專利名稱：作為融合蛋白的異源抗原的表達系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和遺傳工程領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及使用重組DNA技術(shù)經(jīng)與細菌肽融合在微生物宿主中表達異源蛋白質(zhì)的方法。現(xiàn)有技術(shù)用重組DNA技術(shù)在大腸桿菌中產(chǎn)生任何來源的蛋白質(zhì)的有效性已有廣泛說明。為此，盡管由于克隆和表達的各種基因通常需要單個對待，需要新的變體，但已開發(fā)了大量載體(Denhardt，D.T.和Colasanti，載體雜志，Butterworths，Stoneham，M，pp.179，1987和Lukacsovich，T.等，生物技術(shù)雜志，13，243，1990)。
由于可以獲得高的表達水平，胞內(nèi)合成已用于在大腸桿菌中獲得異源多肽(Goeddel，D.V，酶學方法，185，3-7，1990)。然而，對宿主蛋白酶的敏感性和表達的蛋白質(zhì)的毒性之類的因素可以明顯降低所說的水平，而不依賴于高效調(diào)節(jié)序列的使用(Reads，C.A.和Saier，M.H.，細菌學雜志，153，685-692；Gwyn，G.W.，膜蛋白表達系統(tǒng)用戶指南，波特蘭出版社，倫敦，英國，29-82)。
在合適的載體中，與編碼宿主細胞中穩(wěn)定多肽的核酸序列同讀框克隆編碼興趣蛋白質(zhì)的核苷酸序列，導(dǎo)致在細胞質(zhì)中表達被稱為融合蛋白的雜合產(chǎn)物(Marston，F(xiàn).A.O.，生物化學雜志240，11986)。這種多肽一般對宿主的蛋白酶解降解較不敏感，或者由于形成包含體毒性較低。這導(dǎo)致比不使用穩(wěn)定子肽時所獲多肽較高的表達水平(Itakura，K.等，科學，198，1056，1977)。此外，如果可以使用不同的用于重組產(chǎn)物隨后復(fù)性的方法，這類表達會有利于簡化初始純化步驟(Fischer，B.，Sumner，I.和Goodenough，P.，生物技術(shù)和生物工程，41，3-13)。
在大腸桿菌中許多重組蛋白質(zhì)的表達期間，包含體是不溶性蛋白質(zhì)聚集體，在胞質(zhì)溶膠中表現(xiàn)為電子致密體(Rinas，Or.和Bailey，應(yīng)用微生物學和生物技術(shù)雜志，37，609-614)。它們是部分折疊的多肽之間相互作用的結(jié)果，由于其中疏水殘基對溶劑的暴露，其聚集體是熱力學上有利的(Kiefhaber，T.，Rudolph，R.等，生物技術(shù)，9，825-829)。由于含豐富的二硫鍵-形成氨基酸(半胱氨酸)或β轉(zhuǎn)角-形成氨基酸(脯氨酸)，許多真核蛋白質(zhì)在細菌胞質(zhì)溶膠中的緩慢折疊使得它們作為穩(wěn)定化肽廣泛使用。為這一目的，前者的例子使用具有抗體結(jié)合活性的多肽，它們來源于人奶脂肪球蛋白(HMFG)(按照國際專利申請PCT No.WO 9207939 A2 920514)；免疫球蛋白恒定區(qū)(如歐洲專利申請No.EP 0464533 A1 920108中描述的)；人血管生成素(歐洲專利申請No.EP 0423641 A2 910424)、生長激素(EP0429586 A1 910605)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(WO 8809372 A1 881201)和豬腺苷酸激酶(EP 0423641 A2 910424和EP 0412526 A2 910213)。
然而，如果融合蛋白是疫苗候選者，則使用構(gòu)成融合蛋白顯著部分的穩(wěn)定子多肽具有某些缺點，因為外源序列的存在可以改變B和T細胞表位的天然順序(Denton G.，Hudecz，F(xiàn).，Kajtar，J.等，肽研究，7，258-264)或者它們被抗原呈遞細胞的加工(Del Val，M.，Schlicht，H.，Ruppert，T.，等，細胞，66，1145-1153)，甚至經(jīng)特異表位抑制現(xiàn)象嚴重影響候選者的免疫原性(Etlinger，H.，現(xiàn)代免疫學，13，52-55)。
由于以上提及的現(xiàn)象，一些研究組試圖確定仍然使表達穩(wěn)定化的小片段。例如，德國專利申請3541856 A1(Hoechst AG)報道了使用穩(wěn)定子肽以獲得在大腸桿菌中合成的可溶形式的融合蛋白的可能性，所述肽由人類蛋白質(zhì)白介素(IL-2)N-末端頭95個氨基酸構(gòu)成。類似地，在同一公司的歐洲專利申請0416 673 A2和229 998中，使用了與所說蛋白質(zhì)的頭58個或38個氨基酸一致的穩(wěn)定子肽。在歐洲專利416 673 B1中，也使用了IL-2的頭58個氨基酸，為了這一目的，在使用人血清白蛋白N-末端片段(歐洲專利申請EP 0423641 A1 920212)、結(jié)締組織的激活劑肽III(WO 90136647 A1901115)、人類激肽釋放酶片段(EP 0381433 A1900808)的情況下，采用了類似的策略。這些發(fā)明給出了以前的問題的解決辦法，但是所獲得的融合多肽不能包含到用于人類的疫苗制劑中，因為其中存在與人類蛋白質(zhì)同源的或相同的序列，有誘導(dǎo)自身免疫疾病的可能性。
也已成功地開發(fā)了供胞內(nèi)表達的使用細菌來源(并且由此沒有與人源抗原的交叉反應(yīng)性)的穩(wěn)定子多肽的替代方案。一種對這一目的最有用的蛋白質(zhì)是大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Itakura，K.等，科學，198，1056 1977)或其部分(Hoechst AG公司的德國專利申請EP 0235754 A2 870909)。這個系統(tǒng)的主要缺點是這種蛋白質(zhì)大，這使得所需肽僅代表總雜合蛋白的一小部分(Flowers，N.等，應(yīng)用微生物學和生物技術(shù)25，267 1986；G oeddel，D.V.等，P.N.A.S.USA,76,106)。類似問題出現(xiàn)在破傷風類毒素C片段和假單胞菌外毒素的應(yīng)用中(國際專利申請PCT WO 9403615 A1 940217和歐洲專利申請EP 0369316 A2 900523)。非常合適的表達變體是使用具有大腸桿菌tiorredoxin的融合物(PCT專利申請WO 9402502 A1 940203)，為了有利于純化，其利用了經(jīng)滲透壓從細胞釋放的性質(zhì)(Elyaagoubi，A.，Kohiyama，M.，Richarme，G.，細菌學雜志，176，7074-7078)。然而，這一方式對包含體的獲得是不成功的，因為通過這一步驟，包含體不能被游離出來。
許多這樣的問題已由模擬融合蛋白的設(shè)計解決。在這些設(shè)計中，穩(wěn)定子肽與興趣蛋白質(zhì)靠允許兩者獨立折疊的間隔分離開，其氨基酸序列使其對特異性內(nèi)肽酶的進攻敏感。如果有識別所選穩(wěn)定子的配體，則經(jīng)親和色譜法純化融合多肽和經(jīng)用不同的蛋白酶處理從穩(wěn)定子最終分離它是可能的(Cress，D.，Shultz，J.和Breitlow，S.，Promega you Note，42，2-7)。另一個優(yōu)點是在接下來的純化的中間步驟中利用這一分子相互作用，而不需要每種所表達蛋白質(zhì)的抗體。這一點的一個眾所周知的實例是利用組氨酸(His)與系統(tǒng)中某些金屬(如鎳(Ni)和鋅(Zn))的親和性，按照Upjoho公司的PCT專利申請WO 9115589 A1 911017中的描述，所述系統(tǒng)由具有6個串聯(lián)His的穩(wěn)定子和鎳螯合物親和基質(zhì)組成。盡管如此，這一種類的表達系統(tǒng)不是在所有情況下都起作用，因為除了其它原因外，興趣蛋白質(zhì)可以具有所選蛋白酶的限制性位點，或折疊后有暴露于溶劑的間隔(Uhlen，M.和Moks，T.，酶學方法.185，129-140；Cress，D.，Shultz，J.和Breitlow，S.，Promega youNote，42，2-7)，以致干擾穩(wěn)定子和親和基質(zhì)之間的結(jié)合(新英格蘭生物實驗室，The NEB Transcript，3，14)，或者只是其純化需要影響它的生物活性的條件。由于這些理由，需要不同的變體，因為各種要表達的蛋白質(zhì)代表特定的情形。為了這一目的，已經(jīng)開發(fā)出基于下列蛋白質(zhì)的穩(wěn)定子肽大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)，其對直鏈淀粉樹脂具有親和性(歐洲專利申請EP 0426787 A1 910515)；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(歐洲專利申請EP0131363 A1 850116)或谷脫甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Amrad公司的歐洲專利申請EP 0293249 A1 88130)，其可用固定化底物獲得；金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A(按照專利申請PCT WO 9109946 A1 910711)；或薛曼納氏丙酸桿菌轉(zhuǎn)羧基酶復(fù)合物的12.5kDa亞單位，其在體內(nèi)生物素化，并使得可以進行基于抗生物素蛋白的生物素親和性的純化(Cress，D.，Shultz，J.和Breitlow，S.，Promega Notes，42，2-7，專利申請EP 0472658 A1 920304或WO 9014431A1 901129)。
歐洲專利申請EP 0472658 A1 920304或WO 9014431 A1 901129中描述的方法具有特別意義，該方法是由生物技術(shù)研究與發(fā)展公司與美國伊利諾州大學一同開發(fā)的。在這一申請中，描述了一種表達系統(tǒng)，其使用二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶硫辛酸結(jié)合域(EC 2.3.1.12)，也被稱為大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞單位。這一結(jié)構(gòu)域通過添加硫辛酸分子到一個賴氨酸的氮原子上被體內(nèi)翻譯后修飾(Guest，J.R.，Angler，J.S.和Russell，G.C.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，573，76-99)，其被用來純化和鑒別融合蛋白，其中使用僅識別硫辛酸化結(jié)構(gòu)域的抗體。
然而，這一方法具有許多弊端。首先，已知包含硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的超量表達會超過細胞硫辛酸化容量，結(jié)果產(chǎn)生非硫辛酸化結(jié)構(gòu)域(Thousands，J.S.和Guest，J.R.，生物化學雜志，245，869-874；All，S.T.和Guest，J.R.，生物化學雜志，271，139-145)或辛酸化結(jié)構(gòu)域(Ali，S.T.，Moir，A.J.，Ashton，P.R.等，分子微生物，4，943-950；Dardel，F(xiàn).，Packman，L.C.和Perham，R.N.，F(xiàn)EBS Lett.295，13-16)，這可以導(dǎo)致免疫親和純化降低產(chǎn)量。在第二方面，有一組推定由自身免疫引起的疾病，其共同特征是存在在這些結(jié)構(gòu)域中特異性識別硫辛酸的抗體。它們主要是早期膽汁性肝硬變，以發(fā)炎和肝內(nèi)膽汁導(dǎo)管進行性阻礙為特征的一種慢性病(Tuaillon，N.，Andre，C.，Briand，J.P.等，免疫學雜志，148，445-450)；和由鹵烷(一種通過形成三氟乙酰賴氨酸衍生某些蛋白質(zhì)的廣泛使用的麻醉劑)引起的肝炎(Gut，J.，Christen，Or.，F(xiàn)rey，N.等，毒理學，97，199-224)?；歼@種疾病的患者的血清識別所說復(fù)合物，其分子結(jié)構(gòu)與二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶中的硫辛酸相似(Gut，J.，Christen，Or.，F(xiàn)rey，N.等，毒理學，97，199-224)。鑒于這一理由，如果包含硫辛酸的融合蛋白構(gòu)成用于人的疫苗候選者，則最好避免在這樣的肽中存在硫辛酸。發(fā)明描述本發(fā)明的目的是提供一種在大腸桿菌中高水平地表達作為融合多肽的異源蛋白質(zhì)的方法，其基于使用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)B4P1.15(歐洲專利申請0474 313 A2)的P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定子序列，所說穩(wěn)定子賦予它們被作為包含體表達的能力。盡管存在與部分二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶硫辛酸結(jié)合域的同源性，所說的序列已經(jīng)由基因工程操作消除了自身修飾的可能性，并且具有低免疫原性的優(yōu)點。這一方法也包括使用特異性地識別被論及的穩(wěn)定子的單克隆抗體，使得可以進行任何融合到所述穩(wěn)定子上的蛋白質(zhì)的免疫檢測。
更具體地說，在本發(fā)明中，使用了作為表達載體的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶在大腸桿菌色氨酸啟動子(ptrip)控制下的所述序列，其后是限制性位點XbaI，EcoRV和BamHI。這些使得可以在同讀框中克隆編碼興趣多肽的DNA片段。這一載體也包含噬菌體T4基因32的轉(zhuǎn)錄終止子和作為選擇性標記的氨芐青霉素抗性基因。
這一方法也使得在用于人類的疫苗制劑中包含所獲得的融合多肽成為可能；并且所采用的穩(wěn)定子肽的性質(zhì)使得可以產(chǎn)生針對與其結(jié)合的外源蛋白質(zhì)或多表位肽的保護性免疫反應(yīng)。
基因工程操作和使用與部分二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源穩(wěn)定子肽，以便經(jīng)重組DNA技術(shù)在大腸桿菌中產(chǎn)生融合蛋白構(gòu)成了本發(fā)明的新穎性。更具體地說，為了前述的目的，使用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定子肽以及特異性識別所述穩(wěn)定子的單克隆抗體構(gòu)成了本發(fā)明的新穎性。
實施例實施例1
腦膜炎奈瑟氏球菌LpdA抗原(P64K LpdA)是594個氨基酸的蛋白質(zhì)，屬于二氫硫辛酰胺脫氫酶(EC 1.8.1.4)家族，更具體地說，屬于其中的一個新亞組，以在其N-末端部分具有硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其類似于存在于二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶中的結(jié)構(gòu)域)為特征(Kruger，N.，Oppermann，F(xiàn).B.，Lorenzl，H.和Steinbchel，A.，細菌學雜志，176，3614-3630，1994；Hein，S.和Steinbchel，A.，細菌學雜志，176，4394-4408，1994)。LpdA蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中克隆和超量表達，在其N-末端具有5個附加的氨基酸(MLDKR)(歐洲專利申請0474 313 A2；

圖1)，盡管名稱LpdA和P64K是等價的，但將利用P64K指重組蛋白質(zhì)。
為了確定所說抗原的不同片段的免疫原性和分析利用較低免疫原性穩(wěn)定子肽的可能性，通過評價多克隆抗-P64K血清對合成肽的反應(yīng)性定位存在于P64K中的B細胞表位。
為了這一目的，經(jīng)在丁基-TSK中的疏水性色譜和凝膠-過濾純化P64K蛋白質(zhì)(歐洲專利申請0 474 313 A2)；經(jīng)三氯乙酸(TCA)沉淀變性，用NaOH中和，并且經(jīng)凝膠-過濾色譜在磷酸鹽緩沖液中平衡。將這一制劑經(jīng)皮下路線以20μg劑量輔以2μg氫氧化鋁(0天)免疫30只小鼠Balb/C，7和21天后，用相同的抗原加強免疫。在第一次抽取之后28天收集血清。合并所獲得的血清，將形成的混合物等分并貯存在-20℃下。
此外，按照制造者提供的說明，以96孔平板方式使用用于固相合成的市售試劑盒(Multipin肽合成系統(tǒng)，Chairon Mimotope Pty.有限公司，美國)合成了具有20個氨基酸(a.a.)的59種肽(各覆蓋完整的重組蛋白質(zhì)序列并有10個a.a.重疊)。隨后，將這些從蛋白質(zhì)的N-末端編號。采用1∶2000相同的稀度測定血清抗P64K針對這些肽的反應(yīng)性，使用的免疫測定的方式與由前述市售試劑盒的制造者推薦的相同。
結(jié)果在圖2中顯示，其中給出了每種肽的吸光值。很明顯，頭110個氨基酸(由肽1到肽11代表)形成差的致免疫區(qū)段(盡管免疫原變性，其甚至能夠暴露隱藏的表位)。這一區(qū)段基本上包括硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸和丙氨酸的間隔(其將所述結(jié)構(gòu)域連接到蛋白質(zhì)的其余部分上)。這一結(jié)果說明，所述的穩(wěn)定子肽(或者其衍生物片段)可以有效地用作穩(wěn)定子肽，這是由于對與其融合的多肽的免疫原性影響小。如果融合多肽構(gòu)成疫苗候選者，這一優(yōu)點尤其重要。實施例2為了在大腸桿菌中通過將不同的異源蛋白質(zhì)融合進腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原的硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域來表達異源蛋白質(zhì)，構(gòu)建表達載體pM-83，其中引入了編碼來源于所說蛋白質(zhì)的頭47個氨基酸的穩(wěn)定子肽的序列(序列識別號1)。在大腸桿菌色氨酸啟動子的控制下克隆該序列，引入的序列包括作為轉(zhuǎn)錄終止信號的噬菌體T4終止子和作為選擇性標記的氨芐青霉素抗性基因。
為了獲得pM-83表達載體，首先從質(zhì)粒pM-6經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Randall，K-等，科學，42394，487-491，1988)擴增穩(wěn)定子肽，所述質(zhì)粒攜帶編碼P64K抗原的核苷酸序列(歐洲專利申請0 474 313 A2，圖1)。為了這一目的，使用寡核苷酸引物1573和1575，其在擴增的DNA片段中引入相應(yīng)于所述DNA編碼的穩(wěn)定子的氨基和羧基末端的NcoI和XbaI限制性位點NcoI15735’TTCCATGGTAGATAAAAG 3’(序列識別號2)XbaI15755’TTTCTAGATCCAAAGTAA 3’(序列識別號3)由形成的穩(wěn)定子編碼的氨基酸序列示于圖3中(序列識別號6)。NcoI限制性位點的引入使亮氨酸2改變成纈氨酸；引物1517消除序列ETD(45-47位)，在它的位置上引入序列DLE。以這種方式，硫辛酸的結(jié)合賴氨酸(48位)不形成穩(wěn)定子的一部分。其鄰近區(qū)(在這些結(jié)構(gòu)域中其是高度保守的(Russell；G.C.，Guest，J.R.，生物化學和生物物理報告，1076，225-232，1991))被改變。所有這一切保證消除含有這些結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的翻譯后被硫辛酸化的可能性，以及在用這些蛋白質(zhì)免疫期間產(chǎn)生與存在于早期膽汁性肝硬變患者中的那些有類似特異性的自身抗體(Tuaillon，N.，Andre，C.，Briand，J.P.等，免疫學雜志，148，445-450)的可能性。
通過克隆這一片段(序列識別號5)于質(zhì)粒pILM-29(Guillén，G.，Loyal，M.，Alvarez，A.等，生物技術(shù)學報，15，97-106，1995)中構(gòu)建質(zhì)粒pM-83，所述片段已用XbaI/NcoI事先消化。pILM29質(zhì)粒包含與人IL-2頭58個氨基酸一致的穩(wěn)定子肽融合的腦膜炎奈瑟氏球菌Opc(5c)基因，因而這種克隆過程是除去IL-2片段并使Opc融合到P64K蛋白質(zhì)穩(wěn)定子上(圖4)。用酶XbaI和BamHI從形成的質(zhì)粒(命名為pM-80)切除Opc基因，在其位置上克隆由寡核苷酸1576和1577雜交形成的接頭，這一過程在穩(wěn)定子片段的3’末端引入限制性位點XbaI，EcoRV和BamHI1576 5′CTAGATTTGATATCAG 3′(序列識別號7)1577 3′TAAACTATAGTCCTAG 5′(序列識別號8)這一質(zhì)粒命名為pM-83(圖4)。按照Sanger，F(xiàn).等(PNAS，USA，7454631977)的方法經(jīng)DNA測序證實了所有DNA片段和寡核苷酸的插入以及正確讀框的保持。實施例3如果形成的融合蛋白是疫苗候選者，重要的是所說穩(wěn)定子不含有與人類蛋白質(zhì)高度同源的區(qū)。通過在核苷酸序列數(shù)據(jù)庫EMBL數(shù)據(jù)庫v.38(Curl，C.M.，F(xiàn)uchs，R.，Higgins，D.G.等，Nucl.Acids Beast.21，2967-2971，1993)和氨基酸序列的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫v.38(Bairoch，A.和Boeckmann，B.，Nucl.Acids Beast.21，3093-3096，1993)中的同源性檢索進行了pM-83穩(wěn)定子肽(實施例2)與人類蛋白質(zhì)的類似性研究。使用的均是1994年3月版本的兩個BLAST程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，And.W.和Lipman，D.J.，分子生物學雜志，215403-410，1990)BLASTP，其將一個氨基酸序列與蛋白質(zhì)序列庫(base)比較(在這種情況下是SWISS-PROT)；和TBLASTN，其將氨基酸序列與所有兩個方向上的所有核苷酸序列庫中讀框中的翻譯產(chǎn)物比較(在這種情況下是EMBL數(shù)據(jù)庫)；在兩種情況下均使用了輔助基質(zhì)PAM 120[Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.和Orcutt，B.B.，inDayhoff，M.Or.(of.)，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜，5，增補本3，345-352，Natn.Biomed.Beast.Found.，華盛頓，1978]。
可以從圖6和圖5看出結(jié)果，其中顯示了BLASTP和TBLASTN各自的結(jié)果單(為了更好地理解，省去了原核生物或低等真核生物的同源序列。很明顯，沒有人類蛋白質(zhì)或來源于其它哺乳動物的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與P64K來源的穩(wěn)定子的明顯的類似性；因為由兩種算法檢測的同源性(在人和大鼠丙酮酸激酶中；和人和犬粘蛋白的C-末端中)存在最高的偶然出現(xiàn)的可能性(在維涅蘭德固氮菌二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶的情況下作為比較點的相同的可能性是3.7×10-5)。
從所有以上所述可以得出結(jié)論，在疫苗候選者中使用所說的穩(wěn)定子是絕對有把握的。實施例4通過比較融合到人白介素-2(IL-2)頭22個或58個氨基酸的幾種蛋白質(zhì)(一種常用于該目的的融合肽)或按照實施例2所述修飾的融合到P64K抗原頭47個氨基酸上的幾種蛋白質(zhì)的表達，評價了pM-83中的穩(wěn)定子允許高水平和以包含體形式胞內(nèi)合成的能力。
為了這一目的，將編碼腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15 PorA和Opc外膜蛋白的基因克隆進載體pFP15(hIL2-58；歐洲專利416 673 B1)或pM-83(P64K-47)；并將編碼多表位肽(MEP)(包含人類免疫缺損病毒幾種分離物的致免疫區(qū))的基因克隆進載體pISL31(hIL2-22，Castellanos-Sierra，L.R.，Hardy，E.，Ubieta，R.，等，提交的論文)或pM-83。所形成的表達質(zhì)粒是pILM-28(IL2-58 PorA；Guillén，G.，Alvarez，A.，Lion，L.，等，494-498 inConde-González，C.J.，Morse，S.，Rice，P.等(編者).，奈瑟氏球菌科的病理學和免疫學，Institute de Salud Pública Nacional，Cuernavaca，Mexico，1994)，pM-82(P64K-47 PorA；Niebla，O.，Alvarez，A.，González，S.等，85-86 inEvans，J.S.，Yost，S.和Maiden，M.C.J.等(編者)，奈瑟氏球菌屬94第IX次國際致病奈瑟氏球菌屬會議論文集，Winchester，英國，1994)，pILM-29(IL2-58 Opc；Guillén，G.，Leal，M.，Alvarez，A.等，生物技術(shù)學報，15，97-106，1995)，pM-80(實施例2，圖4)，pTAB4(IL2-22+MEP)和pTAB9(P64K-47 MEP)。
TAB4和TAB9蛋白質(zhì)是多表位多肽(MEP)，其包括HIV-1gp120蛋白質(zhì)可變區(qū)3(V3)中心部分的幾個拷貝。為了構(gòu)建這些MEP，選擇了下列分離物的V3區(qū)的15個中心氨基酸LR150SRGIRIGPGRAILAT(序列識別號9)JY1RQSTPIGLGQALYTT(序列識別號10)RFRKSITKGPGRVIYAT(序列識別號11)MNRKRIHIGPGRAFYTT(序列識別號12)BRVARKRITMGPGRVYYTT(序列識別號13)IIIBSIRIQRGPGRAFVTI(序列識別號14)這些區(qū)由序列為AGGGA(序列識別號17)的五個氨基酸的間隔肽結(jié)合。
為了達到這一目的，用化學合成獲得編碼由間隔肽結(jié)合的V3表位的DNA序列(序列識別號21)，并且在色氨酸啟動子控制下克隆，融合進人IL-2的頭22個氨基酸(圖7)。通過用酶ScaI和HindIII消化從形成的質(zhì)粒(命名為pTAB3)切除包含MEP基因、色氨酸啟動子以及T4終止子的片段，并克隆進pUC19(Yanisch-Perron，C.等，1985，基因33，103-119)以獲得pTAB4(圖7)。最后，構(gòu)建pTAB9，通過用酶NcoI和XbaI消化消除編碼來源于人IL-2的穩(wěn)定子序列，在它們的位置上克隆由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的編碼P64K抗原的頭47個氨基酸的片段(如實施例2所述)。形成的序列如圖8所示，其組成如圖9所示。
用于所有這些質(zhì)粒的宿主大腸桿菌是W3110(Hill，C.W.，和Hamish，B，W.美國科學院學報，78，7069，1981；Jensen，K.F.，細菌學雜志，175，3401-3407，1993)(用于pILM-28，pILM-29，pM-80和pM-82)；和W3110trpA905(用于pTAB4或pTAB9)。所有這些均獲得了表達將培養(yǎng)物接種到5ml具有氨芐青霉素(Ap)50μg/ml和色氨酸(W)100μg/ml的LB培養(yǎng)基(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Y.F.和Maniatis，T.，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，1989，紐約，美國)上。于37℃生長12小時。用所述培養(yǎng)物接種50ml LB-Ap培養(yǎng)基(pTAB4和pTAB9)或由以下物質(zhì)組成的限定培養(yǎng)基M9鹽(Miller，J.H.，分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室出版社，1972，紐約，美國)，葡萄糖1％，酪蛋白水解產(chǎn)物1％，CaCl20.1mM，MgCl21mM和Ap 50ug/mL(plLM-28，pILM-29，pM-80，pM-82)，于37℃和250r.p.m下生長12小時。此后，取得總蛋白樣品，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Laemmli，O.K.，自然，277，680，1970s)和用考馬斯亮藍R-250染色分析。在激光Bromma-LKB密度計中分析表達百分比。通過用溶菌酶和超聲波結(jié)合處理裂解細胞確定它們的細胞定位。然后經(jīng)離心將不溶性蛋白質(zhì)和可溶性蛋白質(zhì)分離。不溶性蛋白質(zhì)用作估價其作為包含體的表達水平，因為在這種情況下，它們能表現(xiàn)出所說行為(與膜或肽聚糖結(jié)合)的其它條件是靠不住的。
總的結(jié)果可以從圖10A中看出。在所有情況下，在來源于P64K的穩(wěn)定子下的表達與在融合進IL-2肽時獲得的表達是可比較的這是就異源蛋白質(zhì)/總細胞蛋白質(zhì)之比而言(參見有關(guān)MEP的圖10B)，其證實了pM-83用作表達融合肽的載體的能力。值得注意的是如果它們不是融合的，則這些多肽難于在大腸桿菌中表達，這是因為它們的小的尺寸和對宿主蛋白酶的敏感性(如MEP)或者蛋白質(zhì)PorA和一般細菌porins的毒性(Carbonetti，N.H.和Sparling，P.F.；美國科學院學報U.S.A.，84，9084-9088)。在所有的情況下，所述產(chǎn)物以包含體獲得，如由pTAB9所例證的(圖10C)。
總之，得出以下結(jié)論是可能的，與其它系統(tǒng)(歐洲專利申請0 416 673 A2和229 998，Hoechst AG；歐洲專利申請0 416 673 B1；Castellanos-Sierra，L.R.，Hardy，E.，Ubieta，R.，等，提交的原稿)比較，使用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定子(P64K-47)導(dǎo)致有效地以包含體表達異源蛋白質(zhì)，并且由于不存在與人源抗原明顯的同源性，具有產(chǎn)物可直接使用的額外的優(yōu)點。實施例5特異性識別穩(wěn)定子之配體(例如抗體，酶促輔因子等)的可獲得性是任何重組蛋白質(zhì)的表達中的一個所希望的特征。這是因為如果所述配體固定化在色譜樹脂上，則以上特征使得可以例如設(shè)計親和純化的有效方案；并且在抗體的情況下甚至隨后通過免疫技術(shù)純化的中間步驟不依賴于所表達異源蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
為了獲得針對這一穩(wěn)定子的單克隆抗體(Mab)，用蛋白質(zhì)TAB13(序列識別號20)免疫小鼠達到了這一目標。TAB13是一種來源于TAB9的MEP，后者不同于前者之處在于存在兩個附加的V3共有區(qū)(圖9B)-C6TSITIGPGQVFYRTG(序列識別號15)-C8RQRTSIGQGQALYTT(序列識別號16)用類似于有關(guān)TAB4和TAB9所描述的方式表達(實施例4)和純化(實施例6)這一MEP。
然后，經(jīng)皮下路線用3劑20μg TAB13輔以氫氧化鋁以15天間隔免疫小鼠Balb/c。在最后一次用藥后20天，經(jīng)腹膜內(nèi)路線用在磷酸鹽緩沖液中的20μg相同的抗原加強免疫所說動物。將脾細胞與骨髓瘤X63 Ag8 653融合，分離形成的雜交瘤，按照已經(jīng)建立的方法(Gavilondo，J.V.(編者)，單克隆抗體理論和實踐，Elfos Scientiae，1995，哈瓦那，古巴)檢查。
經(jīng)ELISA(用MEP TAB13，P64K蛋白質(zhì)或代表TAB13中存在的不同V3區(qū)的合成肽涂布平板)，評價由分離的雜交瘤分泌的抗體的反應(yīng)性。在獲得的總共18個陽性克隆中，其中一個(命名為448/30/7)識別TAB13及64K，但不識別來源于gP120的肽。
采用不同的樣品(融合到來源于P64K的穩(wěn)定子上的異源蛋白質(zhì)(P64K-47)或相同的融合蛋白質(zhì)或者融合到IL-2的頭58個氨基酸上的蛋白質(zhì)(IL2-58))經(jīng)Western印跡法測定這一MAb對pM-83穩(wěn)定子肽的特異性和其用于包含它的蛋白質(zhì)的免疫檢測的可能性。為此，用下列質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Y.F.和Maniatis，T.，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，1989，紐約，美國)大腸桿菌菌株MM294pILM-28(IL2-58+porA)、pM-82(P64K-47+porA)、pTAB13(P64K-47+MEP)、pM-6(P64K)和pFP15(IL-2)。也使用表達質(zhì)粒pM-134，該質(zhì)粒含有P64K的頭120個氨基酸，其包括在如原有質(zhì)粒中的相同的調(diào)節(jié)信號控制下的硫辛酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。用引物1573(序列識別號2)和2192(序列識別號4)經(jīng)PCR擴增這一區(qū)段，用酶NcoI和BamHI消化，在同樣消化過的質(zhì)粒pFP15(參見實施例4)中克隆。在有關(guān)pTAB4和pTAB9的實施例4中限定的生長條件下獲得這些轉(zhuǎn)化體的表達。
圖11顯示了獲得的結(jié)果，可以看出由于與質(zhì)粒pM-6，pM-82，pTAB13和pM134樣品的反應(yīng)性(盡管所有這些蛋白質(zhì)抗原性不同)，Mab448/30/7識別在穩(wěn)定子P64K-47內(nèi)的很可能為線性的表位，這一實驗表明這一反應(yīng)性絕不是由于融合到穩(wěn)定子上的蛋白質(zhì)(例如質(zhì)粒pILM-28和pM-82，在不同的穩(wěn)定子下兩者都攜帶基因porA)引起的。這證明了這一Mab識別的特異性。
總之，由穩(wěn)定子P64K-47形成的表達系統(tǒng)，含有它的質(zhì)粒和Mab448/30/7，使得可以以包含體形式有效合成大量不同蛋白質(zhì)，它們的檢測不需要預(yù)先獲得針對所表達的各種肽的免疫探針。實施例6在選擇疫苗候選者表達系統(tǒng)時，對融合到穩(wěn)定子上的多肽的免疫應(yīng)答無有害影響是要考慮的一個重要因素?；诜€(wěn)定子P64K-47表達系統(tǒng)的一個明顯優(yōu)點是其保證以上所述因素的降低的免疫原性(實施例1)。然而，仍通過比較針對存在于MEP TAB4(IL2-22)和TAB9(P64K-47)中的V3區(qū)不同肽的抗體反應(yīng)定量評價了在穩(wěn)定子P64K-47對融合蛋白免疫反應(yīng)的影響。
為了表達和純化TAB4和TAB9，如實施例4所述獲得菌株W3110trpA905+pTAB4和W3110trpA905+pTAB9的生物量。在苯甲基磺酰氟(PMSF)和非離子洗滌劑Tritón-X-100存在下用溶菌酶和超聲波共同處理裂解生物量。經(jīng)分級離心獲得包含體，用陽離子移變劑(caotrophicagent)和洗滌劑(TAB41.尿素4M Trit6n-X-100 1％，2.尿素8M。TAB91.尿素8M Tritón-X-100 1％，2.鹽酸胍6M)對包含體的兩個連續(xù)的洗滌循環(huán)部分純化并溶解MEP。通過在高效液相色譜(HPLC)，C4VYDAC柱中通過20-80％乙腈梯度洗脫最終純化所獲得的上清液，純度達約90％。
以每毫克蛋白質(zhì)60毫克佐劑的比例將純化的重組蛋白質(zhì)輔以氫氧化鋁凝膠。將該制劑用于經(jīng)皮下路線以200μg/劑免疫5組兔。使用充分涂布有用于免疫的MEP或涂布有相應(yīng)于存在于其上的各V3區(qū)的肽的96孔聚苯乙烯平板(高結(jié)合，Costar，USA)經(jīng)ELISA評價免疫反應(yīng)。用高于原血清混合物兩倍的吸收值的各血清的最大稀釋度計算滴度。所有血清均以雙份分析。
所獲得的值(圖12)表明，在不同的IL2-22+MEP(TAB4)和P64K-47+MEP(TAB9)之間針對V3區(qū)的滴度是類似的。盡管對TAB9的肽識別頻率稍高些，但這種差別在統(tǒng)計學上是不顯著的(p＜0.05)。總之，異源蛋白質(zhì)的免疫原性受穩(wěn)定子P64K-47影響很小，并且可與現(xiàn)行使用的其它表達系統(tǒng)相比。
附圖描述圖1編碼P64K的基因IpdA基因的核苷酸序列。斜體顯示插入質(zhì)粒pM-6的IpdA原本缺乏的序列(歐洲專利申請0474313A2)。
圖2抗P64K肽小鼠多克隆血清的反應(yīng)性。選擇被認為陽性的最小值為0.4光密度單位。
圖3穩(wěn)定子的氨基酸序列，從質(zhì)粒pM-6經(jīng)PCR擴增的DNA序列推定。下劃線序列相應(yīng)于寡核苷酸引物。
圖4構(gòu)建質(zhì)粒pM-83的策略。
圖5采用BLASTP程序進行的穩(wěn)定子序列(“查找”)和SWISS-PROT庫中存在的序列(“目標”)之間的同源性檢索結(jié)果。僅顯示了人蛋白質(zhì)和哺乳動物蛋白質(zhì)相應(yīng)的結(jié)果。P(N)代表在由隨機序列構(gòu)成的庫內(nèi)發(fā)現(xiàn)N等同排列的幾率。同源性的顯著性隨著P(N)值減小。相同的殘基用它的單字母代碼表示。保守取代用“+”表示，沒有顯示差異。
圖6采用TBLASTN程序進行的穩(wěn)定子序列(“查找”)和EMBL數(shù)據(jù)庫序列的所有可能的翻譯產(chǎn)物(“目標”)之間的同源性檢索結(jié)果。僅顯示了人蛋白質(zhì)和哺乳動物蛋白質(zhì)相應(yīng)的結(jié)果。P(N)代表在由隨機序列構(gòu)成的庫內(nèi)發(fā)現(xiàn)N等同排列的幾率。同源性的顯著性隨著P(N)值減小。相同的殘基用它的單字母代碼表示。保守取代用“+”表示，沒有顯示差異。
圖7構(gòu)建質(zhì)粒pTAB4和pTAB9的策略。
圖8MEP TAB9的核苷酸和氨基酸序列。
圖9AMEP TAB4和TAB9的總的結(jié)構(gòu)。BMEP TAB13的總的結(jié)構(gòu)。
圖10基因porA、Opc和MEP在來源于人IL-2或來源于P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定子下表達的比較。
A比較表，hIL2-58指人類IL-2頭58個氨基酸，hIL2-22指頭22個氨基酸，P64K-4指來源于P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定子。
B在質(zhì)粒TAB4和TAB9中MEP表達的SDS-PAGE比較分析。A道分子量標記；B道菌株W3110trpA905的總蛋白質(zhì)；C道W3110trpA905+pTAB4的總蛋白質(zhì)；D道純化的TAB4；E道W3110trpA905+pTAB9的總蛋白質(zhì)；F純化的TAB9。
C以包含體表達的TAB9。A樣品的可溶性蛋白質(zhì)。B不溶性蛋白質(zhì)或膜蛋白質(zhì)。
圖11采用Mab448/30/7和大腸桿菌MM294總蛋白質(zhì)樣品進行的Western印跡分析，所述大腸桿菌已由以下質(zhì)粒轉(zhuǎn)化1陰性對照，2pM-6(P64K)，3pM-82(P64K-47+porA)，4pTAB13(P64K-47+MEP)，5pFP15(IL-2)，6pM-134(P64K-120)，7pILM-28(IL2-58+porA)。左邊列出了分子量標志。
圖12用TAB4和TAB9免疫的兔ELISA滴度值倒數(shù)。MG抗V3滴度倒數(shù)的幾何平均值；R與V3肽的百分反應(yīng)性。
序列表序列識別號1序列類型氨基酸長度47個氨基酸分子類型蛋白質(zhì)片段性質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭47個氨基酸MLDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLETD44序列識別號2序列類型核苷酸長度29個堿基分子類型合成寡核苷酸性質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭44個氨基酸的PCR擴增的5’引物No.1573TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAG29序列識別號3序列類型核苷酸長度29個堿基分子類型合成寡核苷酸性質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭44個氨基酸的PCR擴增的3’引物No.1575TTTCTAGATCCAAAGTAATC AG GGTATCG 29序列識別號4序列類型核苷酸長度26個堿基分子類型合成寡核苷酸性質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭120個氨基酸的PCR擴增的3’引物No.2192GGCGGTTCTGCCGATTAAGG ATCCGA 26序列識別號5序列類型核苷酸長度146個堿基對分子類型PCR擴增片段性質(zhì)腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭47個氨基酸的衍生片段。限制性位點NcoI(3-8位)和XbaI(139-144位)由PCR引入，其引起這一片段核苷酸序列上的變化TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAGTTGAATTGAAAGTGCCCGACATTGGCGGACA 60CGAAAATGTAGATATTATCGCGGTTGAAGTAAACGTGGGCGACACTATTGCTGTGGACGA 120TACCCTGATTACTTTGGATCTAGAAA 146序列識別號6序列類型氨基酸長度47個氨基酸分子類型來源于腦膜炎奈瑟氏球菌重組蛋白質(zhì)P64k的頭47個氨基酸的穩(wěn)定子片段性質(zhì)與P64k相比，該片段具有下列變化L2→V2；E45→D45；T46→L46；D47→E47MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLE47序列識別號7序列類型核苷酸長度16個堿基分子類型合成寡核苷酸CTAGATTTGATATCAG16序列識別號8序列類型核苷酸長度16個堿基分子類型合成寡核苷酸GATCCTGATATCAAAT 16序列識別號9序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 LR150分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)SRGIRIGPGRAILAT15序列識別號10序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 JY1分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)RQSTPIGLGQALYTT15序列識別號11序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 RF分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)RKSITKGPGRVIYAT15序列識別號12
序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 MN分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)RKRIHIGPGRAFYTT 15序列識別號13序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 BRVA分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)RKRITMGPGRVYYTT 15序列識別號14序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型HIV-1 IIIB分離物gp120蛋白質(zhì)的V3環(huán)的中心區(qū)SIRIQRGPGRAFVTI 15序列識別號15序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型MEP TAB13內(nèi)7位上，不同HIV-1分離物gp120蛋白質(zhì)V3環(huán)中心區(qū)的共有序列TSITIGPGQVFYRTG 15序列識別號16序列類型氨基酸長度15個氨基酸分子類型MEP TAB13內(nèi)8位上，不同HIV-1分離物gp120蛋白質(zhì)V3環(huán)中心區(qū)的共有序列RQRTSIGQGQALYTT 15序列識別號17序列類型氨基酸長度5個氨基酸分子類型在MEP TAB3、TAB4、TAB5和TAB13中分開V3表位的柔性接頭AGGGA5序列識別號18序列類型氨基酸長度141個氨基酸分子類型多表位多肽(MEP)TAB4。MAPTSSSTAQTQLQLEHLLLDLQIFLSRGIRIGPGRAILATAGGGARQSTPIGLGGALYT 60TAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFYTTAGGGARKRITMGPGRVYYT 120TAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 141序列識別號19序列類型氨基酸長度162個氨基酸分子類型多表位多肽(MEP)TAB9MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRIGPGRAIL 60ATAGGGARQSTPIGLGGALYTTAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFY 120TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 162序列識別號20序列類型氨基酸長度202個氨基酸分子類型多表位多肽(MEP)TAB13MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRIGPGRAIL 60ATAGGGAROSTPIGLGOALYTTAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFY 120TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGARORTSIGOGOALYTTAGGGATSITIGPGOVFYR 180TGAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 202序列識別號21序列類型核苷酸長度368個堿基對分子類型合成寡核苷酸性質(zhì)編碼在MEP TAB9中由AGGGA間隔的V3表位的核苷酸片段。引入了限制性位點XbaI(1至6位)和BamHI(363至368位)TCTAGACTCGAGAGGCATTCGTATCGGCCCAGGTCGCGCAATTTTAGCAACAGCTGGCGG 60TGGCGCACGTCAATCTACCCCTATTGGTTTAGGTCAGGCTCTGTATACGACTGCCGGCGG 120TGGTGCGCGCAAAAGTATCACCAAGGGTCCAGGCCGCGTCATTTACGCCACCGCGGGCGG 180CGGTGCCCGTAAGCGTATCCACATTGGCCCAGGCCGTGCATTCTATACTACAGCAGGTGG 240TGGCGCACGTAAACGCATCACTATGGGTCCTGGTCGCGTCTATTACACGACCGCTGGCGG 300CGGTGCTAGCATTCGCATCCAACGCGGCCCTGGTCGTGCATTTGTGACCATATGATAACG 360CGGGATCC 368
權(quán)利要求
1.含有源于腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原N-末端頭47個氨基酸的穩(wěn)定子肽和與其融合的異源蛋白的融合蛋白。
2.按照權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說的異源蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白質(zhì)。
3.按照權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所說的異源蛋白質(zhì)是腦膜炎奈瑟氏球菌的Opc(5c)蛋白質(zhì)或者是腦膜炎奈瑟氏球菌的PorA蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所說的異源蛋白質(zhì)是多表位多肽，其包括HIV-1gp 120蛋白質(zhì)可變區(qū)3(V3)中心部分的幾個拷貝。
5.按照權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所說的多表位多肽是多肽TAB4和/或TAB9。
6.在大腸桿菌中產(chǎn)生作為融合多肽的異源蛋白質(zhì)的方法，其中將來源于腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原N-末端頭47個氨基酸的肽用作表達所說的異源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定子，將所說穩(wěn)定子的特異性單克隆抗體用于免疫檢測融合到所說穩(wěn)定子上的任何蛋白質(zhì)。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所說的穩(wěn)定子肽的氨基酸序列基本上相應(yīng)于序列識別號6的序列1020 304047MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDTLITLDLE
8.按照權(quán)利要求6的方法，其中用于純化融合蛋白的單克隆抗體被命名為448/30/7。
9.按照權(quán)利要求6的方法，其中所表達的異源蛋白質(zhì)是可以在疫苗制劑中用作免疲原的任何蛋白質(zhì)。
10.按照權(quán)利要求6的方法，其中所說的表達的異源蛋白質(zhì)是多表位多肽TAB4和/或TAB9，或腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白Opc(5c)或PorA。
11.單克隆抗體448/30/7，其對來源于腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原N-末端頭47個氨基酸的穩(wěn)定子肽是特異性的，并且用于免疫檢測和純化融合到所說穩(wěn)定子肽上的任何蛋白質(zhì)。
12.融合蛋白在大腸桿菌中的表達載體，該載體包含編碼穩(wěn)定子肽的序列，所說穩(wěn)定子肽來源于腦膜炎奈瑟氏球菌B4P1.15的P64K抗原N-末端頭47個氨基酸，所說序列在大腸桿菌色氨酸啟動子的控制下，其后是用于同框克隆編碼興趣肽之DNA片段的限制性位點XbaI、EcoRV和BamHI，和作為轉(zhuǎn)錄終止信號的噬菌體T4終止子，以及作為選擇性標記的氨芐青霉素抗性基因。
13.按照權(quán)利要求12的表達載體，其用于同框克隆編碼腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白的DNA片段。
14.按照權(quán)利要求13的表達載體，其被命名為pM-80 pM-82。
15.按照權(quán)利要求12的表達載體，其用于同框中克隆編碼多表位多肽的DNA片段，所說的的多表位多肽包括屬于HIV-1gp 120蛋白質(zhì)可變區(qū)3(V3)中心部分的拷貝。
16.按照權(quán)利要求15的表達載體，其被命名為pTAB4和pTAB9。
17.一種大腸桿菌重組菌株，其是用按照權(quán)利要求12到16任一之表達載體轉(zhuǎn)化任何大腸桿菌K12菌株產(chǎn)生的。
18.權(quán)利要求1到8的融合蛋白在用于人或動物的疫苗制劑中的用途。
19.包含權(quán)利要求1到8任一之融合蛋白和合適佐劑的疫苗制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和遺傳工程領(lǐng)域,更具體地說,本發(fā)明涉及使用重組DNA技術(shù)經(jīng)與細菌肽融合在微生物宿主中表達異源蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明提供一種在大腸桿菌中以融合多肽表達外源蛋白的方法,以獲得高純度、商用量且適用于人類疫苗制劑的蛋白。為此主要使用衍生自腦膜炎奈瑟氏球菌B∶4∶P1.15P64K抗原頭47個氨基酸的穩(wěn)定化序列。具體講,使用了含所述序列、大腸桿菌色氨酸啟動子控制下和噬菌體T4轉(zhuǎn)錄終止子的質(zhì)粒,其中含有供同框克隆編碼目的多肽之DNA片段的限制位點。本發(fā)明方法可應(yīng)用于藥物工業(yè)、診斷系統(tǒng)的開發(fā)、疫苗制劑、和任何需要在大腸桿菌中獲得高產(chǎn)量融合多肽形式的外源蛋白的情形。
文檔編號A61K39/00GK1177982SQ97190017
公開日1998年4月1日 申請日期1997年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月17日
發(fā)明者C·A·杜阿特·卡諾, G·E·奎倫·奈托, A·阿爾瓦里茨·阿克斯塔, E·L·卡皮奧·莫諾茨, D·奎恩塔納·瓦茨奎茲, C·E·格梅茨·羅德里奎茨, R·C·西爾瓦·羅德里奎茨, C·納扎貝爾·加爾韋茨, M·J·里爾·安古洛, A·M·馬蒂恩·杜恩 申請人:基因工程和生物技術(shù)中心