專利名稱：抑制結(jié)腸腫瘤的方法
背景技術(shù)：
結(jié)腸癌，包括直腸的和結(jié)腸直腸的腺癌，原發(fā)的或轉(zhuǎn)移的腺癌等等，今天從疾病發(fā)病率的觀點(diǎn)出發(fā)是一個(gè)主要的健康問題。據(jù)估計(jì)，二十五個(gè)美國人中的一個(gè)在他一生的時(shí)間里將發(fā)生某種形式的結(jié)腸癌，Sugarbaker,P.H等，Cancer,DeVita,V.T.，等(Eds.),Lippinocott Publ.Philadelphia,pp.795-884(1985)。
從治療的觀點(diǎn)出發(fā)，廣泛采用外科方法，它有好的、混合的、或不令人滿意的結(jié)果。特別是在伴隨有局部地晚期或轉(zhuǎn)移的疾病的結(jié)腸癌病人中，預(yù)后極其不好，伴有高發(fā)病率和死亡率。
已經(jīng)嘗試的藥物治療沒有令人滿意的結(jié)果，抗腫瘤的化合物，5-氟尿嘧啶(5-FU)，已是在治療結(jié)腸癌方面選擇的主要藥物，已證實(shí)它的使用只有勉強(qiáng)夠格的效果。5-FU可能暫時(shí)縮小結(jié)腸腫瘤的大小，但幾乎沒有證據(jù)顯示病人的生存時(shí)間能被實(shí)質(zhì)性地延長或得到“治愈”(根據(jù)五年緩解期)。在腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟的病人中，已用5-FU進(jìn)行化療，但僅在百分之二十五或不到這個(gè)比例的病人中觀察到暫時(shí)的改善，并且總的說來，沒有對(duì)生存產(chǎn)生有意義地影響，LaMont,J.T.和Isselbacher,K.,Harrison’s Principles of Internal Medicine(10 th ed.)McGraw-Hill,New York,P.1764,(1983)。盡管5-FU勉強(qiáng)的效果，但沒有其它藥物或聯(lián)合治療表現(xiàn)出令人信服地更有效。Sugarbaker P.H.等，Supra.Woolley,P.V.，等，New Eng.,Med.,312:1465(1985)。
關(guān)于治療人類癌癥的藥物療法也已被評(píng)價(jià)，例如，人類結(jié)腸癌異種移植家系，在此家系中，人類腫瘤被連續(xù)異種移植到免疫缺陷的、所謂“裸的”小鼠中，然后檢測這種小鼠對(duì)一種特定藥物的敏感性。Giovanella,B.C.，等，Cancer 5(7):1146(1983)。在這些研究中得到的數(shù)據(jù)有力地支持異種移植人類腫瘤(包括結(jié)腸腫瘤)到免疫缺陷的哺乳動(dòng)物(如“裸的”小鼠)中的有效性，它作為一個(gè)預(yù)言性模型來檢測抗癌劑的效力。
在一個(gè)簡短的臨床試驗(yàn)中使用一種天然存在的生物堿-喜樹堿的鈉鹽，來評(píng)價(jià)它對(duì)晚期不能治愈病人的毒性作用。Gottlieb,G.A.，等，Cancer Chemotherapy Rep.54:461(1970)。雖然經(jīng)過這個(gè)治療的這些病人的平均存活從大約2月增加到大約3.5+月，但從這個(gè)研究中幾乎沒有能得出結(jié)論。
人們已合成了喜樹堿的衍生物或類似物，并在小鼠中作為抗白血病劑使用。(見例如，Wani,M.C.，等，J.Med.Chem.23:544,1980；Wani M.C.，等，J.Med.Chem.30:1774(1987)；and Wani,M.C.等，J.Med.Chem.30:2317(1987)。
在美國專利Nos.4473692和4545880中，Miyasaka等公開了10-取代喜樹堿衍生物及其制備方法。10-取代喜樹堿衍生物據(jù)說具有抗腫瘤活性，且同母體喜樹堿化合物相比，它的毒性減低或稍有毒性。Miyasaka等沒有公開特定的腫瘤靶，也沒有表明用他們的10-取代喜樹堿化合物可達(dá)到減小或稍有毒性至什么水平。
最近，已在各種人類癌癥如白血病、淋巴瘤中檢測到一種酶，人類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ。Potmesil M.等，Cancer Res.48:3537(1988)。人類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ被認(rèn)為是一種單體蛋白質(zhì)，它有一個(gè)100,000道爾頓的表觀分子量。在各種DNA反式作用中(復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和重組)，酶的轉(zhuǎn)環(huán)狀功能已受影響。在涉及兩條DNA鏈中的一條瞬間斷裂及一個(gè)共價(jià)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物形成的機(jī)制中，純化的哺乳動(dòng)物拓樸異構(gòu)酶Ⅰ松弛正向超螺旋的和反向超螺旋的DNA。在這個(gè)復(fù)合物中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ被共價(jià)連接到斷裂的DNA主鏈的3’-磷酰基末端。
最近，已經(jīng)揭示了同正常粘膜的酶的水平比較，在癌組織中如結(jié)腸癌的外科手術(shù)標(biāo)本中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的水平平均較高。(Hsiang,Y-H.，等，Proc Ann Meet of the Amer.Assoc.Cancer Res.29:172(1988)Abstract。雖然據(jù)稱在這種(結(jié)腸癌)疾病的化療中，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可被認(rèn)為是一個(gè)選擇的靶，但還完全沒有關(guān)于任何特異性拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ相互作用藥物的公開或建議。
鑒于經(jīng)受了結(jié)腸癌常規(guī)治療(如外科手術(shù)切除或用5-FU化療)的病人極低的5年生存率(大約百分之五十或更少)，發(fā)現(xiàn)一種例如在外科手術(shù)后用藥物或化合物有效治療人類惡性結(jié)腸腫瘤的新方法將是非常有用的，這有助于證實(shí)診斷及消除大部分癌。這種藥物治療也有助于晚期疾病患者，這些患者的癌已轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到各種器官，以致于外科手術(shù)不適宜消除所有的癌組織。
發(fā)明概述本發(fā)明提供通過將有效量的下式Ⅰ化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽及其溶劑化物給予需要它的哺乳動(dòng)物而抑制結(jié)腸癌的方法
其中R1和R3獨(dú)立地為氫、-CH3、
(C1-C6烷基)、或
其中Ar是可任選取代的苯基；R2選自吡咯烷基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基和哌啶子基。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩類(苯并噻吩)的一個(gè)精選組的發(fā)現(xiàn)，它表示于式Ⅰ，它對(duì)抑制結(jié)腸癌有作用。
本發(fā)明提供的使用方法通過將一定量的對(duì)抑制結(jié)腸癌有效的式Ⅰ化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物給予需要它的人來實(shí)施。此處術(shù)語“抑制”包括它的一般接受的含義阻止、防止、抑制以及減緩、停止或逆轉(zhuǎn)進(jìn)程、嚴(yán)重性或產(chǎn)生的癥狀或影響。
本發(fā)明的一個(gè)化合物，雷洛昔芬(Raloxifene)，它是R1和R3是氫、R2是1-哌啶基的式Ⅰ化合物的鹽酸鹽，它是一個(gè)核調(diào)節(jié)分子。已表明雷洛昔芬同雌激素受體結(jié)合，并且它最初被認(rèn)為是一個(gè)在功能和藥理學(xué)上為抗-雌激素的分子，因?yàn)樗钄啻萍に丶せ钭訉m組織以及雌激素依賴的乳腺癌的能力。實(shí)際上，雷洛昔芬在某些細(xì)胞中能阻止雌激素的作用，而在其它細(xì)胞類型中，雷洛昔芬激活的基因與雌激素激活的基因相同，并顯示出相同的藥理學(xué)，如骨質(zhì)疏松癥、高脂血癥。結(jié)果，雷洛昔芬已被認(rèn)為是具有混合的興奮劑-拮抗劑特性的一個(gè)抗雌激素。雷洛昔芬顯示出且與雌激素不同的一個(gè)獨(dú)特的特征范圍是，現(xiàn)在認(rèn)為在于它通過雷洛昔芬-雌激素受體復(fù)合物的不同基因獨(dú)特的激活作用和/或抑制作用與通過雌激素-雌激素受體復(fù)合物的基因的激活作用和/或抑制作用相反。因此，雖然雷洛昔芬和雌激素利用和競爭相同的受體，但從二者的基因調(diào)節(jié)而來的藥理學(xué)上的結(jié)果不能容易地預(yù)言并且是各自獨(dú)特的一般地，這種化合物是用通常的賦形劑、稀釋劑或載體來配制，并壓制成片劑，或配制成酏劑或溶液劑以便于口服，或通過肌肉內(nèi)的或靜脈內(nèi)的途徑使用。這些化合物能被經(jīng)皮使用，并且可以配制成緩釋劑型等。
可根據(jù)既定的步驟制備在本發(fā)明方法中使用的這些化合物，如在美國專利Nos.4133814、4418068和4380635中詳述的那些步驟，它們?nèi)客ㄟ^引用結(jié)合到本文中。通常，這個(gè)過程以具有6-羥基基團(tuán)和2-(4-羥基苯)基團(tuán)的苯并[b]噻吩開始。起始化合物被保護(hù)、?；⑷缓笕ケＷo(hù)形成式Ⅰ的化合物。這種化合物制備的例子在上面討論的美國專利中提供?？扇芜x取代的苯基包括苯基和用C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代一次或二次的苯基。
本發(fā)明方法中所用的化合物可用種類繁多的有機(jī)和無機(jī)酸和堿形成藥學(xué)上可接受的酸和堿加成鹽以及包括在生理學(xué)上可接受的鹽，這類化合物經(jīng)常在藥物化學(xué)中使用。這類鹽也是本發(fā)明的部分。通常形成這類鹽所用的典型的無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、次磷酸等等。從下列有機(jī)酸得到的鹽也可用，如脂族一元羧酸和二羧酸、苯取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸和羥基鏈烷雙酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸。因而這類藥學(xué)上可接受的鹽包括醋酸鹽、苯乙酸鹽。三氟醋酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰-乙酸基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽，溴化物。異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、乙醇酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對(duì)苯二酸鹽、磷酸鹽、一氫磷酸鹽、二氫磷酸鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、酸式硫酸鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、酸式亞硫酸鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)-溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙磺酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對(duì)-甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
藥學(xué)上可接受的酸加成鹽典型地是由式Ⅰ化合物同等摩爾的或超量的酸反應(yīng)而形成的。通常在互溶劑如乙醚或苯中化合反應(yīng)物。這種鹽通常在大約1小時(shí)至10天中從溶液中沉淀，通過過濾或通過常規(guī)方法除去溶劑而分離這種鹽。
通常用于形成鹽的堿包括氫氧化銨和堿金屬和堿土金屬的氫氧化物、碳酸鹽、還有脂族伯胺、仲胺和叔胺、脂族二元胺。在加成鹽的制備中特別有用的堿包括氫氧化銨、碳酸鉀、甲胺、二乙胺、乙二胺和環(huán)己胺。
藥學(xué)上可接受的鹽與衍生出這些鹽的化合物相比，一般增加溶解度特性，因此經(jīng)常更適于配制成液體或乳劑。
采用本領(lǐng)域公知的方法可制備藥用制劑。例如，這些化合物可用普通賦形劑、稀釋劑或載體來配制，形成片劑、膠囊劑、混懸液、粉劑等等。適于這樣的制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實(shí)例包括填料和增量劑，如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合劑如羧甲基纖維素和其它纖維素衍生物、海藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；增濕劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；抑制溶解劑如石蠟；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇、甘油一硬脂酸酯；吸附載體如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂和固體聚乙二醇。
這些化合物也可以配制成酏劑或溶液供方便的口服，或配制成溶液以適于非腸道使用，例如通過肌內(nèi)的、皮下的、或靜脈的途徑。另外，這些化合物也適于配制成緩釋劑型等制劑，這種制劑如此構(gòu)成使得它們僅在或最好在腸道的一個(gè)特定部位并可能經(jīng)過一段時(shí)間釋放活性成分。也可例如用高分子物質(zhì)或蠟制作包衣、外殼和保護(hù)基質(zhì)。
在此公開的以及根據(jù)本發(fā)明為抑制結(jié)腸癌所需的或任何其它用途的式Ⅰ化合物的特定劑量將取決于疾病的嚴(yán)重程度，給藥途徑、和將由主治醫(yī)師決定的相關(guān)因素。一般地，可接受的且有效的每日劑量是從大約0.1至大約1000毫克/天，更典型地是從大約50到大約200毫克/天。這種劑量給予需要它的受治療者，從每天一次至大約三次，或當(dāng)需要更有效地抑制結(jié)腸癌時(shí)，給予更頻繁。
式Ⅰ化合物通常最好是以酸加成鹽的形式使用，正如通常在給予含有堿性基團(tuán)(如哌啶子基環(huán))的藥物中所做的那樣。這樣的化合物也有利于通過口的途徑給予。為此目的，下列口服劑型是可用的。
制劑在下列制劑中，“活性成分”意指式Ⅰ化合物。制劑1明膠膠囊硬明膠囊用以下成分制備
將這些成分混合，通過一個(gè)No.45目U.S.篩，填入硬明膠膠囊。
制造特定的雷洛昔芬膠囊制劑的實(shí)施例包括下示制劑2雷洛昔芬膠囊
<claim>1、通式Ⅰ含全氟烷基的化合物RF-L-AⅠ其中RF是全氟化的、直鏈或支鏈的式-CnF2nX的烴鏈，這里X是終端的氟、氯、溴、碘或氫原子，n是4～30的數(shù)，L是直接的鍵、亞甲基基團(tuán)、-NHCO-基團(tuán)、或基團(tuán)
這里，p是0～10的數(shù)，q和u相互獨(dú)立的是數(shù)0或1和R1是氫原子、甲基基團(tuán)、-CH2-OH基團(tuán)、-CH2-CO2H基團(tuán)或者C2-C15鏈，其需要時(shí)可被1～3個(gè)氧原子、1～2個(gè)＞CO基團(tuán)或者一個(gè)取代或未取代的芳基基團(tuán)中斷，和/或被1～4個(gè)羥基基團(tuán)、1～2個(gè)C1-C4-烷氧基基團(tuán)、1～2個(gè)羧基基團(tuán)或基團(tuán)-SO3H取代，或者L是直鏈、支鏈、飽和或者不飽和的C2-C30烴鏈，其需要時(shí)可包含1～10個(gè)氧原子、1～3個(gè)-NR1基團(tuán)、1～2個(gè)硫原子、哌嗪、-CONR1基團(tuán)、-NR1CO基團(tuán)、-SO2基團(tuán)、-NR1-CO2基團(tuán)、1～2個(gè)-CO基團(tuán)、基團(tuán)
或1～2個(gè)取代或未取代的芳基和<p>活性成分 0.1-1000纖維素，微晶 0-650鍛制二氧化硅 0-650Stearate acid0-15將這些組分混合并壓制形成片劑。
或者，每個(gè)含0.1-1000毫克活性成分的片劑用以下成分配制制劑7片劑成分 量(毫克/膠囊)活性成分 0.1-1000淀粉 45纖維素，微晶 35聚乙烯吡咯烷酮 4(以10％水溶液)羧甲基纖維素鈉 4.5硬脂酸鎂 0.5滑石 1將活性成分、淀粉和纖維素通過一個(gè)No.45目U.S.篩并完全混合，產(chǎn)生的粉末與聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，再通過一個(gè)No.14目U.S.篩，這樣產(chǎn)生的顆粒于50-60℃干燥，通過一個(gè)No.18目U.S.篩。羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石，事先通過一個(gè)No.60目U.S.篩，然后加到顆粒中，混合后，在壓片機(jī)上壓制生產(chǎn)片劑。
每5毫升劑量含0.1-1000毫克藥物的混懸液，按如下方法配制制劑8混懸液成分 量(毫克/膠囊)
活性成分 0.1-1000mg羧甲基纖維素鈉 50mg糖漿 1.25mg苯甲酸溶液 0.10mL增香劑 適量色素 適量純水至 5mL藥物通過一個(gè)No.45目U.S.篩并同羧甲基纖維素鈉和糖漿混合，形成調(diào)勻的糊劑。苯甲酸溶液、增香劑和色素用一些水稀釋并加入，同時(shí)攪拌，加入充分的水至要求的體積。
纖維性腫瘤罕見纖維性起源的非轉(zhuǎn)移腫瘤。臨床上相關(guān)的意見是，在這類腫瘤自然的歷史中，類固醇激素可能有一個(gè)作用它在分娩年齡的女性病人中顯著地被見到，且這些腫瘤的退化與絕經(jīng)或與抗雌激素治療有聯(lián)系。
這個(gè)工作的目的是識(shí)別在纖維性腫瘤原代細(xì)胞中的雌激素受體，并評(píng)價(jià)式Ⅰ化合物在原代培養(yǎng)的纖維細(xì)胞中的作用。
因?yàn)橛袝r(shí)纖維性腫瘤在家族性腺瘤息肉病(FAP)的病人中發(fā)生，在結(jié)腸或直腸癌中它可發(fā)生退化，我們已檢測到化合物Ⅰa對(duì)腺癌細(xì)胞系(HCT8)和從結(jié)腸癌活檢標(biāo)本中來的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞生長的抑制作用。
化合物Ⅰa是式Ⅰ的一個(gè)化合物，其中R2是吡咯烷基，R1和R3是氫。
結(jié)合研究是用完整細(xì)胞完成。纖維細(xì)胞被接種到6孔板上的生長培養(yǎng)基中(Coon’s修改的Ham’s F12補(bǔ)充10％FCS)。24小時(shí)后，用沒有酚紅的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基取代生長培養(yǎng)基，細(xì)胞在饑餓中維持24小時(shí)。然后用含25毫摩爾HEPES和0.5％EtOH(結(jié)合緩沖液)的1亳升無酚紅培養(yǎng)基和濃度增加(0.05-10nM)的[3H]17βE2以及化合物Ⅰa孵育細(xì)胞1小時(shí)，濃度增加的[3H]17βE2。含或不含超500倍量的未標(biāo)記17βE2。孵育后，細(xì)胞用800μl結(jié)合緩沖液洗2次并用1N NaOH在70℃溶解30分鐘。然后對(duì)每個(gè)孔加入4N HCl中和。用液體閃爍分光術(shù)測定放射活性。通過Scatchard分析評(píng)價(jià)ER結(jié)合親和力和結(jié)合能力。
所有隨后的步驟均在0-4℃完成。研碎的組織在一個(gè)polytron勻漿器中以2次10秒破裂勻漿，在下列緩沖液中，通過30秒冷卻過程分離，10mM Tris-HCl、5mM EDTA、10mM鉬酸鈉、10mM二硫蘇糖醇、10％甘油(v/v),pH 7.4。勻漿液以7000g離心20分鐘，棄去沉淀，上清液于10500g再離心60分鐘得到細(xì)胞溶質(zhì)進(jìn)行雌激素受體分析。將細(xì)胞溶質(zhì)稀釋至1-2毫克蛋白質(zhì)/毫升，細(xì)胞溶質(zhì)蛋白根據(jù)Brodford的方法確定。為了評(píng)價(jià)雌激素受體，在濃度范圍0.05-5nM的[3H]17βE2和化合物Ⅰa上于40℃孵育細(xì)胞溶質(zhì)16小時(shí)，[3H]17βE2含有或沒有超過500倍量的未標(biāo)記17βE2。通過Scatchard分析評(píng)價(jià)ER結(jié)合親和力和結(jié)合能力。
細(xì)胞以8×104細(xì)胞的密度接種于6孔板的生長培養(yǎng)基中，24小時(shí)后，在沒有酚紅、補(bǔ)充了0.1％DMF、0.1％EtOH和不同濃度的化合物Ⅰa(2×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M)的生長培養(yǎng)基中刺激細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)6天，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液分離細(xì)胞，然后通過顯微鏡下計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)生長。同樣的方法用于結(jié)腸癌原代成纖維細(xì)胞系和HCT8細(xì)胞系這個(gè)細(xì)胞系在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)、刺激后孵育4天。
用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)測定培養(yǎng)基中的Ⅰ型膠原和細(xì)胞層。簡短地說，細(xì)胞于無補(bǔ)充物的Coon’s修改的Ham F12培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)，該培養(yǎng)基含50μg/ml抗壞血酸和100μg/mlβaminopropionitryl fumarate。
收獲培養(yǎng)基并適當(dāng)?shù)叵♂屧?.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中，然后用來包被ELISA平板，4℃過夜，ELISA平板在含5％奶粉的PBS中(PBS Blotto)37℃孵育1.5小時(shí)以飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)，與含特異多克隆抗體的PBS Blotto于37℃孵育2小時(shí)，在含羊抗兔IgG-堿性磷酸酶結(jié)合復(fù)合物(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO)的PBS Blotto中37℃孵育1.5小時(shí)。
然后以50μg/ml Mg++和1mg/ml對(duì)硝基苯磷酸鹽作為堿性磷酸酶的底物將樣品室溫下暴露于10％二乙醇胺(pH9.8)中。讀405nm處的光密度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上計(jì)算濃度。單層細(xì)胞收獲在0.5NNaOH中，并用超聲處理以決定細(xì)胞的膠原類型Ⅰ。然后將細(xì)胞抽提物稀釋到0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中(pH9.6)，并用于ELISA平板的包被。以一式三份分析標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，結(jié)果用微克蛋白質(zhì)/微克細(xì)胞DNA表示，DNA含量用熒光分光法測定。
結(jié)合實(shí)驗(yàn)是在原代纖維性腫瘤細(xì)胞和纖維性腫瘤的冰凍標(biāo)本中用[3H]17βE2作為配體來完成。
在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用超過500倍量的未標(biāo)記雌激素和化合物Ⅰa少量地(約10％)置換[3H]17βE2。采用計(jì)算機(jī)結(jié)合程序LIGAND(MunsonP.J.,Rodbard D.Anal.Bioehem.1980；107:220-39)Scatchard分析的[3H]17βE2結(jié)合數(shù)據(jù)顯示在三個(gè)不同的培養(yǎng)物中和在二個(gè)不同的從纖維性腫瘤活檢標(biāo)本來的細(xì)胞溶質(zhì)制品中均存在ER。
在生長測定中，當(dāng)暴露于不同濃度的化合物Ⅰa中時(shí)刺激纖維性腫瘤原代細(xì)胞，結(jié)果為隨化合物Ⅰa的濃度增加細(xì)胞生長抑制(表1)。HCT8細(xì)胞系(表2)和結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞系(表3)獲得同樣的結(jié)果。
纖維性細(xì)胞在10-5M、5×10-6M、10-6M的濃度下，以劑量依賴方式被抑制，它的最大抑制效應(yīng)在10-5M濃度(表4)。
化合物Ⅰa僅在非常高的濃度下(超過500倍量)能取代17βE2結(jié)合于纖維性組織。
化合物Ⅰa能以微摩爾濃度顯著地抑制纖維性細(xì)胞增殖。另外，在同樣的濃度，這個(gè)化合物能抑制人類結(jié)腸癌來源的上皮和成纖維細(xì)胞的增殖。
用化合物Ⅰa，在纖維性細(xì)胞的原代培養(yǎng)中也顯著地減少了Ⅰ型膠原產(chǎn)生。
在所有測試的條件下(電穿孔、Ca/p沉淀、脂質(zhì)體(Lyposomes))，用雌激素應(yīng)答因子轉(zhuǎn)染纖維性細(xì)胞，細(xì)胞都被破壞，結(jié)果不適于“在體外”分析。
表1化合物Ⅰa(Mol/L) 細(xì)胞×10-4對(duì)照 12.32.10-50.110-52.85.10-67.010-610.0表2化合物Ⅰa(Mol/L)細(xì)胞×10-4對(duì)照 1502.10-5310-5715.10-6115表3化合物Ⅰa(Mol/L)細(xì)胞×10-4對(duì)照 7.62.10-50.110-55.45.10-66.310-67.6表4DNA DNA膠原 膠原 P值(O:D.) (μg) 類型Ⅰ 類型Ⅰ(pg/孔)(μg/μg DNA)對(duì)照 4.85±0.32 1.36±0.06 47.82±4.15 35.00±1.41化合物Ⅰa 1μM 8.20±0.23 1.97±0.05 43.78±5.23 22.00:±1.46 P＜0.005化合物Ⅰa 5μM 6.90±0.50 1.85±0.24 38.01±6.24 20.50±0.61 P＜0.005化合物Ⅰa10μM 7.90±1.46 1.96±0.29 35.16±2.44 18.00±1.41 P＜0.00權(quán)利要求
1．一種抑制結(jié)腸癌的方法，包括將有效量的下式化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物給予需要它的哺乳動(dòng)物，
其中R1和R3獨(dú)立地為氫、-CH3-、
烷基)、或
，其中Ar是可任選取代的苯基；R2是選自吡咯烷基、六亞甲基亞氨基、和哌啶子基。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述化合物是其鹽酸鹽。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽。
全文摘要
一種抑制結(jié)腸癌的方法,包括將有效量的式(Ⅰ)化合物或藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑合物給予需要它的哺乳動(dòng)物,在式(Ⅰ)中,R
文檔編號(hào)A61K31/4025GK1209745SQ97191791
公開日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1997年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月29日
發(fā)明者M·L·布蘭迪, F·托內(nèi)利 申請(qǐng)人:伊萊利利公司