專利名稱：含有氧化氮的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有氧化氮(NO)的，無菌的，可注射的生理上可接受的溶液的藥物組合物，其制備方法和生理上存在的NO的檢測方法。
生理上存在的氧化氮(NO)可通過多種生物學功能影響動脈硬化發(fā)展中的必要的關鍵性的過程，例如使血管平滑肌松弛，抑制血小板、粒細胞和單核細胞與血管壁的粘附，抑制分泌性平滑肌細胞的增殖等，并能直接影響到內皮代謝。
因此，最近幾年來已闡明內皮中的氧化氮(NO)可通過很多種機理影響血管壁的代謝以及功能1．通過刺激可溶性的鳥苷酸環(huán)化酶而導致血管平滑肌的松弛，和2．由此參與外周血管阻力和動脈血壓的調節(jié)，3．另外，可抑制血管平滑肌細胞的有絲分裂發(fā)生和增殖，4．抑制血小板、單核細胞和嗜中性粒細胞與血管壁的粘附，和5．通過例如改變表面膜上粘附分子的表達可直接影響到內皮細胞的代謝。其一般性的評論見于1．Moncada,S.和Higgs,A.,L-精氨酸-氧化氮途徑，新英格蘭醫(yī)學雜志，329:2002-2012,1993。
2．Radomski,M.W.和Moncada,S.，通過氧化氮調節(jié)血管的穩(wěn)態(tài)，Thromb.Haemost,70:36-41,1993。
3．Snyder,S.H.和Bredt,D.S.，氧化氮的生物學作用，SciAM266(5):68-77,1992。
4．Gibbons,G.H.和Dzau,V.J.，形成中的血管模型重建概念，新英格蘭醫(yī)學雜志，330:1431-1438,1994。
所有上述方法表示在動脈硬化的病理性血管壁變化進展方面的關鍵事件。認識到的動脈硬化的危險因素是動脈高血壓，血脂蛋白過高，糖尿病，尼古丁消耗，可能還有年齡和性別，所述危險因素也影響內皮功能(見Moncada,S和Higgs,A,L-精氨酸-氧化氮途徑，新英格蘭醫(yī)學雜志，329:2002-2012,1993；Ross,R，粥樣硬化的發(fā)病機制-最新進展，新英格蘭醫(yī)學雜志，324(No.8):488-500,1986；Safar,M.E和Frohlich,E.D，高血壓的動脈系統(tǒng)，未來展望，高血壓，26:10-14,1995)。
然而，內皮NO合成的經改變的活性的病理生理學有效的證明僅僅在具有經培養(yǎng)的細胞或分離的器官循環(huán)系統(tǒng)(其中NO或其分解代謝產物的定量是可能的)的實驗制劑中是成功的。但是，關于這一點，在人體內，迄今為止只有在各種血管區(qū)域中與改變的乙酰膽堿誘導的血流反應有關的現(xiàn)象學發(fā)現(xiàn)被描述為內皮依賴的血管舒張的間接標記物。在人體內作為內皮機能失調指示劑的內皮組成性NO合成活性的精確量化在以前是不可能的。
最后，在過去的幾十年內，很多類型的用于治療動脈硬化的血管壁改變，如冠心病的NO供體已經被成功地開發(fā)和應用(在這方面總的看法參見Feelisch,M，由氮血管舒張藥形成氧化氮的生化途徑外源NO供體的適當選擇和NO水溶液的制備和運用方面，J.Cardiovasc.Pharmacol,17(suppl.3):S25-S33,1991；Feelisch,M和Noack,E，氮血管舒張藥的體外代謝和它們向作用于血管的類型的轉化，心臟障礙的機制和處理，由Lewis,B.S和Kimchi,A..編輯，Springer:Berlin,Heidelberg,1991,p.241-255；Harrison,D.G和Bates,J.N，氮血管舒張藥，循環(huán)，87:1461-1467,1993；DeCaterina,R.Nitrate als Thrombozytenfunctionshemmer[硝酸鹽作為血小板功能的抑制劑]，Z.Kardiol,83:463-473,1994)。
NO供體在循環(huán)系統(tǒng)的動脈以及靜脈部分起作用，也NO-依賴性地影響血管壁與血液的細胞成分(血小板，中性粒細胞和單核細胞)的相互作用。但是，至今還沒有使NO以真正的NO溶液的形式直接用于人體循環(huán)系統(tǒng)的治療進展。其根源在于NO在人體循環(huán)系統(tǒng)中極其迅速地代謝和失活，一方面，阻止成功和定向的將NO導入人體循環(huán)系統(tǒng)，但在另一方面，具有這樣的優(yōu)點，即潛在地可以局部獲得很高的NO劑量而不伴隨系統(tǒng)副作用。關于上述NO的廣泛的抗動脈硬化性質，尤其是最后一點對于外周和冠狀動脈中所有的血管內干擾似乎特別有意義。
現(xiàn)在，在高度發(fā)達的工業(yè)國如美國和德國，每年進行超過370000例冠狀動脈干擾(PTCA，等等)(參見Gleichmann,U.,Mannebach,H和Lichtlen,P.10.Bericht über Struktur und Leistungszahlen derHerzkatheterlabors in der Bundesrepublik Deutschland[德國心導管實驗室結構和工作報告]，Z.Kardiol,84:327-333,1995)。
最初的成功率達到90％，但10％的PTCA導致早期閉塞或血栓形成。另外，根據(jù)引用的文獻，在25-50％的病例中，手術之后的頭六個月會形成再狹窄。世界范圍內實施的血管成形術的總數(shù)估計到2000年會超過一百萬，也就是說每年預計會發(fā)生高達400000例再狹窄。這些數(shù)字強調迫切需要治療以降低PTCA后的急性或慢性再狹窄率。用鈣拮抗劑，有機硝酸酯和ACE抑制劑干擾的系統(tǒng)藥理研究已經顯示對于再狹窄率沒有效果。甚至大量其它機械方法(directional atherectomy，激光血管成形術，斯坦特移植，rotablation)也未能導致再狹窄率的全面降低，這些方法限于某些龕指示。最近，這導致了新LDD(局部藥物輸送)系統(tǒng)，如被包被的斯坦特修復術，Kaplan-simpson灌注導管(斯坦福大學)，微灌注導管(Cordis)或多孔PTCA氣球導管(ACS)的發(fā)展。使用這些系統(tǒng)似乎第一次可以將高局部劑量的藥物輸送到冠狀動脈的血管壁。由于NO在人體血液中被迅速代謝，現(xiàn)在，在冠狀動脈干擾期間將NO以高劑量局部導入冠狀動脈，并因此以引言中所述的方式在局部點應用上述NO的所有生物學作用，如血管平滑肌松弛，抑制血小板和嗜中性單核細胞的粘附，而不伴隨系統(tǒng)作用，例如，由于高劑量而產生的臨界性血壓下降，看來是極其需要和有用的。
如在開始時提到的，動脈高血壓，血脂蛋白過高和糖尿病是主要的致動脈粥樣硬化的危險因素。流行病數(shù)據(jù)指示僅僅動脈高血壓及其引發(fā)的心血管疾病的總死亡率即達25％；(參見Strauer,B.E.DasHochdruckherz[The hypertensive heart],Berlin,Heidelberg,NewYork:Springer Verlag,1991,pp.1-241)。
至今還不能通過任何常規(guī)的臨床參數(shù)檢測被定義為動脈硬化的主要起搏點的內皮機能失調。所以，從早期診斷，以及對這類內皮機能失調的鑒別治療影響的一般性觀點出發(fā)，用于心血管醫(yī)藥領域的可靠的檢測方法是需要的。
因此，本發(fā)明的目的是提供含有NO的，無菌的，可注射的生理上可接受的溶液的藥物組合物，其制備方法和檢測生理上存在的NO的方法。
此目的已按下文解釋和權利要求所公開的內容完成。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，藥物組合物由用NO飽和的0.9％生理氯化鈉溶液組成。
在本發(fā)明的藥物組合物中，在0.9％生理氯化鈉溶液中的NO飽和濃度隨溫度的增加而有區(qū)別地降低。
根據(jù)本發(fā)明特別有利的實施方案，在0℃下，0.9％生理氯化鈉溶液中NO飽和濃度的值是3.26 NO[μmo1/L]，在25℃是1.85NO[μmol/L]，在37℃是1.52 NO[μmol/L]，而在50℃是1.26NO[μmol/L]。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物這樣制備為了排除氧氣，將氬氣通入無菌的，可注射的0.9％氯化鈉溶液直至任何殘留的氧氣含量都被除去，然后通入NO直到NO在0.9％氯化鈉溶液中達到飽和濃度。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，本發(fā)明的NO溶液可以用于制備治療哺乳動物內皮機能失調的藥物組合物。
下列實施例1闡述了用于制備無菌的，可注射的NO溶液及其制劑的裝置的結構。
實施例1a)．設備的構造設備的構造在

圖1中示出，其中1．NO 3.0儲罐(AGA)；2．氬氣5.0儲罐(Linde)；3．裝有在飽和KOH(w∶v)中的5％pyrogallol(pyrogallolz.A.612,Merck)的洗氣瓶；4．裝有20％KOH z.A.5033(Merck)的洗氣瓶；5．洗氣瓶，干的；6．三頸圓底燒瓶(250ml)，裝有0.9％NaCl溶液，帶有3個接地插入物，在每個中摻入a)活塞b)Luer-鎖三通活塞c)三通活塞7．洗氣瓶，空的，作為水阱8．裝有KOH z.A.5033(Merck)的洗氣瓶，作為水阱；A．各個氣密接地接頭；B．氣密三通活塞；C．氣密接地接頭；
D．氣密三通活塞；E．用于連接各個洗氣瓶的氣密接地接頭。所有設備的部件都通過氣密管(Tygon R 3603型)連接。TeflonPlastibrand(Brand)密封圈被用于密封，0.2μm(微孔)的Millex型GS濾膜被用作濾膜。b)無菌NO溶液的制備用濃苛性蘇打溶液(NaOH)清洗所有玻璃容器，并且在每種情況下用aquabidestillata和HPLC水再洗滌10次。然后依次連接洗氣瓶(3),(4),(5)，其中在(3)中放入在飽和KOH(w∶v)中的pyrogallol(5％)用于除去痕量的氧氣，在(4)中放入20％KOH用于除去較高含量的氧化氮，而(5)是干燥的，與其連接的是三頸圓底燒瓶，其中放入NaCl溶液(0.9％)，通入氬氣45分鐘。將在上升管中發(fā)現(xiàn)的NaCl溶液部分丟棄，利用氬氣從無菌的氣密封的注射器和相關的傳導系統(tǒng)以及0.2μm濾膜的無菌過濾器中除去氧氣，并且往無氧的，氣密封的注射器中注入用于稀釋NO溶液需要的NaCl體積。最后，將氧化氮(NO)通入系統(tǒng)45分鐘。
重新用氬氣將氧氣從過濾器和將存在的稀溶液導入注射器的傳導系統(tǒng)中完全除去。在上升管中發(fā)現(xiàn)的NO溶液部分被丟棄，之后將整個傳導系統(tǒng)和無菌過濾器用NO溶液充分洗滌。所需體積的NO溶液立即轉入預先用給出的NaCl溶液經三通活塞(B)通過無菌過濾器(在各種情況下可以是安培，小瓶，注射器，等等)制備的氣密的首次包裝。
本發(fā)明的另一方案是定量檢測哺乳動物內皮機能失調的檢測方法。
以前，動脈高血壓，糖尿病和/或血脂蛋白過高的患者的內皮機能失調只能通過高花費的診斷方法來確定，如動脈穿刺，隨后局部施用乙酰膽堿，與標準的適當年齡的小組相比使被檢查的循環(huán)區(qū)域中產生的血流反應的血液動力學量化(參見Calver,A.,Collier,J和Vallance,P，抑制和刺激胰島素依賴型糖尿病患者的前臂動脈床中氧化氮的合成，臨床研究雜志，90:2548-2554,1992；Creager,M.A.,Cooke,J.P.,Mendelsohn,M.E.,Gallagher,S.J.,Coleman,S.M.,Loscalzo,J和Dzau,V.J，血膽甾醇過多患者的前臂阻力血管的受損害的血管舒張，臨床研究雜志，86:228-234,1990；Kelm,M.,Preik,M.,Motz,W和Strauer,B.E,Endotheliale Funktionbei Patienten mitarteriellerHypertonie[動脈高血壓患者的內皮功能]，見于ZellulareMechanismen der Herz-Kreislaufregulation[心血管調節(jié)的細胞機制]，由Gante,D.編輯，Stuttgart:Schattauer,1993,p.139-150；Linder,L.,Kiowski,W.,Bühler,F.R和Luscher,T.F，人前臂體內循環(huán)中衍生自內皮的松弛因子釋放的的間接證據(jù)，循環(huán)，81:1762-1767,1990;Panza,J.A.,Epstein,S.E和QuyyumiA.A.，血管緊張的生理節(jié)奏變化及其與交感神經血管收縮活性的關系，新英格蘭雜志，325:986-990,1990)。
另外，在對此純現(xiàn)象學方法的縱向研究中，我們試圖用文獻證明通過ACE抑制劑的降壓療法對例如動脈高血壓患者的內皮機能失調的可能的治療效果，然而，我們未能成功，因為研究探討的方法變化很大(見Creager,M.A和Roddy,M.-A,Captopril和enalapril對高血壓患者內皮功能的影響，高血壓，24:499-505,1994)。
另外，通過依賴于變化的乙酰膽堿的血流反應的純現(xiàn)象學方法不能區(qū)分動脈硬化誘導的內皮機能失調的程度是基于降低的NO合成和/或增加的NO分解代謝(見Kelm,M.,Preik,M.,Koster,A.,Heinzelmann,A.,Motz,W.，和Strauer,B.E，給原發(fā)性高血壓患者施用有機硝酸酯后氧化氮依賴型血管舒張的減弱，見氧化氮生物學，由Moncada,S編輯，倫敦Portland出版公司，1994,p509-513；Kelm,M.,FeelischM.,Krebber,T.,Deussen,A.,Motz,W和Strauer,B.E，氧化氮(NO)在調節(jié)高血壓大鼠心臟的冠狀血管緊張中的作用；維持NO的形成能力并增加NO的基本生成，高血壓，25:186-193,1995；Kelm,M.,Preik,M.,Hafner,D.,Strauer,B.E，內皮機能失調的高血壓患者中涉及對氧化氮的受損的血流反應的多因子過程的證據(jù)，高血壓，出版中，1996)。
本發(fā)明的檢測方法允許測量哺乳動物全血、尤其是人的全血中的亞硝酸鹽含量，在人的循環(huán)系統(tǒng)中，亞硝酸鹽是內皮組成型NO合成之活性的特異性的標記物。
下列實施例2解釋了檢測方法。實施例2人全血中亞硝酸鹽的檢測方法將1ml血置于含有1ml的1mol/L濃NaOH終止溶液的注射器中，隨后立即加入50μl的1mol/L濃磷酸(H3PO4)以中和所得的血/NaOH混合物，以10,000g的轉速將所述混合物置于離心機(Universal30RF,hettichfirm)中離心5分鐘，將所得的上清液輕輕傾入超濾管(Sartorius截留10,000)中，在2,000g的轉速下重新離心15分鐘(Eppendorf離心管5402C,Eppendorffirm)。將所得的水-白色超濾物轉移到能承受1.5ml體積的反應容器中，并用HPLC水按1∶10的比率稀釋。
接著可以立即進行分析，或者將所得樣品儲存于-80℃下放置1個月。藥理學研究1．亞硝酸鹽作為cNOS的特異性診斷試劑以我們自己的有關人心血管系統(tǒng)中NO代謝的知識作為基礎，準確地測定作為內皮組成型NO合成之活性的特異性標記物的亞硝酸鹽。
使用實施例2中所述的特異性的終止溶液，它可以防止人血中的亞硝酸鹽快速地轉變成硝酸鹽，從而在制備樣品的過程中不會導致亞硝酸鹽的任何可估計到的損失，而且在樣品的制備和隨后的測定之后能夠回收亞硝酸鹽。另外，還發(fā)展了高度敏感的測定方法，該方法聯(lián)合使用整合到2-通道HPLC系統(tǒng)中的紫外光和電化學檢測，使得能夠同時和高度敏感地定量測定人或哺乳動物全血樣品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽，用試驗受試者取得了下列結果根據(jù)實驗性的研究，已顯示出在基礎條件下，動脈和靜脈內皮細胞中NO的產生有所不同，已發(fā)現(xiàn)人動脈血樣品中所含的亞硝酸鹽濃度(1310±50nmol/L)比靜脈血管區(qū)域的樣品中的(1100±40nmol/L)高。如上所述，與之形成對比的是硝酸鹽的血清值并未顯示出特別的差異，人心血管系統(tǒng)的動脈和靜脈部分的樣品中測得的平均值皆為42±6μmol/L(n=5)。另外，通過人前臂循環(huán)系統(tǒng)模型表明在靜止時，將內皮-依賴性擴張劑乙酰膽堿和緩激肽局部灌注到A.Brachialis會劑量依賴性地導致血流量4倍以上的增加(n=7)。在血流量增加的過程中，有文獻證明來自Vena cubitalis的樣品中亞硝酸鹽血清濃度呈劑量-依賴性地增加，尤其是對兩個中介體而言。因此，盡管前臂血流區(qū)的血流量增加4倍以上，但在灌注了兩種組成型內皮NO合成刺激劑后，亞硝酸鹽的血清濃度呈特異性地增加。這意味著亞硝酸鹽特異性地和劑量依賴性地反映了此血流區(qū)中增加的內皮NO產生。另外，針對兩種物質，發(fā)現(xiàn)了血流量增加和血清中亞硝酸鹽濃度的增加以及通過前臂血流區(qū)釋放的速率之間的高度重要的關系(見圖2和3)。另外，在對照研究中，顯示出不依賴于內皮的血管舒張藥罌粟堿導致血流量類似地增加4倍，但未論證亞硝酸鹽血清濃度的增加。另外，同時灌注L-NMMA作為組成型內皮NO合成的立體特異性抑制劑(6μmol/min)顯示出與對照條件(n=3)相比，血流反應和亞硝酸鹽的血清濃度降低了40％。概括地說，這些研究證實了通過先進的方法學，第一次可以局部地和特異性地定量檢測血管系統(tǒng)中內皮組成型NO合成的活性，因此可診斷其與內皮機能失調有關的功能性狀態(tài)。2．左哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)，特別是人循環(huán)系統(tǒng)中使用本發(fā)明的可靠的NO溶液的療法由于NO在人循環(huán)系統(tǒng)中的快速代謝，本發(fā)明的可靠的NO溶液可被用作治療劑以得到局部非常高效的NO濃度，而不會同時引發(fā)有害的全身性副作用。選擇前臂循環(huán)的模型，以逐漸增加的劑量局部使用含水的NO標準以檢測受試者。由于NO在人血中的代謝，連續(xù)的灌注不適于此療法，而大丸劑技術實際上更有效。所選擇的儲存液的濃度和應用的動力學必需選擇得使對應于環(huán)形的循環(huán)體積和從應用點到阻力動脈的轉運時間的含水NO溶液的清楚限定的大丸劑能可再生地到達靶向的血流區(qū)。從圖4和5可看出，利用此大丸劑技術，在頂點以及血流反應曲線下表面以上，NO可再生地導致血流量呈劑量依賴性地增加，而不會導致全身性的可測的血壓降低。另外，其它的毒理學研究表明在研究過程中使用NO，在相關劑量下，試驗受試者血液中的正鐵血紅蛋白含量沒有變化。另外，使用上述終止溶液顯示出在此血流區(qū)域使用NO的過程中，Vena cubitalis中的血清亞硝酸鹽濃度增加了111±12％，而亞硝酸鹽的血清濃度(45±8μmol/L)在干擾過程中沒有顯著的變化。對通過大丸劑技術使用的此含水NO標準的局部血流反應與各個試驗受試者的體表區(qū)域高顯著地相關，并且不依賴于心率或全身性動脈血壓的水平。3．圖2-5的解釋圖2
局部動脈內灌注劑量逐漸增加的乙酰膽堿后(數(shù)據(jù)見圖6)，前臂血流量變化(FBF)和亞硝酸鹽的血清濃度(A)以及前臂循環(huán)中NO或亞硝酸鹽的釋放速率之間的關系。線性回歸分析顯示r=0.997和p=0.003。圖3局部動脈內灌注劑量逐漸增加的緩激肽后(數(shù)據(jù)見圖7)，前臂血流量變化(FBF)和亞硝酸鹽的血清濃度(A)以及前臂循環(huán)中NO或亞硝酸鹽的釋放速率之間的關系。線性回歸分析顯示r=0.985和p=0.001。圖4前臂循環(huán)中NO誘導的血管舒張的劑量反應曲線。體積描記法測定的前臂血流量(FBF)增加對NO劑量作圖，所述NO以大丸劑技術在NO溶液的鹽水標準液中被使用(n=6，平均值±SEM)。圖5前臂循環(huán)中NO誘導的血管舒張的劑量反應曲線。曲線以下區(qū)域作圖的是FBF變化，試驗受試者與圖4/5中相同(n=6，平均值±SEM)。
權利要求
1．無菌的，可注射的，生理上可接受溶液的藥物組合物，其特征在于該組合物具有隨溫度增加而降低的氧化氮(NO)含量，并且不含氧，由用NO飽和的0.9％氯化鈉溶液組成。
2．根據(jù)權利要求1的藥物組合物，其特征在于0.9％氯化鈉溶液中的NO和濃度隨溫度的增加而有區(qū)別地降低。
3．根據(jù)權利要求1和2的藥物組合物，其特征在于0.9％氯化鈉溶液中的NO飽和濃度在0℃下是3.26 NO[μmol/L]，在25℃是1.85NO[μmol/L]，在37℃是1.52 NO[μmol/L]，而在50℃是1.26NO[μmol/L]。
4．制備根據(jù)權利要求1-3的藥物組合物的方法，其特征在于為了排除氧氣，將氬氣通入無菌的，可注射的0.9％氯化鈉溶液直至任何殘留的氧氣含量都被除去，然后通入NO直到NO在0.9％氯化鈉溶液中達到飽和濃度。
5．不含氧的，由NO飽和的0.9％氯化鈉溶液組成的無菌的，可注射的生理上可接受的溶液在制備治療哺乳動物內皮機能失調的權利要求1-3的藥物組合物中的用途。
6．定量測定哺乳動物內皮機能失調的檢測方法，其特征在于將充分排除氧的已測量體積的全血置于類似體積的濃NaOH終止溶液(1mol/L)中，加入50μl濃磷酸(1mol/L)，以10,000g的轉速離心5分鐘，將所得的上清液輕輕傾入超濾管中，在2,000g的轉速下重新離心15分鐘，然后用HPLC水按1∶10的比率稀釋所得的超濾物，按已知的方式測定亞硝酸鹽的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有一氧化氮(NO)的,無菌的,可注射的生理上可接受的溶液的藥物組合物,其制備方法,以及檢測生理上存在的NO的方法。有關本發(fā)明的NO溶液,局部高劑量的NO可引發(fā)血管(如冠狀血管)中靶向的局部生物學作用,如平滑肌系統(tǒng)的松弛,血小板等的粘附的抑制等等,而不會產生由高劑量引起的全身性的副作用,如血壓的臨界性降低。有關本發(fā)明的檢測方法,可在人/哺乳動物的全血中檢測到內皮機能失調的存在。
文檔編號A61P9/10GK1210468SQ97192105
公開日1999年3月10日 申請日期1997年2月3日 優(yōu)先權日1996年2月7日
發(fā)明者M·克爾姆 申請人:施瓦茨制藥有限公司