)核注射或原生質(zhì)體融合。
D.生產(chǎn)KDP多肽的方法本發(fā)明的一個(gè)方面涉及生產(chǎn)分離的KDP多肽的方法。該方法包括把KDP多核苷酸插入到合適的重組表達(dá)載體(如上所述)中，和然后用這一重組表達(dá)載體(如上所述)轉(zhuǎn)化合適的宿主。其后，所轉(zhuǎn)化的宿主用來(lái)表達(dá)KDP多肽，隨后自宿主中純化出所產(chǎn)生的KDP多肽。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括培養(yǎng)用包含KDP多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞。其后用培養(yǎng)的細(xì)菌宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)KDP多肽，隨后自培養(yǎng)基中純化所產(chǎn)生的KDP多肽。
繼轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株和宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如變溫或者化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。典型地，由離心收獲細(xì)胞，用物理或者化學(xué)方法破碎細(xì)胞，并保留所產(chǎn)生的粗提物以便進(jìn)一步純化。
可以用任何便利方法破碎用于KDP多肽的表達(dá)的微生物細(xì)胞，包括凍結(jié)-解凍循環(huán)，超聲處理，機(jī)械破碎，或者利用細(xì)胞溶解劑；這樣的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。
可以利用包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜在內(nèi)的各種方法，自重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化KDP多肽。如果必要，在完成成熟蛋白質(zhì)構(gòu)型的過(guò)程中，可以利用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可以利用高效液態(tài)色譜(HPLC)作為最后的純化步驟。
在可選擇的實(shí)施方案中，KDP多肽可以由常規(guī)肽合成儀合成。
E.抗體本發(fā)明的另一方面涉及特異地結(jié)合多肽的抗體，該多肽包含實(shí)質(zhì)上顯示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或?qū)嵸|(zhì)上類似于保藏號(hào)FERMBP-6129的氨基酸序列(這里稱為“KDP抗體”)。
可以利用多肽、它們的片段或其它衍生物、或其類似物或表達(dá)它們的細(xì)胞作為免疫原，由此產(chǎn)生抗體。例如，這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合、單鏈和人源化抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的各種方法來(lái)生產(chǎn)這樣的抗體和片段。
通過(guò)向動(dòng)物直接注射本發(fā)明的多肽或者通過(guò)施用多肽于動(dòng)物(優(yōu)選為非人)身上，可以獲得KDP抗體。然后所獲得的抗體將與多肽本身結(jié)合。按照這一方法，即使只編碼多肽的片段的序列也可以用來(lái)產(chǎn)生結(jié)合完整天然多肽的抗體。然后可以利用這樣的KDP抗體使KDP多肽從表達(dá)該KDP多肽的組織中分離出來(lái)。
對(duì)于單克隆抗體的制備，可以利用任一提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，自然，256495-497(1975))、trioma技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，今日免疫學(xué)，472(1983)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。
產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可適用于產(chǎn)生抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
F.包合多肽的組合物本發(fā)明的另一方面涉及包含KDP多肽和可接受的載體的組合物。組合物可以是需要蛋白酶組分的任何種類的組合物。尤其優(yōu)選的是能與人接觸(例如通過(guò)使用或者制造)的組合物。一般認(rèn)為，通過(guò)使用本發(fā)明的KDP多肽，可以減少或消除免疫原性反應(yīng)，而使用者和/或處理者使用包含已知蛋白酶，尤其是非人源的蛋白酶的類似組合物時(shí)也可能經(jīng)歷這種免疫原性反應(yīng)。優(yōu)選的組合物是護(hù)膚組合物和洗衣用洗滌劑組合物。
在這里，“可接受的載體”包括，但不限于，化妝上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的載體和在清潔組合物用途中可接受的載體。
1.護(hù)膚組合物除KDP多肽之外，本發(fā)明的護(hù)膚組合物還優(yōu)選包括化妝上或藥學(xué)上可接受的載體。
在這里，“化妝上可接受的載體”意指一或多種相容的固體或液體填充稀釋劑或膠囊化物質(zhì)，這些物質(zhì)適于用來(lái)與人和低等動(dòng)物的皮膚接觸而無(wú)過(guò)分的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、變應(yīng)性反應(yīng)等等，具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比。
在這里，“藥學(xué)上可接受的”意指一或多種相容的藥物、藥物成分或惰性成分，這些物質(zhì)適于用來(lái)與人和低等動(dòng)物的皮膚接觸而無(wú)過(guò)分的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、變應(yīng)性反應(yīng)等等，具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比。當(dāng)然，藥學(xué)上可接受的載體必須具有足夠高的純度和足夠低的毒性，以使它們適于施用到需要接受治療的哺乳動(dòng)物身上。
在這里，“相容的”意指化妝組合物或藥物組合物的組分能夠與KDP多肽，并且相互之間以無(wú)任何相互作用(該作用實(shí)質(zhì)上會(huì)減少組合物在普通使用情況下的化妝或藥物功效)的方式混合。
優(yōu)選地，本發(fā)明的護(hù)膚組合物是局部施用組合物，即通過(guò)將組合物直接施于或涂布于皮膚上而局部施用它們。優(yōu)選地，這樣的局部施用組合物包括化妝上或者藥物上可接受的局部載體。
局部施用組合物可以制成各種類型的產(chǎn)品。這些類型包括，但不限于，水劑、乳膏、海灘防曬油、凝膠、棒形物、噴霧劑、軟膏、糊狀物、摩絲和化妝品；護(hù)發(fā)組合物，如香波和調(diào)理劑(例如用于治療/預(yù)防頭皮屑)；和個(gè)人清潔組合物。這些產(chǎn)品類型可以包括幾個(gè)載體系統(tǒng)，這些載體系統(tǒng)包括，但不限于，溶液、乳劑、凝膠和固體。
優(yōu)選地，載體是化妝上或藥物上可接受的含水或有機(jī)溶劑。水是優(yōu)選的溶劑。合適的有機(jī)溶劑的例子包括丙二醇，聚乙二醇(200-600)，聚丙二醇(425-2025)，丙二醇-14丁基醚，甘油，1，2，4-丁三醇，山梨醇酯，1，2，6-己三醇，乙醇，異丙醇，丁二醇及其混合物。在本發(fā)明中有用的這樣的溶液優(yōu)選包含大約0.001％至大約25％的KDP多肽，更優(yōu)選從大約0.1％至大約10％；更為優(yōu)選從大約0.5％至大約5％；和優(yōu)選為大約50％至大約99.99％的可接受的含水或有機(jī)溶劑，更為優(yōu)選為大約90％至大約99％。
本發(fā)明的護(hù)膚組合物還可以包括可便利地用于局部施用組合物中的各種附加的油溶性材料和/或水溶性材料，其含量已被本領(lǐng)域所確立。這樣的附加組分包括，但不限于增稠劑、顏料、香味劑、濕潤(rùn)劑、蛋白質(zhì)和多肽、防腐劑、遮光劑、滲透增強(qiáng)劑、膠原、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、水解液、櫻草油、西蒙得木油、表皮生長(zhǎng)因子、大豆皂甙、粘多糖、維生素A及其衍生物、維生素B2、生物素、泛酸、維生素D及其混合物。
2.清潔組合物除KDP多肽之外，本發(fā)明的清潔組合物優(yōu)選包括表面活性劑。清潔組合物可以具有各種形式，其包括，但不限于，硬表面清潔組合物、餐具清潔組合物和洗衣用洗滌劑組合物。
優(yōu)選的清潔組合物是洗衣用洗滌劑組合物。這樣的洗衣用洗滌劑組合物包括，但不限于，粒狀、液態(tài)和塊狀組合物。優(yōu)選地，洗衣用洗滌劑組合物還包括助洗劑。
本發(fā)明的洗衣用洗滌劑組合物包含KDP多肽，其含量為足以提供“清潔有效量”的水平。術(shù)語(yǔ)“清潔有效量”意指任一能夠?qū)Φ孜?如織物、餐具等等)產(chǎn)生清潔、去污、除塵、漂白、除臭和鮮艷度改善作用的量。從目前的商業(yè)制劑的實(shí)際方面看，以重量計(jì)的每克洗滌劑組合物的活性酶的典型量高達(dá)大約5mg，更典型為0.01mg-3mg。也就是說(shuō)，本文的洗衣用洗滌劑組合物典型地將包括0.001％至5％、優(yōu)選為0.01％-3％、更優(yōu)選為0.01％至1％以重量計(jì)的粗KDP多肽制劑。在這里，“粗KDP多肽制劑”意指其中KDP多肽在其加入至洗衣用洗滌劑組合物中之前包含在其中的制劑或組合物。優(yōu)選地，KDP多肽存在于這樣的粗KDP多肽制劑中，其含量為每克粗KDP多肽制劑足以提供0.005至0.1個(gè)Anson單位(AU)的活性。對(duì)于某些洗滌劑，如用于自動(dòng)洗碟機(jī)中的，可能需要增加粗KDP多肽制劑中的活性KDP多肽的含量以便最大限度地減少非催化活性物的總量，進(jìn)而改善去斑/成膜或其它的最后結(jié)果。在高度濃縮的洗滌劑配方中也可能需要更高的活性物含量。
優(yōu)選地，包括但不限于液態(tài)組合物的本發(fā)明的洗衣用洗滌劑組合物，可以包含大約0.001％至大約10％、優(yōu)選為大約0.005％至大約8％、最優(yōu)選為大約0.01％至大約6％的以重量計(jì)的酶穩(wěn)定體系。酶穩(wěn)定體系可以是與KDP多肽相容的任何穩(wěn)定體系，或者是可以包含在組合物中的任何其它附加的去污酶。這樣的體系可以由其它配方活性物內(nèi)在地提供，或者例如由配方設(shè)計(jì)師或洗滌劑可用酶的制造廠商來(lái)單獨(dú)地加入。例如，這樣的穩(wěn)定體系可以包括鈣離子、硼酸、丙二醇、短鏈羧酸、二羥基甲硼烷及其混合物，并且可以根據(jù)洗滌劑組合物的類型和外形來(lái)設(shè)計(jì)以解決不同的穩(wěn)定化問(wèn)題。
洗滌劑組合物也包括去污表面活性劑。優(yōu)選地，洗滌劑組合物包括至少大約0.01％的去污表面活性劑；更優(yōu)選為至少大約0.1％；更為優(yōu)選為至少大約1％；更更優(yōu)選為大約1％至大約55％。
優(yōu)選的去污表面活性劑是陽(yáng)離子、陰離子、非離子、兩性離子、兼性離子表面活性劑及其混合物，其進(jìn)一步描述如下。在洗滌劑組合物方面有用的去污表面活性劑的非限定性例子包括常規(guī)的C11-C18烷基苯磺酸鹽(“LAS”)和一級(jí)支鏈和隨機(jī)C10-C20烷基硫酸鹽(“AS”)，式CH3(CH2)X(CHOSO3-M+)CH3和CH3(CH2)Y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18二級(jí)(2，3)烷基硫酸鹽(其中x和(y+1)是至少為大約7的整數(shù)，優(yōu)選為至少大約9，且M是水增溶陽(yáng)離子，尤其是鈉)，不飽和硫酸鹽(如油基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(“AExS”；尤其是EO 1-7乙氧基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸鹽)，C10-C18甘油醚，C10-C18烷基多糖苷及其對(duì)應(yīng)的硫酸化多糖苷，以及C12-C18α-磺化脂肪酸酯。如果需要，在總組合物中也可以包括常規(guī)非離子和兼性表面活性劑，如C12-C18烷基乙氧基化物(“AE”)，包括所謂的窄峰烷基乙氧基化物和C6-C12烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜堿以及磺基甜菜堿，C10-C18胺氧化物等。也可以使用C10-C18N-烷基多羥基脂肪酸酰胺。典型的例子包括C12-C18N-甲基葡糖酰胺。參見(jiàn)WO 9,206,154。其它的糖衍生的表面活性劑包括N-烷氧基多羥基脂肪酸酰胺，如C10-C18N-(3-甲氧基丙基)葡糖酰胺。N-丙基到N-己基C12-C18葡糖酰胺可以用于產(chǎn)生低泡沫。也可以使用C10-C20常規(guī)皂類。如果需要產(chǎn)生高泡沫，可以使用支鏈C10-C16皂類。陰離子和非離子表面活性劑的混合物是尤其有用的。有用的其它常規(guī)表面活性劑列在權(quán)威教科書中。
洗滌劑助劑也包括在洗衣用洗滌劑組合物中，以有助于控制礦物硬度?？梢允褂脽o(wú)機(jī)和有機(jī)助洗劑。助洗劑典型地用于織物洗滌組合物中，以有助于除去顆粒狀污垢。
助洗劑的含量可以廣泛地變化，這取決于組合物的最終用途及其所需的外形。當(dāng)存在助洗劑時(shí)，組合物典型地包括至少大約1％的助洗劑。液態(tài)配方典型地包括大約5％至大約50％、更典型地為大約5％至大約30％的以重量計(jì)的洗滌劑助劑。粒狀配方典型地包括大約10％至大約80％、更典型為大約15％至大約50％的以重量計(jì)的洗滌劑助劑。然而，并非意味著將更低或更高含量的助洗劑排除在外。
無(wú)機(jī)或含P的洗滌劑助劑包括，但不限于，多磷酸的堿金屬、銨和鏈烷醇銨鹽(例如三多磷酸鹽、焦磷酸鹽和玻璃狀聚合偏磷酸鹽)，膦酸鹽，植酸，硅酸鹽，碳酸鹽(包括重碳酸鹽和倍半碳酸鹽)，硫酸鹽和硅鋁酸鹽。然而，在一些情況下需要非磷酸鹽助洗劑。重要的是，本文的組合物起著相當(dāng)驚人的作用，即使存在所謂的“弱”助洗劑(與磷酸鹽比較)(如檸檬酸鹽)時(shí)，或在所謂的“加助劑不足”情況下(可發(fā)生于使用沸石或?qū)訝罟杷猁}助洗劑時(shí))。
硅酸鹽助洗劑的例子是堿金屬硅酸鹽，特別是那些SiO2∶Na2O比值范圍為1.6∶1至3.2∶1的層狀硅酸鹽，如描述在美國(guó)專利4,664,839(1987年5月12日授予H.P.Rieck)中的層狀硅酸鈉。NaSKS-6是由Hoechst推向市場(chǎng)的結(jié)晶性層狀硅酸鹽的商標(biāo)(本文一般簡(jiǎn)寫為“SKS-6”)。不同于沸石助洗劑，Na SKS-6硅酸鹽助洗劑不包含鋁。Na SKS-6具有δ-Na2SiO5形態(tài)學(xué)形式的層狀硅酸鹽。它可以用如下文獻(xiàn)描述的方法制備德國(guó)DE-A-3,417,649和DE-A-3,742,043。SKS-6是用于本文的特別優(yōu)選的層狀硅酸鹽，但是這里也可以使用其它這樣的層狀硅酸鹽，如那些具有通式NaMSixO2x+1·yH2O(其中M是鈉或氫，X是1.9至4的數(shù)，優(yōu)選為2，并且Y是0至20的數(shù)，優(yōu)選為0)的層狀硅酸鹽。得自Hoechst的各種其它的層狀硅酸鹽包括作為α、β和γ形式的NaSKS-5、NaSKS-7、NaSKS-11。正如以上所提到的，δ-Na2SiO5(NaSKS-6形式)是最優(yōu)選用于本文的。其它硅酸鹽也可以用于本文，例如硅酸鎂，其在粒狀配方中可以用作為增脆劑，在氧化漂白中用作為穩(wěn)定劑，以及用作為泡沫控制體系的組分。
碳酸鹽助洗劑的例子是堿土和堿金屬碳酸鹽，其公開(kāi)在1973年11月15日公開(kāi)的德國(guó)專利申請(qǐng)2,321,001中。
硅鋁酸鹽助洗劑在本發(fā)明中是有用的。硅鋁酸鹽助洗劑在大多數(shù)目前市售的高效型粒狀洗滌劑組合物中是十分重要的，并且也可以是液態(tài)洗滌劑配方中重要的助洗劑組分。硅鋁酸鹽助洗劑包括那些具有下列經(jīng)驗(yàn)式的助洗劑Mz(zAlO2)Y]·xH2O其中Z和Y是至少6的整數(shù)，Z與Y的摩爾比為1.0至大約0.5，X是大約15至大約264的整數(shù)。
有用的硅鋁酸鹽離子交換材料是市售的。這些硅鋁酸鹽在結(jié)構(gòu)上可以是結(jié)晶性的或無(wú)定形的，并且可以是天然產(chǎn)生的或人工合成的硅鋁酸鹽。用于生產(chǎn)硅鋁酸鹽離子交換材料的方法公開(kāi)在美國(guó)專利3,985,669(1976年10月12日授予Krummel等人)中。這里所用的優(yōu)選的合成結(jié)晶性硅鋁酸鹽離子交換材料可以沸石A、沸石P(B)、沸石MAP和沸石X的名稱獲得。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)晶性硅鋁酸鹽離子交換材料具有下式Na12[(AlO2)12(SiO2)12]·xH2O其中X為大約20至大約30，尤其為大約27。這種材料被稱為沸石A。脫水沸石(X＝0-10)也可以用于本文。優(yōu)選地，硅鋁酸鹽具有大約0.1-10微米直徑的粒度。
適于本發(fā)明目的的有機(jī)洗滌劑助劑包括，但不限于，各種多羧酸鹽化合物。如本文所用的，“多羧酸鹽”意指具有多個(gè)羧酸鹽基團(tuán)的化合物，優(yōu)選為至少3個(gè)羧酸鹽基團(tuán)。一般可以以酸形式將多羧酸鹽助洗劑加入組合物中，但是也可以以中性鹽形式加入。當(dāng)以鹽形式利用時(shí)，堿金屬(如鈉、鉀和鋰)或鏈烷醇銨鹽是優(yōu)選的。
在多羧酸鹽助洗劑中包括各種類型的有用材料。多羧酸鹽助洗劑的一個(gè)重要種類包括醚多羧酸鹽，其包括公開(kāi)在下列文獻(xiàn)中的氧丁二酸氫鹽美國(guó)專利3,128,287(1964年4月7日授予Berg)和美國(guó)專利3,635,830(1972年1月18日授予Lamberti)。也參見(jiàn)美國(guó)專利4,663,071(1987年5月5日授予Bush等人)的“TMS/TDS”助洗劑。合適的醚多羧酸鹽也包括環(huán)狀化合物，尤其是脂環(huán)化合物，如那些在下列文獻(xiàn)中描述的化合物美國(guó)專利3,923,679(1975年12月2日授予Rapko)；3,835,163(1974年9月10日授予Rapko)；4,158,635(1979年6月19日授予Crutchfield等人)；4,120,874(1978年10月17日授予Crutchfield等人)；和4,102,903(1978年7月25日授予Crutchfield等人)。
其它有用的洗滌劑助劑包括醚羥基多羧酸鹽，馬來(lái)酸酐與乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1，3，5-三羥基苯-2，4，6-三磺酸，和羧甲基氧琥珀酸，多乙酸(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的各種堿金屬，銨和取代銨鹽，以及多羧酸鹽(如苯六羧酸，琥珀酸，氧聯(lián)二琥珀酸，多馬來(lái)酸，苯1，3，5-三羧酸，羧基甲基氧琥珀酸和其可溶性鹽)。
檸檬酸鹽助洗劑，例如檸檬酸及其可溶性鹽(尤其是鈉鹽)，對(duì)高效型液態(tài)洗滌劑配方來(lái)說(shuō)是特別重要的多羧酸鹽助洗劑，因?yàn)樗鼈兛傻米钥稍偕Y源并且是可生物降解的。檸檬酸鹽也可以用于粒狀組合物中，尤其是與沸石和/或?qū)訝罟杷猁}助洗劑結(jié)合起來(lái)使用。氧丁二酸氫鹽在這樣的組合物和結(jié)合物中是尤其有用的。
也適用于本發(fā)明的洗滌劑組合物中的物質(zhì)是3，3-二羧基-4-氧雜-1，6-己二酸鹽和相關(guān)化合物(公開(kāi)在1986年1月28日授予Bush的美國(guó)專利4,566,984中)。有用的琥珀酸助洗劑包括C5-C20烷基和鏈烯基琥珀酸及其鹽。這一類型的特別優(yōu)選的化合物是十二碳烯基琥珀酸。琥珀酸鹽助洗劑的具體例子包括月桂基琥珀酸鹽，十四烷基琥珀酸鹽，十六烷基琥珀酸鹽，2-十二碳烯基琥珀酸鹽(優(yōu)選的)，2-十五碳烯基琥珀酸鹽等等。月桂基琥珀酸鹽是這一組的優(yōu)選助洗劑，并且被描述在Barrat等的歐洲專利申請(qǐng)200,263(1986年11月5日公開(kāi))中。
其它合適的多羧酸鹽公開(kāi)在美國(guó)專利4,144,226(1979年3月13日授予Crutchfield等人)和美國(guó)專利3,308,067(1967年3月7日授予Diehl)。也參見(jiàn)美國(guó)專利3,723,322(1973年3月27日授予Diehl)。
脂肪酸(例如C12-C18單羧酸)也可以單獨(dú)地、或者與上述助洗劑(尤其是檸檬酸鹽和/或琥珀酸鹽助洗劑)結(jié)合加入組合物中，以提供附加的助洗劑活性。這樣的脂肪酸的使用一般地將導(dǎo)致起泡的減少，對(duì)此配方設(shè)計(jì)師應(yīng)當(dāng)加以考慮。
在可以使用含磷助洗劑的情況下，尤其是在用于手洗操作的塊狀配方中，可以使用各種堿金屬磷酸鹽，如眾所周知的三聚磷酸鈉鹽、焦磷酸鈉和正磷酸鈉。也可以使用膦酸鹽助洗劑，如乙烷-1-羥基-1，1-二膦酸鹽和其它已知的膦酸鹽(參見(jiàn)，如1964年12月1日授予Diehl的美國(guó)專利3,159,581；1965年10月19日授予Diehl的3,213,030；1968年9月3日授予Quimby的3,400,148；1969年1月14日授予Roy的3,422,021；和1969年1月14日授予Quimby的3,422,137)。
可以用于本發(fā)明的洗衣用洗滌劑組合物的附加組分包括，但不限于烷氧基化的多羧酸鹽(以提供，例如，附加的去油污性能)，漂白劑，漂白活化劑，漂白催化劑，增白劑，螯合劑，粘土污垢清除/抗再沉積劑，染料轉(zhuǎn)移抑制劑，附加的酶(包括脂肪酶、淀粉酶、水解酶和其它蛋白酶)，織物軟化劑，聚合污垢釋放劑，聚合分散劑和泡沫抑制劑。
本文的組合物還可以包括一或多種其它的洗滌劑添加材料或有助于或增強(qiáng)清潔性能、對(duì)所需清潔底物的處理或者改善洗滌劑組合物的美學(xué)特性的其它材料(例如香料、著色劑、染料等等)。
本文的洗滌劑組合物還可以包括其它已知的洗滌劑清潔組分，這些組分包括烷氧基化的多羧酸鹽，漂白化合物，增白劑，螯合劑，粘土污垢清除/抗再沉積劑，染料轉(zhuǎn)移抑制劑，酶，酶穩(wěn)定系統(tǒng)，織物軟化劑，聚合污垢釋放劑，聚合分散劑，泡沫抑制劑。洗滌劑組合物也可以包括其它組分，這些組分包括載體，水溶助劑，加工助劑，染料或顏料，液態(tài)配方的溶劑，塊狀組合物的固體填料。
G.治療或預(yù)防脫皮的方法本發(fā)明的另一方面涉及治療或者預(yù)防脫皮的方法。該方法包括局部施用安全和有效量的包含KDP多肽的組合物。
在這里，“安全和有效量”意指在正確的醫(yī)學(xué)判斷范圍之內(nèi)，KDP多肽量高到足以提供對(duì)所治療癥狀的明顯的改善，但低到足以避免嚴(yán)重的副作用(具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比)。KDP多肽的安全和有效量將隨著所治療的具體癥狀、患者年齡和身體況狀、病癥的嚴(yán)重程度、治療的持續(xù)時(shí)間、并行治療的性質(zhì)等等的變化而變化。
在主題方法中使用的合適的組合物包括上述護(hù)膚組合物，該護(hù)膚組合物包括護(hù)發(fā)組合物(例如用來(lái)治療/預(yù)防由脫皮造成的頭皮屑)。
下列實(shí)施例進(jìn)一步描述和說(shuō)明屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的優(yōu)選實(shí)施方案。給出這些例子只是為了說(shuō)明的目的，而不作為對(duì)本發(fā)明的限制，因?yàn)榭赡艽嬖谄湓S多變體而不偏離其精神和范圍。
實(shí)施例1
這一實(shí)施例顯示KDP多核苷酸的分離。用化學(xué)方法合成一對(duì)寡核苷酸引物，并利用人角質(zhì)形成細(xì)胞cDNA文庫(kù)作為模板，用其由PCR(聚合酶鏈反應(yīng))來(lái)擴(kuò)增人SCCE(角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶樣酶)基因的編碼區(qū)(基于在Hansson等人，生物化學(xué)雜志，26919420-19426，1994中提出的基因的DNA序列)。然后將所擴(kuò)增的SCCE cDNA片段克隆入大腸桿菌載體，并確認(rèn)它的DNA序列。然后分離所克隆的SCCE DNA片段，用32P放射性標(biāo)記之，并在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中將其用作為探針，以篩選具有與SCCE類似的結(jié)構(gòu)的新cDNA克隆。雜交實(shí)驗(yàn)在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行，這種條件提供陽(yáng)性信號(hào)，即使核苷酸序列的相似性低至大約70％。在一個(gè)具體實(shí)驗(yàn)中，自所篩選的1×105λ噬菌體克隆中獲得了11個(gè)陽(yáng)性克隆，并且結(jié)果是其中的兩個(gè)陽(yáng)性克隆(克隆#31和克隆67#)在不同的位置上攜帶相同的cDNA。我們集中注意力于這兩個(gè)克隆。由于兩克隆都缺乏基因的5′部分，因此由PCR制備了對(duì)應(yīng)于克隆#67的5′末端的短DNA片段，用32P放射性標(biāo)記之，并利用其來(lái)再一次篩選文庫(kù)，以分離包含缺失部分的克隆。自另一所篩選的1×105克隆中選擇出總共12個(gè)陽(yáng)性克隆。DNA測(cè)序分析表明在這些克隆中，命名為#TZ--10的克隆包含cDNA的缺失5′部分和最長(zhǎng)5′非翻譯區(qū)。分離克隆#31和#TZ-10的DNA，并使它們?cè)趐Bluescript II SK+載體中與適當(dāng)?shù)南拗泼敢黄鸷喜槿L(zhǎng)克隆。全長(zhǎng)克隆的DNA序列與DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的比較表明它編碼新絲氨酸蛋白酶，因此，我們將其命名為克隆KDP1(角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的蛋白酶1)。在蛋白質(zhì)水平上，KDP1在結(jié)構(gòu)上類似于SCCE、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(分別為49％、48％和36％)，但彼此之間卻明顯不同。KDP1具有編碼KDP多肽(保藏號(hào)FERMBP-6129提出的)的核苷酸序列。
實(shí)施例2這一實(shí)施例顯示KDP多核苷酸的化學(xué)合成。利用核苷酸合成儀(如ABI DNA/RNA合成儀模型380A/380B/381A/390Z/391/392/394)，用化學(xué)方法合成對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1的KDP1基因的任一所需部分的單鏈或雙鏈寡核苷酸。
實(shí)施例3這一實(shí)施例顯示包含KDP多核苷酸的表達(dá)載體的形成。通過(guò)利用重組PCR技術(shù)，使KDP1基因的成熟部分與在5′末端包含六個(gè)組氨酸殘基的重復(fù)片段的人造前序列融合。這一組氨酸標(biāo)記設(shè)計(jì)用于在表達(dá)之后KDP1蛋白質(zhì)的快速純化。前序列也包含腸激酶的特異性切割位點(diǎn)，以便可以在純化步驟之后通過(guò)腸激酶消化來(lái)激活重組前KDP1。這一KDP1基因盒在pPIC9載體(Invitrogen)(用于在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá))的Xho1和Noti1位點(diǎn)之間得到克隆。克隆位點(diǎn)直接定位于適當(dāng)讀框中的酵母α-因子信號(hào)序列的下游，以便設(shè)計(jì)成使重組前KDP1分泌到培養(yǎng)基中。前KDP1蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)處于AOX1啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子定位于酵母α-因子信號(hào)序列的上游。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入甲醇來(lái)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)得自AOX1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄物，并因此可以由甲醇誘導(dǎo)重組KDP1蛋白質(zhì)。載體也分別在大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中包含氨芐青霉素抗性基因和用于選擇的HIS4基因。
實(shí)施例4這一實(shí)施例顯示用實(shí)施例3的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)宿主的轉(zhuǎn)化。用原生質(zhì)球方法或電穿孔法完成畢赤酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。(參考在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法的手冊(cè)(目錄號(hào)K1710-01)，其由Invitrogen分發(fā))。通過(guò)用山梨醇和酶解酶處理GS115、KM71或SMD1168菌株來(lái)制備畢赤酵母原生質(zhì)球。加入10μg表達(dá)質(zhì)粒DNA，以在PEG和CaCl2存在下轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球制備物。然后在28-30℃下將原生質(zhì)球平板接種在用于選擇HIS+轉(zhuǎn)化體的組氨酸-缺失平板上。對(duì)于電穿孔法，使畢赤酵母GS115、KM71或SMD1168細(xì)胞生長(zhǎng)在豐富培養(yǎng)基中，收集并利用1M山梨醇溶液處理它們。在細(xì)胞與5-20μg線性化質(zhì)粒DNA混合之后，將溶液轉(zhuǎn)移至冰冷的0.2cm電穿孔小池(Bio-Rad)中。用Bio-Rad GenePulsar在1,500伏特下以25pF電容和200Ω電阻進(jìn)行電穿孔。在28-30℃下，將細(xì)胞鋪展在平板上以獲得HIS+轉(zhuǎn)化體。經(jīng)由在轉(zhuǎn)化DNA和基因組之內(nèi)的同源區(qū)之間的同源重組，線型DNA可以產(chǎn)生巴斯德畢赤酵母的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。與雙交換事件(置換)相比，單交換事件(插入)更為可能。由于單交換事件不破壞宿主基因組上的AOX1基因，因此這樣的轉(zhuǎn)化體可以在含甲醇的平板上充分地生長(zhǎng)(HIS+和Mut+表型)。相反，當(dāng)由AOX1啟動(dòng)子和載體的3′AOX1區(qū)與基因組之間雙交換事件而引起基因置換時(shí)，將導(dǎo)致完全除去AOX1編碼區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)它們?cè)诤状嫉钠桨迳系木徛L(zhǎng)來(lái)選擇具有所產(chǎn)生的表型(HIS+Muts)的轉(zhuǎn)化體。篩選用于KDP1表達(dá)的Mut+和Muts轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例5這一實(shí)施例顯示KDP多肽的表達(dá)和純化。
表達(dá)通過(guò)搖瓶或發(fā)酵培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在基本或豐富培養(yǎng)基中，直到它們達(dá)到它們的最大生長(zhǎng)量。對(duì)于KDP1基因的誘導(dǎo)，在Muts轉(zhuǎn)化體的情況下，以1％的最大濃度在培養(yǎng)基中加入甲醇。對(duì)于Mut+轉(zhuǎn)化體，加入甲醇以使細(xì)胞得以保持溶解氧水平在培養(yǎng)基中為20％以上。在開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)之后大約6天，收獲培養(yǎng)基，并由離心收集上清液。
純化將上清液施于鎳-螯合柱上，并通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子的高親和性HIS標(biāo)記來(lái)吸附前KDP1。在自柱上洗去培養(yǎng)基中的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)之后，由在低pH緩沖液中的洗脫或通過(guò)與咪唑或組氨酸的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)回收前KDP1蛋白質(zhì)。由超濾濃縮洗脫物，并用腸激酶反應(yīng)緩沖液交換緩沖液。通過(guò)利用腸激酶處理前KDP1蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)它的活化。在活化步驟之后，利用合適的生化方法除去腸激酶，濃縮樣品，凍干，并在使用前將其保持在4℃下。
實(shí)施例6這一實(shí)施例顯示簡(jiǎn)單的局部護(hù)膚組合物。利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分。組分以組合物重量計(jì)的％KDP多肽 5乙醇平衡至100這一組合物以足以沉積大約0.5μg/cm2皮膚的量每天施用兩次，歷時(shí)六個(gè)月，以提供皮膚調(diào)理益處。
實(shí)施例7這一實(shí)施例顯示簡(jiǎn)單的局部護(hù)膚組合物。利用混合技術(shù)常規(guī)合并下列組分。組分 以組合物重量計(jì)的％KDP多肽0.05去離子水 平衡至100這一組合物每天施用一次，歷時(shí)六個(gè)月。每cm2皮膚足以沉積大約120μg活性物的用量對(duì)于提供皮膚調(diào)理益處是適當(dāng)?shù)摹?br> 實(shí)施例8這一實(shí)施例顯示通過(guò)利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分制備的乳膏組合物。組分 以組合物重量計(jì)的％--水相--美國(guó)藥典級(jí)H2O 63.03EDTA二鈉 0.13甘油 3羥苯甲酸甲酯 0.25--油相--丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯 3硬脂酸甘油酯 4鯨蠟醇 1硬脂醇 1乙氧基化鯨蠟基硬脂醇 1.5羥苯甲酸丙酯 0.1--防腐劑相--美國(guó)藥典級(jí)H2O 1.49丁二醇 1.5芐醇 0.5--活性物溶液--KDP多肽 0.03水平衡至100將前三個(gè)相與活性物溶液混合。組合物每隔一天施用一次，歷時(shí)兩個(gè)月。每cm2皮膚沉積40μg活性物的用量對(duì)于提供皮膚調(diào)理益處是適當(dāng)?shù)摹?br> 實(shí)施例9這一實(shí)施例顯示用于治療或防止頭皮脫皮的香波組合物。利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分。組分 以組合物重量計(jì)的％月桂基醚硫酸鈉(2EO)21％AD 41.4％月桂基二甲基氨基乙酸甜菜堿30％AD 4椰子脂肪酸二乙醇胺 1.5Oleth-3-磷酸酯(CRODAFOS N 3AcidCroda) 1PEG-15牛脂多胺(POLYQUART HHenkel)50％活性物 1.5防腐劑，著色物質(zhì)，鹽 0.58香料 適量KDP多肽 1水 平衡至100實(shí)施例10這一實(shí)施例顯示用于治療或防止頭皮脫皮的頭發(fā)調(diào)理組合物。利用常規(guī)混合技術(shù)合并下列組分。組分以組合物重量計(jì)的％二甲聚硅氧烷/環(huán)甲聚硅氧烷 4.2十八酰氨基丙基二甲胺1鯨蠟醇 0.9二牛脂二甲銨0.75硬脂醇 0.6羥乙基纖維素0.5一硬脂酸甘油酯 0.25無(wú)水檸檬酸 0.22防腐劑 0.0005香料0.26KDP多肽 8水 平衡至100實(shí)施例11按照本發(fā)明制備下列的粒狀洗衣用洗滌劑組合物A至D組分以組合物重量計(jì)的％A B C D--基本顆粒--沸石A 30 22 24 10硫酸鹽 10 5 10 7MA/AA 3 - - -AA - 1.6 2MA/AA(1)- 12 - 6LAS 14 10 9 20C45AS 8 7 9 7C45AES - 1 1硅酸鹽 - 1 0.5 10皂 - 2 - -增白劑10.2 0.2 0.2 0.2碳酸鹽 6 9 1010PEG 4000 - 1 1.5 -DTPA - 0.4 - ---噴霧于--C25E9 - - - 5C45E7 1 1 - -C23E9 - 1 2.5 -香料 0.2 0.3 0.3 ---干燥添加劑--碳酸鹽 5 10188PVPVI/PVNO 5 10188KDP多肽1 1 1 0.5脂肪酶 0.4 - - 0.4淀粉酶 0.1 - - 0.1纖維素酶 0.1 0.2 0.2 0.1NOBS - 4 - 4.5PB11 5 1.5 6硫酸鹽 4 5 - 5SRP1 - 0.4 - -泡沫抑制劑 - 0.5 0.5 -混雜/次要組分 平衡至100AA平均分子量為4,500的聚丙烯酸鈉聚合物。
淀粉酶淀粉水解酶，具有以重量計(jì)的1.6％的活性酶，由NOVOIndustries A/S以Termamyl 120T商品名出售。
漂白劑14，4′-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯二鈉。
碳酸鹽粒徑為200μm至900μm之間的無(wú)水碳酸鈉。
纖維素酶纖維素水解酶，具有以重量計(jì)的0.23％的活性酶，由NOVO Industries A/S以Carezyme商品名出售。
CxyASC1x-C1y烷基硫酸鈉。
CxyEz與Z摩爾(平均值)的環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y主要線性的伯醇。
CxyEzS與Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基硫酸鈉。
DTPA二亞乙基三胺五乙酸。
LAS線型C11-13烷基苯磺酸鈉。
脂肪酶脂解酶，具有以重量計(jì)的2.0％的活性酶，由NOVOIndustries A/S以商品名Lipolase出售。
MA/AA1∶4馬來(lái)酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量為大約70,000。
MA/AA(1)4∶6馬來(lái)酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量為大約10,000。
NOBS鈉鹽形式的壬酰羥苯磺酸酯。
PB1標(biāo)稱式為NaBO2·H2O2的無(wú)水過(guò)硼酸鈉漂白劑。
PEGx分子量為X(典型地為4,000)的聚乙二醇。
PVNO平均分子量為50,000的聚乙烯吡啶N-氧化物聚合物。
PVPVI平均分子量為20,000的聚乙烯吡咯烷酮和乙烯咪唑的共聚物。
硅酸鹽無(wú)定形的硅酸鈉(SiO2∶Na2O＝2.0∶1)。
皂得自80/20的牛脂和椰子脂肪酸的混合物的線型烷基羧酸鈉。
SRP1陰離子封端的聚酯。
硫酸鹽無(wú)水硫酸鈉。
沸石A具有0.1至10微米的初級(jí)粒徑、分子式為Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅鋁酸鹽鈉(重量以無(wú)水基準(zhǔn)表示)。
可以理解，本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了說(shuō)明本發(fā)明，并且基于其的各種改進(jìn)或變化都可以在不偏離本發(fā)明范圍的情況下由本領(lǐng)域技術(shù)人員想到。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人The Procter & Gamble Company，N/A N/A(ii)發(fā)明名稱得自人皮膚的蛋白酶基因(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)收信人T.David Reed(B)街道5299 Spring Grove Avenue(C)城市Cincinnati(D)州俄亥俄(E)國(guó)家美國(guó)(F)ZIP45217-1087(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)當(dāng)前的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Reed，T David(B)登記號(hào)32,931(C)參考/證書號(hào)AA-(ix)聯(lián)系信息(A)電話513-627-7025(B)傳真513-627-6333(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1499個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置291...1172(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置489...1172(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞5′UTR(B)位置1...290(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞3′UTR(B)位置1173...1499(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGCCAGGAA GGCACAGGCC TGAGAAGTCT GCGGCTGAGC TGGGAGCAAA TCCCCCACCC60CCTACCTGGG GGACAGGGCA AGTGAGACCT GGTGAGGGTG GCTCAGCAGG AAGGAAGGAG 120AGGTGTCTGT GCGTCCTGCA CCCACATCTT TCTCTGTCCC CTCCTTGCCC TGTCTGGAGG 180CTGCTAGACT CCTATCTTCT GAATTCTATA GTGCCTGGGT CTCAGCGCAG TGCCGATGGT 240GGCCCGTCCT TGTGGTTCCT CTCTACTTGG GGAAATCAGG TGCAGCGGCC ATG GCT 296Met Ala-66 -65ACA GCA AGA CCC CCC TGG ATG TGG GTG CTC TGT GCT CTG ATC ACA GCC 344Thr Ala Arg Pro Pro Trp Met Trp Val Leu Cys Ala Leu Ile Thr Ala-60 -55 -50TTG CTT CTG GGG GTC ACA GAG CAT GTT CTC GCC AAC AAT GAT GTT TCC 392Leu Leu Leu Gly Val Thr Glu His Val Leu Ala Asn Asn Asp Val Ser-45 -40 -35TGT GAC CAC CCC TCT AAC ACC GTG CCC TCT GGG AGC AAC CAG GAC CTG 440Cys Asp His Pro Ser Asn Thr Val Pro Ser Gly Ser Asn Gln Asp Leu-30 -25 -20GGA GCT GGG GCC GGG GAA GAC GCC CGG TCG GAT GAC AGC AGC AGC CGC 488Gly Ala Gly Ala Gly Glu Asp Ala Arg Ser Asp Asp Ser Ser Ser Arg-15 -10 -5ATC ATC AAT GGA TCC GAC TGC GAT ATG CAC ACC CAG CCG TGG CAG GCC 536Ile Ile Asn Gly Ser Asp Cys Asp Met His Thr Gln Pro Trp Gln Ala1 5 10 15GCG CTG TTG CTA AGG CCC AAC CAG CTC TAC TGC GGG GCG GTG TTG GTG584Ala Leu Leu Leu Arg Pro Asn Gln Leu Tyr Cys Gly Ala Val Leu Val20 25 30CAT CCA CAG TGG CTG CTC ACG GCC GCC CAC TGC AGG AAG AAA GTT TTC 632His Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Lys Val Phe35 40 45AGA GTC CGT CTC GGC CAC TAC TCC CTG TCA CCA GTT TAT GAA TCT GGG 680Arg Val Arg Leu Gly His Tyr Ser Leu Ser Pro Val Tyr Glu Ser Gly50 55 60CAG CAG ATG TTC CAG GGG GTC AAA TCC ATC CCC CAC CCT GGC TAC TCC 728Gln Gln Met Phe Gln Gly Val Lys Ser Ile Pro His Pro Gly Tyr Ser65 70 75 80CAC CCT GGC CAC TCT AAC GAC CTC ATG CTC ATC AAA CTG AAC AGA AGA 776His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Leu Asn Arg Arg85 90 95ATT CGT CCC ACT AAA GAT GTC AGA CCC ATC AAC GTC TCC TCT CAT TGT 824Ile Arg Pro Thr Lys Asp Val Arg Pro Ile Asn Val Ser Ser His Cys100 105 110CCC TCT GCT GGG ACA AAG TGC TTG GTG TCT GGC TGG GGG ACA ACC AAG 872Pro Ser Ala Gly Thr Lys Cys Leu Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Lys115 120 125AGC CCC CAA GTG CAC TTC CCT AAG GTC CTC CAG TGC TTG AAT ATC AGC 920Ser Pro Gln Val His Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn Ile Ser130 135 140GTG CTA AGT CAG AAA AGG TGC GAG GAT GCT TAC CCG AGA CAG ATA GAT 968Val Leu Ser Gln Lys Arg Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Arg Gln Ile Asp145 150 155 160GAC ACC ATG TTC TGC GCC GGT GAC AAA GCA GGT AGA GAC TCC TGC CAG 1016Asp Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Lys Ala Gly Arg Asp Ser Cys Gln
165 170 175GGT GAT TCT GGG GGG CCT GTG GTC TGC AAT CCC TCC CTG CAG GGA CTC 1064Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asp Gly Ser Leu Gln Gly Leu180 185 190GTG TCC TGG GGA GAT TAC CCT TGT GCC CGG CCC AAC AGA CCG GGT GTC 1112Val Ser Trp Gly Asp Tyr Pro Cys Ala Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val195 200 205TAC ACG AAC AAC TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATC CAG GAA ACC ATC CAG 1160Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Gln Glu Thr Ile Gln210 215 220GCC AAC TCC TGA GTCATCCCAG GACTCAGCAC ACCGGCATCC CCACCTGCTG 1212Ala Asn Ser225CAGGGACAGC CCTGACACTC CTTTCAGACC CTCATTCCTT CCCAGAGATG TTGAGAATGT1272TCATCTCTCC AGCCCCTGAC CCCATGTCTC CTGGACTCAG GGTCTGCTTC CCCCACATTG1332GGCTGACCGT GTCTCTCTAG TTGAACCCTG GGAACAATTT CCAAAACTGT CCAGGGCGGG1392GGTTGCGTCT CAATCTCCCT GGGGCACTTT CATCCTCAAG CTCAGGGCCC ATCCCTTCTC1452TGCAGCTCTG ACCCAAATTT AGTCCCAGAA ATAAACTGAG AAGTGGC 1499(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度294個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Thr Ala Arg Pro Pro Trp Met Trp Val Leu Cys Ala Leu Ile-66 -65 -60 -55Thr Ala Leu Leu Leu Gly Val Thr Glu His Val Leu Ala Asn Asn Asp-50 -45 -40 -35Val Ser Cys Asp His Pro Set Asn Thr Val Pro Ser Gly Ser Asn Gln-30 -25 -20Asp Leu Gly Ala Gly Ala Gly Glu Asp Ala Arg Ser Asp Asp Ser Ser-15 -10 -5Ser Arg Ile Ile Asn Gly Ser Asp Cys Asp Met His Thr Gln Pro Trp1 5 10Gln Ala Ala Leu Leu Leu Arg Pro Asn Gln Leu Tyr Cys Gly Ala Val15 20 25 30Leu Val His Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Lys35 40 45Val Phe Arg Val Arg Leu Gly His Tyr Ser Leu Ser Pro Val Tyr Glu50 55 60Ser Gly Gln Gln Met Phe Gln Gly Val Lys Ser Ile Pro His Pro Gly65 70 75Tyr Ser His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Leu Asn80 85 90Arg Arg Ile Arg Pro Thr Lys Asp Val Arg Pro Ile Asn Val Ser Ser95 100 105 110His Cys Pro Ser Ala Gly Thr Lys Cys Leu Val Ser Gly Trp Gly Thr115 120 125Thr Lys Ser Pro Gln Val His Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn130 135 140Ile Ser Val Leu Ser Gln Lys Arg Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Arg Gln145 150 155Ile Asp Asp Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Lys Ala Gly Arg Asp Ser160 165 170Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Ser Leu Gln175 180 185 190Gly Leu Val Ser Trp Gly Asp Tyr Pro Cys Ala Arg Pro Asn Arg Pro195 200 205Gly Val Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Gln Glu Thr210 215 220Ile Gln Ala Asn Ser22權(quán)利要求
1.一種包含氨基酸序列的分離的多肽，該氨基酸序列a)實(shí)質(zhì)上顯示在SEQ ID NO2中；b)實(shí)質(zhì)上類似于由質(zhì)粒中的核苷酸序列 編碼的氨基酸序列，其中的質(zhì)粒具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征；或者c)實(shí)質(zhì)上類似于包含SEQ ID NO2的位置39-43、86-88和177-185的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中的氨基酸序列顯示在下列序列或片段中a)SEQ ID NO2，b)SEQ ID NO2的位置1-227，或者c)SEQ ID NO2的位置39-185。
3.一種包含核苷酸序列的分離的多核苷酸，該核苷酸序列a)實(shí)質(zhì)上顯示在SEQ ID NO1中；b)實(shí)質(zhì)上類似于包含在質(zhì)粒中的核苷酸序列，其中的質(zhì)粒具有保藏號(hào)FERM BP-6129的所有鑒定特征；或者c)實(shí)質(zhì)上類似于包含SEQ ID NO1的位置603-617、744-752和1017-1043的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3的分離的多核苷酸，其中的核苷酸序列顯示在下列序列或片段中a)SEQ ID NO1，b)SEQ ID NO1的291-1172位置c)SEQ ID NO1的536-1172位置，d)SEQ ID NO1的1-1172位置，e)SEQ ID NO1的291-1499位置，或者f)SEQ ID NO1的603-1043位置。
5.一種編碼權(quán)利要求1或2之任一的多肽的分離的多核苷酸。
6.一種包含權(quán)利要求3-5之任一的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)。
7.一種包含權(quán)利要求1或2之任一的多肽的組合物。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中的組合物是護(hù)膚組合物。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中的組合物是洗衣用洗滌劑組合物。
10.一種治療或防止脫皮的方法，該方法包括局部施用包含權(quán)利要求1或2之任一的多肽的組合物。
11.一種特異地結(jié)合權(quán)利要求1或2之任一的多肽的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離的角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的蛋白酶,該蛋白酶包含實(shí)質(zhì)上類似于由質(zhì)粒(具有保藏號(hào)FERM BP－6129的所有鑒定特征)中的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的氨基酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了包含上述多肽的護(hù)膚和洗衣用洗滌劑組合物。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1276011SQ97182443
公開(kāi)日2000年12月6日 申請(qǐng)日期1997年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月3日
發(fā)明者北出治子, 吉川秋勝, 材生朋子 申請(qǐng)人:普羅克特和甘保爾公司