專利名稱：重組的核糖核酸酶蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)所需細(xì)胞有毒性地核糖核酸酶分子的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
自1960和1970年完成的許多研究都詳細(xì)地提供了核糖核酸酶如核糖核酸酶A(RNase A)和其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性資料，并在Roth,J.1963,癌癥研究23:657-666中作了綜述。還發(fā)現(xiàn)人血清含有數(shù)種以組織特異性方式表達(dá)的RNase(Reddi E.1975,Biochem.Biophys.Res.Commun.67:110-118,Blank等，人類體液核糖核酸酶檢測，相互關(guān)系及意義1-203-209(IRL Press,London,1981))。與宿主嗜酸性粒細(xì)胞的防御活性有關(guān)的蛋白質(zhì)與RNase同源并表現(xiàn)出RNase活性(Gleich等，1986,美國科學(xué)院學(xué)報(bào)83:3146-3150；Slifman等，1986，免疫學(xué)雜志137:2913-2917)。因此，認(rèn)為人血清RNase也有宿主防御活性。
對(duì)這些早期研究的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)來自美洲豹蛙卵母細(xì)胞的抗腫瘤蛋白質(zhì)與RNase A同源(Ardelt等，1991,生物學(xué)及化學(xué)雜志256:245-251)。已將該蛋白質(zhì)命名為ONCONASE,Alfacell Corporation,N.J.,也參見例如Darzynkiewicz等(1988)細(xì)胞組織動(dòng)力學(xué)21,169-182；Mikulski等，(1990)細(xì)胞組織動(dòng)力學(xué)23,237-246。在美國專利4888172中也描述了該蛋白質(zhì)。最近已經(jīng)完成了ONCONASE作為患各種固體瘤患者的單一治療藥物的臨床試驗(yàn)(Mikulski等，(1993)癌癥學(xué)國際雜志3,57-64)或在患前期胰腺癌的患者中與三苯氧胺聯(lián)用的Ⅰ期和Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(Chun等(1995)Proc.Amer Soc.Clin.Oncol.14:No.157,210)。ONCONASE與細(xì)胞-型-特異性配體的結(jié)合提高了其抗腫瘤細(xì)胞的能力(Rybak等(1993)Drug Delivery 1,3-10)。綜合考慮，這些結(jié)果表明ONCONASE具有有利于產(chǎn)生有效選擇性細(xì)胞殺死試劑的特性。
但由于該蛋白質(zhì)不是人源蛋白，因此當(dāng)在人體中使用時(shí)，易刺激不想要的免疫反應(yīng)。因此，需要既保持該分子的有效細(xì)胞毒性特性，而同時(shí)又降低其在人體中的免疫原性。此外，需要重組生產(chǎn)該分子的衍生物以便它能夠更好地與其他分子化學(xué)結(jié)合或重組相連以導(dǎo)向特異性細(xì)胞。直到本文描述的本發(fā)明為止，已證明很難重組表達(dá)出與ONCONASE相關(guān)的活性細(xì)胞毒性分子。盡管認(rèn)為所述重組分子的甲硫氨酸-谷氨酸氨基末端使所述分子難以具有顯著的酶活性，但是直到本發(fā)明為止尚未提出解決該問題的方法。
另外，盡管在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)方面的進(jìn)步有希望降低與免疫毒素抗體部分相關(guān)的免疫原性(Bird等，1988,科學(xué)242:423；Huston等，1988,美國科學(xué)院學(xué)報(bào)85:5879；Ward等，1989,自然341:544)，但是除患者的免疫抑制外，還沒有解決所述毒素部分免疫原性的方案(Khazaeli等，1988,Proceedings of AACR 29:418)。因此，仍然需要降低美洲豹蛙-衍生的毒性部分之免疫原性的方法和組合物。
已經(jīng)表明，通過化學(xué)(Rybak等，(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志266:1202-21207,Newton等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267,19572-19578)或重組方法(Rybak等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)89,3165,Newton等，(1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745)，與腫瘤相關(guān)性抗原相連的RNase A超家族的非細(xì)胞毒性的人源成員可以提供選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的策略，這種策略比目前使用植物和細(xì)菌毒素的策略(Rybak,S.M.&Youle,R.J.(1991)北美免疫學(xué)和過敏反應(yīng)臨床學(xué)11:2,359-380)的免疫原性低。所需的人源性核糖核酸酶包括嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)和血管生成素。
發(fā)明綜述
我們發(fā)現(xiàn)了如何構(gòu)建有高度細(xì)胞毒性并是天然ONCOASE(nOnc)修飾物的RNase。當(dāng)重組表達(dá)nOnc時(shí)，發(fā)現(xiàn)它沒有顯著的細(xì)胞毒性。但我們的修飾產(chǎn)物(rOnc)是高細(xì)胞毒性的，并保持了天然ONCOASE分子的優(yōu)點(diǎn)，而在某些情況下，它們的細(xì)胞毒特性還有所提高。rOnc分子可單獨(dú)使用或方便地用于形成化學(xué)結(jié)合物，以及形成被導(dǎo)向的重組免疫融合物?？捎眠@些rOnc分子降低腫瘤細(xì)胞的生長。nOnc的有效重組形式可有利地使所述重組分子與其他治療藥物或所需的導(dǎo)向分子重組融合。此外，如下文可見到的，可修飾rOnc分子以提高細(xì)胞毒性。我們的nOnc衍生的分子還是令人滿意的，因?yàn)閚Onc是一種特有的核糖核酸酶，即可將其單獨(dú)直接施用給患者以降低并抑制腫瘤細(xì)胞的生長而不需施用導(dǎo)向試劑。
本發(fā)明還包括用與配體相連的rOnc以產(chǎn)生本發(fā)明的選擇性細(xì)胞毒試劑從而選擇性殺死細(xì)胞的方法。所述方法包括將待殺死的細(xì)胞與含有配體結(jié)合部分的本發(fā)明細(xì)胞毒性試劑接觸，所述配體結(jié)合部分特異性地將所述試劑傳遞到待殺死的細(xì)胞?？蓪⒈景l(fā)明的所述方法用于通過選擇性殺死不想要的細(xì)胞類型(如在將骨髓移植到通過照射而部分切除骨髓的患者前殺死骨髓中不想要的細(xì)胞類型)而進(jìn)行體外細(xì)胞分離，或用于殺死引起移植物抗宿主病的白血病細(xì)胞或T細(xì)胞。還可用所述毒素選擇性殺死培養(yǎng)中的不想要的細(xì)胞。
還描述了我們r(jià)Onc分子的人源化產(chǎn)物，該產(chǎn)物將部分哺乳動(dòng)物或人衍生的RNase如血管生成素或人嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)移植到rOnc衍生的分子中。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是其中將EDN的氨基末端接到rOnc分子氨基末端上的一種分子。描述了這些雜種蛋白質(zhì)在核糖核酸酶活性和體外抗腫瘤作用方面的令人驚奇的特性。
附圖簡要描述圖注


圖1描述的是Rana克隆9的推測氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，和nOnc氨基酸序列的序列排列(SEQ ID NO:1)。黑體表示nOnc和Rana克隆9之間相同的殘基。點(diǎn)表示在PCR克隆中丟失的氨基酸。
圖2A和2B是實(shí)施例中舉證的DNA構(gòu)建體的構(gòu)型。將從美洲豹蛙DNA得到的PCR產(chǎn)物鑒定為Rana 9。將N-和C-末端合成補(bǔ)平，在編碼EDN/Onc雜合N-末端的[Met-(-1)]rOnc或EDN的構(gòu)建體中鑒定為Onc。在下面的各構(gòu)建體中標(biāo)明了相應(yīng)的氨基酸殘基。圖2B表示nOnc(SEQ ID NO:3)、rEDN(SEQ ID NO:4)、在位置20含有Gly代替Asp的[Met-(-1)]rOnc(SEQ ID NO:5)、在氨基酸位置26含Asp的rEDN(1-21)rOnc(SEQ ID NO:6)和在氨基酸位置26含Gly的rEDN(1-21)rOncG26(SEQ ID NO:7)的N端序列的序列對(duì)比。黑體字母表示保守的殘基，大寫字母表示從Rana克隆9推測的序列。
圖3A-3D說明nOnc、rEDN、[Met-(-1)]rOnc或雜種蛋白質(zhì)抑制人腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。將細(xì)胞(104)鋪在各個(gè)96孔微滴定培養(yǎng)平板中，用不同濃度的各試劑處理48小時(shí)。按下文實(shí)施例中所述確定細(xì)胞生存力。將來自1個(gè)以上試驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合起來得到平均值點(diǎn)。當(dāng)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差大于標(biāo)準(zhǔn)記號(hào)時(shí)，顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。細(xì)胞系A(chǔ)CHN,腎癌(圖3A)；MDA-MB-231(圖3B)；和HS 578T(圖3D)，乳腺癌；SF-539(圖3C)，CNS,癌。EDN(空心三角)；nOnc(空心方塊)；[Met-(-1)]rOnc(實(shí)心三角)；rEDN(1-21)rOnc(空心圓)；rEDN(1-21)rOncG26(實(shí)心圓)。
圖4表示RNase A超家族一些成員的序列對(duì)比蛙凝集素來自Ranacatesbeiana,ONCONASE、EDN、ECP(人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白)，Ang是牛血管生成素，Seminal是牛精液RNase，和RNaseA是牛胰腺RNaseA(分別為SEQ ID NO:8、1和9-13)。在所有成員中保守的氨基酸是大寫字母，用星號(hào)標(biāo)明了活性位點(diǎn)殘基H12、K41和H119(RNaseA編號(hào))。
圖5說明MetSerOnc和MetSer-或MetGlu-OncFvs的蛋白質(zhì)合成抑制作用。單鏈抗體rOnc融合蛋白的細(xì)胞毒性作用；通過確定在SF 539細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制作用，對(duì)E6FB[Met-(-1)]SerrOnc(實(shí)心圓)，[Met-(-1)]SerrOncAngFBE6(空心方塊)和[Met-(-1)]GlurOncFBE6(實(shí)心方塊)與非靶向的重組蛋白質(zhì)[Met-(-1)]SerrOnc進(jìn)行比較。將細(xì)胞鋪在96孔微滴定板中用10％熱滅活胎牛血清補(bǔ)充的Dulbecco’s基本培養(yǎng)基中。使總體積達(dá)到10μl，然后將平板在37℃保溫3天。在加入含0.1mci[14C]亮氨酸的磷酸緩沖液2-4小時(shí)后，用PHD細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾器上，用水洗滌，用乙醇干燥，然后計(jì)數(shù)。將結(jié)果表示為模擬品處理孔中的[14C]亮氨酸摻入的百分比。
圖6A和6B在如圖3A-3D說明的試驗(yàn)中，用細(xì)胞系SF539、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和命名為MetLysTryrOnc的rOnc融合蛋白(空心圓，圖6A)、MetAlaAlaTyrOnc(實(shí)心圓，圖6A)和含信號(hào)肽的rOnc融合蛋白MetKDELSerrOnc(空心圓，圖6B)以及MetNLSSerrOnc(實(shí)心圓圖6B)說明蛋白質(zhì)合成的抑制作用。
圖7在如圖3A-3D說明的試驗(yàn)中，用細(xì)胞系SF539、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞并比較對(duì)應(yīng)于MetSerOnc(含有Met-Ser氨基末端的SEQ IDNO:39)的三種融合蛋白MetSerOnc(實(shí)心圓)、MetSerOncC4(在SEQ ID NO:39的氨基酸位置5為Cys的MetSerOnc，實(shí)心方塊)和MetSerOncC72(SEQ ID NO:39的氨基酸位置72為Cys的MetSerOnc,空心圓)說明蛋白質(zhì)合成的抑制作用。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了可用于選擇性殺死靶細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞的有高活性和細(xì)胞毒性的核糖核酸酶分子。在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)使所述分子含有來自人衍生之核糖核酸酶的序列，所述序列也是有高活性和細(xì)胞毒性的，但它們還有其他優(yōu)點(diǎn)，即在人體中的致免疫性較低。本發(fā)明的rOnc分子是nOnc衍生的重組的序列。
nOnc分子含有列于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。牛胰腺RNaseA的氨基酸序列列于SEQ ID NO:13。除非特別說明，本文描述的氨基酸序列的位置使用參考SEQ ID NO:13中牛胰腺RNaseA序列的框架，因?yàn)檫@是RNase領(lǐng)域常用的參考序列。應(yīng)理解所述位置命名并不說明所要求分子本身中的氨基酸編號(hào)，而是說明當(dāng)所要求的分子序列與牛RNase一起排列時(shí)，在所要求分子中出現(xiàn)的殘基。
本文所述和要求的rOnc分子優(yōu)選在對(duì)應(yīng)于氨基酸位置26、40、58、84、95和110的氨基酸位置含有半胱氨酸殘基；參考牛RNaseASEQ ID NO:13，在位置41是賴氨酸，在位置119是組氨酸(所述位置分別對(duì)應(yīng)于在SEQ ID NO:1列出的nOnc序列的氨基酸位置19、30、48、68、75和90，以及87和104)。
本發(fā)明的rOnc分子是具有如下所定義的可測量的核糖核酸酶活性的分子。核糖核酸酶還含有(a)從甲硫氨酸開始的氨基末端，在所述甲硫氨酸后可以是除谷氨酸(Glu)以外的任何氨基酸；(b)在氨基酸位置26、40、58、84、95和110含有半胱氨酸，在位置41是賴氨酸，在位置119是組氨酸，所述位置參考牛RNaseA(SEQ ID NO:13)氨基酸序列中的位置來確定的；和(c)nOnc衍生的氨基酸序列。
優(yōu)選rOnc分子含有選自下列的氨基末端
Met-Ala
Met-Ala-Ala-Ser
Met-Arg
Met-(J)
Met-Lys-(J)
Met-Arg-(J)
Met-Lys
Met-Lys-Pro
Met-Lys-(J)-Pro(SEQ ID NO:14)
Met-Lys-Pro-(J)(SEQ ID NO:15)
Met-Asn
Met-Gln
Met-Asn-(J)
Met-Gln-(J)
Met-Asn-(J)-Pro(SEQ ID NO:16)
Met-(J)-Lys
Met-(J)-Lys-Pro(SEQ ID NO:17)和
Met-(J)-Pro-Lys(SEQ ID NO:18)
其中(J)是絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸。
此外，優(yōu)選修飾rOnc分子以便將nOnc氨基酸位置2的天冬氨酸(對(duì)應(yīng)于牛RNaseA序列的位置4)缺失或使之被丙氨酸或天冬酰胺取代。
在另一種形式的rOnc分子中，所述分子具有由衍生于EDN氨基末端的序列編碼的氨基末端，其后是來自rOnc的序列。在所述形式中，優(yōu)選所述氨基酸序列選自由基本上與下式相同的氨基酸序列組成的序列
Met(-1)EDN(1-m)Onc(n-104)
其中Met(-1)指氨基末端殘基Met；其中EDN(1-m)指從EDN(SEQID NO:9)的氨基酸位置1開始，延續(xù)至并包括EDN氨基酸位置m的連續(xù)氨基酸序列；其中Onc(n-104)指從SEQ ID NO:1的氨基酸位置n開始，延續(xù)至并包括氨基酸位置104的連續(xù)氨基酸序列；以便
當(dāng)m是21時(shí)，n是16或17；
當(dāng)m是22時(shí)，n是17；
當(dāng)m是20時(shí)，n是16；
當(dāng)m是19時(shí)，n是15；
當(dāng)m是18時(shí)，n是14；
當(dāng)m是17時(shí)，n是12或13；
當(dāng)m是16時(shí)，n是11、12、13或14；
當(dāng)m是15時(shí)，n是10；
當(dāng)m是14時(shí)，n是9；
當(dāng)m是13時(shí)，n是8；和
當(dāng)m是5時(shí)，n是1。
在其他實(shí)施方案中，將rOnc分子在羧基末端與來自血管生成素的序列，如在SEQ ID NO:11中所列的序列或SEQ ID NO:20的氨基酸位置101-107的序列相融合。人血管生成素的核酸序列是已知的并列在美國專利申請(qǐng)08/125,462中。
優(yōu)選的rOnc核酸序列是編碼優(yōu)選的rOnc氨基酸序列的那些，所述氨基酸序列基本上等同于SEQ ID NO:20、22、24、26、28和30(分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:19、21、23、25、27和29所列的核酸序列)所列的。最優(yōu)選的rOnc氨基酸序列基本上等同于SEQ ID NO:20、22、24和26所列的氨基酸序列。其相應(yīng)的核酸序列也是優(yōu)選的，并列于SEQ ID NO:19、21、23和25中，包括其保守修飾的變異體。最佳序列包括SEQ ID NO:22，它具有移植到nOnc序列的16-104位氨基酸上的EDN的氨基末端1-21(通常21)氨基酸的氨基末端，而且nOnc中的氨基酸殘基20(Asp)被Gly取代。相對(duì)于SEQ ID NO:39，優(yōu)選的rOnc序列還可在相對(duì)于氨基酸位置5或73上含有半胱氨酸，或在氨基酸位置88丙氨酸代替半胱氨酸。
將本文所提供的rOnc序列與胰腺RNaseA超家族中的序列進(jìn)行比較。所述成員中的許多是已知的，包括(但不限于)來自Rana catesbeiana的蛙凝集素(Titani等，生物化學(xué)26:2189(1987))；ONCONASE(Ardelt,W.等，生物化學(xué)雜志266:245(1991))；嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)(Rosenberg等，同上文)；人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)(Rosenberg等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志170:163(1989))；血管生成素(Ang)(Fett,J.W.等生物化學(xué)24:5480(1985))；牛精液RNase(Preuss等，校酸研究18:1057(1990))；以及牛胰腺RNase(Beintama等，生物物理學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)展51:165(1988))；有關(guān)所有所述蛋白質(zhì)的參考文獻(xiàn)均引入本文作為參考。所述RNase的氨基酸序列已對(duì)比列于圖4和Youle等，Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Systems 10:1-28(1993)以及美國專利申請(qǐng)No.08/125,462(引入本文作為參考)中。定義
除非本文特別說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。Singleton等(1994)微生物和分子生物學(xué)字典，第二版，John Wiley and Sons(New York)和Hale andMarham(1991)The Harper Collins Dictionary of Biology,HarperPerennial,NY給技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用的許多術(shù)語的字典。盡管在實(shí)施或?qū)嶒?yàn)本發(fā)明的過程中，可以使用與本文所述的相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧?，但本文描述了?yōu)選的方法和材料。對(duì)于本發(fā)明目的而言，下列術(shù)語定義如下。
本文中氨基酸用其熟知的三字母符號(hào)或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一個(gè)字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸用通常接受的單字母密碼子來表示。
術(shù)語“可測量的核糖核酸酶活性”或“顯著的核糖核酸酶活性”指當(dāng)分子加到蛋白質(zhì)合成受到抑制的兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物試驗(yàn)中時(shí)，所述抑制以[35S]甲硫氨酸摻入到酸可沉淀的蛋白質(zhì)中進(jìn)行測量，IC50(ng/ml)低于40的分子。IC50是試驗(yàn)中對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制達(dá)到50％所需的蛋白質(zhì)濃度。還可按可從Promega Corpation,Madison,WI購買的Promega溶解產(chǎn)物試劑盒的所述完成溶解產(chǎn)物試驗(yàn)。按照公開的方法(Newton D.L.等，(1996)生物化學(xué)，35:545-553)，用高分子量RNA和tRNA,在37℃通過高氯酸可溶性核苷酸的形成來確定核糖核酸酶活性。用poly(A,C)UpG和polyU，按照Deprisco等和Libonati and Floridi(Deprisco等，(1984)Biochimica et Biophysica Acta 788:356-363；Libonati,M.等，(1969)歐洲生物化學(xué)雜志8:81-87)所述檢測核糖核酸酶活性。通過測量在260nm吸收值隨時(shí)間的增加來檢測活性。保溫混合物在25℃(1ml10mM咪唑，0.1M NaCl,pH6.5或pH7)含有底物和適宜量的酶溶液。按前述(Pearson J.W.等，(1991)J.Natl.Cancer Inst.83:1386-1391)用(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑嗡溴化物；噻唑基蘭)(MMT)(Mossman,T.(1983)免疫學(xué)方法雜志65:55-63)完成體外翻譯試驗(yàn)(St.Clair,D.K.等(1987)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)84:8330-8334)和細(xì)胞生存力試驗(yàn)。
“nOnc衍生的”氨基酸序列是至少含一串6個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述6個(gè)連續(xù)氨基酸與選自從nOnc氨基酸序列(SEQ ID NO:1)位置1(用Glu代替pyroGlu)、2、3、4、5、6、7、8、11、12、13、14、15、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、41、42、43、44、45、46、47、50、52、54、56、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、80、81、82、84、85、86、87、91、92、93、95或96開始的連續(xù)6個(gè)氨基酸的序列相同。
特定核酸序列的“保守修飾的變異體”指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或若所述核酸不編碼氨基酸序列，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼任何特定的多肽。例如密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼丙氨酸。因此，在用密碼子限定是丙氨酸的每個(gè)位置時(shí)，可將密碼子變成任何所述的相應(yīng)密碼子而不會(huì)改變所編碼的多肽。所述核酸變異是“沉默變異”，它們是保守修飾變異中的一種。本文編碼多肽的各核酸序列還描述了各種可能的核酸的沉默變異。專業(yè)人員可以認(rèn)識(shí)到，可修飾核酸中的各密碼子(除AUG外，通常它是甲硫氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽之核酸的各沉默變異是各所述序列中內(nèi)含的。此外，專業(yè)人員可以認(rèn)識(shí)到改變、增加或缺失編碼序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比氨基酸的各個(gè)取代、缺失或增加也是“保守修飾的變異”，所述改變會(huì)導(dǎo)致用化學(xué)相似的氨基酸進(jìn)行氨基酸的取代。提供功能相似氨基酸的保守取代是本領(lǐng)域熟知的。下列6組含有彼此是保守取代的氨基酸
1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
還可參見Creighton(1984)Proteins W.H,Freeman and Company
術(shù)語“分離的”或“生物學(xué)純的”指基本上不含天然環(huán)境中通常與其相伴之組分的物質(zhì)。分離的物質(zhì)還可含有在天然環(huán)境中與所述物質(zhì)非同時(shí)發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。本文所述的rOnc是分離的和生物學(xué)純的，因?yàn)樗鼈兪窃诓缓乐薇軣o關(guān)蛋白質(zhì)的情況下重組產(chǎn)生的。但是，它們可包括異源細(xì)胞組分、配體結(jié)合部分、標(biāo)記等。
術(shù)語“核酸”指單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非特別限定，包括以天然核苷酸相似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非特別說明，特定的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。核酸編碼與特定核酸相同或與特定核酸互補(bǔ)的另一核酸。
“表達(dá)載體”包括核酸的重組表達(dá)盒，所述核酸編碼可由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯的rOnc多肽。重組表達(dá)盒是重組或合成的核酸構(gòu)建體，含有一系列可使特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動(dòng)子。
術(shù)語“重組”與相應(yīng)的蛋白質(zhì)一起使用時(shí)，指細(xì)胞表達(dá)由對(duì)所述細(xì)胞而言是外源的核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可表達(dá)在所述細(xì)胞天然(非重組體)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因。重組細(xì)胞還可表達(dá)在所述細(xì)胞天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因，其中將所述基因通過人工方法，如在異源啟動(dòng)子的控制下，重新導(dǎo)入到所述細(xì)胞中。
本文中術(shù)語特定核酸或多肽序列的“亞序列”指等于或小于所述特定核酸或多肽的核酸或多肽區(qū)域。
在核酸雜交試驗(yàn)如Southern和Northern雜交中的“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，而且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于Tijssen(1993)生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-用核酸探針雜交，I部分，第2章“雜交原理和核酸探針試驗(yàn)的綜述”，Elsevier,New York。通常，選擇高度嚴(yán)格的洗滌條件是在特定的離子強(qiáng)度和pH下，比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃。Tm是靶序列與精確匹配的探針雜交達(dá)到50％時(shí)的溫度(在特定的離子強(qiáng)度和pH)。極嚴(yán)格條件選擇為等于特定探針的Tm點(diǎn)。在嚴(yán)格條件下，彼此不雜交的核酸如果它們所編碼的多肽基本相同，則它們也是基本相同的。例如當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生一拷貝的核酸時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種情況。
本文中術(shù)語兩個(gè)核酸或多肽序列的“相同”指在規(guī)定的比較窗口進(jìn)行最大一致性的序列比較時(shí)，兩個(gè)序列中的殘基相同。在提到蛋白質(zhì)或肽使用序列一致性百分比時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置通常以保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)特性(電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基取代，因此不改變所述分子的功能特性。若序列的差別在于保守取代，可根據(jù)所述取代的保守性，將序列一致性百分比向上調(diào)整到正確值。進(jìn)行所述調(diào)整的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。這通常包括將保守取代記分為部分而不是全錯(cuò)配，由此提高序列一致性百分比。因此例如，若將一個(gè)相同氨基酸記分為1時(shí)，就將非保守取代記分為0，保守取代在0-1之間。例如按照Meyers和Miller，計(jì)算機(jī)應(yīng)用與生物科學(xué)4:11-17(1988)的算法，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中包含的算法計(jì)算保守取代的值。
用于比較的序列對(duì)比的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于比較的最佳序列對(duì)比可通過Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)分子生物學(xué)雜志48:443的同源序列對(duì)比算法；Pearson和Lipman(1988)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)85:2444的相似性方法檢索；這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(包括但不限于在PC/GENE程序中的CLUSTAL(Intelligenetics,Mountain View,California),在Wisconsin Genetics軟件包(Genetics計(jì)算機(jī)集團(tuán)GCG,575 Science Dr.Madison,wisconsin,USA)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)來完成；CLUSTAL程序在Higgins和Sharp(1988)，基因，73:237-244和Higgins和Sharp(1989)，生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用5:151-153；Corpet等(1988)，核酸研究16,1088-90；Huang等(1992)，生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用8,155-65和Pearson等(1994)，分子生物學(xué)方法24,307-31中作了詳細(xì)描述。還常常通過檢查和手工序列對(duì)比完成序列對(duì)比。
在提及多肽時(shí)術(shù)語“基本上相同”或“基本上相似”指在約10-20個(gè)氨基酸殘基的比較窗口上，多肽含有與參考序列有至少70％序列一致性的序列，與參考序列相比優(yōu)選有80％或更優(yōu)選85％的序列一致性，更優(yōu)選90％的序列一致性。兩個(gè)多肽序列基本相同的指標(biāo)是指一個(gè)肽與抗第二個(gè)肽的抗體有免疫反應(yīng)性。因此，例如若兩個(gè)肽的差別僅在保守取代，則一多肽與第二多肽基本相同。
兩個(gè)核酸序列基本相同的指標(biāo)是指第一個(gè)核酸所編碼的多肽與第二個(gè)核酸所編碼的多肽有免疫交叉反應(yīng)性。
兩個(gè)核酸序列基本相同的另一指標(biāo)是指兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，而且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。通常，嚴(yán)格條件選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH下，比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5℃-20℃。Tm是50％的靶序列與精確匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在特定的離子強(qiáng)度和pH下)。但是，在嚴(yán)格條件下，彼此不雜交的核酸如果它們所編碼的多肽基本相同，則它們也是基本相同的。例如當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生一拷貝的核酸時(shí)，就會(huì)發(fā)生這種情況。
本文所用的術(shù)語“特異性的傳遞者”，指分子與攜帶特定靶分子或標(biāo)記的細(xì)胞或組織優(yōu)先結(jié)合而不與不含靶分子的細(xì)胞或組織優(yōu)先結(jié)合。當(dāng)然，應(yīng)認(rèn)識(shí)到在分子和非靶細(xì)胞或組織之間可以發(fā)生一定程度的非特異性相互作用。然而，可將特異性傳遞明確為通過靶分子的特異性識(shí)別介導(dǎo)的。典型的特異性傳遞會(huì)導(dǎo)致被傳遞分子與攜帶靶分子的細(xì)胞之間的結(jié)合強(qiáng)于被傳遞分子與不含靶分子的細(xì)胞之間的結(jié)合。與不含靶分子或標(biāo)記的細(xì)胞或組織相比，特異性傳遞會(huì)導(dǎo)致傳遞到攜帶靶分子或組織中的被傳遞分子的量高2倍，優(yōu)選高5倍，更優(yōu)選高10倍，最優(yōu)選高100倍。
本文所用的術(shù)語“殘基”指摻入到多肽中的氨基酸。所述氨基酸可以是天然氨基酸，除非特別說明，可包括以與天然氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的天然氨基酸的已知類似物。
“融合蛋白”或當(dāng)一個(gè)分子與另一個(gè)分子“相連”時(shí)指通過一個(gè)多肽氨基末端和另一多肽羧基末端之間形成的肽鍵，而連接兩個(gè)或多個(gè)多肽而形成的嵌合分子。所述融合蛋白或連接的分子可以通過組成分子的化學(xué)結(jié)合而形成，或者可從編碼連續(xù)融合蛋白的核酸序列以單個(gè)多肽的形成表達(dá)出來。單鏈融合蛋白是含有單一連續(xù)多肽骨架的融合蛋白。
本文所用的“配體”或“配體結(jié)合部分”通常指能夠特異性傳遞分子，與靶細(xì)胞上的受體反應(yīng)或識(shí)別或結(jié)合的所有分子。具體地說，配體的例子包括但不限于抗體、淋巴因子、細(xì)胞因子、受體蛋白如CD4和CD8，溶解的受體蛋白如可溶性CD4，激素、生長因子以及特異性結(jié)合所需靶細(xì)胞的那些配體。制備rOnc-衍生的核酸和多肽
本文描述了一些編碼rOnc-衍生的多肽的具體核酸。這些核酸可用標(biāo)準(zhǔn)重組或合成技術(shù)制備。在給定本發(fā)明核酸的情況下，專業(yè)人員可以構(gòu)建各種含功能等同核酸如編碼相同多肽之核酸的克隆。達(dá)到這些目的的克隆方法以及確定核酸序列的測序方法是本領(lǐng)域熟知的。適宜的克隆和測序技術(shù)的例子，以及足以指導(dǎo)專業(yè)人員進(jìn)行許多克隆試驗(yàn)的說明見于Berger和Kimmel,分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法152卷，學(xué)術(shù)出版公司San Diego,CA(Berger)；Sambrook等(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版)1-3卷；以及分子生物學(xué)常用方法F.M.Ausubel等，編，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1994增補(bǔ)版)(Ausubel)。來自生物學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器制造商的產(chǎn)品說明提供了用于已知生物學(xué)方法的信息。所述制造商包括SIGMA化學(xué)公司(Saint Louis,MO)，R&D systems(Minneapolis,MN)，Pharmacia LKB Biotechnology(Pescataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(PAlo Alto,CA),Chem Genes Corp.,Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),Glen Research,Inc.,GIBCOBRL Life Technologies,Inc.,(Gaithersberg,MD),Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen,San Diego,CA和Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及專業(yè)人員已知的許多其他商業(yè)來源。
本發(fā)明的核酸組合物，RNA、cDNA、基因組DNA或各種組合的雜種可從生物源中分離或體外合成。本發(fā)明的核酸存在于轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中，或以部分純化或基本純的形式存在。
用于擴(kuò)增用作分子探針或產(chǎn)生用于隨后亞克隆的核酸片段的體外擴(kuò)增技術(shù)是已知的。足以指導(dǎo)專業(yè)人員完成所述體外擴(kuò)增方法的技術(shù)的例子，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、Qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增以及其他RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(如NASBA)見于Berger、Sambrook等(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)1-3卷；和Ausubel以及Mullis等(1987)美國專利4683202；PCR方案，方法和應(yīng)用指南(Innis等編)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)(Innis)；Amheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN 36-47；NIH研究雜志(1991)3,81-94；(Kwoh等(1990)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)86,1173；Guatelli等(1990)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)87,1874；Lomell等(1989)臨床化學(xué)雜志35,1826；Landegren等(1988)科學(xué)241,1077-1080；Van Brunt(1990)生物技術(shù)8,291-294；Wuand Wallace(1989)基因4,560；Barringer等(1990)基因89,117,andSooknanan和Malek(1995)生物技術(shù)13:563-564。在Wallace等的美國專利5426039中描述了體外克隆擴(kuò)增核酸的改進(jìn)方法。
用作探針的寡核苷酸如在體外rOnc核酸擴(kuò)增方法中用作探針或用作核酸探針以檢測rOnc核酸的寡核苷酸，通常是按照Beaucage和Caruthers(1981)(Tetrahedron Letts.,22(20):1859-1862,)描述的固相亞磷酰胺三酯法，如用Needham-Vandevanter等(1984)核酸研究12:6159-6168描述的自動(dòng)合成儀化學(xué)合成的。還可常規(guī)制備寡核苷酸并從技術(shù)人員已知的許多商業(yè)來源訂購。如果需要的話，寡核苷酸的純化通常是通過天然丙烯酰胺凝膠電泳或通過Pearson和Regnier(1983)染色體雜志255:137-149所述的陰離子交換HPLC完成的。合成的寡核苷酸序列可以用Maxam和Gilbert(1980)(在Grossman and Moldave(eds.)Academic Press,New York,酶學(xué)方法65:499-560)中的化學(xué)降解法來確定。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以了解在給定核酸序列中產(chǎn)生所需改變的許多方法。所述熟知的方法包括定點(diǎn)誘變，使用簡并寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，將含所述核酸的細(xì)胞與誘變劑接觸或使之暴露于照射中，所需的寡核苷酸的化學(xué)合成(如與連接和/或克隆相結(jié)合以產(chǎn)生大核酸)以及其他熟知的技術(shù)。參見，Giliman和Smith(1979)基因8:81-97；Roberts等(1987)自然328:731-734和Sambrook等(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)1-3卷；Innis Ausbel,Berger,Needham VanDevanter和Mullis(所有均同上文)。
可用各種熟知的方法合成本發(fā)明的多肽。通常按照常規(guī)技術(shù)在溶液或固體支持物上合成相當(dāng)短的多肽。參見例如Merrifield(1963)美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志85:2149-2154?？梢再徺I到各種自動(dòng)合成儀和測序儀并可按照已知的方法使用。參見如Stewart和Young(1984)固相肽合成，第二版，Pierce Chemical Co.。還可通過重組表達(dá)編碼所述多肽的核酸，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化來生產(chǎn)多肽。制備本發(fā)明的核酸和多肽的保守修飾物
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可預(yù)料到公開的所述序列的許多保守變異會(huì)產(chǎn)生基本相同的rOnc。例如由于遺傳密碼的簡并性，“沉默取代”(即不改變所編碼的多肽的核酸序列的取代)是編碼氨基酸的各核酸序列的不言而喻的特征。同樣，在氨基酸序列中的一個(gè)或少數(shù)氨基酸上發(fā)生的保守氨基酸取代是用具有高度相似特性的不同氨基酸進(jìn)行取代(參見上文定義部分)，并很容易鑒定為與公開的氨基酸序列或編碼氨基酸的公開的核酸序列高度相似。各清楚公開的序列的所述保守取代(或修飾)變異是本發(fā)明的一個(gè)特征。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員了解在給定的核酸序列中產(chǎn)生改變的許多方法。所述熟知的方法包括定點(diǎn)誘變，使用簡并寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，將含所述核酸的細(xì)胞與誘變劑接觸或暴露于照射中，化學(xué)合成所需的寡核苷酸(如與連接和/或克隆相結(jié)合以產(chǎn)生大核酸)以及其他熟知的技術(shù)。參見，Giliman和Smith(1979)基因8:81-97；Roberts等(1987)自然328:731-734和Sambrook、Innis Ausbel,Berger,Needham VanDevanter andMullis(所有均同上文)。
最常見的是，通過改變相應(yīng)的核酸序列并表達(dá)所述多肽來改變多肽序列。但是還可用市售的肽合成儀來合成多肽序列以產(chǎn)生任何所需的多肽(參見Merrfield,and Stewart and Young,同上文)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以以所提供的序列和本領(lǐng)域有關(guān)核糖核酸酶的一般性知識(shí)為基礎(chǔ)來選擇本發(fā)明所需的核酸或多肽。RNase的物理特征和一般特性是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。RNase中一些突變的特定效果是已知的。此外，有關(guān)蛋白質(zhì)和核酸特性的一般性知識(shí)可以使本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員選擇與本文序列表中所公開的核酸和多肽相似或等同的適宜序列。本文定義部分描述了舉例性的保守氨基酸取代。
最后，用適宜的試驗(yàn)，通過常規(guī)篩選技術(shù)，可以對(duì)核酸和多肽的大部分修飾進(jìn)行所需特征的評(píng)估。例如，通過適宜的免疫實(shí)驗(yàn)可檢測多肽免疫特征方面的改變。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)還可以檢測其他特性的修飾，如與靶核酸的核酸雜交、蛋白質(zhì)的氧化還原或熱穩(wěn)定性、熱histeresis、疏水性、對(duì)蛋白水解的敏感性。rOnc融合蛋白和其他治療部分
rOnc分子還包括藥理試劑或含各種藥理試劑的微囊劑。它們通常包括作為導(dǎo)向分子的配體以便將rOnc導(dǎo)向所需的細(xì)胞?？蓪Onc直接與配體或有助于傳遞rOnc的反義分子相連。參見，例如SEQ IDNO:40-61。還可將rOnc工程化以便其含有如SEQ ID NO:32(和SEQ IDNO:31)氨基酸位置1-7的核定位信號(hào)(NLS)，以指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的rOnc。或者，位置8的甲硫氨酸和SEQ ID NO:31位置22-24的相應(yīng)核酸已被刪除且可被刪除。NLS的核酸序列是SEQ ID NO:31的核酸1-21。信號(hào)肽是例如SEQ ID NO:63的氨基酸位置1-25。
根據(jù)基因治療應(yīng)用特定地改變r(jià)Onc分子?？蓪⑵渑c其他治療藥物融合，如將其與抗B細(xì)胞淋巴瘤抗體融合。例如，如下文詳細(xì)解釋的，與抗運(yùn)鐵蛋白受體抗體或抗結(jié)腸癌抗體重組融合的rOnc分子是有活性的。如上所述，nOnc有體內(nèi)抗腫瘤作用，而且優(yōu)先殺死由血清或生長促進(jìn)因子如ras刺激的快速分裂的細(xì)胞。所述分子在細(xì)胞內(nèi)很容易內(nèi)部化。通過將其與核定位信號(hào)等相連以便重新將所述分子再導(dǎo)向細(xì)胞內(nèi)，可進(jìn)一步增強(qiáng)其活性。在腫瘤細(xì)胞中特別有用的是導(dǎo)向靶端粒酶，一種由RNase降解的一種酶。
在微注射研究中，我們發(fā)現(xiàn)Onc與ras有協(xié)同作用。這意味著Onc與ras都在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)Onc經(jīng)其自身途徑進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，它與ras沒有協(xié)同作用。需要CAAX(SEQ ID NO:33)基元以將ras定位在質(zhì)膜上(C=Cys，A=脂肪族氨基酸，X=S、M、C、A或Q，例子是Cys-Val-Ile-Met(SEQ ID NO:34))。重要的是已經(jīng)表明這種類型的序列可將異源蛋白質(zhì)導(dǎo)向質(zhì)膜(Hancock.J.,Cadwallader,K.,Paterson,H.and C.Marshall(1991)EMBO J.10:4033)。需要將rOnc基因與編碼實(shí)施例中所給出的CAAX(SEQ ID NO:33)信號(hào)或下文所述的KDEL的DNA相連。
端粒酶正作為“通用的癌靶”被研究(G.B.Morin,JNCL(1995)87:859)。它是一種定位在核中的RNA蛋白。已經(jīng)表明端粒酶RNA的反義序列可抑制該酶的功能并阻斷癌細(xì)胞的生長(J.Feng等，科學(xué)(1995)269:1236)。RNase還破壞了該酶的活性。當(dāng)與含端粒酶的細(xì)胞提取物一起保溫時(shí)，Onc也可破壞該酶的活性。可制備NLS/Onc分子(如在SEQ ID NO:32中所列的)以便指導(dǎo)Onc到達(dá)核，從而使其降解端粒酶。已經(jīng)表明我們所用的NLS可將蛋白質(zhì)再導(dǎo)向核以達(dá)到干擾核抗原功能的目的(S.Biocca,M.S.Neuberger and A.Cattaneo(1990)9:101)。我們的NLS/Onc分子在殺死細(xì)胞的過程中是有效的。
在需要將重組分子運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞細(xì)胞溶膠的情況下，所述重組分子的氨基末端序列是優(yōu)選的。通常在所述蛋白質(zhì)的氨基末端插入所述信號(hào)肽。例如，本文所述重組分子的前數(shù)個(gè)氨基酸(Met之后的)可以是KDEL(SEQ ID NO:64)，并可發(fā)出信號(hào)將所述分子導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。可以使用本文稱為“內(nèi)質(zhì)滯留序列”的包括KDEL、KDEL重復(fù)區(qū)的氨基酸序列，或發(fā)揮功能使蛋白質(zhì)保持在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或再循環(huán)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的其他序列。
與配體相連的rOnc分子可選擇性地包括微囊系統(tǒng)，如脂質(zhì)體或微團(tuán)，它們含其他治療組合物如藥物、核酸(如反義核酸)或優(yōu)選避免直接與循環(huán)系統(tǒng)接觸的另一治療部分。制備與抗體相連的脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。參見例如美國專利4957735,Connor等，藥物治療，28:341-365(1985)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可預(yù)料到可將配體分子或其他治療組分和rOnc分子以任何順序連接在一起。因此，若配體是多肽，可將rOnc分子與配體的氨基或羧基末端連接，或可將其與兩種分子的任一內(nèi)部區(qū)相連只要所述連接不會(huì)干擾所述分子的相應(yīng)活性。
所述分子可通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的任何方法連接。通?？蓪Onc直接或通過接頭(間隔基)與配體結(jié)合。但是，若rOnc和配體或其他治療藥物都是多肽，優(yōu)選重組表達(dá)作為單鏈融合蛋白的嵌合分子。
在一實(shí)施方案中，將rOnc分子與另一分子(如細(xì)胞毒素、標(biāo)記、配體或藥物或脂質(zhì)體)化學(xué)結(jié)合?；瘜W(xué)結(jié)合分子的方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。
將藥物與抗體或其他多肽導(dǎo)向分子相連的方法隨所述藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)而不同。通常多肽含有各種功能基團(tuán)；如羧基(COOH)或游離胺基團(tuán)(-NH2)；它們可與rOnc分子上的適宜官能團(tuán)反應(yīng)以便將其他分子結(jié)合到其上。
或者，可將配體和/或rOnc分子衍生以便與其他反應(yīng)性官能接觸或與其相連。衍生作用涉及連接許多接頭分子中的任何一個(gè)，如可從PierceChemical Company,Rockford Illinois得到的接頭分子。
本文所用的“接頭”是用于連接兩個(gè)分子的分子。所述接頭能夠在兩個(gè)分子間形成共價(jià)鍵。適宜的接頭是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的，包括(但不限于)直鏈或支鏈碳接頭、雜環(huán)碳接頭，或肽接頭。若兩個(gè)分子都是多肽，可將所述接頭通過其側(cè)翼基團(tuán)(如通過連接半胱氨酸的二硫鍵連接)與組成型氨基酸相連。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將所述接頭與末端氨基酸的α碳氨基和羧基相連。
可以使用雙功能接頭以形成所需的免疫結(jié)合物，所述雙功能接頭含有一個(gè)與特定試劑上的基團(tuán)反應(yīng)的功能基團(tuán)，和與抗體反應(yīng)的另一基團(tuán)?；蛘?，衍生作用涉及配體的化學(xué)處理，如用高碘酸鹽進(jìn)行糖蛋白抗體糖部分的乙二醇裂解以產(chǎn)生游離的醛基?？蓪⒖贵w上的游離醛基與試劑上的游離胺或肼基團(tuán)反應(yīng)以便將所述試劑結(jié)合到其上。(參見美國專利4671958)。在多肽如抗體或抗體片段上產(chǎn)生游離巰基的方法是熟知的(參見美國專利4659839)。
將各種化合物包括放射性核素金屬螯合劑、毒素和藥物與蛋白質(zhì)如抗體相連的許多方法和接頭分子是已知的。參見例如，歐洲專利申請(qǐng)188,256；美國專利4671958、4659839、4414148、4699784；4680338；4569789和4589071；以及Borlinghaus等癌癥研究47:4071-4075(1987)(所述文獻(xiàn)引入本文作為參考)。具體地說，各種免疫毒素的生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域熟知的，并可見于例如“單克隆抗體.毒素連接物瞄準(zhǔn)奇異的子彈”Thorpe等，臨床醫(yī)學(xué)中的單克隆抗體，學(xué)術(shù)出版社，pp.168-190(1982)；Waldmann,科學(xué)，252:1657(1991)；美國專利4545985和4894443(所述文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
在某些情況下，當(dāng)嵌合分子已到達(dá)其靶位點(diǎn)時(shí)，需要使rOnc與配體分離。因此，可以使用含有在靶位點(diǎn)附近可裂解之鍵的嵌合結(jié)合物，以便在靶位點(diǎn)釋放效應(yīng)物。通過酶促活性或免疫結(jié)合物在靶細(xì)胞內(nèi)或靶位點(diǎn)附近所處的條件來促進(jìn)所述鍵的裂解，以從配體中釋放所述試劑。當(dāng)靶位點(diǎn)是腫瘤時(shí)，可以使用在腫瘤位點(diǎn)存在的條件下(如當(dāng)與腫瘤相關(guān)酶或酸性pH接觸時(shí))可裂解的接頭。
許多不同的可裂解接頭是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的。參見美國專利4619492；4542225和4625014。從這些接頭基團(tuán)中釋放試劑的機(jī)制包括例如照射光敏感的鍵和酸摧毀的水解作用。例如美國專利4671958中描述了免疫結(jié)合物，所述結(jié)合物含有在體內(nèi)靶位點(diǎn)通過患者補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白水解酶可裂解的接頭。就大量已經(jīng)報(bào)道的用于將各種放射性診斷化合物、放射性治療化合物、藥物、毒素和其他的試劑與抗體相連的方法而言，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員能夠確定用于將給定試劑與抗體或其他多肽相連的適宜方法。rOnc分子或融合蛋白的生產(chǎn)
若所需的分子相對(duì)較短(即不到約50個(gè)氨基酸)，則可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)肽合成技術(shù)合成它們。若所需的兩個(gè)分子相對(duì)短，則可將嵌合分子合成為單個(gè)連續(xù)多肽。或者，將所述分子分別合成，然后通過將一個(gè)分子的氨基末端與另一分子的羧基末端縮合形成肽鍵而將其融合。或者，可將所述分子與肽間隔基分子的一端縮合，由此形成連續(xù)的融合蛋白。
固相合成法是用于化學(xué)合成本發(fā)明多肽的優(yōu)選方法，在所述固相合成法中，所述序列的C末端氨基酸與不可溶的支持物相連，然后依次加入序列中的剩余氨基酸。用于固相合成法的技術(shù)由Barany和Merrifield,固相肽合成；pp3-284肽合成，生物學(xué)，Vol.2肽合成的具體方法，A部分，Merrifiels等，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，85:2149-2156(1963)和Stewart等，固相肽合成，第二版Pierce Chem.Co.,Rockford,Ull.(1984)(所述文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用重組DNA方法合成本發(fā)明的嵌合融合蛋白。這通常涉及產(chǎn)生編碼融合蛋白的DNA序列，將所述DNA放在表達(dá)盒中并置于特定啟動(dòng)子的控制下，在宿主中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，分離表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后如果需要將所述蛋白質(zhì)復(fù)性。
編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA以及rOnc分子本身可通過任何適宜的方法制備，包括如適宜的序列的克隆和限制性消化，或通過Narang等(酶學(xué)方法68:90-99(1979)；)的磷酸三酯法、Brown等(酶學(xué)方法68:109-151(1979)；)的磷酸二酯法；Beaucage等(Tetra.Lett.,22:1859-1862(1981)；)的二乙基亞磷酰胺法以及美國專利4458066中的固體支持法直接化學(xué)合成(所有文獻(xiàn)均引入本文作為參考)。
以化學(xué)合成法生產(chǎn)單鏈寡核苷酸。通過與互補(bǔ)序列雜交，或通過用所述單鏈作為模板，用DNA聚合酶通過聚合反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到盡管DNA的化學(xué)合成法限于約100個(gè)堿基的序列，但通過連接較短的序列可以獲得較長的序列。
或者，克隆亞序列，然后用適宜的限制酶裂解所述適宜的亞序列。然后連接所述片段以產(chǎn)生所需的DNA序列。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用DNA擴(kuò)增法如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA或rOnc分子。如果將兩個(gè)分子連在一起，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以預(yù)料到所述分子可以通過由一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的肽間隔基分開。通常所述間隔基除連接蛋白質(zhì)或保持某種最小距離或在它們之間的其它空間關(guān)系外，沒有特定的生物活性。但是，可以選擇間隔基的氨基酸組成以影響所述分子的某些特性如折疊、凈電荷或疏水性。
編碼rOnc分子或融合蛋白的核酸序列可以在各種宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、其他細(xì)菌宿主、酵母和各種高等真核細(xì)胞如COS、CHO和HeLa細(xì)胞系以及骨髓瘤細(xì)胞系中表達(dá)。將重組蛋白基因與用于各宿主的適宜的表達(dá)控制序列可操作相連。對(duì)于大腸桿菌而言，包括啟動(dòng)子如T7、trp或λ啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)并優(yōu)選包括轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。對(duì)于真核細(xì)胞而言，控制序列包括啟動(dòng)子并優(yōu)選包括衍生于免疫球蛋白基因、SV40、巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子等，以及聚腺苷酸化序列，并可包括剪接供體和受體序列。
通過熟知的方法如用于大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化和用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的磷酸鈣處理和電穿孔，可將本發(fā)明的表達(dá)載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到所選的宿主細(xì)胞中?？赏ㄟ^質(zhì)粒所含的基因如amp,gpt,neo和hyg基因所賦予的抗生素抗性篩選用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
表達(dá)后，按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法包括硫酸銨沉淀、親和柱層析、柱色譜純化、凝膠電泳等(參見R.Scopes,蛋白質(zhì)純化，Springer-Verlag,N.Y.(1982),Deutscher,酶學(xué)方法Vol.182蛋白質(zhì)純化指南，AcademicPress,Inc.N,Y,(1990))純化重組rOnc或融合蛋白。對(duì)于藥物用途來說，具至少約90-95％均一性的基本純組合物是優(yōu)選的，98-99％或更高均一性的組合物是最優(yōu)選的。在按照需要部分純化或達(dá)到均一后，在治療中可使用所述多肽。
因此，本發(fā)明還提供了含上述所述核酸序列的宿主細(xì)胞和表達(dá)載體。
此外，本發(fā)明包括用與配體相連的rOnc以產(chǎn)生本發(fā)明的選擇性細(xì)胞毒性試劑，從而選擇性殺死細(xì)胞的方法。所述方法包括將所述待殺死的細(xì)胞與本發(fā)明含配體結(jié)合部分的細(xì)胞毒性試劑接觸，所述配體結(jié)合部分特異性地將所述試劑傳遞到待殺死的細(xì)胞。可將本發(fā)明的所述方法用于通過選擇性殺死不想要的細(xì)胞類型(如在將骨髓移植到通過照射而部分切除骨髓的患者前殺死骨髓中不想要的細(xì)胞類型)而進(jìn)行體外細(xì)胞分離，或用于殺死引起移植物抗宿主病的白血病細(xì)胞或T細(xì)胞。
對(duì)于體內(nèi)使用方法而言，優(yōu)選在該方法中所用試劑的哺乳動(dòng)物蛋白對(duì)于所述試劑所打算應(yīng)用的種來說是內(nèi)源的。對(duì)用于人體的來說，所述細(xì)胞毒性試劑優(yōu)選是含人源化嵌合抗體和人源化rOnc的融合蛋白。本發(fā)明的具體體內(nèi)方法包括用于化療減輕哺乳動(dòng)物中癌癥的方法，所述方法包括施用細(xì)胞毒性量的本發(fā)明的選擇性細(xì)胞毒性試劑。所述方法特別適用于治療對(duì)細(xì)胞毒性試劑敏感的腫瘤。特別適用的腫瘤包括胰腺、結(jié)腸、乳腺和腎腫瘤。藥物組合物
本發(fā)明的rOnc分子和含有它們的融合蛋白可用于胃腸外、局部、口服或局部給藥，如通過氣溶膠或經(jīng)皮以用于預(yù)防和/或治療。根據(jù)給藥方法，可將藥物組合物以各種單位劑量形式給藥。例如，適用于口服給藥的單位劑量形式包括粉劑、片劑、粒劑、膠囊和錠劑。應(yīng)認(rèn)識(shí)到當(dāng)口服給藥時(shí)，必須要使本發(fā)明的主體分子和融合蛋白以及藥物組合物不被消化。這通常是通過將所述蛋白質(zhì)與一組分復(fù)合以使其對(duì)酸和酶促水解產(chǎn)生抗性，或通過將所述蛋白質(zhì)包裝在有適宜抗性的載體如脂質(zhì)體中而做到的。保護(hù)蛋白質(zhì)不被消化的方法是本領(lǐng)域熟知的。
本發(fā)明的藥物組合物特別適用于胃腸外給藥，如靜脈內(nèi)給藥或施用到體腔或器官的腔內(nèi)。用于給藥的組合物通常含有溶解在可藥用載體，優(yōu)選含水載體中的嵌合分子的溶液?？梢允褂酶鞣N含水載體如緩沖鹽水等。這些溶液是無菌的，并通常不含不想要的物質(zhì)?？赏ㄟ^常規(guī)的熟知的滅菌技術(shù)將這些組合物滅菌。按接近生理?xiàng)l件的需要，所述組合物可含有藥用上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑等，如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。治療分子在這些制劑中的濃度可以有很大的變化，并主要以液體體積、粘度、體重等為基礎(chǔ)，根據(jù)所選的特定給藥方式和患者的需要來選擇。
因此，用于靜脈內(nèi)給藥的典型藥物組合物是大約0.1-10mg/患者/天?？梢允褂脧?.1-100mg/患者/天的劑量，特別是當(dāng)將藥物施用到隔離的位點(diǎn)，而不是到血液中，如施用到體腔或器官腔內(nèi)時(shí)。制備胃腸外可給藥的組合物的實(shí)際方法是本領(lǐng)域已知的或?qū)Ρ绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的，詳細(xì)地描述于諸如Remington’s Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1990)這樣的文獻(xiàn)中。
可施用含本發(fā)明rOnc分子或融合蛋白或其混合物(即含有其他蛋白質(zhì))的組合物以用于治療。在治療應(yīng)用中，將組合物以細(xì)胞毒性量、足以殺死特定細(xì)胞的量施用給患病的患者。將足以達(dá)到該目的的量定義為“治療有效量”。對(duì)于所述用途有效的量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者的一般健康狀況。
根據(jù)患者的需要和可耐受的劑量和頻率，可將所述組合物單次或多次給藥。在任何情況下，所述組合物應(yīng)提供足量的本發(fā)明蛋白質(zhì)以有效治療患者。
本文引用的所有專利、申請(qǐng)和文獻(xiàn)均引入本文作為參考。提供下列實(shí)施例僅僅是為了說明的目的，而不以任何方式對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例
實(shí)施例Ⅰ克隆并表達(dá)rOnc和含EDN的Onc結(jié)合物
A材料按所述，天然ONCONASE(nOnc)(SEQ ID NO:1)Ardelt等(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志256,245-251和重組人EDN(rEDN)(SEQ ID NO:9)Newton等(1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745是分別從美洲豹蛙卵母細(xì)胞，NASCO,Fort Atkinson,WI和大腸桿菌中純化的。由Assay Research,Inc.,college Park,MD制備抗所述變性蛋白質(zhì)的抗體。完成PCR和直接克隆PCR產(chǎn)物的試劑是分別從Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT和Invitrogen,San diego,CA得到的。用于核糖核酸酶實(shí)驗(yàn)的底物是從Sigma,St.Louis,MO和BoehringerMannheim,Indianapolis,IN購買的。Newton等(生物化學(xué)35:545(1996))描述了重組蛋白的構(gòu)建和表達(dá)中所用的材料和其來源以及兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物。
B．PCR克隆Onconase按標(biāo)準(zhǔn)方法用蛋白酶K(Maniatis,T,Fritsch,E.F.&Sambrook,J.分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1982))分離美洲豹蛙基因組DNA。設(shè)計(jì)一系列簡并引物以對(duì)應(yīng)于公開的nOnc序列(Ardelt等(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志256,245-251)各區(qū)域中的氨基酸。用15μg在100μl中的基因組DNA，按制造商的說明完成PCR反應(yīng)。除DNA外，將所有試劑混合，然后在95℃保溫8分鐘以便在加入Taq DNA聚合酶前時(shí)任何殘留的蛋白酶K失活。完成40個(gè)循環(huán)的PCR，每個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，然后在72℃引物延伸2分鐘。數(shù)對(duì)引物產(chǎn)生預(yù)期大小的產(chǎn)物。用編碼氨基酸殘基15-23的前向引物(AG(GA)GATGT(GT)GATTG(TC)GATAA(CT)ATCATG)(SEQ ID NO:35)和編碼氨基酸殘基90-98的反向引物(TGTGA(AG)AA(CT)CAGGC(AC)CC(TA)GT(GT)CA(CT)TTT)(SEQ ID NO:36)得到最大的產(chǎn)物(252bp)。通過TA克隆將該片段亞克隆到PCTTMⅡ中，然后直接將攜帶適宜大小插入片段的克隆測序，發(fā)現(xiàn)編碼nOnc的16-98氨基酸殘基(Rana 9)(SEQID NO:2)。將相應(yīng)的核酸序列列在SEQ ID NO:37中。
C．質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)、蛋白質(zhì)純化和體外實(shí)驗(yàn)在N末端用nOnc的氨基酸殘基1-15或EDN的氨基酸殘基-1-21，在C末端用nOnc的氨基酸殘基99-104，通過重疊延伸(Horten等(1990)生物技術(shù)8,528-532)，用剪接PCR技術(shù)重構(gòu)建nOnc的N和C末端。將組裝的基因插入細(xì)菌表達(dá)載體pET-11d(Novagen Madison,WI)中的XbaI和BamHI位點(diǎn)之間。所有過程均基本按Newton等((1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745)所述完成。按供應(yīng)商(Novagen Madison,WI)的說明在BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)所述質(zhì)粒。在應(yīng)用到CM-Sephadex C-50柱(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)前，按Newton等((1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745)所述將融合蛋白從包函體中分離，變性、復(fù)性并透析。用在20mM Tris-Cl,pH7.5中含10％甘油的NaCl梯度(0-0.5M)洗脫蛋白質(zhì)。在用5％甲酸平衡并洗脫的Sephadex-100上通過大小排阻色譜使最終的純度＞95％。收集蛋白質(zhì)，用YM3膜(或凍干)(Amicon,Beverly,MA)通過amicon超濾濃縮，然后在分析前，用含10％甘油的20mM Tris-Cl,pH7.5透析。
按公開的方法(Newton等(1996)生物化學(xué)35:545-553)，通過在37℃形成高氯酸可溶的核苷酸，按照公開的方法(Newton等(1994)神經(jīng)科學(xué)雜志14,538-544)用高分子量RNA和tRNA確定核糖核酸酶活性。用poly(A,C)UpG和polyU，按照Deprisco等和Libonati和FloridaDeprisco等，(1984)Biochimica et Biophysica Acta 788:356-363；Libonati,M.和Floridi,A.(1969)歐洲生物化學(xué)雜志.8:81-87所述經(jīng)分光光度法檢測核糖核酸酶活性。簡單地說，通過測量在260nm光吸收值的增加來檢測活性。保溫混合物在25℃(1ml 10mM 咪唑，0.1M NaCl,pH6.5或pH7)含有底物和適宜量的酶溶液。按前述進(jìn)行體外翻譯試驗(yàn)(St.Clair等(1987)美國科學(xué)院學(xué)報(bào)84,8330-8334和細(xì)胞活性試驗(yàn)(Pearson等，(1991)J.Natl.Cancer Inst.83:1386-1391，使用(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑嗡溴化物；噻唑基蘭)(MMT)(Mossman,T.(1983)免疫學(xué)方法雜志65:55-63))。
D．[Met-(-1)]rOnc和rOnc嵌合體的克隆和表達(dá)設(shè)計(jì)8個(gè)不同的寡核苷酸引物以對(duì)應(yīng)于nOnc主要氨基酸結(jié)構(gòu)中的特定區(qū)域(Ardelt等(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志256,245-251)，然后按上述用熱循環(huán)儀完成美洲豹蛙基因組DNA的擴(kuò)增。分別對(duì)應(yīng)于nOnc的氨基酸殘基15-23和90-98的引物對(duì)產(chǎn)生252bp的片段。將代表Rana克隆9的PCR產(chǎn)物克隆到PCRTMⅡ中，序列分析證明所述PCR產(chǎn)物編碼從氨基酸殘基16-98(圖1)的Onc(共104個(gè)氨基酸)。
將完整的重組體Onc(rOnc)基因(SEQ ID NO:38)通過PCR延伸構(gòu)建，然后用前述方法(Newton等(1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745)克隆到表達(dá)載體中。通過分別插入nOnc的前15個(gè)和后16個(gè)氨基酸殘基得到rOnc的氨基和羧基末端。在圖2A的上部描述了半合成rOnc基因的構(gòu)型。設(shè)計(jì)引物以便與Rana克隆9PCR產(chǎn)物的DNA序列重疊。在BL21(DE3)大腸桿菌中表達(dá)質(zhì)粒，在應(yīng)用到CM SephadexC-50柱前按Newton等(1994)生物學(xué)化學(xué)雜志269,26739-26745所述從包函體中分離重組蛋白質(zhì)。通過大小排阻色譜使最終的純度＞95％。在該表達(dá)系統(tǒng)中，從所述細(xì)菌中得到的rOnc在氨基末端[Met-(-1)]含有額外的甲硫氨酸(SEQ ID NO:39)，與天然蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:1)真正的焦谷氨?；被釟埢?＜Glu-1)相反。
為了人源化[Met-(-1)]rOnc而同時(shí)保持活性位點(diǎn)殘基的排列(圖2B)，用編碼人嗜酸性粒細(xì)胞RNase、EDN(圖2B,rEDN(1-21)Onc)前21個(gè)氨基酸殘基的寡核苷酸再構(gòu)建Rana克隆9的N末端。PCR克隆會(huì)導(dǎo)致序列錯(cuò)誤。的確，編碼EDN(1-21)Onc基因的DNA序列含有A到G的取代，在所述嵌合體的位置26(nOnc中的殘基20)導(dǎo)致從Asp到Gly的改變，并在圖2B中命名為rEDN(1-21)rOncG26。將含編碼rEDN(1-21)Onc的另一質(zhì)粒測序，發(fā)現(xiàn)其含有正確的DNA序列。由于突變導(dǎo)致用小的中性殘基取代了帶電荷的氨基酸，所以還表達(dá)了突變嵌合體并鑒定了其活性。另外，突變[Met-(-1)]rOnc使其位置20的Asp改變?yōu)镚ly(rOncGly20，圖2A和B)。
E．Onc、EDN、[Met-(-1)]rOnc和雜種rOnc蛋白質(zhì)的核糖核酸酶活性nOnc(Lin,J.J.等(1994)生物化學(xué)和生物物理研究通訊204,156-162)和EDN(Saxena等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267,21982-21986)均是在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，通過依賴于其相應(yīng)的溶核活性的機(jī)制的有效的體外翻譯抑制劑。如表1所述，如通過[35S]甲硫氨酸摻入到酸可沉淀的蛋白質(zhì)中所測量的，將nOnc或EDN加入兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中會(huì)引起蛋白質(zhì)合成的抑制。而nOnc和EDN均會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成，IC50s分別為0.2和1.3ng/nl。[Met-(-1)]rOnc、[Met-(-1)]rOncG20和rEDN(1-21)rOncG26的效力相當(dāng)?shù)?IC50s分別為98、28和28ng/ml)。在該實(shí)驗(yàn)中，活性最差的RNase是rEDN(1-21)rOnc,IC50為1600ng/ml。胎盤核糖核酸酶抑制劑(PRI)與EDN緊密結(jié)合并抑制其酶活性Sorrentino等((1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267,14859-14865)，而nOnc活性幾乎不受PRI的影響(Wu,Y.N.等(1993)生物學(xué)化學(xué)雜志268,10686-10693)，表1描述了其與EDN和胰腺RNase超家族其他成員的同源性。就此而言，令人感興趣的是，rEDN(1-21)rOnc的活性，與nOnc一樣幾乎不受PPI的影響，而含有Gly突變的雜種RNase現(xiàn)在的行為更象EDN，即其活性顯著受PRI的抑制(21倍)。
用高和低分子量底物，用實(shí)驗(yàn)評(píng)估這些蛋白質(zhì)的核糖核酸酶活性。如表2所示，EDN和nOnc有不同的底物特異性，與以前公開的結(jié)果一致(Ardelt等(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志256,245-251,Sorrentino等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267,14859-14865,Ardelt等(1994)蛋白質(zhì)科學(xué)3，增刊1,137)。與表1的結(jié)果一致，[Met-(-1)]rOnc(SEQ ID NO:39)和rEDN(1-21)rOnc對(duì)所有底物的活性很差(在所用的實(shí)驗(yàn)條件下檢測不到活性或活性極低)。令人驚奇的是，含Gly的雜種蛋白質(zhì)特別是在EDN酶活性的最佳條件下，顯示有顯著的核糖核酸酶活性。EDN在中性pH的活性更高(Sorrentino等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志267,14859-14865)如表2所見，在pH7.5時(shí)，與pH6時(shí)相比，tRNA的EDN降解顯著提高(42.3倍)。同樣，與EDN的行為類似，含Gly的雜種蛋白質(zhì)隨pH從6變化到7.5，其活性提高(21.7倍)，而nOnc在pH7.5時(shí)失去活性，這與其6-6.5的最佳pH相一致(Ardelt等(1991)生物學(xué)化學(xué)雜志256,245-251,Ardelt等(1994)蛋白質(zhì)科學(xué)3，增刊1,137)。含Gly的雜種蛋白質(zhì)具有提高的類似EDN的活性的跡象還通過其與EDN的優(yōu)秀底物poly(A,C)的行為而得到證實(shí)。如表2所示，僅rEDN(1-21)rOncG26表達(dá)與該底物幾乎50％的EDN酶活性，而其他RNase的活性幾乎可以忽略。用poly(U)可以觀察到相似的結(jié)果。相反，rEDN或rEDN(1-21)rOncG26與UpG(最佳的Oncanase底物)(Ardelt等(1994)蛋白質(zhì)科學(xué)3，增刊1.1,137)檢測不到活性。總之，[Met-(-1)]rOnc和rEDN(1-21)rOnc的酶活性比nOnc或rEDN低。當(dāng)用EDN的特定底物和最佳條件檢測時(shí)，盡管rEDN(1-21)rOncG26表達(dá)顯著的EDN-類似酶活性，但在任何實(shí)驗(yàn)中，它的活性都不如EDN。這可能是由于受損的酶底物相互作用或使用了該雜種酶的次最佳檢測條件而導(dǎo)致的。
表1與rEDN或nOnc相比，在存在或不存在PRI的條件下，[Met-(-1)]rOnc和雜種蛋白質(zhì)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中的活性
IC50a(ng/ml)
(-)PRI (+)PRI 差異倍數(shù)
nOnc 0.2 0.24 1.2
rEDN 1.3 ＞40 ＞30.7[Met-(-1)]rOnc 96140 1.4[Met-(-1)]rOncG202824 0.9 rEDN(1-21)rOnc 1600 3200 2 rEDN(1-21)rOncG26 28600 21
aIC50是在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物中抑制蛋白質(zhì)合成達(dá)到50％所需的蛋白質(zhì)濃度。數(shù)據(jù)點(diǎn)是至少3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表2 RNase對(duì)不同底物的活性
RNase(活性單位/mg蛋白質(zhì)) 底物 測量pH rEDN nOnc [Met-(-1)rOnc] rEND1-21rOnc rEND1-21rOncG26酵母RNAa6.06000560 0.01 8 120 tRNAa,c6.01100390 12 4 340 tRNAa,c7.546000 6050 130 7400 poly(A,C)b 7.080000.04 54.5 3900 UpGb 6.50.050.18＜0.01 ＜0.01＜0.01 poly Ub7.016.50.15 0.20 0.35 4.5
a通過高氯酸可溶性核苷酸的形成定量RNase活性。將單位定義為從實(shí)驗(yàn)的線性部分的斜率計(jì)算的每分鐘A260的改變。各值是不同實(shí)驗(yàn)中的2-3個(gè)檢測的平均值。
b如在材料和方法部分所述，按Deprisco等(1984)和Libonati和Floridi(1969)所述的方法完成分光光度檢測。將單位定義為從實(shí)驗(yàn)的線性部分的斜率計(jì)算的每分鐘A260的改變。各值是2或多個(gè)結(jié)果的平均值。
c[Met-(-1)]rOncG20沒有可檢測的活性。
F在4種人腫瘤細(xì)胞系中用Rnase抑制蛋白質(zhì)合成用MTT實(shí)驗(yàn)，通過確定細(xì)胞生存力，將[Met-(-1)]rOnc和兩種雜種Rnase的細(xì)胞毒性作用與rEDN和nOnc進(jìn)行比較。如圖3所示，在所有4種人類腫瘤細(xì)胞系中nOnc降低了腫瘤細(xì)胞的生存力。在所示濃度，rEDN對(duì)任何細(xì)胞系的生存力均沒有影響。與nOnc相反，在所有4種細(xì)胞系中[Met-(-1)]rOnc和[Met-(-1)]rOncG20的細(xì)胞毒性始終很低。然而，在ACHN、人腎癌細(xì)胞中，rEDN(1-21)rOncG26的細(xì)胞毒性比nOnc高，在MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性與nOnc相同。盡管分別在SF-539和HS 578T人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞系中，rEDN(1-21)rOncG26的活性比nOnc低，但是仍比[Met-(-1)]rOnc或在位置26含Asn的rEDN(1-21)rOnc蛋白質(zhì)的活性高。
G雜種Rnase的結(jié)構(gòu)分析以對(duì)Onc(Mosiann S.C.,Ardelt W.,James M.N.g.,(1994),P-30蛋白質(zhì)，一種具有抗腫瘤活性的兩棲動(dòng)物核糖核酸酶的精細(xì)1.7A X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，(分子生物學(xué)雜志236,1141-1153))和EDN(Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,重組的嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒素在1183A分辨率下的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué)雜志)的結(jié)構(gòu)的序列對(duì)比為基礎(chǔ)，建造雜種Rnase的模型。用ALIGN(Satow Y.,Cohen G.H.,Padlan E.A.,Davies D.R.,(1986),分子生物學(xué)雜志190,593-604)完成這點(diǎn)以及隨后的序列對(duì)比。
H建造雜種Rnase的結(jié)構(gòu)模型以Cα痕跡排列為基礎(chǔ)，疊加Onc和EDN的坐標(biāo)。當(dāng)比較兩種結(jié)構(gòu)(90Cα原子對(duì)1.44A的球形r.m.s.d.)時(shí)，在保守區(qū)特別是活性位點(diǎn)中的殘基幾乎沒有移位。人工重建雜種蛋白質(zhì)的模型并用TOM(Cambillau C.,Horjales E.,(1987),J.Mol Graph 5,174-177)幾何規(guī)則化。隨后，確定rEDN(1-21)rOnc和rEDN(1-21)rOncG26模型的所有非氫原子的總15A2的B因子，然后用程序XPLOR(BrungerA(1992)XPLOR用于X射線晶體學(xué)和NMR的系統(tǒng)，New Haven:YaleUniversity Press)分別進(jìn)行300循環(huán)的位置能量最小化。在這兩種情況下，最小產(chǎn)生實(shí)際相同的結(jié)構(gòu)，以Cα痕跡排列為基礎(chǔ)，對(duì)于突變殘基26的Cα來說，最高距離0.44。用PROCHECK(Laskowshi R.A.,MacArthur M.W.,Moss D.S.,Thornton J.M.,(1993),應(yīng)用晶體學(xué)雜志26,283-291)評(píng)估最終模型的幾何性質(zhì)。
由于殘基26距活性位點(diǎn)遠(yuǎn)，從中性蛋白質(zhì)的模型中，在含Gly和Asp的雜種RNase之間，產(chǎn)生活性上顯著差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)不明顯。當(dāng)在雜種蛋白質(zhì)模型的結(jié)構(gòu)上疊加與五核苷酸(Fontecilla-Camps J.C.,deLorens R.,leDu M.H.,Cuchillo C.M.,(1994),生物學(xué)化學(xué)雜志269,21526-21531)復(fù)合的高度同源的RNase A的結(jié)構(gòu)時(shí)，觀察到所述核苷酸也遠(yuǎn)離突變區(qū)。但是，在不同RNase中多核苷酸鏈的排列并不一定吻合。在EDN的結(jié)構(gòu)中，除在活性位點(diǎn)中的外，還發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)硫離子(Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,重組嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒素在1.83A分辨率下的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué)雜志)。所述第二個(gè)硫可能取代來自被裂解核苷酸的磷，但在RNase A-五核苷酸復(fù)合物中的等同位置上，沒有磷離子。此外，該復(fù)合物中的一個(gè)磷酸與Lys-66(在Onc沒有配對(duì)物的一個(gè)氨基)形成一個(gè)鹽鍵，因?yàn)樗挥谠谶@兩個(gè)分子中有不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的環(huán)中。因此，無論在嵌合體中，Asp和Gly突變體之間的酶活性差異是否與同底物的結(jié)合親和性方面的變化有關(guān)仍是未解決的問題。
盡管尚不清楚兩個(gè)EDN-Onc雜種活性方面差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但rEDN(1-21)OncG26雜種類似EDN的行為可能是由于N末端區(qū)的構(gòu)型造成的，因?yàn)樵趎Onc中的焦谷氨酸和rEDN中的Lys-1均位于活性位點(diǎn)區(qū)(Mosiann S.C.,Ardelt W.,James M.N.g.,(1994),P-30蛋白質(zhì)，一種具有抗腫瘤活性的兩棲動(dòng)物核糖核酸酶的精細(xì)的1.7A X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)(分子生物學(xué)雜志236,1141-1153；Mosiann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,X-ray重組嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒素在1.83A分辨率下的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué)雜志)。另外，在[Met-(-1)]rOnc中導(dǎo)入Gly并沒有顯著影響酶活性。在RNase A的B1亞位點(diǎn)中U優(yōu)于C是與特定殘基(Asp-83)的存在有關(guān)(DelCardayre S.B.,Raines R.T.,(1995),殘基-殘基氫鍵介導(dǎo)核糖核酸酶A的核苷酸特異性，分子生物學(xué)雜志252,328-336)。在nOnc中的相應(yīng)殘基也是天冬氨酸(Asp-67)，而在EDN的該位置由組氨酸占據(jù)(His-82)。EDN對(duì)poly(A,C)更有活性，這表明它在B1亞位點(diǎn)中“優(yōu)選”C，可能是因?yàn)樗信cnOnc和RNase A中的天冬氨酸相反的組氨酸殘基。綜合考慮，這可以解釋相對(duì)于rEDN，含Gly的雜種的活性降低，因?yàn)楦鶕?jù)所述假設(shè)，rOnc序列中Asp殘基的存在比C更有利于U的結(jié)合。就PRI抑制作用的差異而言，在EDN-Onc和RNase A之間疊加表明EDN-Onc嵌合體中的Asp-26在與RNase A Asp-27等同的位置，已經(jīng)報(bào)道Asp-27與PRI接觸(KobeB.,Deisenhofer J.,(1995),自然374,183-186)。另外，兩個(gè)嵌合體中的Asp-24與該區(qū)很接近。因此，該區(qū)負(fù)電荷的積累可能抑制了抑制劑的結(jié)合。如果是這樣的話，Gly取代Asp減少了負(fù)電荷并保留了結(jié)合能力。
實(shí)施例Ⅱ rOnc-抗體融合蛋白
已經(jīng)生產(chǎn)了其他的rOnc-抗體和配體蛋白并且有高活性。E6FB[Met-(-1)]SerrOnc是一個(gè)rOnc分子，含有SEQ ID NO:40所列的核酸序列和SEQ ID NO:41所列的氨基酸序列并包括來自抗體E6，一種抗運(yùn)鐵蛋白受體抗體的Fv序列。E6的序列在SEQ ID NO:41中的氨基酸位置1-237。“FB”指用于連接抗體和所述分子rOnc部分的接頭，見SEQ ID NO:40中的核酸位置712-750。該分子包括在氨基酸位置252代替Glu的Ser。E6FB[Met-(-1)]Glu rOnc指SEQ ID NO:40中的序列。還制備了相似的雜種分子。Met-NLS(信號(hào)肽)-Gln-rOncFBE6的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:42和43。將另一E6/rOnc分子命名為Met-Ser-rOncA87FBE6并可見于SEQ ID NO:44和45?！癆87”指在氨基酸位置87的Ala。
Met-Ser-rOnc-Ang-FBE6列于SEQ ID NO:46和47。
E6FB Met-Ser-rOnc列于SEQ ID NO:48和49。
Met-Glu-rOnc FBE6列于SEQ ID NO:50和51。
Met-Ser-rOnc FBE6列于SEQ ID NO:50和51。
除絲氨酸取代在氨基酸位置2的Glu外。
MOC31和MOC162指抗17-1-Apancarinoma抗原的抗結(jié)腸癌抗體，所述抗原是從Hennie Hoogenboom博士處得到的。將這些抗體的Fv區(qū)與rOnc融合。MetSerrOnc A87 FBMOC31的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:52和53。MOC31FB MetSerrOnc的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:54和55。MetSerrOnc FBMOC162的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO:56和57。
將配體IL2(白細(xì)胞介素2)也與rOnc重組融合。IL2 FBMetSerrOnc見SEQ ID NO:58和59。MetSerrOncFB IL2見SEQ ID NO:60和61。
按上述測量在SF539細(xì)胞(它攜帶運(yùn)鐵蛋白受體)中，[Met-(-1)Ser]rOnc、E6FB[Met-(-1)Ser]rOnc；[Met-(-1)Set]rOnc-AngFBE6和[Met-(-1)Glu]rOncFBE6構(gòu)建體的蛋白質(zhì)合成的抑制作用，并與nOnc進(jìn)行比較。結(jié)果列于表3。具體地說，三個(gè)E6構(gòu)建體具有很高水平的活性——相對(duì)于兩個(gè)非E6分子的差異高達(dá)45倍。也見圖5。制備相應(yīng)于SEQ IDNO:47氨基酸1-107的MetSerrOncAng分子。
表3修飾的rOnc和修飾的rOncFv對(duì)蛋白質(zhì)合成的活性Rnase IC50(nM)差異倍數(shù)nOnc 10 1[Met-(-1)Ser]rOnc 8 NSDE6FB[Met-(-1)Ser]rOnc 0.2245[Met-(-1)Ser]rOnc-AngFBE6 0.2737[Met-(-1)Glu]rOncFBE6 0.5020
表中所示濃度為在SF539人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制達(dá)到50％所需的濃度。NSD，沒有顯著差異。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人蘇姍娜·M·雷巴克；黛安娜·L·牛頓；劉易斯·博克；亞歷山大·沃達(dá)韋爾(ⅱ)發(fā)明名稱重組的核糖核酸酶蛋白(ⅲ)序列數(shù)39(ⅳ)通訊地址(A)收信人湯森和湯森和克魯(Townsend and Townsend and Crew)(B)街道One Marker Plaza,Stenart Street Tower(C)城市舊金山(D)洲加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編94105-1492(ⅴ)計(jì)算機(jī)可訊形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柮绹形唇o出(B)申請(qǐng)日尚未給定(C)分類號(hào)(ⅷ)代理人信息(A)姓名Weber,Ellen Lauver(B)登記號(hào)32,762(C)案卷/卷宗號(hào)015280-244000(ⅸ)電訊信息(A)電話(415)543-9600(B)電傳(415)543-5043(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度104個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..104(D)其它信息/標(biāo)記=nOnc/注=“來自美洲豹蛙的天然ONCONASE(注冊(cè)商標(biāo))”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注=“Xaa=焦谷氨酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Xaa Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp1 5 10 15Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp
20 25 30Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys
35 40 45Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr
50 55 60Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys65 70 75 80Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val
85 90 95His Phe val Gly Val Gly Ser Cys
100(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度83個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1.83(D)其它信息/注=“來自美洲豹蛙基因組DNA的Rana克隆9的肽”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys1 5 10 15Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
20 25 30Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
35 40 45Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu
50 55 60Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro65 70 75 80Val His Phe
(2)SEQ ID NO:3的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度28個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..28
(D)其它信息/注=“nOnc的N-末端序列，在1位由Glu取代了焦谷氨酸”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe
20 25
(2)SEQ ID NO:4的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..34
(D)其它信息/注=“重組嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(rEDN)的N-末端序列”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Gln Cys Thr Asn Ala Met Gln Val Ile Asn Asn
20 25 30
Tyr Gln
(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度28個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..28
(D)其它信息/注=“[Met-(-1)]rOncG20的N-末端序列，在[Met-(-1)]rOnc的20位含有Gly取代Asp的取代，并且沒有來自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe
20 25
(2)SEQ ID NO:6的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1.34
(D)其它信息/注=“rEDN1-21rOnc的N-末端序列，沒有來自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn
20 25 30
Leu Phe
(2)SEQ ID NO:7的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度34個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..34
(D)其它信息/注=“rEDN1-21rOncG26的N-末端序列，在rEDN1-21rOncG26的26位含有Gly取代Asp的取代，并且沒有來自大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的多余N-末端Met”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr Asn
20 25 30
Leu Phe
(2)SEQ ID NO:8的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度111個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1..111
(D)其它信息/注=“來自Rana catesbeiana的青蛙凝集素”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
Glu Asn Trp Ala Thr Phe Gln Gln Lys His Ile Ile Asn Thr Pro Ile
1 5 10 15
Ile Asn Cys Asn Thr Ile Met Asp Asn Asn Ile Tyr Ile Val Gly Gly
20 25 30
Gln Cys Lys Arg Val Asn Thr Phe Ile Ile Ser Ser Ala Thr Thr Val
35 40 45
Lys Ala Ile Cys Thr Gly Val Ile Asn Met Asn Val Leu Ser Thr Thr
50 55 60
Arg Phe Gln Leu Asn Thr Cys Thr Arg Thr Ser Ile Thr Pro Arg Pro
65 70 75 80
Cys Pro Tyr Ser Ser Arg Thr Glu Thr Asn Tyr Ile Cys Val Lys Cys
85 90 95
Glu Asn Gln Tyr Pro Val His Phe Ala Gly Ile Gly Arg Cys Pro
100 105 110
(2)SEQ ID NO9的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度134個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1..134
(D)其它信息/注=“人嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)毒素(EDN)”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Gln Cys Thr Asn Ala Met Gln Val Ile Asn Asn
20 25 30
Tyr Gln Arg Arg Cys Lys Asn Glu Asn Thr Phe Leu Leu Thr Thr Phe
35 40 45
Ala Asn Val Val Asn Val Cys Gly Asn Pro Asn Met Thr Cys Pro Ser
50 55 60
Asn Lys Thr Arg Lys Asn Cys His His Ser Gly Ser Gln Val Pro Leu
65 70 75 80
Ile His Cys Asn Leu Thr Thr Pro Ser Pro Gln Asn Ile Ser Asn Cys
85 90 95
Arg Tyr Ala Gln Thr Pro Ala Asn Met Phe Tyr Ile Val Ala Cys Asp
100 105 110
Asn Arg Asp Gln Arg Arg Asp Pro Pro Gln Tyr Pro Val Val Pro Val
115 120 125
His Leu Asp Arg Ile Ile
130
(2)SEQ ID NO:10的信息
(ⅰ)序列特征
(A)長度133個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)
(B)位置1..133
(D)其它信息/注=“人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白質(zhì)(ECP)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Arg Pro Pro Gln Phe Thr Arg Ala Gln Trp Phe Ala Ile Gln His Ile1 5 10 15Ser Leu Asn Pro Pro Arg Cys Thr Ile Ala Met Arg Ala Ile Asn Asn
20 25 30Tyr Arg Trp Arg Cys Lys Asn Gln Asn Thr Phe Leu Arg Thr Thr Phe
35 40 45Ala Asn Val Val Asn Val Cys Gly Asn Gln Ser Ile Arg Cys Pro His
50 55 60Asn Arg Thr Leu Asn Asn Cys His Arg Ser Arg Phe Arg Val Pro Leu65 70 75 80Leu His Cys Asp Leu Ile Asn Pro Gly Ala Gln Asn Ile Ser Asn Cys
85 90 95Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Gly Arg Arg Phe Tyr Val Val Ala Cys Asp
100 105 110Asn Arg Asp Pro Arg Asp Ser Pro Arg Tyr Pro Val Val Pro Val His
115 120 125Leu Asp Thr Thr Ile
130(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度125個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..125(D)其它信息/注=“牛源血管生成素(Ang)”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Ala Gln Asp Asp Tyr Arg Tyr Ile His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp1 5 10 15Ala Lys Pro Lys Gly Arg Asn Asp Glu Tyr Cys Phe His Met Met Lys
20 25 30Asn Arg Arg Leu Thr Arg Pro Cys Lys Asp Arg Asn Thr Phe Ile His
35 40 45Gly Asn Lys Asn Asp Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asn Gly Gln
50 55 60Pro Tyr Arg Gly Asp Leu Arg Ile Ser Lys Ser Glu Phe Gln Ile Thr65 70 75 80Ile Cys Lys His Lys Gly Gly Ser Ser Arg Pro Pro Cys Arg Tyr Gly
85 90 95Ala Thr Glu Asp Ser Arg Val Ile Val Val Gly Cys Glu Asn Gly Leu
100 105 110Pro Val His Phe Asp Glu Ser Phe Ile Thr Pro Arg His
115 120 125(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度124個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..124(D)其它信息/注=“牛精液RNase”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Lys Glu Ser Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Gly1 5 10 15Asn Ser Pro Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Leu Met Met Cys Cys
20 25 30Arg Lys Met Thr Gln Gly Lys Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val His
35 40 45Glu Ser Leu Ala Asp Val Lys Ala Val Cys Ser Gln Lys Lys Val Thr
50 55 60Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Lys Ser Thr Met Arg65 70 75 80Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys Ala
85 90 95Tyr Lys Thr Thr Gln Val Glu Lys His Ile Ile Val Ala Cys Gly Gly
100 105 110Lys Pro Ser Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
115 120(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度124個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..124(D)其它信息/注=“牛胰腺Rnase A”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Ser1 5 10 15Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Asn Tyr Cys Asn Gln Met Met Lys Ser
20 25 30Arg Asn Leu Thr Lys Asp Arg Cys Lys Pro Val Asn Thr Phe Val His
35 40 45Glu Ser Leu Ala Asp Val Gln Ala Val Cys Ser Gln Lys Asn Val Ala
50 55 60Cys Lys Asn Gly Gln Thr Asn Cys Tyr Gln Ser Tyr Ser Thr Met Ser65 70 75 80Ile Thr Asp Cys Arg Glu Thr Gly Ser Ser Lys Tyr Pro Asn Cys Ala
85 90 95Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Asn Lys His Ile Ile Val Ala Cys Glu Gly
100 105 110Asn Pro Val Val Pro Val His Phe Asp Ala Ser Val
115 120(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Met Lys Xaa Pro1(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Met Lys Pro Xaa 1(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Met Asn Xaa Pro 1(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Met Xaa Lys Pro(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Tyr或Thr”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Met Xaa Pro Lys1(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度321個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..321(D)其它信息/注=“MetSerOnc86Ang104”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:ATC TCA GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Ile Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT CAG TCA ATT TTC CGT CGT CCG321Val His Phe Val Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro
100 105(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Ile Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro
100 105(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度333個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..333(D)其它信息/注=“EDNGlyOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:ATG AAA CCG CCG CAG TTC ACT TGG GCT CAG TGG TTC GAA ACT CAG CAT 48Met Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His 1 5 10 15ATC AAC ATG ACT TCT CAG GAT GTT GAT TGT GGT AAT ATC ATG TCA ACA 96Ile Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr
20 25 30AAC TTG TTC CAC TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT144Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro
35 40 45GAG CCA GTG AAG GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG192Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val
50 55 60TTA ACT ACC TCT GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG240Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg 65 70 75 80CCT TGC AAG TAT AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT288Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr
85 90 95TGT GAA AAT CAG GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 333Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度111個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Met Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His 1 5 10 15Ile Asn Met Thr Ser Gln Asp Val Asp Cys Gly Asn Ile Met Ser Thr
20 25 30Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro
35 40 45Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val
50 55 60Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg 65 70 75 80Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr
85 90 95Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..315(D)其它信息/注=“MetTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:ATG TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Met Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ACT TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度105個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Met Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..315(D)其它信息/注=“MetSerrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:ATG TCA GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC AGT TTT ACT TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC 144Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT 192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA 240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA 288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度105個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Thr Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度318個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..318(D)其它信息/注=“MetLysTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:ATG AAA TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA 48Met Lys Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr 1 5 10 15AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC 96Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys
20 25 30AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC 144Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala
35 40 45ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG 192Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu
50 55 60TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA 240Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys 65 70 75 80TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA 288Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala
85 90 95CCA GTT CAT TTT GTT GGAGTT GGATCT TGT 318Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度106個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Met Lys Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr 1 5 10 15Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys
20 25 30Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala
35 40 45Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu
50 55 60Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys 65 70 75 80Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala
85 90 95Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度321個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..321(D)其它信息/注=“MetAlaAlaTyrrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:ATG GCT GCT TAT GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC 48Met Ala Ala Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn 1 5 10 15ACA AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC 96Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His
20 25 30TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG144Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys
35 40 45GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT192Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser
50 55 60GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT240Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr 65 70 75 80AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG288Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln
85 90 95GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT321Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Met Ala Ala Tyr Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn 1 5 10 15Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His
20 25 30Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys
35 40 45Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser
50 55 60Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr 65 70 75 80Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln
85 90 95Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度336個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..336(D)其它信息/注=“NLSMetSerrOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CCC AAG AAG AAG CGG AAG GTG ATG TCA GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA 48Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys 1 5 10 15AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA 96Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser
20 25 30ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT 144Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg
35 40 45CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT 192Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn
50 55 60GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC 240Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser 65 70 75 80AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA 288Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val
85 90 95ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT 336Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度112個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Ser Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys 1 5 10 15Lys His Ile Thr Asn Thr Arg Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser
20 25 30Thr Asn Leu Phe His Cys Lys Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg
35 40 45Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn
50 55 60Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser 65 70 75 80Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val
85 90 95Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105 110(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注=“Xaa=脂族氨基酸，Ala、Leu、Ile、Val或Pro”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/注=“Xaa=脂族氨基酸，Ala、Leu、Ile、Val或Pro”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注=“Xaa=Ser,Met,Cys,Ala或Gln”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33Cys Xaa Xaa Xaa1(2)SEQID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:34:Cys Val Ile Met
1(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:AGRGATGTKG ATTGYGATAA YATCATG(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:TGTGARAAYC AGGCMCCWGT KCAYTTT27(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長度249個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞(B)位置1..249(D)其它信息/注=“Rana 9”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:GATGTTGATT GTGATAATAT CATGTCAACA AACTTGTTCC ACTGCAAGGA CAAGAACACT 60TTTATCTATT CACGTCCTGA GCCAGTGAAG GCCATCTGTA AAGGAATTAT AGCCTCCAAA 120AATGTGTTAA CTACCTCTGA GTTTTATCTC TCTGATTGCA ATGTAACAAG CAGGCCTTGC 180AAGTATAAAT TAAAGAAATC AACTAATAAA TTTTGTGTAA CTTGTGAAAA TCAGGCACCA 240GTTCATTTT 249(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..315(D)其它信息/注=“[Met-(-1)]rOnc”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:ATG GAG GAT TGG CTT ACA TTT CAG AAA AAA CAC ATC ACA AAC ACA AGG 48Met Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15GAT GTT GAT TGT GAT AAT ATC ATG TCA ACA AAC TTG TTC CAC TGC AAG 96Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30GAC AAG AAC ACT TTT ATC TAT TCA CGT CCT GAG CCA GTG AAG GCC ATC144Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45TGT AAA GGA ATT ATA GCC TCC AAA AAT GTG TTA ACT ACC TCT GAG TTT192Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60TAT CTC TCT GAT TGC AAT GTA ACA AGC AGG CCT TGC AAG TAT AAA TTA240Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80AAG AAA TCA ACT AAT AAA TTT TGT GTA ACT TGT GAA AAT CAG GCA CCA288Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95GTT CAT TTT GTT GGA GTT GGA TCT TGT315Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度105個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Met Glu Asp Trp Leu Thr Phe Gln Lys Lys His Ile Thr Asn Thr Arg 1 5 10 15Asp Val Asp Cys Asp Asn Ile Met Ser Thr Asn Leu Phe His Cys Lys
20 25 30Asp Lys Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Glu Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45Cys Lys Gly Ile Ile Ala Ser Lys Asn Val Leu Thr Thr Ser Glu Phe
50 55 60Tyr Leu Ser Asp Cys Asn Val Thr Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu 65 70 75 80Lys Lys Ser Thr Asn Lys Phe Cys Val Thr Cys Glu Asn Gln Ala Pro
85 90 95Val His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys
100 105
SEQ ID NOS:40,41
SEQ ID NOS:42,43
SEQ ID NOS:44,45
SEQ ID NOS:46,47
SEQ ID NOS:48,49
SEQ ID NOS:50,51
SEQ ID NOS:52,53
SEQ ID NOS:54,55
SEQ ID NOS:56,57
SEQ ID NOS:58,59
SEQ ID NOS:60,61
SEQ ID NOS:62,6權(quán)利要求
1．一種核糖核酸酶分子，具有(a)可測量的核糖核酸酶活性；(b)從甲硫氨酸開始，后面可接除谷氨酸以外的任何氨基酸的氨基末端；(c)在氨基酸位置26、40、58、84、95和110的位置上為半胱氨酸，在位置41是賴氨酸，在位置119是組氨酸，所述位置是參考牛RNaseA(SEQ ID NO:13)的具體氨基酸位置確定的；和(d)自nOnc衍生的氨基酸序列。
2．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有選自下列群組的氨基末端Met-Lys；Met-Tyr；Met-Ser；Met-Ala；Met-Arg和Met-Asn。
3．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有選自下列群組的氨基末端
Met-Ala；
Met-Ala-Ala；
Met-Ala-Ala-Ser；
Met-Arg；
Met-(J)；
Met-Lys-(J)；
Met-Arg-(J)；
Met-Lys；
Met-Lys-Pro；
Met-Lys-(J)-Pro(SEQ ID NO:14)；
Met-Lys-Pro-(J)(SEQ ID NO:15)；
Met-Asn；
Met-Gln；
Met-Asn-(J)；
Met-Gln-(J)；
Met-Asn-(J)-Pro(SEQ ID NO:16)；
Met-(J)-Lys；
Met-(J)-Lys-Pro(SEQ ID NO:17)和
Met-(J)-Pro-Lys(SEQ ID NO:18)
其中(J)是絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸。
4．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Ala的氨基末端。
5．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Arg的氨基末端。
6．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Lys的氨基末端。
7．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Asn的氨基末端。
8．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有Met-Gln的氨基末端。
9．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，具有選自Met-Ser；Met-Tyr或Met-Thr的氨基末端。
10．權(quán)利要求3的核糖核酸酶，其中在nOnc第2氨基酸位置(是牛RNase序列的位置4)上的天冬氨酸被缺失，或被Ala或Asn取代。
11．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有由來自EDN氨基末端的序列編碼的氨基末端，其后接來自rOnc的序列。
12．權(quán)利要求11的核糖核酸酶，其中所述氨基酸序列選自基本上與下式相同的序列
Met(-1)EDN(1-m)Onc(n-104)
其中Met(-1)指氨基末端殘基Met；其中EDN(1-m)指長度為從EDN(SEQ ID NO:9)的氨基酸位置1開始，延續(xù)至并包括EDN第m位氨基酸的連續(xù)氨基酸序列；其中Onc(n-104)指從SEQ ID NO:1的氨基酸位置n開始，延續(xù)至并包括氨基酸位置104的連續(xù)氨基酸序列；以便:
當(dāng)m是21時(shí)，n是16或17；
當(dāng)m是22時(shí)，n是17；
當(dāng)m是20時(shí)，n是16；
當(dāng)m是19時(shí)，n是15；
當(dāng)m是18時(shí)，n是14；
當(dāng)m是17時(shí)，n是12或13；
當(dāng)m是16時(shí)，n是11、12、13或14；
當(dāng)m是15時(shí)，n是10；
當(dāng)m是14時(shí)，n是9；
當(dāng)m是13時(shí)，n是8；和
當(dāng)m是5時(shí)，n是1。
13．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列。
14．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:22相同的氨基酸序列。
15．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列。
16．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列。
17．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列。
18．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:32相同的氨基酸序列。
19．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有基本上與SEQIDNO:2相同的氨基酸序列。
20．權(quán)利要求1的核糖核酸酶，含有來自血管生成素的羧基末端。
21．權(quán)利要求20的核糖核酸酶，含有基本上與SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列。
22．基本上與SEQ ID NO:2所列的序列相同的氨基酸序列。
23．與配體結(jié)合部分或標(biāo)記相連的權(quán)利要求1的核糖核酸酶。
24．權(quán)利要求23的核糖核酸酶分子，其中所述分子與抗體相連。
25．編碼權(quán)利要求1的氨基酸序列的核酸序列。
26．一種藥物組合物，含細(xì)胞毒性量的權(quán)利要求1的核糖核酸酶和可藥用載體。
27．權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述核糖核酸酶與配體結(jié)合部分相連。
28．選擇性殺死細(xì)胞的方法，包括使待殺死的細(xì)胞與連接有配體結(jié)合部分的權(quán)利要求1的核糖核酸酶接觸。
29．權(quán)利要求1的核糖核酸酶分子，還含有核定位信號(hào)。
30．權(quán)利要求1的核糖核酸酶分子，還含有內(nèi)質(zhì)滯留序列。
31．一種載體，含編碼權(quán)利要求1的核糖核酸酶的核酸。
32．一種宿主細(xì)胞，含編碼權(quán)利要求1的核糖核酸酶的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生于在美洲豹蛙的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的天然核糖核酸酶的核糖核酸酶。還描述了這些分子的各種人源化的和重組的形式以及其用途。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1212016SQ9719244
公開日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年2月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月21日
發(fā)明者蘇姍娜·M·雷巴克, 黛安娜·L·牛頓, 劉易斯·博克, 亞歷山大·沃達(dá)韋爾 申請(qǐng)人:美國國有衛(wèi)生與人類服務(wù)部