專利名稱：合成的hiv基因的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參照這是于1996年2月22日申請(qǐng)的美國(guó)序號(hào)60/012,082相關(guān)的非臨時(shí)申請(qǐng)。關(guān)于聯(lián)邦資助的R&D的聲明不適用微縮膠片附錄的參照不適用發(fā)明領(lǐng)域HIV疫苗發(fā)明背景1．HIV感染人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是獲得性人類免疫缺陷綜合癥(AIDS)和相關(guān)失調(diào)的致病劑。HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的一種RNA病毒，并表現(xiàn)出所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’結(jié)構(gòu)。另外，HIV-1包含少數(shù)具有調(diào)節(jié)或未知功能的基因，包括tat和REV基因。env基因編碼病毒被膜糖蛋白，這種糖蛋白作為160千道爾頓(kDa)的前體(gp160)翻譯，然后被細(xì)胞蛋白酶酶切，產(chǎn)生外部120-kDa被膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa被膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41保持相連并且呈現(xiàn)在病毒顆粒和HIV感染的細(xì)胞表面上。gp120與存在于輔助T-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它靶細(xì)胞表面上的CD4受體結(jié)合。gp120與CD4結(jié)合后，gp41介導(dǎo)負(fù)責(zé)病毒侵入的融合事件。
當(dāng)病毒粒子上的gp120與T4淋巴細(xì)胞或其它靶細(xì)胞表面上的CD4受體結(jié)合時(shí)，感染開始。結(jié)合的病毒與靶細(xì)胞融合，并逆轉(zhuǎn)錄它的RNA基因組到細(xì)胞的的雙鏈DNA中。病毒DNA被整合到細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)中，在那里病毒DNA指導(dǎo)新病毒RNA、病毒蛋白質(zhì)和新病毒粒子的產(chǎn)生。新粒子從靶細(xì)胞膜上芽生，并感染其它細(xì)胞。
對(duì)免疫防御很關(guān)鍵的T淋巴細(xì)胞的破壞是作為HIV感染標(biāo)志的進(jìn)行性免疫機(jī)能障礙的主要原因。靶細(xì)胞的喪失嚴(yán)重地?fù)p壞了機(jī)體對(duì)大部分侵入者的抵抗能力，但它對(duì)于針對(duì)病毒、真菌、寄生蟲和包括分枝桿菌的某些細(xì)菌的防御有特別嚴(yán)重的影響。
HIV-1通過(guò)復(fù)制、從細(xì)胞中芽生和損壞細(xì)胞膜殺傷它感染的細(xì)胞。HIV可能間接地利用呈現(xiàn)在被感染細(xì)胞表面上的病毒gp120來(lái)殺傷靶細(xì)胞。因?yàn)門細(xì)胞上的CD4受體對(duì)gp120有強(qiáng)的親合力，表達(dá)CD4受體的健康細(xì)胞可以結(jié)合gp120，并與被感染細(xì)胞融合形成合胞體。合胞體不能存活。
HIV還能引起針對(duì)被感染細(xì)胞的正常細(xì)胞免疫防御。有或沒(méi)有抗體的協(xié)助，細(xì)胞毒性的防御細(xì)胞都能夠破壞在其表面呈現(xiàn)病毒蛋白質(zhì)的被感染細(xì)胞。最后，游離的gp120能在感染有HIV的個(gè)體的血液中循環(huán)。游離的蛋白質(zhì)能結(jié)合到未感染細(xì)胞的CD4受體上，使它們看來(lái)似乎被感染，因此引起免疫應(yīng)答。
HIV-1感染幾乎都是致命的，目前還沒(méi)有HIV-1感染的治療方法。也沒(méi)有得到預(yù)防HIV-1感染的有效疫苗?；畹臏p毒病毒因?yàn)橛谢貜?fù)或感染的危險(xiǎn)，不能作為疫苗使用。大多數(shù)亞單位疫苗方法尚未成功地預(yù)防HIV感染。對(duì)于HIV感染的治療，盡管延長(zhǎng)一些被感染的人的生命，但有嚴(yán)重的副作用。因此很需要有效的治療和疫苗，來(lái)與這種致命的感染作斗爭(zhēng)。2．疫苗接種疫苗是疾病預(yù)防的一種有效形式，并已證明能成功地抵抗幾種類型的病毒感染。決定把HIV-1抗原提呈給人免疫系統(tǒng)以便引起保護(hù)性體液免疫和細(xì)胞免疫的方法是一項(xiàng)困難的工作。到目前為止，試圖生產(chǎn)有效的HIV疫苗還未成功。在AIDS病人中，游離的病毒僅以低水平出現(xiàn)。HIV-1的傳染被通過(guò)融合和合胞體形成的細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用所加強(qiáng)。因此，針對(duì)游離病毒或病毒亞基所產(chǎn)生的抗體一般對(duì)消除病毒感染的細(xì)胞無(wú)效。
疫苗利用機(jī)體的“記憶”抗原的能力。第一次與給定的抗原相遇后，免疫系統(tǒng)就產(chǎn)生在個(gè)體的一生中保持該抗原免疫學(xué)記憶的細(xì)胞。以后接觸該抗原就刺激免疫應(yīng)答，并導(dǎo)致消除或滅活該病原體。
免疫系統(tǒng)以兩種方式對(duì)付病原體通過(guò)體液應(yīng)答和通過(guò)細(xì)胞-介導(dǎo)的應(yīng)答。在體液應(yīng)答中，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生與該抗原結(jié)合的專一性抗體，由此使病原體失活。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答涉及細(xì)胞毒性和專一性攻擊和消滅被感染細(xì)胞的協(xié)助T淋巴細(xì)胞。
用HIV-1病毒研制的疫苗存在一些問(wèn)題，因?yàn)镠IV-1感染一些在免疫系統(tǒng)中疫苗需要激活的相同的細(xì)胞(如T4淋巴細(xì)胞)。研制在免疫系統(tǒng)損害發(fā)生之前使HIV失活的疫苗是有益的。特別合適的一類型的HIV疫苗能產(chǎn)生識(shí)別HIV變異體的抗-HIV免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答在處于感染開始時(shí)的HIV-陽(yáng)性個(gè)體中起作用。
研制針對(duì)病毒的疫苗的主要挑戰(zhàn)是在不同的病毒分離物或毒株中的病毒被膜蛋白的多樣性；特別是那些具有高突變率的病毒，例如人類免疫缺陷病毒，針對(duì)這種病毒誘出中和性和保護(hù)性免疫應(yīng)答是合乎需要的。因?yàn)樵谛∈蠛腿祟愔械募?xì)胞毒性的T-淋巴細(xì)胞(CTL)能夠識(shí)別得自保守的內(nèi)部病毒蛋白質(zhì)的抗原決定基，被認(rèn)為在針對(duì)病毒的免疫應(yīng)答中是重要的，因此已做了研制能夠提供針對(duì)不同病毒株的異源性保護(hù)的CTL疫苗的努力。
已經(jīng)知道CD8+CTL當(dāng)其T細(xì)胞受體識(shí)別與MHCⅠ型分子相結(jié)合的病毒肽時(shí)，殺傷病毒感染的細(xì)胞。這些病毒肽得自內(nèi)源性合成的病毒蛋白質(zhì)，與該蛋白質(zhì)在病毒中的定位或功能無(wú)關(guān)。這樣，CTL通過(guò)識(shí)別來(lái)自保守的病毒蛋白的抗原決定基，可提供交叉毒株保護(hù)。能夠與用于CTL識(shí)別的MHCⅠ型結(jié)合的肽來(lái)源于存在于或穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)，一般來(lái)說(shuō)，進(jìn)入核內(nèi)體加工途徑的外源性蛋白質(zhì)(如在由MHCⅡ型分子呈遞的抗原的情況下)在產(chǎn)生CD8+CTL應(yīng)答中無(wú)效。
產(chǎn)生CTL應(yīng)答的大多數(shù)嘗試已用復(fù)制型載體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)抗原，或這些嘗試集中于將肽導(dǎo)入細(xì)胞胞質(zhì)中。這些方法有一些限制，可減低它們作為疫苗的實(shí)用性。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在可以作為融合蛋白表達(dá)而同時(shí)保持重組體病毒復(fù)制能力的多肽的大小和結(jié)構(gòu)上有限制，用于后續(xù)免疫接種的載體(例如牛痘)效力可被針對(duì)所述載體本身的免疫應(yīng)答所損害。另外，病毒載體和修飾的病原體有在人類中阻礙其用途的固有的風(fēng)險(xiǎn)。此外，呈現(xiàn)出來(lái)的抗原決定基的選擇依賴于個(gè)體的MHC抗原的結(jié)構(gòu)，因此，由于在遠(yuǎn)系繁殖的群體中MHC單倍型的多樣性，肽疫苗可能具有有限的功效。3．DNA疫苗Benvenisty,N.和Reshf.L(PNAS 83,9551-9555,(1986))顯示腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈內(nèi)(i.v)或肌內(nèi)(i.m.)導(dǎo)入小鼠中的CaCl2-沉淀的DNA能夠被表達(dá)。在鼠中i.m.注射不用CaCl2處理的DNA表達(dá)載體導(dǎo)致肌肉細(xì)胞攝取DNA，并表達(dá)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)。該質(zhì)粒以附加體形式保持并且不復(fù)制。隨后，在大鼠、魚和靈長(zhǎng)類骨骼肌和大鼠的心肌內(nèi)i.m.注射后，已經(jīng)觀察到持續(xù)的表達(dá)。用核酸作為治療劑的技術(shù)已在WO90/11092(1990年10月4日)中報(bào)道，其中裸露的多核苷酸用來(lái)接種脊椎動(dòng)物。
肌內(nèi)免疫方法的成功不是必須的。將覆蓋有編碼牛生長(zhǎng)激素(BGH)的DNA的金微彈導(dǎo)入小鼠皮膚中，導(dǎo)致鼠中抗-BGH抗體的產(chǎn)生。噴射注射器已用來(lái)轉(zhuǎn)染活動(dòng)物的皮膚、肌肉、脂肪和乳房組織。導(dǎo)入核的不同方法已有綜述。Zhu顯示了在小鼠中靜脈內(nèi)注射DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物(Science 261:209-211(1993年7月9日)產(chǎn)生克隆的轉(zhuǎn)移基因的系統(tǒng)表達(dá)。Ulmer等(Science 259:1745-1749,(1993))報(bào)道了通過(guò)肌肉內(nèi)注射編碼病毒蛋白的DNA異源性保護(hù)抵抗流感病毒感染。
本發(fā)明滿足對(duì)能夠引起對(duì)病原體和腫瘤抗原所需免疫應(yīng)答的專一性治療劑和預(yù)防劑的需要。在這種治療方法中特別重要的是誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，這種免疫應(yīng)答可以預(yù)防感染或甚至由與獲取該抗原基因的毒株異源的病毒毒株引起的疾病。當(dāng)處理HIV時(shí)，這是特別需考慮的，因?yàn)檫@種病毒已被認(rèn)為能快速突變，并已鑒定了許多毒性分離物(見(jiàn)例如LaRosa等Science 249:932-935(1990)，鑒定245個(gè)獨(dú)立的HIV分離物)。為了響應(yīng)這種識(shí)別的多樣性，研究者們已試圖產(chǎn)生基于肽免疫的CTL。因此，Takahashi等(Science 255:333-336(1992))報(bào)道了誘導(dǎo)識(shí)別HIV被膜(gp160)決定簇的廣譜交叉反應(yīng)細(xì)胞毒性的T細(xì)胞。然而，那些工作者認(rèn)識(shí)到在達(dá)到真正的交叉反應(yīng)性CTL反應(yīng)的困難，并提示在非常嚴(yán)格的引發(fā)或重刺激T細(xì)胞和引起包括來(lái)自已刺激的CTL的細(xì)胞毒性在內(nèi)的效應(yīng)物功能之間有二叉分枝。
Wang等報(bào)道了通過(guò)肌肉內(nèi)接種克隆的基因組(未剪接型)HIV基因，引起小鼠中針對(duì)HIV的免疫應(yīng)答。然而，在這些研究中得到的免疫應(yīng)答水平是很低的。另外，Wang等的DNA構(gòu)成物利用編碼鄰接Ta+/REV-gp/160-Tat/REV編碼序列的HIV必需基因組片段。如在下面詳細(xì)描述的，有一獲取高水平表達(dá)gp160的次優(yōu)系統(tǒng)。這也是一潛在的危險(xiǎn)，因?yàn)門at的表達(dá)有助于Kaposis氏肉瘤的發(fā)展。
WO93/17706描述用于針對(duì)病毒給動(dòng)物接種疫苗的方法，其中載體粒子包有基因構(gòu)成物，并且將包被粒子加速到動(dòng)物的細(xì)胞中。對(duì)于HIV，建議使用失去長(zhǎng)末端重復(fù)片段的基本上整個(gè)基因。這個(gè)方法指出了接受者的實(shí)質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)。一般認(rèn)為HIV構(gòu)成物應(yīng)包含少于大約50％的HIV基因，以保證疫苗的安全；這保證已消除酶部分和病毒調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，它們中的許多其功能是未知或了解很少。這樣，如果由該基因傳遞技術(shù)生產(chǎn)出有用的人類HIV疫苗，尚存在許多問(wèn)題。
本發(fā)明設(shè)想將多核苷酸導(dǎo)入活體組織中來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的任何已知的方法。然而，本發(fā)明提供了一新型免疫原，用于將HIV和其它蛋白質(zhì)導(dǎo)入抗原加工途徑中，以有效地產(chǎn)生HIV-專一性CTL和抗體。作為誘導(dǎo)細(xì)胞和體液抗-HIV和HIV中和免疫應(yīng)答的疫苗，在藥物學(xué)上是有效的。在本發(fā)明中，談到前面所提到的問(wèn)題，并通過(guò)提供多核苷酸免疫原來(lái)解決，這種免疫原當(dāng)被導(dǎo)入動(dòng)物體時(shí)，指導(dǎo)HIV蛋白和抗原決定基的有效表達(dá)，而沒(méi)有與那些方法有關(guān)的相伴的風(fēng)險(xiǎn)。這樣產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對(duì)識(shí)別HIV、抑制HIV的復(fù)制、鑒別和殺傷被HIV感染的細(xì)胞是有效的，并對(duì)許多HIV毒株為交叉反應(yīng)性的。4．密碼子用法和密碼子上下文有機(jī)體的密碼子配對(duì)是高度非隨機(jī)的，并從有機(jī)體到有機(jī)體不同，這一信息已用來(lái)構(gòu)建和表達(dá)具有所需水平翻譯效率的改變的和合成的基因、決定基因組的哪一區(qū)域是蛋白編碼區(qū)、將翻譯中止位點(diǎn)導(dǎo)入異源性基因上和確定核苷酸序列的關(guān)系或祖先起源。
在轉(zhuǎn)化的有機(jī)體中外來(lái)的異源基因的表達(dá)現(xiàn)在已是常事。大量的哺乳動(dòng)物基因包括例如鼠和人類的基因已被成功地插入到單細(xì)胞有機(jī)體中。這方面的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括待表達(dá)的外來(lái)基因?qū)肜缳|(zhì)?；蚴删w的載體中，并利用這種載體將該基因插入到有機(jī)體中。這類基因的天然啟動(dòng)子通常用與該基因所插入到的宿主相容的強(qiáng)啟動(dòng)子所取代。蛋白質(zhì)測(cè)序儀能夠闡明甚至是極小量的天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列。從這些氨基酸序列可推斷編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列。DNA合成也是一快速發(fā)展的技術(shù)。能容易地構(gòu)建對(duì)應(yīng)于這些推斷的DNA序列的合成基因。
盡管有高速增長(zhǎng)的表達(dá)系統(tǒng)和重組DNA的知識(shí)，但當(dāng)人們?cè)噲D在有機(jī)體中表達(dá)異種或合成基因時(shí)，仍存在很大的阻礙，許多天然的活性蛋白質(zhì)例如以不同于它們?cè)诋惙N宿主中表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的形式糖基化。因?yàn)檫@一原因，對(duì)于表達(dá)許多哺乳動(dòng)物基因，例如酵母的真核生物宿主可能優(yōu)于細(xì)菌宿主。糖基化的問(wèn)題是繼續(xù)研究的課題。
另一個(gè)問(wèn)題了解的更少。通常合成基因甚至當(dāng)與一強(qiáng)啟動(dòng)子偶聯(lián)時(shí)，其翻譯進(jìn)行的效率比所期望的低得多。非表達(dá)有機(jī)體原有的外源基因通常也是如此。甚至當(dāng)該基因以生產(chǎn)可回收量翻譯產(chǎn)物的充分有效的方式轉(zhuǎn)錄時(shí)，該蛋白質(zhì)通常為無(wú)活性的或在性質(zhì)上不同于天然蛋白質(zhì)。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到后一個(gè)問(wèn)題通常是由于不同有機(jī)體中蛋白質(zhì)折疊的差異。這一問(wèn)題的解釋是難以理解的，而且對(duì)控制蛋白質(zhì)折疊的機(jī)制知之甚少。
與翻譯效率相關(guān)的問(wèn)題被認(rèn)為是與密碼字上下文作用有關(guān)聯(lián)的。在所有有機(jī)體中基因的蛋白編碼區(qū)受到很多種功能上的限制，其中的一些限制取決于編碼合適功能的蛋白質(zhì)的需求和適宜的翻譯起始和終止信號(hào)。然而，已分辨出蛋白編碼區(qū)的幾個(gè)特征，按照這些限制因素不容易理解這些特征。這些特征的兩個(gè)重要類型是涉及密碼子用法和密碼子上下文的那些特征。
已經(jīng)知道在不同有機(jī)體之間密碼子利用是有高度傾向性的，并且變異相當(dāng)大。已經(jīng)顯示密碼子用法的類型是與tRNA同工受體的相對(duì)豐度相關(guān)連的。高與低豐度的編碼蛋白質(zhì)的基因在它們的密碼子傾向性上顯示了差異。已廣泛討論了密碼子用法的傾向性改變肽延伸速率的可能性。盡管密碼子用法的差異是與翻譯速率上的差異相關(guān)聯(lián)的，但要證實(shí)密碼子選擇對(duì)翻譯的直接作用是困難的。其它已提出的密碼子用法類型上的限制包括把翻譯的可靠性增加到最大程度和使蛋白質(zhì)合成的動(dòng)力學(xué)效率最佳化。
除密碼子的非隨機(jī)用法外，已積累了相當(dāng)多的證據(jù)證明密碼子/反密碼子識(shí)別是受該密碼子本身之外的序列影響的，即稱為“密碼子上下文”的現(xiàn)象。鄰近的核苷酸對(duì)無(wú)義密碼子和錯(cuò)義密碼子的抑制效率存在強(qiáng)烈的影響。顯然，天然細(xì)菌群體中抑制基因活性的豐度和編碼硒代胱氨酸和磷酸絲氨酸“終止”密碼子的使用需要終止為上下文依賴性的。已經(jīng)顯示了類似的上下文效應(yīng)影響翻譯的可靠性和翻譯起始的效率。
大腸桿菌蛋白編碼區(qū)的統(tǒng)計(jì)分析表明了另一種“密碼子上下文”形式。在一位置的特定密碼子的存在強(qiáng)烈地影響鄰近密碼子的某些核苷酸同時(shí)出現(xiàn)的頻率，這些上下文的限制在高水平和低水平表達(dá)的基因中差異很大。盡管已認(rèn)識(shí)到上下文效應(yīng)，但與鄰近密碼子的優(yōu)選核苷酸相聯(lián)系的統(tǒng)計(jì)規(guī)律的預(yù)計(jì)值是相對(duì)低的。這就限制了選擇密碼子以達(dá)到所需水平翻譯效率的這些核苷酸選擇數(shù)據(jù)的實(shí)用性。
自動(dòng)化核苷酸序列儀的出現(xiàn)已使得得到許多種有機(jī)體的大量序列數(shù)據(jù)。弄懂這些數(shù)據(jù)存在實(shí)際的困難。例如，為了將該遺傳序列數(shù)據(jù)與蛋白序列聯(lián)系起來(lái)而鑒定該基因組的編碼區(qū)是很重要的。另外，某些有機(jī)體基因組的祖先是有實(shí)質(zhì)價(jià)值。已知一些有機(jī)體的基因組是來(lái)自混合祖先的。在起源上是病毒的一些序列現(xiàn)在已穩(wěn)定地整合到真核有機(jī)體的基因組中。這些病毒序列本身可能起源于另外實(shí)質(zhì)不相關(guān)連的物種。了解基因的祖先對(duì)獲取相關(guān)基因和它們?cè)谄渌袡C(jī)體中的翻譯產(chǎn)物之間的合適相似性可能是重要的。
需要更好地了解密碼子上下文對(duì)翻譯的作用和確定任何所需的翻譯作用合適的密碼子的方法。也需要用于鑒定來(lái)自核苷酸序列數(shù)據(jù)的該基因組編碼區(qū)的方法。還需要用于控制蛋白質(zhì)折疊和保證當(dāng)異種基因在宿主中表達(dá)時(shí)異種基因合適地折疊的方法。按照所需的翻譯效率來(lái)改變或構(gòu)建的基因?qū)⑹欠浅Ｓ袃r(jià)值的。
用于微生物表達(dá)工業(yè)上和藥物學(xué)上有價(jià)值的蛋白質(zhì)的另一方面的重組DNA技術(shù)的實(shí)踐是“密碼子優(yōu)先權(quán)”現(xiàn)象。盡管已較早注意到用于基因表達(dá)的現(xiàn)存機(jī)構(gòu)是遺傳轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它將“工作”來(lái)構(gòu)建給定的所需產(chǎn)物，但在微生物中達(dá)到的表達(dá)水平能夠受到很大的變異，這部分依賴存在于插入的外源基因中氨基酸專一化的遺傳密碼的特定選擇形式。四個(gè)可能的核苷酸堿基的“三聯(lián)體”密碼子能夠以64個(gè)變異體形式存在。這些形式為僅僅20個(gè)不同的氨基酸(還有轉(zhuǎn)錄起始和終止)提供信息，這就意味著一些氨基酸能被不止一個(gè)密碼子所編碼。的確，一些氨基酸具有多達(dá)6個(gè)“豐余的”可供選擇的密碼子，同時(shí)一些氨基酸只有單個(gè)所需的密碼子。因?yàn)椴煌耆私獾脑?，可供選擇的密碼子不都是均勻地存在于不同類型細(xì)胞的內(nèi)源性DNA中，并且在某些類型的細(xì)胞中對(duì)某些密碼子似乎存在可用的天然等級(jí)制度或“優(yōu)先權(quán)”。
作為一個(gè)例子，氨基酸亮氨酸被6個(gè)DNA密碼子的任何一個(gè)所指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG(它們分別對(duì)應(yīng)于mRNA密碼子CUA、CUC、CUG、CUU、UUA和UUG)。微生物的基因組密碼子頻率的完全分析揭示大腸桿菌的內(nèi)源性DNA最常包含CTG亮氨酸特定性密碼子，而酵母和粘菌的DNA最常包含TTA亮氨酸特定性密碼子?？紤]到這種等級(jí)制度，通常認(rèn)為獲得大腸桿菌宿主高水平表達(dá)富含亮氨酸多肽的可能性將在某種程序上依賴于密碼子使用頻率。例如，富含TTA密碼子的基因很可能在大腸桿菌中表達(dá)差，而富含CTG的基因?qū)⒖赡芨咚奖磉_(dá)該多肽。同樣，當(dāng)酵母細(xì)胞為用于表達(dá)富含亮氨酸的多肽的預(yù)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在插入DNA中使用的優(yōu)選密碼子將是TTA。
密碼子優(yōu)先權(quán)現(xiàn)象在重組DNA技術(shù)上的意義是顯而易見(jiàn)的，這種現(xiàn)象可用來(lái)解釋為在成功轉(zhuǎn)化的宿主有機(jī)體中獲取外源性基因的高水平表達(dá)的許多以前的失敗即較少“優(yōu)選的”密碼子在插入的基因中可重復(fù)出現(xiàn)，用于表達(dá)的宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)可能不能有效地運(yùn)作。這個(gè)現(xiàn)象提示已設(shè)計(jì)成包含預(yù)定宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子的合成基因?yàn)橹亟MDNA技術(shù)的實(shí)踐提供異種遺傳物質(zhì)的一種優(yōu)選形式。5．蛋白質(zhì)運(yùn)送象征真核細(xì)胞的功能多樣性依賴于它們的膜邊界結(jié)構(gòu)上的差異。為了產(chǎn)生和保持這些結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)必須貫穿細(xì)胞，從它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成部位運(yùn)送到預(yù)定的目的地。這需要運(yùn)送的蛋白質(zhì)顯示位于主要運(yùn)送通道入口點(diǎn)的負(fù)責(zé)通道選擇的分子機(jī)構(gòu)所識(shí)別的分類信號(hào)。大部分蛋白質(zhì)橫穿其生物合成途徑時(shí)，其分類決定僅需進(jìn)行一次，因?yàn)樗鼈兊淖罱K目的地，即行使其功能的細(xì)胞位置成為它們的永久居住點(diǎn)。
胞間完整性的維持部分依賴于蛋白質(zhì)的選擇性分類和將其精確轉(zhuǎn)運(yùn)到它們的正確目的地。過(guò)去的幾年，很活躍地研究了用于蛋白質(zhì)導(dǎo)向和定位的分子機(jī)構(gòu)的分析。在可以作為“地址標(biāo)記”的蛋白質(zhì)上已鑒定了定義的序列的基序。已發(fā)現(xiàn)許多分類標(biāo)記是與膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相聯(lián)系的。發(fā)明概述提供編碼HIV env的合成DNA分子和HIV env的修飾。該合成分子的密碼子包括預(yù)定宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子。該合成分子提供異種遺傳物質(zhì)的優(yōu)選形式。該合成分子可作為多核苷酸疫苗使用，這種疫苗通過(guò)中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用來(lái)提供針對(duì)HIV感染的有效的免疫預(yù)防。本發(fā)明提供多核苷酸，當(dāng)這種多核苷酸直接導(dǎo)入包括哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類和人類)的脊椎動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，誘導(dǎo)該動(dòng)物中編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示基于HIV env盒的表達(dá)策略。
圖2表示DNA疫苗介導(dǎo)的抗gp120反應(yīng)。
圖3表示鼠的DNA疫苗血清的抗gp120 ELISA效價(jià)。
圖4表示HIV env PNV細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染后，gp120的相對(duì)表達(dá)。
圖5表示tPA-gp143/optA對(duì)optB DNA接種后的普通抗gp120 ELISA反應(yīng)。
圖6表示鼠的DNA疫苗血清對(duì)HIV的中和作用。
圖7顯示來(lái)自鼠HIV env DNA疫苗的血清對(duì)HIV的中和作用。
圖8是最佳化HIV env DNA構(gòu)成物的免疫印跡分析。本發(fā)明的詳細(xì)描述提供編碼HIV env的合成DNA分子和編碼修飾形式的HIV env的合成DNA分子。設(shè)計(jì)所述合成分子的密碼子以便使用預(yù)定宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。所述合成分子能作為多核苷酸疫苗使用，這種疫苗通過(guò)中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用來(lái)提供針對(duì)HIV有效的免疫預(yù)防。所述合成分子能作為免疫原組合物使用。本發(fā)明提供多核苷酸，當(dāng)這種多核苷酸直接導(dǎo)入包括哺乳動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類和人類)的脊椎動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，誘導(dǎo)該動(dòng)物中編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如本文中所用的，多核苷酸是一種含有調(diào)節(jié)元件的核酸組合物，使得導(dǎo)入活的脊椎動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，該多核苷酸能夠指導(dǎo)細(xì)胞機(jī)構(gòu)產(chǎn)生包含該多核苷酸的核酸所編碼的翻譯產(chǎn)物。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，該多核苷酸是包含至少一個(gè)在操作上與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連的HIV基因的多聚脫氧核糖核酸。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該多核苷酸疫苗(PNV)包含編碼至少一個(gè)經(jīng)得起真核細(xì)胞機(jī)構(gòu)(核糖體、tRNA和其它翻譯因子)翻譯檢驗(yàn)的HIV基因的多聚核糖核酸。該多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)是那些在動(dòng)物中除非在病理?xiàng)l件下出現(xiàn)而通常不出現(xiàn)的蛋白質(zhì)(如異源性蛋白質(zhì))時(shí)，例如為與獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)致病劑人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)的蛋白質(zhì)時(shí)，則該動(dòng)物的免疫系統(tǒng)被激活，引起保護(hù)性免疫應(yīng)答。因?yàn)檫@些外源性蛋白質(zhì)是由該動(dòng)物組織產(chǎn)生的，表達(dá)的蛋白質(zhì)由主要組織相容性系統(tǒng)MHC以類似于相關(guān)生物(HIV)真正感染時(shí)的形式加工。結(jié)果就是誘導(dǎo)針對(duì)同種病原體的免疫應(yīng)答。
本說(shuō)明書的多核苷酸當(dāng)導(dǎo)入生物系統(tǒng)中時(shí)，誘導(dǎo)HIV蛋白質(zhì)與抗原決定基的表達(dá)和專一性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)是專一性針對(duì)表達(dá)的HIV蛋白質(zhì)，并中和HIV。另外，誘導(dǎo)專一性識(shí)別和破壞HIV感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
本說(shuō)明書提供導(dǎo)入哺乳動(dòng)物組織時(shí)在體內(nèi)在單個(gè)細(xì)胞中誘導(dǎo)不連續(xù)基因產(chǎn)物表達(dá)的多核苷酸的使用方法。本說(shuō)明書提供不需要多次操縱REV賴性HIV基因來(lái)獲得不依賴REV的基因的方法。這里描述的不依賴REV的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于它自身的機(jī)制是有用的，并且是用于證明在體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)所需單個(gè)基因產(chǎn)物的系統(tǒng)。
因?yàn)楸景l(fā)明的許多應(yīng)用運(yùn)用于抗病毒接種疫苗，所述多核苷酸通常稱為核苷酸疫苗或PNV。這不是說(shuō)在免疫刺激中和抗腫瘤治療中，這些多核苷酸另外的應(yīng)用被認(rèn)為在本發(fā)明發(fā)范圍之外。
在一實(shí)施方案中，將編碼HIV基因產(chǎn)物的基因加入表達(dá)載體中。該載體含有真核細(xì)胞RNA聚合酶識(shí)別的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和一個(gè)位于HIV基因編碼序列末端的轉(zhuǎn)錄終止子。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是帶有內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-intA)，盡管那些熟知這一技術(shù)的人將認(rèn)識(shí)到可以使用許多其它已知啟動(dòng)子的任何一種，例如強(qiáng)免疫球蛋白或其它真核基因啟動(dòng)子。一個(gè)優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長(zhǎng)激素終止子。特別推薦CMVint A-BGH終止子組合物。
為了幫助制備原核細(xì)胞中的多核苷酸，抗生素抗性標(biāo)記可包含到該表達(dá)載體中；該標(biāo)記可在原核細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下，以至該標(biāo)記的表達(dá)不發(fā)生在真核細(xì)胞中?？梢岳冒逼S青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和其它藥學(xué)上可接受的抗生素抗性標(biāo)記。為了幫助通過(guò)原核生物的發(fā)酵高水平地生產(chǎn)多核苷酸，該載體可能最好含有原核生物的復(fù)制起點(diǎn)并且是高拷貝數(shù)目。許多市售的原核生物克隆載體提供這些益處。最好是去掉非必需的DNA序列并保證該載體在真核細(xì)胞中不能夠復(fù)制。這就將多核苷酸疫苗序列整合到受體的基因組的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低程度。只要當(dāng)需要將該多核苷酸表達(dá)限于特定的組織類型時(shí)，可使用組織專一性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
在一實(shí)施方案中，使用了表達(dá)載體pnRSV，其中勞氏肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)是作為該啟動(dòng)子使用的。在另一實(shí)施方案中，使用了突變的pBR322載體V1，這個(gè)載體中克隆有CMV啟動(dòng)子和BGH轉(zhuǎn)錄終止子。在另一實(shí)施方案中，已將元件V1和pUC19結(jié)合，用來(lái)生產(chǎn)命名為V1J的表達(dá)載體。在V1J或另一個(gè)希望的表達(dá)載體中克隆了一個(gè)HIV基因，例如gp120、gp41、gp160、gag、pol、env或能夠誘導(dǎo)抗HIV免疫應(yīng)答的任何其它的HIV基因。在另一實(shí)施方案中，從VIJ中去掉氨芐青霉素抗性基因，并用新霉素抗性基因代替，以在按本發(fā)明使用的已克隆出的不同HIV基因中產(chǎn)生V1J-neo。在另一實(shí)施方案中，該載體是V1Jns，它和V1Jneo一樣，區(qū)別是唯一的SfiⅠ限制性位點(diǎn)已加工到V1J-neo位置2114的單個(gè)KnpⅠ位點(diǎn)中。在人類基因組DNA中SfiⅠ位點(diǎn)的發(fā)生率是非常低的(大約每100,000個(gè)堿基一個(gè)位點(diǎn))。因此，這個(gè)載體允許簡(jiǎn)單地通過(guò)SfiⅠ消化提取的基因組DNA，小心地監(jiān)測(cè)表達(dá)載體整合到宿主DNA中。在進(jìn)一步的精制中，該載體是V1R。在這個(gè)載體中，盡可能多的非必需DNA從載體中“修剪”掉，產(chǎn)生一高度緊密的載體。這個(gè)載體是V1Jns的衍生物。該載體允許利用大的插入，較少考慮不適宜的序列被編碼和使細(xì)胞的攝取最佳化。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案加入來(lái)自實(shí)驗(yàn)室采用的HIV毒株(例如SF2、ⅢB或MN)的編碼HIV的gp160、gp120、gag和其它基因產(chǎn)物的基因。熟知這一技術(shù)的人將認(rèn)識(shí)到利用具有與HIV-1的基因類似功能的HIV-2毒株的基因，期望產(chǎn)生類似于在這里對(duì)HIV-1構(gòu)成物所描述的免疫應(yīng)答。熟知這項(xiàng)技術(shù)的人員已知道獲得這些基因的克隆和操作方法。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到引起針對(duì)實(shí)驗(yàn)室采用的HIV毒株的免疫應(yīng)答可能不足以提供HIV原始現(xiàn)場(chǎng)分離物的中和作用。這樣，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將來(lái)自毒性HIV原始現(xiàn)場(chǎng)分離物的基因加入該多核苷酸免疫原中。這是通過(guò)制備該病毒基因的cDNA拷貝，然后將各個(gè)基因亞克隆到該多核苷酸免疫原中來(lái)完成的。許多HIV毒株的很多基因的序列現(xiàn)在能在GENEBANK公開獲得，并且這些HIV的原始現(xiàn)場(chǎng)分離物能從國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究所(NIAID)獲取，這個(gè)研究所已與QualityBiological,Inc.[7581 Lindbergh Drive,Gaithersburg，馬里蘭20879]訂有合約使得可得到這些毒株。這些毒株也能從世界衛(wèi)生組織(WHO)獲取[HIV分離和特征記述網(wǎng)絡(luò)，疫苗研制單位，研究所，世界AIDS方案，CH-1211 Geneva 27，瑞士)。從這一工作中那些熟知這項(xiàng)技術(shù)的人將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是提供用于體內(nèi)和體外檢驗(yàn)和分析的系統(tǒng)，使得能夠作出HIV序列多樣性與HIV中和作用的血清學(xué)和其它參數(shù)的相互關(guān)系。加入來(lái)自HIV毒株原始分離物的基因提供誘導(dǎo)針對(duì)該病毒臨床分離物的免疫應(yīng)答的免疫原，這樣，就滿足了此領(lǐng)域尚未遇到的需求。此外，由于所述毒性分離物改變，可修飾該免疫原來(lái)反映所需要的新序列。
為了保持術(shù)語(yǔ)上的一致，遵照下面的本文為描述多核苷酸免疫原構(gòu)成物的慣例“載體名稱-HIV毒株-基因-附加元件”。這樣，其中MN毒株的gp160基因克隆到表達(dá)載體V1Jneo上的構(gòu)成物，這里它給出的名稱是“V1Jneo-MN-gp160”。加入到該構(gòu)成物的另外的元件在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述。因?yàn)樵摬《镜牟≡局旮淖?，可改變?cè)谒幬飳W(xué)上最適宜加入的精確基因。然而，如下面所表明的，因?yàn)檎T導(dǎo)能夠保護(hù)抵抗異源性毒株的CTL應(yīng)答，與完整病毒或基于亞單位多核苷酸的疫苗相比，該毒株的變異性在本發(fā)明的免疫原和疫苗中是較不關(guān)鍵的。另外，因?yàn)樵撍幬锶菀撞僮鞑迦胄禄?，這是容易用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的調(diào)整。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指DNA鏈上的識(shí)別位點(diǎn)，在這一點(diǎn)上RNA聚合酶與之結(jié)合。該啟動(dòng)子與RNA聚合酶形成起始復(fù)合物，來(lái)起始和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性，該復(fù)合物能夠被命名為“增強(qiáng)子”的激活序列或命名為“沉默子”的抑制序列所修飾。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“前導(dǎo)序列”是指位于結(jié)構(gòu)基因5’末端與該基因一起被轉(zhuǎn)錄的DNA序列。前導(dǎo)序列通常產(chǎn)生具有N末端肽延伸的有時(shí)稱為原序列的蛋白質(zhì)。對(duì)于注定或分泌到胞外介質(zhì)或膜上的蛋白質(zhì)，這種信號(hào)序列一般為疏水性序列，指導(dǎo)蛋白質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被運(yùn)輸?shù)胶线m的目的地。
這里所使用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子”是指出現(xiàn)于基因中間的DNA區(qū)域，這一區(qū)域不編碼該基因產(chǎn)物中的氨基酸。該內(nèi)含子的前體RNA被切斷，因此既不被轉(zhuǎn)錄mRNA，也不被翻譯成蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“盒”是指含有待表達(dá)核酸序列的本發(fā)明的序列。該盒在概念上類似于盒式磁帶。每個(gè)盒將有它自身的序列。這樣通過(guò)交換該盒，該載體將表達(dá)不同的序列。因?yàn)橄拗菩晕稽c(diǎn)位于5’和3’末端，因此該盒能夠容易地被插入、去除或用另一個(gè)盒代替。
術(shù)語(yǔ)“3’非翻譯區(qū)域”或“3’UTR”是指通常與該基因一起轉(zhuǎn)錄的位于結(jié)構(gòu)基因3’末端的序列。這個(gè)3’UTR區(qū)通常含有poly A序列。盡管3’UTR從該DNA轉(zhuǎn)錄，但在翻譯成蛋白質(zhì)之前它從DNA上被切下。
術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”或“NCR”是指與該結(jié)構(gòu)基因的3’UTR區(qū)鄰近的區(qū)域。NCR區(qū)含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“限制性位點(diǎn)”是指限制性內(nèi)切酶的序列專一性切割位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指一些工具，通過(guò)這些工具可以將DNA片段導(dǎo)入宿主有機(jī)體或宿主組織中。有各種類型的載體，包括質(zhì)粒、噬菌體和粘粒。
術(shù)語(yǔ)“有效量”表示注射足夠的PNA以產(chǎn)生足夠水平的多肽。熟知這一技術(shù)的人認(rèn)識(shí)到這一水平可以變化。
為了提供本發(fā)明的說(shuō)明，現(xiàn)提供下面的HIV背景資料。人類免疫缺陷病毒有一核糖核酸(RNA)基因組，其結(jié)構(gòu)描述在圖1中。這個(gè)RNA基因按照本領(lǐng)域已知的方法必須反轉(zhuǎn)錄，以便產(chǎn)生用于克隆和按照這里所指出方法的操縱的cDNA拷貝。在該基因組的每個(gè)末端是一用作啟動(dòng)子的長(zhǎng)末端重復(fù)。在這些末端中間，該基因組在不同的閱讀框架中編碼作為主要基因產(chǎn)物的gag-pol-env:gag是基團(tuán)專一性抗原；pol是逆轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶；也由這一區(qū)域編碼、在另一的閱讀框架中的是負(fù)責(zé)將例如gp160翻譯后加工為gp120和gp41的病毒蛋白酶；env是被膜蛋白；vif是病毒粒子感染性因子；REV是病毒粒子蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)節(jié)因子；neg是負(fù)調(diào)節(jié)因子；vpu是病毒粒子產(chǎn)率因子“u”；tat是轉(zhuǎn)錄的凡是激活因子；vpr是病毒蛋白r。已描述了這些成分的每一種的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼HIV或SIV蛋白質(zhì)的基因直接連接到轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上。env基因編碼大的膜結(jié)合蛋白質(zhì)gp160，它翻譯后修飾為gp41和gp120。gp120基因可放在用于表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制之下。然而，gp120不是膜結(jié)合的，因此，表達(dá)時(shí)，它可從細(xì)胞中分泌出來(lái)。因?yàn)镠IV趨向在被感染細(xì)胞中保持休眠狀態(tài)，最好是也產(chǎn)生針對(duì)細(xì)胞結(jié)合的HIV抗原決定基的免疫應(yīng)答。另外，最好是疫苗產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)上類似于病毒感染產(chǎn)生的膜結(jié)合的寡聚ENV抗原，以產(chǎn)生用于中和病毒的最有效的抗體反應(yīng)。在這里這一目標(biāo)通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)細(xì)胞膜結(jié)合的抗原決定基gp160，以引發(fā)免疫系統(tǒng)來(lái)完成。但是，由于從未剪接的基因的核中沒(méi)有輸出，因此在缺少REV的情況下，gp160的表達(dá)被抑制。為了了解該系統(tǒng)，必須進(jìn)一步詳細(xì)描述HIV的生活周期。
在HIV的生活周期中，感染宿主細(xì)胞時(shí)，HIV RNA基因被反轉(zhuǎn)錄成前病毒DNA，這一DNA整合到宿主基因組的DNA中，作為單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。LTR提供從5’到3’的方向轉(zhuǎn)錄HIV基因(gag、pol、env)的啟動(dòng)子，形成整個(gè)基因組未剪接的轉(zhuǎn)錄物。未剪接轉(zhuǎn)錄物作為翻譯gag和pol的mRNA；而為了翻譯env編碼基因，必須發(fā)生有限的剪接。關(guān)于該表達(dá)的調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物REV，必須發(fā)生不止一個(gè)剪接事件，因?yàn)槿缭趫D1所示的基因組的裝置中REV和env重疊。為了轉(zhuǎn)錄env,REV轉(zhuǎn)錄必須停止，反之也一樣。另外，從細(xì)胞核輸出未剪接的RNA，需要REV的存在。但是，為了REV以這種方式起作用，REV反應(yīng)性元件(RRE)必須存在于轉(zhuǎn)錄物上(Malim等，Nature 338:254-259(1989))。
在本發(fā)明的多核苷酸疫苗中，通過(guò)提供完整的剪接基因來(lái)消除某些HIV基因必須的剪接(即提供所需基因產(chǎn)物的完全的開放閱讀框架，在該閱讀框架中不需要開關(guān)或消除非編碼區(qū)；熟知這項(xiàng)技術(shù)的那些人將認(rèn)識(shí)到當(dāng)剪接一特定的基因時(shí)，在產(chǎn)生的準(zhǔn)確的序列中有一些變化幅度；但是只要能得到功能性編碼序列，這是可接受的)。因此，在一實(shí)施方案中，剪接gp160的整個(gè)編碼序列，以至于不需要每個(gè)基因產(chǎn)物間斷的表達(dá)。
已知HIV在群體和被感染個(gè)體中突變的傾向，按照本發(fā)明產(chǎn)生的二元體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答特別明顯地抑制HIV感染。為了配制對(duì)HIV的有效保護(hù)性疫苗，最好既產(chǎn)生例如對(duì)gp160的多價(jià)抗體反應(yīng)(在各種美國(guó)人群體中的流行毒株HIV、分化體(clade)B毒株中env的保守性大約為80％)、以HIV為靶子的主要中和作用，也產(chǎn)生對(duì)gp160的保守部分和gag編碼的病毒內(nèi)部蛋白有反應(yīng)性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。我們已經(jīng)制備了一包含gp160基因的HIV疫苗，這些gp160基因選自普通實(shí)驗(yàn)室毒株、被感染的人群中發(fā)現(xiàn)的主要原始病毒分離物、設(shè)計(jì)成來(lái)暴露交叉毒株中和抗體抗原決定基的突變gp160和其它代表性HIV基因，例如gag和pol基因(在HIV分離物中-95％保守)。
實(shí)際上，還沒(méi)有朝免疫缺陷狀態(tài)發(fā)展的所有HIV血清陽(yáng)性的病人都含有抗gag CTL，同時(shí)這些病人中的大約60％顯示交叉毒株gp160專一性的CTL。然而，在已經(jīng)發(fā)展成已知為AIDS疾病狀態(tài)的被感染個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的HIV專一性CTL的量非常低，這證明了我們下述發(fā)現(xiàn)的重要性我們能夠誘導(dǎo)交叉毒株CTL反應(yīng)。
在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中證實(shí)了我們的env和gag多核苷酸疫苗構(gòu)成物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。監(jiān)視小鼠中監(jiān)測(cè)針對(duì)env的抗體產(chǎn)生允許證實(shí)給予的構(gòu)成物是合適的免疫原，即高比率的接種疫苗的動(dòng)物顯示抗體反應(yīng)。小鼠還提供適合于檢驗(yàn)我們的構(gòu)成物對(duì)CTL誘導(dǎo)的最易得到的動(dòng)物模型，并因此用來(lái)評(píng)價(jià)特定的構(gòu)成物是否能夠產(chǎn)生這種活性。猴(非洲綠猴、恒河猴、黑猩猩)提供用于在大的非嚙齒類動(dòng)物中抗體評(píng)價(jià)的另外的物種，包括靈長(zhǎng)類。由于在小鼠血清中觀察到針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的高水平的內(nèi)源性中和作用活性，對(duì)于抗血清中和作用檢驗(yàn)這些物種也優(yōu)于小鼠。這些數(shù)據(jù)表明我們的疫苗產(chǎn)生足夠的免疫原性，以在這一系統(tǒng)已知保護(hù)水平中和性抗體的基礎(chǔ)上在實(shí)驗(yàn)中獲得黑猩猩/HIVⅢB攻擊免疫模型的保護(hù)。然而，現(xiàn)在在科學(xué)界出現(xiàn)的和日益接受的保護(hù)的定義是遠(yuǎn)離所謂的“消毒性免疫”，這表示免于HIV感染的完全保護(hù)，來(lái)預(yù)防疾病。這一目標(biāo)的許多相關(guān)物包括通過(guò)或者HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性、血清樣品的傳染性、p24 ELISA檢驗(yàn)或者血液中其它的HIV抗原濃度、增加的CD4+T細(xì)胞濃度和增加的存活率來(lái)測(cè)定的降低的血液病毒效價(jià)。(參見(jiàn)例如Cohen,J.,Science 262:1820-1821,1993，關(guān)于抗HIV疫苗效力的發(fā)展的定義的討論)。本發(fā)明的免疫原還產(chǎn)生針對(duì)傳染性(臨床，基礎(chǔ)領(lǐng)域)的HIV分離物的中和性免疫應(yīng)答。免疫學(xué)A．對(duì)env的抗體反應(yīng)1．gp160和gp120.用ELISA分析來(lái)確定表達(dá)或是分泌型gp120、或是膜結(jié)合型gp160的疫苗載體對(duì)env專一性抗體的生產(chǎn)是否是有效的。通過(guò)gp160轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物的免疫印跡分析，提供我們疫苗接種載體的env表達(dá)的最初體外特征記述。這些數(shù)據(jù)證實(shí)并定量分析gp160的表達(dá)，用抗gp41和抗gp120單克隆抗體使轉(zhuǎn)染子細(xì)胞gp160的表達(dá)可見(jiàn)。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，因?yàn)橄铝性騡p160較gp120優(yōu)選(1)原始的gp120載體在鼠中產(chǎn)生不一致的免疫原性，并且在非洲綠猴中反應(yīng)性非常差或無(wú)反應(yīng)性；(2)gp160通過(guò)由于包含gp41而提供增加的大約190個(gè)氨基酸殘基，來(lái)貢獻(xiàn)出額外的中和抗體和CTL抗原決定基。(3)就四聚體裝配和總體構(gòu)象而論，gp160的表達(dá)更類似于病毒的env，這可提供寡聚物依賴性中和作用抗原決定基；并且(4)我們發(fā)現(xiàn)，象在小鼠、白鼬和非人類的靈長(zhǎng)類中產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)的膜結(jié)合流感HA構(gòu)成物的成功一樣，抗gp160抗體的產(chǎn)生勝過(guò)抗gp120抗體產(chǎn)生。選擇哪種類型的env或是否優(yōu)選env亞片段的混合物是由下面略述的實(shí)驗(yàn)決定的。
2．中和活性的存在和廣度檢測(cè)來(lái)自猴的ELISA陽(yáng)性抗血清，顯示它既中和同源性HIV毒株，也中和異源性HIV毒株。
3．V3對(duì)非V3中和抗體對(duì)于env PNV的主要目標(biāo)是產(chǎn)生廣譜中和抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)表明針對(duì)V3環(huán)的抗體是非常毒株專一性的，這一反應(yīng)的血清學(xué)已用來(lái)定義毒株。
a．非V3中和抗體似乎主要識(shí)別gp120之中負(fù)責(zé)與CD4結(jié)合的不連續(xù)的結(jié)構(gòu)抗原決定基?？赡苡捎诓《九c其細(xì)胞配體結(jié)合的需要所施加的突變上的限制，對(duì)這一結(jié)構(gòu)域的抗體是多克隆的并具有更寬范圍交叉中和性。體外分析用來(lái)檢驗(yàn)免疫動(dòng)物的血清阻止gp120與固定在96孔板的CD4的結(jié)合。第二個(gè)體外分析檢測(cè)與代表固定在塑料上的選定V3域的合成多肽的直接抗體結(jié)合。這些分析適用于來(lái)源于我們研究中所用的任何動(dòng)物類型的抗血清，并定義我們的疫苗已產(chǎn)生中和抗體的類型，以及提供在體外與病毒中和作用的關(guān)聯(lián)。
b．gp41含有至少一個(gè)主要中和決定簇，對(duì)應(yīng)于廣譜中和2F5單克隆抗體(可由Viral Testing Systems Corp.,Texas Commerce Tower,600Travis street,Suite 4750,Houston,TX 77002-3005(美國(guó))得到，或由Waldheim Pharmazeutika GmbH,Boltzmangasse 11,A-1091 Wien,Austria得到)識(shí)別的高度保守的線狀抗原決定基和其它潛在的位點(diǎn)，包括位于gp41 N末端保守性好的“融合肽”域。除了上面描述的通過(guò)免疫印跡來(lái)檢測(cè)針對(duì)gp41的抗體外，用一用于抗體的體外分析檢驗(yàn)，所述抗體與代表固定在塑料上的這些域的合成肽結(jié)合。
4．抗體反應(yīng)的成熟。在HIV血清陽(yáng)性病人中，中和抗體反應(yīng)從主要的抗V3發(fā)展到包括更廣譜的中和抗體，這些抗體包含上面描述的(#3)結(jié)構(gòu)gp120域抗原決定基，包括gp41抗原決定基。在當(dāng)時(shí)和隨后的疫苗接種的過(guò)程中監(jiān)測(cè)這些類型的抗體反應(yīng)。B．針對(duì)env和gag的T細(xì)胞反應(yīng)性。
1．CTL反應(yīng)的產(chǎn)生。在細(xì)胞內(nèi)合成的病毒蛋白質(zhì)引起MHCI限制的CTL反應(yīng)。這些蛋白質(zhì)中的每一種在血清陽(yáng)性病人中都誘出CTL。我們的疫苗還能夠在小鼠中誘出CTL。這些小鼠毒株的免疫遺傳學(xué)有助于這些研究，如用流感NP所證明的。已在Balb/C的鼠中定義了HIV蛋白質(zhì)env、REV、nef和gag的幾個(gè)抗原決定基，這樣有利于體外的CTL培養(yǎng)和細(xì)胞毒性分析。最好使用同源腫瘤品系，例如用這些基因轉(zhuǎn)染的鼠肥大細(xì)胞瘤P815，以提供CTL和體外抗原專一性再刺激的靶子。已經(jīng)知道定義能夠誘出MHCI型限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法。還發(fā)現(xiàn)包含氨基酸152-176的肽誘導(dǎo)HIV中和抗體，這些方法可用來(lái)鑒定包含在本發(fā)明的PNV中的致免疫性的抗原決定基。另一方面，可以使用編碼gp160、gp120、蛋白酶或gag的整個(gè)基因。如這里所使用，T細(xì)胞效應(yīng)物功能是與成熟T細(xì)胞表型相聯(lián)系的，例如細(xì)胞毒性、用于B細(xì)胞激活的細(xì)胞因子的分泌和/或巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的補(bǔ)充或刺激。
2．TH活性的測(cè)定。通過(guò)加入或重組蛋白質(zhì)或肽抗原決定基，檢驗(yàn)得自免疫動(dòng)物的回憶專一性抗體的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)物。通過(guò)這些培養(yǎng)物的增殖或細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞被伴隨性脾臟抗原提呈細(xì)胞APC提呈的這些抗原的激活作用。細(xì)胞因子產(chǎn)生的類型還允許將TH反應(yīng)分類為1型和2型。因?yàn)檎純?yōu)勢(shì)的TH2反應(yīng)似乎與免疫平衡的血清陽(yáng)性病人中的細(xì)胞免疫排斥相關(guān)聯(lián)，定義在病人中給定的PNV所引起的反應(yīng)類型是可能的，允許操縱產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
3．延遲型超敏感性(DTH)。i.d.注射后，DTH對(duì)病毒抗原表示細(xì)胞的主要MHCⅡ限制的免疫作用。因?yàn)榭傻玫缴唐沸问降闹亟M體HIV蛋白質(zhì)和已知抗原決定基的合成肽，用這些試劑容易在接種疫苗的脊椎動(dòng)物中測(cè)定DTH反應(yīng)，這樣就提供誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的另一體內(nèi)關(guān)聯(lián)。保護(hù)基于上面的免疫學(xué)研究，可預(yù)言我們的疫苗在脊椎動(dòng)物中對(duì)毒性HIV的攻擊是有效的。在用PNV構(gòu)成物或包含gp160ⅢB、gagⅢB、nefⅢB和REVⅢB的PNV構(gòu)成物混合物充分地疫苗接種黑猩猩后的HIVⅢB/黑猩猩攻擊模型中完成這些研究。ⅢB毒株在這方面是有用的，因?yàn)橐呀?jīng)建立了這種毒株的致死劑量的黑猩猩效價(jià)。然而，用HIV的任何毒株和對(duì)于給定毒株專一性或異源性的抗原決定基來(lái)設(shè)想同樣的研究。除了黑猩猩外，第二個(gè)疫苗接種/攻擊模型是Scid-hu PBL小鼠。在這個(gè)模型允許用隨后的HIV攻擊小鼠宿主檢驗(yàn)人類淋巴系統(tǒng)免疫系統(tǒng)和我們的疫苗。這個(gè)系統(tǒng)是有益的，因?yàn)樗菀走m合于與任何HIV毒株一起使用，并且它提供針對(duì)HIV原始現(xiàn)場(chǎng)分離物的多種毒株的保護(hù)證據(jù)。第三種攻擊模型利用雜種HIV/SIV病毒(SHIV)，它們中一些已顯示感染恒河猴并引起導(dǎo)致死亡的免疫缺陷(參見(jiàn)Li,J.等J.AIDS 5:639-646,1992)。用我們的多核苷酸疫苗構(gòu)成物接種恒河猴，對(duì)用致死劑量的SHIV的后續(xù)攻擊是有保護(hù)性的。PNV構(gòu)成物概述將HIV和其它基因連接到最適于多核苷酸疫苗接種的表達(dá)載體中?；旧先サ羲械耐鈦?lái)DNA，留下轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、免疫原性的抗原決定基、轉(zhuǎn)錄終止子、細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因這些必須元件。
HIV晚期基因如env和gag的表達(dá)是REV依賴性的，并需要REV反應(yīng)元件(RRE)存在于病毒基因轉(zhuǎn)錄物上。在沒(méi)有REV的情況下，通過(guò)用例如來(lái)自tPA(組織型血纖維蛋白溶酶激活物)的異源前導(dǎo)序列，更優(yōu)選是用例如在高度表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白)前導(dǎo)肽中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)肽來(lái)取代gp120前導(dǎo)肽，可以產(chǎn)生一分泌形式的gp120。我們已將tPA-gp120嵌合基因插入到在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中(RD，人橫紋肌肉瘤系)有效表達(dá)分泌gp120的V1Jns中。不加入REV表達(dá)載體，單順?lè)醋觛p160轉(zhuǎn)染時(shí)不產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)。典型的構(gòu)成物組分包括(但不局限于)1．TPA-gp120MN；3．gp160ⅢB；10．gagⅢB對(duì)于抗gag CTL；11．tPA-gp120ⅢB；12．具有結(jié)構(gòu)突變的gp160:V1、V2、和/或V3環(huán)缺失或取代20．編碼抗原的基因，這些抗原由非HIV病原體表達(dá)，例如(但不局限于)流感病毒核蛋白質(zhì)、血細(xì)胞凝集素、基質(zhì)、神經(jīng)氨酸苷酶和其它抗原性蛋白質(zhì)；單純皰疹病毒基因；人乳頭瘤病毒基因；肺結(jié)核抗原；甲、乙或丙性肝炎病毒抗原。
用本發(fā)明的非復(fù)制型質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫，證明多核苷酸HIV免疫原針對(duì)后續(xù)病毒攻擊的保護(hù)性效力。這是有益的，因?yàn)闆](méi)有牽涉感染性因子，不需要病毒粒子的裝配，并允許選擇決定簇。此外，因?yàn)間ag序列和蛋白酶和幾個(gè)其它病毒基因產(chǎn)物在HIV的不同的毒株中是保守的，因此使得能夠保護(hù)抵抗與與獲得克隆基因的毒株同源的和異源的毒性HIV毒株的后續(xù)攻擊。
i.m.注射編碼gp160的DNA表達(dá)載體，導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)后續(xù)病毒攻擊的顯著保護(hù)性免疫。特別是，產(chǎn)生gp160專一性抗體和原始的CTL。盡管可變的被膜蛋白的抗原性變化和漂變，但針對(duì)保守的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答可以是有效的。因?yàn)槊總€(gè)HIV基因產(chǎn)物顯示某種程度的保守性，并因?yàn)轫憫?yīng)胞內(nèi)表達(dá)和MHC加工而產(chǎn)生CTL，因此可予測(cè)許多病毒基因引起類似于gp160所取得的反應(yīng)。這樣，如在表達(dá)載體中克隆的和測(cè)序的接點(diǎn)所顯示的(見(jiàn)下面)，已克隆出許多這些基因，使得這些構(gòu)成物為可利用形式的免疫原劑。
本發(fā)明提供一種手段，不需要自主復(fù)制型因子或佐劑，來(lái)誘導(dǎo)交叉毒株保護(hù)性免疫。另外，用本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行免疫提供許多其它的益處。該疫苗接種方法應(yīng)適用于腫瘤和感染性因子，因?yàn)镃D8+CTL反應(yīng)對(duì)病理生理過(guò)程都是重要的[K.Tanaka等，Annu.Rev.Immunol.6,359(1988)]。因此，引起針對(duì)對(duì)于轉(zhuǎn)化過(guò)程為決定性的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，可能是一種有效的腫瘤預(yù)防或免疫治療手段。注射病毒蛋白質(zhì)和人生長(zhǎng)激素DNA后，產(chǎn)生針對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)的高效價(jià)抗體提示這是制備或單獨(dú)的、或與導(dǎo)向保守抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞疫苗聯(lián)合的、基于抗體的疫苗的一種易做到的和高效的手段。
生產(chǎn)和純化DNA構(gòu)成物的容易性可有利地與傳統(tǒng)純化蛋白質(zhì)的方法相比較，這樣有利于產(chǎn)生聯(lián)合疫苗。因此，可以制備、混合和共給與例如編碼gp160、gp120、gp41或任何其它HIV基因的多種構(gòu)成物。因?yàn)镈NA注射后保持蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此可提高B-和T-細(xì)胞記憶的持久性，借此引起長(zhǎng)效的體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
用于制備和純化DNA構(gòu)成物的分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使制備本發(fā)明的DNA免疫原成為可能。盡管標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)因此足以用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)物，但這里公開的專一性構(gòu)成物提供驚人地產(chǎn)生交叉毒株和原始HIV分離物中和作用的新型多核苷酸免疫原，這是用標(biāo)準(zhǔn)失活的全病毒或亞基蛋白質(zhì)疫苗到目前為止未得到的結(jié)果。
待導(dǎo)入疫苗受體中可表達(dá)的DNA或轉(zhuǎn)錄的RNA的量將取決于所使用的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)子的強(qiáng)度和表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。一般來(lái)說(shuō)，將大約1ng-100mg，最好為10μg-300μg的免疫學(xué)或預(yù)防有效劑量直接給予到肌肉組織中。也設(shè)想皮下注射、皮內(nèi)導(dǎo)入、通過(guò)皮膚壓印、和其它的給藥模式，例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或吸入傳送。還設(shè)想了提供加強(qiáng)免疫接種。還設(shè)想了在用HIV多核苷酸免疫原疫苗接種后，用HIV蛋白質(zhì)免疫原(例如gp160、gp120和gag基因產(chǎn)物)加強(qiáng)免疫。例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或其它給藥方式的腸胃外給與白細(xì)胞介素-12蛋白質(zhì)，同時(shí)或隨后腸胃外導(dǎo)入本發(fā)明的PNV也是有益的。
該多核苷酸可以是裸露的，就是說(shuō)，不與對(duì)接受者免疫系統(tǒng)有影響的任何蛋白質(zhì)、佐劑或其它試劑結(jié)合。在這種情況下，最好該多核苷酸是存在于生理上可接受的溶液中，例如但不局限于無(wú)菌鹽水或無(wú)菌緩沖鹽水。另一方面，該DNA可與脂質(zhì)體、例如卵磷脂脂質(zhì)體或其它本領(lǐng)域已知的脂質(zhì)體結(jié)合，作為DNA-脂質(zhì)體混合物，或該DNA可與本領(lǐng)域已知的佐劑(例如蛋白質(zhì)或其它載體)結(jié)合，來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如但不局限于鈣離子的幫助細(xì)胞攝入DNA的試劑，也能有益地應(yīng)用。這些試劑在這里通常被稱為轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑和藥學(xué)上可接受的載體。用于包被包被有多核苷酸的微彈的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且也可用來(lái)與本發(fā)明相結(jié)合。
下面的實(shí)施例是以說(shuō)明的方式提供，并且不希望以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1材料說(shuō)明載體pF411和pF412這些載體是從R.Gallo實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的載體pSP62亞克隆來(lái)的。pSP62是從Biotech Research Laboratories,Inc.得到的試劑。pSP62有一從λHXB2亞克隆得到的HXB2基因組的12.5kb XbaⅠ片段。pSP62的SalⅠ和XbaⅠ消化產(chǎn)生HXB2片段5’-XbaⅠ/SalⅠ,6.5kb和3’-SalⅠ/XbaⅠ,6kb。將這些插入物亞克隆到pUC 18的SmaⅠ和SalⅠ位點(diǎn)上，產(chǎn)生pF411(5’-XbaⅠ/SalⅠ)和pF412(3’-XbaⅠ/SalⅠ)。pF411含有g(shù)ag/pol，而pF412含有tat/env/nef。Repligen試劑重組rev(ⅢB),#RP1024-10rec.gp120(ⅢB),#RP1001-10抗rev單克隆抗體，#RP1029-10抗gp120 mAB,#1C1,#RP1010-10AIDS研究和參考試劑方案抗gp41 mAB雜交瘤，Chessie8,#526設(shè)計(jì)了方案來(lái)誘導(dǎo)對(duì)HIV、主要是針對(duì)HIV gag(～95％保守)和env(gp160或gp120；70-80％保守)基因產(chǎn)物的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和中和抗體反應(yīng)。gp160含有僅已知的HIV粒子上的中和抗體抗原決定基，而抗env和抗gag CTL反應(yīng)的重要性被已知的這些細(xì)胞免疫的觸發(fā)與感染后原發(fā)性病毒血癥的清除的關(guān)系所突出，這一反應(yīng)發(fā)生在中和抗體出現(xiàn)之前，以及CTL在維持無(wú)病狀況方面起作用。因?yàn)镠IV的遺傳多樣性是眾所周知的，我們希望通過(guò)包括得自臨床分離物和gp41(～90％保守)的幾個(gè)代表性env基因，來(lái)獲得更寬范圍的中和抗體，同時(shí)高度保守的gag基因應(yīng)產(chǎn)生廣譜的交叉毒株CTL反應(yīng)。
實(shí)施例2HIV晚期基因產(chǎn)物的異源性表達(dá)例如env和gag的HIV結(jié)構(gòu)基因需要HIV調(diào)節(jié)基因rev的表達(dá)，以有效地產(chǎn)生全長(zhǎng)蛋白質(zhì)。我們已發(fā)現(xiàn)rev依賴性的gag表達(dá)產(chǎn)生低水平的蛋白質(zhì)，并且rev自身對(duì)細(xì)胞可能是毒性的。盡管在體外我們獲得了相對(duì)高水平的rev依賴性的gp160表達(dá)，但在體內(nèi)用rev/gp160 DNA免疫后，這一疫苗引出低水平的針對(duì)gp160的抗體。這可能產(chǎn)生于rev已知的細(xì)胞毒性和在含有數(shù)以百計(jì)核的肌小管中獲得rev功能的日益增加的困難(rev蛋白需要在和發(fā)生gag或env蛋白表達(dá)的rev依賴性轉(zhuǎn)錄物相同的核中)。然而，用env基因、gag的選定修飾來(lái)獲得不依賴rev的表達(dá)已是可能的。這些用于疫苗目的質(zhì)粒的評(píng)價(jià)正在進(jìn)行之中。
一般來(lái)說(shuō)，我們的疫苗已利用原始的HIV(ⅢB)env和gag基因，來(lái)使在我們的泛化疫苗接種載體V1Jns中的表達(dá)最佳化，V1Jns由CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子、BGH多腺苷酸化位點(diǎn)和pUC骨架組成。不依賴rev的env表達(dá)的不同效率取決于使用多大的基因片段(例如gp120對(duì)gp160)，可以通過(guò)用來(lái)自組織專一性血纖維蛋白質(zhì)溶酶激活子(tPA)基因的前導(dǎo)肽取代其天然分泌性前導(dǎo)肽，并且表達(dá)CMVIE啟動(dòng)子后面的產(chǎn)生的具有CMV內(nèi)含子A的嵌合基因來(lái)得到。tPA-gp120是一分泌的gp120載體的例子，以這種形式構(gòu)成的載體行使的作用足以在疫苗接種的小鼠和猴中引起抗gp120免疫應(yīng)答。
因?yàn)閾?jù)報(bào)道膜錨著蛋白與分泌的蛋白質(zhì)相比，可以誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)得多的(并可能對(duì)HIV中和更專一性)的抗體反應(yīng)和得到另外的免疫抗原決定基，我們制備了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫印跡分析所顯示的，不加入rev，該tPA-gp160載體產(chǎn)生可檢測(cè)量的gp160和gp120，盡管表達(dá)水平比rev依賴型gp160表達(dá)質(zhì)粒rev/gp160得到的低得多。這可能是因?yàn)橘x予rev依賴于gp160轉(zhuǎn)錄物的抑制區(qū)域(命名為INS)出現(xiàn)在gp160之中包括在gp41的COOH末端的多個(gè)位點(diǎn)上(參見(jiàn)下面圖示)。制備了tPA-gp160的COOH末端截短形式的載體tPA-gp143，設(shè)計(jì)這種載體，以通過(guò)消除這些抑制序列來(lái)提供env的總體表達(dá)水平。該gp143載體還消除了包含已知引起膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶酶體上而不是細(xì)胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞內(nèi)gp41區(qū)域。這樣，與全長(zhǎng)gp160相比，可能期望gp143既提高env蛋白的表達(dá)水平(通過(guò)降低rev依賴性)，也提高蛋白質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞表面的效率，在那里這些蛋白質(zhì)更能夠在DNA疫苗接種后誘出抗gp60抗體。通過(guò)rev反應(yīng)元件(RRE)序列(350bp)廣泛的沉默誘變來(lái)進(jìn)一步修飾tPA-gp143，以消除另外的表達(dá)抑制序列。這個(gè)構(gòu)成物gp143/mutRRE以兩種形式制備或消除(形式A)、或保留(形式B)gp120/41的蛋白酶解位點(diǎn)。制備了兩種形式，因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)道用在牛痘中表達(dá)的不可酶切的gp160疫苗接種小鼠，誘出的抗體比可酶切形式的gp160接種小鼠的水平高得多。
開發(fā)了在細(xì)胞轉(zhuǎn)染子中g(shù)p160/gp120表達(dá)的定量ELISA，來(lái)測(cè)定這些載體的相對(duì)表達(dá)能力。在體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，定量測(cè)定細(xì)胞結(jié)合的對(duì)分泌的/釋放的gp120產(chǎn)生下列結(jié)果(1)tPA-gp160表達(dá)的gp120比rev/gp160低5-10倍，胞內(nèi)gp120與運(yùn)送到細(xì)胞表面的gp120保持相似的比率。(2)tPA-gp143產(chǎn)生的gp120的分泌比rev/gp160大3-6倍，僅具有低水平的細(xì)胞結(jié)合gp143，這證明gp160的胞質(zhì)尾引起gp160胞內(nèi)滯留，這一現(xiàn)象能通過(guò)部分缺失該序列來(lái)克服；并且，(3)tPA-gp143/mutRREA和B產(chǎn)生的蛋白表達(dá)水平比親代tPA-gp143大～10倍，同時(shí)證明形式A消除了蛋白酶解加工。
因此，我們?yōu)樵黾硬灰蕾噐ev的表達(dá)的策略，已導(dǎo)致逐漸增加總體表達(dá)水平以及使膜錨著gp143遠(yuǎn)離溶酶體、重導(dǎo)向細(xì)胞表面。重要的是注意到將得自不同的原始病毒分離物的gp120序列插入含有或位于NH2末端(tPA引物)或位于COOH末端(gp41)的這些修飾的載體盒之中應(yīng)該是可能的，這兩個(gè)末端在不同的病毒毒株間幾乎沒(méi)有抗原差異。換句話說(shuō)，這是可以容易地通過(guò)插入得自不同原始病毒分離物的gp120來(lái)修飾的種屬構(gòu)成物，以獲得臨床相關(guān)的疫苗。
將這些表達(dá)策略應(yīng)用到與疫苗目的有關(guān)的病毒上，并確定我們方法的通用性，我們還制備了得自原始HIV分離物(含有北美人共有V3肽環(huán)；巨噬細(xì)胞向性和非合胞體誘導(dǎo)表型)的tPA-gp120載體。這個(gè)載體在轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞中產(chǎn)生gp120的高度表達(dá)/分泌，并在小鼠中誘出抗gp120抗體，表明它以功能形式克隆。原始分離物gp160基因也可以用于與得自實(shí)驗(yàn)室毒株的gp160同樣的方式表達(dá)。
實(shí)施例3對(duì)HIV-1 env多核苷酸疫苗的免疫應(yīng)答接受gp120 DNA疫苗的非洲綠猴(AGM)和恒河猴(RHM)在疫苗接種2-3次后，顯示低水平的中和抗體，這不能通過(guò)額外的疫苗接種來(lái)增加。在HIV疫苗領(lǐng)域日益認(rèn)識(shí)到對(duì)于誘出中和性抗體，寡聚gp160可能是比gp120單體更妥當(dāng)?shù)陌锌乖?Moore和Ho,J.Virol.67:863(1993))，這些結(jié)果和這種認(rèn)識(shí)引導(dǎo)我們致力于得到基于gp160載體的有效表達(dá)(見(jiàn)上文)。小鼠和AGM也用原始分離物來(lái)源的tPA-gp120疫苗來(lái)接種。這些動(dòng)物顯示抗V3肽(用同源性序列)交互的終點(diǎn)抗體效價(jià)，范圍為500～5000，這證實(shí)該疫苗設(shè)計(jì)對(duì)于臨床相關(guān)的病毒分離物是有作用的。
基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中不能持續(xù)地誘出抗體反應(yīng)，或產(chǎn)生低的抗體效價(jià)。我們用tPA-gp143質(zhì)粒的在鼠中和AGM中兩次疫苗接種后，產(chǎn)生的幾何平均效價(jià)＞103。這些數(shù)據(jù)表明，我們通過(guò)提高表達(dá)水平，已顯著改進(jìn)了gp160樣疫苗的免疫原性。將繼續(xù)記述該構(gòu)成物以及tPA-gp143/mutRRE A和B載體的抗體反應(yīng)的特征，特別是病毒中和的特征。
顯然，gp120 DNA疫苗接種在所有受試的淋巴區(qū)(脾臟、血液、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和髂骨淋巴結(jié))都產(chǎn)生有效的輔助T細(xì)胞反應(yīng)，具有TH1樣細(xì)胞因子分泌輪廓(即g-干擾素和IL-2的產(chǎn)生，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有IL-4)。這些細(xì)胞因子一般啟動(dòng)強(qiáng)細(xì)胞免疫，并已經(jīng)與HIV血清陽(yáng)性病人無(wú)病狀態(tài)的維持有關(guān)聯(lián)。已經(jīng)表明淋巴結(jié)是HIV復(fù)制的主要部位，當(dāng)病毒不易在血液中檢測(cè)到時(shí)，淋巴結(jié)含有大儲(chǔ)藏量的病毒。能夠在各種各樣的淋巴部位中引起抗HIV免疫應(yīng)答的疫苗，例如用我們的DNA疫苗已經(jīng)顯示的，可以協(xié)助阻止最初感染后淋巴管的成功移生。
如前面所述的，我們認(rèn)為實(shí)現(xiàn)下面的目標(biāo)，對(duì)于把我們這一項(xiàng)目成功的機(jī)會(huì)增加到最大程度是最重要的(1)能夠在靈長(zhǎng)類中產(chǎn)生較強(qiáng)中和抗體反應(yīng)的基于env的載體；(2)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中引起以CTL和輔助效應(yīng)物功能為特征的強(qiáng)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的gag和env載體；(3)在我們的疫苗中利用來(lái)自臨床上相關(guān)HIV-1毒株的env和gag基因并記述它們引起的免疫學(xué)反應(yīng)特征，特別是對(duì)原始分離物的中和作用；(4)用合適的最優(yōu)化疫苗證明在例如黑猩猩/HIV(ⅢB)或恒河猴/SHIV的動(dòng)物攻擊模型中的保護(hù)作用；以及，(5)確定適于臨床應(yīng)用的免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間。這些目標(biāo)的前三個(gè)已取得了顯著的進(jìn)展，確定我們最近的gp160和gag疫苗接種構(gòu)成物是否改善這些最初結(jié)果的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行之中。
實(shí)施例4用于疫苗生產(chǎn)的載體A．V1Jneo表達(dá)載體去除用于含有V1J的細(xì)菌的抗生素選擇的ampr基因是必要的，因?yàn)榘逼S青霉素不能用在大規(guī)模的發(fā)酵罐中。通過(guò)用SspⅠ和Eam1105I限制性內(nèi)切酶消化，從V1J的pUC骨架中去除ampr基因。用瓊脂糖凝膠電泳純化剩下的質(zhì)粒，用T4 DNA聚合酶鈍化末端，然后用小牛腸的堿性磷酸酶處理。用PstⅠ限制性內(nèi)切酶切除包含在pUC4K質(zhì)粒內(nèi)的得自轉(zhuǎn)座子903的市售kanr基因，用瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4 DNA聚合酶鈍化末端。將這一片段與V1J骨架相連接，并衍生出具有任意方向kanr基因的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒被命名為V1Jneo#’s 1和3。用限制性酶消化分析、接合點(diǎn)區(qū)域的DNA測(cè)序證實(shí)這些質(zhì)粒的每一種，表明產(chǎn)生和V1J類似量的質(zhì)粒。異源性基因產(chǎn)物的表達(dá)也可與V1J的這些V1Jneo載體相比擬。我們?nèi)我膺x擇其中包含的kanr基因的方向與V1J中的ampr基因相同的V1Jneo#3(下文稱為V1Jneo)作為該表達(dá)構(gòu)成物。B．V1Jns表達(dá)載體將一SfiⅠ位點(diǎn)加入V1Jneo中以有利于整合作用研究。將一市售的13個(gè)堿基對(duì)的SfiⅠ接頭(New England Biolabs)加入該載體BGH序列中的KpnⅠ位點(diǎn)上。V1Jneo用KpnⅠ線狀化、用凝膠純化、用T4 DNA聚合酶鈍化并連接到鈍化的SfiⅠ接頭上。通過(guò)限制性圖譜分析來(lái)選擇克隆的分離物，并通過(guò)該接頭的測(cè)序來(lái)確認(rèn)克隆分離物。這個(gè)新的載體命名為V1Jns。V1Jns中(有SfiⅠ)異源基因的表達(dá)可與V1Jneo中(有KpnⅠ)的相同基因的表達(dá)相比擬。C．V1Jns-tPA為了將異源前導(dǎo)肽序列提供給分泌蛋白和/或膜蛋上，將V1Jn修飾，以包含人組織專一性血纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)前導(dǎo)序列。將兩個(gè)合成的互補(bǔ)寡聚物退火，然后連接到已被BgⅢ消化的V1Jn上。有義寡聚物和反義寡聚物是5’-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAGAGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTCTTC GTT TCG CCC AGC GA-3’,SEQ.ID:18和5’-GAT CTC GCT GGGCGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCAGAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3’。Kozak序列是有義寡聚物的下劃線部分。這些寡聚物有突出的堿基，適合于連接到BgⅢ切割的序列上。連接后破壞上游BgⅢ位點(diǎn)，而保留下游BgⅢ用于后續(xù)的連接。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)連接點(diǎn)以及整個(gè)tPA前導(dǎo)序列。另外，為了與我們的一致最佳化載體V1Jns(=具有SfiⅠ位點(diǎn)的V1Jneo)一致，通過(guò)用T4 DNA聚合酶鈍化KpnⅠ位點(diǎn)，接著與SfiⅠ接頭(分類號(hào)#1138,NewEngland Biolabs)連接，將SfiⅠ限制位點(diǎn)置于V1Jn-tPA的BGH終止子區(qū)域中的KpnⅠ位點(diǎn)上。用限制消化和瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)這種修飾。
實(shí)施例5Ⅰ．HIV env疫苗構(gòu)成物產(chǎn)生分泌型env來(lái)源抗原(gp120和gp140)的疫苗如gp120的rev依賴型env基因的表達(dá)是如下進(jìn)行的將gp120從HIV的MN毒株用PCR克隆出來(lái)，該毒株或帶有天然前導(dǎo)肽序列(V1Jns-gp120)，或是作為于組織特異性纖維蛋白的溶酶原激活劑(tPA)前導(dǎo)肽的融合物而取代天然前導(dǎo)肽(V1Jns-tPA-gp120)。已顯示tPA-gp120的表達(dá)不依賴rev[B.S Chapman等，Nuc.Acids Res.19,3979(1991)；應(yīng)注意的是其它前導(dǎo)序列可能提供類似的功能，使gp120基因不依賴rev]。這可以通過(guò)用上面描述過(guò)的載體制備下列g(shù)p120構(gòu)成物來(lái)完成
實(shí)施例6gp120疫苗構(gòu)成物A．V1Jns-tPA-HIVMNgp120用設(shè)計(jì)以除去該肽前導(dǎo)序列前30個(gè)氨基酸并且促進(jìn)克隆于V1Jns-tPA中的寡聚物，PCR擴(kuò)增HIVMNgp120基因(Medimmune)，以產(chǎn)生含有tPA前導(dǎo)肽、在氨基酸殘基30后接剩余的gp120序列的嵌合蛋白。這種設(shè)計(jì)允許不依賴rev的gp120表達(dá)，以及從包含有這種質(zhì)粒的細(xì)胞中分泌可溶性gp120。所用有義和反義PCR寡聚物是5’-CCC CGG ATCCTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’和5’-C CCCAGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCTTCT C-3’。翻譯終止密碼已劃下劃線標(biāo)出。這些寡聚物在該翻譯開放閱讀框架的任一末端含有BamHI限制性酶切位點(diǎn)，而在有義寡聚物的3’端有一BClⅠ位點(diǎn)。該P(yáng)CR產(chǎn)物相繼用內(nèi)切酶BClⅠ和BamHI消化，再連接到已被BglⅡ消化隨后用小牛腸堿性磷酸酶處理過(guò)的V1Jns-tPA中。產(chǎn)生的載體經(jīng)序列分析證實(shí)，在tPA前導(dǎo)序列和pg120編碼序列之間有框內(nèi)融合；并且通過(guò)轉(zhuǎn)染的RB細(xì)胞免疫印跡法分析證實(shí)gp120的表達(dá)和分泌。B．V1Jns-tPA-HIVⅢBgp120此載體與I.A.類似，其差別是HIVⅢB毒株用于gp120序列。有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTGTGG GTC ACA GTC-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCTTTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3’。這些寡聚物提供位于該插入物任一末端的BclⅠ位點(diǎn)和恰好位于3’末端的BclⅠ位點(diǎn)上游的EcoRV。5’末端的BclⅠ位點(diǎn)充許連接到V1Jns-tPA的BglⅡ位點(diǎn)，以形成一個(gè)嵌合tPA-gp120基因，它編碼tPA前導(dǎo)序列和gp120，而沒(méi)有其天然前導(dǎo)序列。連接產(chǎn)物通過(guò)限制性消化和DNA序列分析而證實(shí)。
實(shí)施例7gp140疫苗構(gòu)成物類似于tPA-gp120，用tPA前導(dǎo)序列取代該天然前導(dǎo)序列通過(guò)PCR制備這些構(gòu)成物，但是通過(guò)緊接該跨膜蛋白的NH2末端終止基因，設(shè)計(jì)生產(chǎn)分泌型抗原(預(yù)定的羧基末端氨基酸序列=NH2-……TNWLWYIK-COOH)。不象產(chǎn)生gp120的構(gòu)成物，gp140構(gòu)成物應(yīng)該產(chǎn)生低聚體的抗原，且保留有已知的含有g(shù)p41的抗體中和抗原決定基，如2F5單克隆抗體限定的ELDKWA。
根據(jù)gp160蛋白酶解切割位點(diǎn)在gp120和gp41的連接處是保留(B)還是通過(guò)Kieny等(Prot.Eng.2:219-255(1988))描述的用合適的氨基酸置換刪除(A)，以2種形式(A或B)制備構(gòu)成物(野生型序列=NH2-…KAKRRV VQRERR…COOH；突變型序列=NH2-…KAQNHVVQNEHQ…COOH，劃線處示突變的氨基酸)。A．V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13’-UTR(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物用以下有義和反義PCR寡聚物通過(guò)PCR方法獲得5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTCTGG-3’,SEG.ID和5’-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATCTTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3’，以從載體ⅣB(含有最佳化的RRE-A區(qū)段)中得到一個(gè)AvrⅡ/EcoRⅤ區(qū)段。該3’-UTR為制備的合成基因片段，它來(lái)源于猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒1(SRV-1，參見(jiàn)下文)，已將其插入緊接gp140開放閱讀框架的3’端導(dǎo)入的SrfⅠ限制性酶切位點(diǎn)中。該UTR列先前已描述為促進(jìn)HIV env和gag的不依賴rev的表達(dá)。B． V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13’-UTR(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物與ⅡA類似，區(qū)別在于env蛋白酶解切割位點(diǎn)已通過(guò)用構(gòu)成物ⅣC作為起始材料而被保留。C．V1Jns-tPA-gp140/opt30-A(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物來(lái)源于ⅣB，通過(guò)AvrⅡ和SrfⅠ限制性內(nèi)切酶消化后，接著通過(guò)對(duì)應(yīng)于gp30、但包含最適于翻譯的密碼子(參見(jiàn)以下gp32-opt)的合成DNA區(qū)段的連接而成。該gp30-opt DNA通過(guò)PCR從gp32-opt擴(kuò)增而獲得，使用的有義和反義寡聚物分別是5’-GGT ACA CCT AGG CATCTG GGG CTG CTC TGG-3’和5’-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG CTTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3’。此DNA區(qū)段用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ和SrfⅠ消化，并連接到已用AvrⅡ和SrfⅠ消化的V1Jns-tPA-gp143/opt32-A(ⅣD)上，以除去相應(yīng)的DNA區(qū)段。所形成的產(chǎn)物通過(guò)連接接點(diǎn)的DNA序列分析和免疫印跡法分析而證實(shí)。D．V1Jns-tPA-gp140/opt30-B(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物與ⅡC類似，區(qū)別是已保留env蛋白酶解切割位點(diǎn)。E．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為A這種構(gòu)成物的env基因含有完整的最適密碼子。恒定區(qū)(C1、C5、gp32)是在ⅣB、D、H中描述的那些區(qū)域，用由最適于翻譯的密碼子構(gòu)成的區(qū)段(見(jiàn)下列基于HIV-1 MN V1-V5的實(shí)施例)加入一條對(duì)應(yīng)于可變區(qū)1-5的額外合成的DNA區(qū)段。F．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為B此構(gòu)成物與ⅡE相似，區(qū)別在于保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。G．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為A(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與上面的ⅡE相似，區(qū)別是用來(lái)自于非ⅢB毒株的env氨基酸序列來(lái)確定整個(gè)可變區(qū)(V1-V5)的最適密碼子用法。H．V1Jns-tPA-gp140/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與ⅡG相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。
實(shí)施例8gp160疫苗構(gòu)成物按照上文描述的，依據(jù)哪一種gp160蛋白酶解切割位點(diǎn)，以2種形式(A或B)制備構(gòu)成物。A．V1Jns-rev/env此載體是上述D節(jié)中描述載體的變異型，其區(qū)別是缺失外顯子1中完整的tat編碼區(qū)直至REV開放閱讀框架的開頭部分。V1Jns-gp160ⅢB(見(jiàn)上文A節(jié))用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和KpnⅠ消化以切除gp160基因的5’區(qū)。用PCR擴(kuò)增得到一個(gè)編碼第一個(gè)REV外顯子直至來(lái)源于HXB2基因組克隆的gp160中KpnⅠ位點(diǎn)的DNA區(qū)段。所述有義和反義PCR寡聚物分別是5’-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGAAGC GGA GAC-3’和5’-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACTGTG ACC-3’。這些寡聚物分別在該DNA片段的5’和3’末端提供PstⅠ和KpnⅠ限制性酶切位點(diǎn)。產(chǎn)生的DNA用PstⅠ和KpnⅠ消化，用瓊脂糖凝膠電泳純化，并與V1Jns-gp160(PstⅠ/KpnⅠ)連接。產(chǎn)生的質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)限制性內(nèi)切酶消化而證實(shí)。B．V1Jns-gp160通過(guò)從包含來(lái)源于HIVⅢb克隆HXB2的HIVⅢb基因組的3’末端一半的質(zhì)粒pF412中PCR擴(kuò)增而克隆HIVⅢbgp160。此PCR有義和反義寡聚物分別為5’-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAGAAA TAT CAG C-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATCTTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3’。劃線部分為Kozak序列和翻譯終止密碼子。這些寡聚物在env基因兩端的翻譯開放閱讀框架外提供BclⅠ限制性酶切位點(diǎn)。(BclⅠ消化酶切位點(diǎn)適合于與BglⅡ消化酶切位點(diǎn)連接，隨后喪失了對(duì)兩種限制性酶的敏感性。選擇BclⅠ用于PCR克隆的gp160，因?yàn)樵摶驇в袃?nèi)部BglⅠ位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn))。正象上文為其它PCR得到的基因描述的那樣，反義寡聚物也加入一個(gè)正好在BclⅠ位點(diǎn)之前的EcoRV位點(diǎn)。擴(kuò)增的gp160基因用瓊脂糖凝膠電泳純化，用BclⅠ消化，連接到已用BglⅡ消化并用小牛腸堿性磷酸酶處理過(guò)的V1Jns上。此克隆基因的大小約為2.6kb，用DNA序列分析來(lái)證實(shí)V1Jns與gp160的每個(gè)連接點(diǎn)。C．V1Jns-tPA-gp160(基于HIV-1ⅢB)此載體與上面實(shí)施例1(C)類似，區(qū)別是用PCR法獲得不帶有天然前導(dǎo)序列的全長(zhǎng)gp160。有義寡聚物與使用于I.C.中的相同，反義寡聚物為5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AATCCT TTC C-3’。這些寡聚物在該插入物一個(gè)末端提供BclⅠ位點(diǎn)，恰好在3’末端BclⅠ位點(diǎn)的上游提供一個(gè)EcoRV位點(diǎn)。5’末端BclⅠ位點(diǎn)允許連接到V1Jns-tPA的BglⅡ位點(diǎn)中，產(chǎn)生編碼tPA前導(dǎo)序列和不含有其天然前導(dǎo)序列的gp160的一個(gè)嵌合tPA-gp160基因。連接產(chǎn)物通過(guò)限制性消化和DNA序列分析而證實(shí)。D．V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物基于ⅣH，帶有對(duì)于C5和gp41而非gp32完整的最適宜密碼子區(qū)段，帶有一個(gè)額外最適宜密碼子區(qū)段(見(jiàn)下文)來(lái)取代位于接著tPA前導(dǎo)序列后的gp120氨基末端的C1。通過(guò)SOE PCR法用合成連接的C1/143片段的下列PCR寡聚物，將該新C1區(qū)段連接到剩余的gp143的片段上5’-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAGAAT GAT ACT AAT AC-3’。產(chǎn)生的gp143基因除了V1-V5區(qū)域以外含有合適的密碼子用法，且有一個(gè)獨(dú)特的PmeⅠ限制性酶切位點(diǎn)，它位于C1和V1的連接區(qū)域以利于加入其它HIV基因的可變區(qū)。E． V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物與ⅢD相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。F．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為A(基于HIV-1ⅢB)此構(gòu)成物的env基因由上述完整的最適宜密碼子組成。其恒定區(qū)(C1、C5、gp32)是那些已在ⅢD、作為盒子使用(用于所有完整的最適宜的gp160)的ⅢE中描述過(guò)的，而可變區(qū)V1-V5得自一個(gè)由最適宜密碼子組成的合成DNA區(qū)段。G．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為B此構(gòu)成物與ⅢF相似，區(qū)別是保留了env蛋白酶解切割位點(diǎn)。H．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為A此構(gòu)成物與上面的ⅢF相似，區(qū)別是來(lái)源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個(gè)可變區(qū)(V1-V5)的最適密碼子用法。Ⅰ．V1Jns-tPA-gp160/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與ⅢH相似，區(qū)別是保留了env蛋白酶解切割位點(diǎn)。
實(shí)施例9gp143疫苗構(gòu)成物類似于上述其它含有tPA的構(gòu)成物(tPA-gp120、tPA-gp140和tPA-gp160)，通過(guò)PCR制備這些構(gòu)成物，tPA前導(dǎo)序列取代其天然前導(dǎo)序列，但是設(shè)計(jì)產(chǎn)生COOH封端的膜結(jié)合env(預(yù)定的胞內(nèi)氨基酸序列=NH2-NRVRQGYSP-COOH)。此構(gòu)成物的設(shè)計(jì)目的是結(jié)合伴隨tPA導(dǎo)入的env較高的表達(dá)，并將對(duì)應(yīng)于env胞內(nèi)部分的轉(zhuǎn)錄物或肽區(qū)域可能對(duì)表達(dá)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性/轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面有負(fù)影響的可能性降低到最小程度。如上所述，根據(jù)gp160蛋白酶解切割位點(diǎn)是切除還是保留，以2種形式(A或B)制備構(gòu)成物。產(chǎn)生于截短至gp143的殘余gp41片段稱為gp32。A．V1Jns-tPA-gp143用質(zhì)粒pF412，用以下有義和反義寡聚物通過(guò)PCR制備此構(gòu)成物5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’,SEQ.ID和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGAATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’。產(chǎn)生的DNA區(qū)段在任一末端含有BclⅠ限制性位點(diǎn)，以克隆入位于BglⅡ消化過(guò)的V1-Jns-tPA的緊接3’-到env開放閱讀框架的SrfⅠ位點(diǎn)上。所述構(gòu)成物用連接接點(diǎn)的DNA序列分析以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫印跡法分析來(lái)證實(shí)。B．V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A此構(gòu)成物基于ⅣA，用上述獨(dú)特的MunⅠ限制性酶位點(diǎn)和下游的SrfⅠ位點(diǎn)切除該DNA區(qū)段。該區(qū)段與gp120 C5域的一部分和整個(gè)gp32相對(duì)應(yīng)。合成的DNA區(qū)段對(duì)應(yīng)于約350bp的gp160的rev反應(yīng)元件(RRE A)，由對(duì)翻譯最適宜的密碼子組成，將其通過(guò)剪接重疊延伸(SOE)PCR方法在兩個(gè)區(qū)段的接點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)AvrⅡ限制性酶切位點(diǎn)(但在氨基酸序列上無(wú)改變)，連接到剩余的gp32片段上。為產(chǎn)生含有g(shù)p32的區(qū)域，用下列有義和反義PCR寡聚物來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述寡聚物分別為5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3’和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCCCTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’(該寡聚物用作ⅣA的反義寡聚物)。通過(guò)SOE PCR方法，用以下寡聚物將突變型RRE(mutRRE-A)區(qū)段與gP32的野生型序列連接由于寡聚物為5’-GGT ACA CAA TTG GAGGAG CGA GTT ATA TAA ATA TAA G-3’，反義寡聚物用于產(chǎn)生gp32區(qū)段。產(chǎn)生的連接DNA區(qū)段用MunⅠ和SrfⅠ限制酶消化，并連接到母本gp143/MunⅠ/SrfⅠ消化的質(zhì)粒中。產(chǎn)生的構(gòu)成物通過(guò)連接和SOE PCR接點(diǎn)的DNA序列分析和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫印跡證實(shí)。C．V1Jns-tPA-gp143/murRRE2-B此構(gòu)成物與ⅣB相似，區(qū)別是利用mutRRE-B合成基因區(qū)段取代mutRRE-A而保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。D．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A此構(gòu)成物來(lái)源于ⅣB，通過(guò)AvrⅡ和SrfⅠ消化后連接與gp32相對(duì)應(yīng)但由對(duì)翻譯最適宜密碼子(見(jiàn)下文gp32opt)組成的合成DNA區(qū)段而構(gòu)建。產(chǎn)生構(gòu)成物用連接接點(diǎn)的DNA序列分析和免疫印跡法證實(shí)。E．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B此構(gòu)成物與ⅣD相似，區(qū)別是通過(guò)用ⅣC作為最初的質(zhì)粒而保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。G．V1Jns-tPA-gp143/SRV-13’-UTR此構(gòu)成物與ⅣA相似，區(qū)別是將來(lái)源于猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒-1(SRV-1，見(jiàn)下文)的3’-UTR加入緊接gp143開放閱讀框架3’端導(dǎo)入的SrfⅠ限制性酶切位點(diǎn)。此UTR序列前面已描述為促進(jìn)HIV env和gag的rev非依賴型表達(dá)。H．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A此構(gòu)成物基于ⅣD，它有C5和gp32的完整的最適宜密碼子區(qū)段段，帶有在tPA前導(dǎo)序列后的gp120的氨基末端取代C1的另一最適密碼子區(qū)段(見(jiàn)下文)。通過(guò)SOE PCR，用下列合成連接的C1/143區(qū)段的PCR寡聚物將這條新C1區(qū)段與剩余的gp143片段連接5’-CCT GTG TGTGAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3’。產(chǎn)生的gp143基因除去V1-V5區(qū)外含有最適密碼子用法，且有一獨(dú)特的PmeⅠ限制酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于C1和V1的接合處，用于插入其它HIV基因的可變區(qū)。I．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt 32 B此構(gòu)成物與ⅣH相似，區(qū)別是仍保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。J．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為A此構(gòu)成物的env基因全部由最適密碼子組成。其恒定區(qū)(C1、C5、gp32)是在4B、D、H中描述過(guò)的那些區(qū)域，用由對(duì)翻譯最適密碼子組成的合成DNA區(qū)段插入另一對(duì)應(yīng)于可變區(qū)V1-V5的合成DNA片區(qū)段。K．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為B此構(gòu)成物與ⅣJ相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。L．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為A(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與上面的ⅢG相似，區(qū)別是來(lái)源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個(gè)可變區(qū)(V1-V5)的最適密碼子。M．V1Jns-tPA-gp143/opt全部為B(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與ⅢG相似，區(qū)別是來(lái)源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個(gè)可變區(qū)(V1-V5)最適密碼子。
實(shí)施例10gp143/glyB疫苗構(gòu)成物與上面的其它含tPA構(gòu)成物(tPA-gp120、tPA-gp140、tPA-gp143和tPA-gp160)類似，通過(guò)PCR方法制備這些構(gòu)成物，它們帶有取代其天然前導(dǎo)序列的tPA前導(dǎo)序列，但是設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生COOH封端的膜結(jié)合env，正如gp143的情況一樣。然而，gp143/glyB構(gòu)成物與gp143的區(qū)別在于，在設(shè)計(jì)以包含胞內(nèi)肽域的6個(gè)氨基酸中，最后4個(gè)與人類血型糖蛋白B(glyB)蛋白質(zhì)的C末端哪些氨基酸相同(預(yù)定的胞內(nèi)氨基酸序列=NH2-NRLIKA-COOH，劃線的殘基與glyB對(duì)應(yīng)，而“R”在env和glyB中都存在)。此構(gòu)成物的設(shè)計(jì)目的是，通過(guò)用來(lái)源于含有一小段胞質(zhì)區(qū)域(胞內(nèi)氨基酸序列=NH2-RRLIKA-COOH)的豐度表達(dá)的蛋白質(zhì)(glyB)肽序列取代可能對(duì)表達(dá)或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性/轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面產(chǎn)生負(fù)影響的區(qū)域，完全消除對(duì)應(yīng)于該env胞內(nèi)部分的任何轉(zhuǎn)錄物或肽區(qū)域而獲得額外的env表達(dá)和導(dǎo)向細(xì)胞表面的尋靶。以2種形式(A或B)制備構(gòu)成物，這取決于如上描述的gp160蛋白酶解切割位點(diǎn)是切除還是保留。A．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB此構(gòu)成物與ⅣD相似，區(qū)別是使用下列反義PCR寡聚物，用上述血型糖蛋白B取代gp143的胞內(nèi)肽域，所述寡聚物為5’-CCA CAT GATATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CACAAT GGA CAG CAC AGG-3’。B．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB此構(gòu)成物與ⅤA相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。C．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB此構(gòu)成物與ⅤA相似，區(qū)別是與ⅣH的情況一樣，gp120的第一個(gè)恒定區(qū)(C1)被最適于翻譯的密碼子取代。D．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB此構(gòu)成物與ⅤC相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。E．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/glyB此構(gòu)成物的env基因完全由上述最適密碼子組成。F．V1Jns-tPA-gp143/opt全B/glyB此構(gòu)成物與ⅤE相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。G．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/gly B(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與上文介紹的ⅢG相似，區(qū)別是來(lái)自非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于確定整個(gè)可變區(qū)(V1-V5)最適密碼子使用。H．V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/gly B(非ⅢB毒株)此構(gòu)成物與ⅤG相似，區(qū)別是保留有env蛋白酶解切割位點(diǎn)。具有可變環(huán)缺失的HIV env疫苗構(gòu)成物這些構(gòu)成物可以包含有上面列舉的所有env形式(gp120、gp140、gp143、gp160、gp143/glyB)，但是具有在制備過(guò)程中缺失的gp120區(qū)內(nèi)的可變環(huán)(如V1、V2和/或V3)。這些修飾的目的是為了消除那些可能封閉保守的中和抗原決定基(如CD4結(jié)合位點(diǎn))暴露的肽區(qū)段。例如，下面的寡聚物可用于PCR反應(yīng)，以產(chǎn)生導(dǎo)致THE C1和C2片段連接的V1/V2缺失5’-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGTAAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3’。
實(shí)施例11用于提高env基因表達(dá)的合成基因區(qū)段的設(shè)計(jì)將基因區(qū)段轉(zhuǎn)化為具有相同的翻譯序列(除去已注明的部位)的序列，但是具有R.Lathe在研究論文中定義的可選擇密碼子用法，該論文參見(jiàn)J.Molec.Biol.第183卷，第1-12頁(yè)(1985)，標(biāo)題是“從氨基酸序列數(shù)據(jù)推斷的合成寡核苷酸探針理論上與實(shí)踐上考慮”。下述增加HIVenv基因區(qū)段的rev非依賴型表達(dá)的方法學(xué)基于我們的假說(shuō)，即已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該基因不能有效地表達(dá)是整個(gè)轉(zhuǎn)錄子組成的結(jié)果。因此，利用編碼同一蛋白序列的可選擇密碼子可能在缺少rev時(shí)解除rev表達(dá)的限制。env中密碼子用法的檢查顯示高百分比的密碼子出現(xiàn)在那些高表達(dá)的人類基因很少的密碼子中。如下用來(lái)自Lathe等的數(shù)據(jù)描述采用的特定密碼子置換方法1．鑒定用于適合的開放閱讀框架的密碼子的定位。
2．比較野生型密碼子以觀察人類基因使用的頻率(參見(jiàn)Lathe等論文中表3)。
3．如果密碼子不是最常用的，則用一個(gè)基于表5中數(shù)據(jù)的最適于高表達(dá)的密碼子替換它。
4．檢查新密碼子的第三個(gè)核苷酸和緊接該第一個(gè)密碼子3’端的相鄰密碼子的第一個(gè)核苷酸。如果配對(duì)已通過(guò)此新密碼子選擇而產(chǎn)生5’-CG-3’，則用表達(dá)5中指示的選擇替換它。
5．重復(fù)此步驟直至已替換完整基因區(qū)段。
6．檢查新基因序列中由這些密碼子替換產(chǎn)生不需要序列(如“ATTTA”序列、不慎產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識(shí)別位點(diǎn)、不需要的限制性酶切位點(diǎn)等)和消除這些序列的替換密碼子。
7．裝配合成基因區(qū)段并測(cè)試其改善的表達(dá)。
這些方法用于產(chǎn)生下列HIV env合成基因區(qū)段，以產(chǎn)生一個(gè)完全由最適于表達(dá)的密碼子用法組成的基因(ⅰ)gp120-C1(opt)；(ⅱ)V1-V5(opt)；(ⅲ)RRE-A/B(mut或opt)；以及(ⅳ)gp30(opt)；每個(gè)區(qū)段獲得的密碼子替代/核苷酸取代的百分率分別為56/19、73/26、78/28和61/25。這些區(qū)段的每一個(gè)都已在上文中詳細(xì)描述過(guò)，其實(shí)際序列見(jiàn)下文。
gp120-C1(opt)這是一個(gè)從成熟N末端到V1起始點(diǎn)的gp120恒定區(qū)1(C1)的基因片段，設(shè)計(jì)具有最適于表達(dá)的密碼子用法。1TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG51AAGGAGGCCA CCACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA101CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC151CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG201TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG251GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT301TAAAC
MN V1-V5 (opt)這是一對(duì)應(yīng)于具有最適于表達(dá)的密碼子用法的HIV MN V1-V5(1066BP)的衍生蛋白序列的基因區(qū)段。1 AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC51 AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA101 AGAACTGCTC CTTCAACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG151 GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC201 CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT251 GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT301 GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC351 CTGCAAGAAT GTGTCCACAG TGCAGTGCAC ACATGGCATC AGGCCTGTGG401 TGTCCACCCA GCTGCTGCTG AATGGCTCCC TGGCTGAGGA GGAGGTGGTC451 ATCAGGTCTG AGAACTTCAC AGACAATGCC AAGACCATCA TCGTGCACCT501 GAATGAGTCT GTGCAGATCA ACTGCACCAG GCCCAACTAC AACAAGAGGA551 AGAGGATCCA CATTGGCCCT GGCAGGGCCT TCTACACCAC CAAGAACATC601 ATTGGCACCA TCAGGCAGGC CCACTGCAAC ATCTCCAGGG CCAAGTGGAA651 TGACACCCTG AGGCAGATTG TGTCCAAGCT GAAGGAGCAG TTCAAGAACA701 AGACCATTGT GTTCAACCAG TCCTCTGGGG GGGACCCTGA GATTGTGATG751 CACTCCTTCA ACTGTGGGGG GGAGTTCTTC TACTGCAACA CCTCCCCCCT801 GTTCAACTCC ACCTGGAATG GCAACAACAC CTGGAACAAC ACCACAGGCT851 CCAACAACAA CATCACCCTC CAGTGCAAGA TCAAGCAGAT CATCAACATG901 TGGCAGGAGG TGGGCAAGGC CATGTATGCC CCCCCCATTG AGGGCCAGAT951 CAGGTGCTCC TCCAACATCA CAGGCCTGCT GCTGACCAGG GATGGGGGGA1001 AGGACACAGA CACCAACGAC ACCGAAATCT TCAGGCCTGG GGGGGGGGAC1051 ATGAGGGACA ATTGG
RRE.Mut(A)這是對(duì)應(yīng)于HIV-1的rev反應(yīng)元件(RRE)的由最適于表達(dá)的密碼子用法組成的DNA區(qū)段?！癆”形式也已在gp120/gp41接點(diǎn)處用粗體所示的核苷酸去掉了已知的蛋白質(zhì)水解切割位點(diǎn)。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAA CCACGTGGTG CAGAACGAGC101 ACCAGGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC
RRE.Mut(B)這是對(duì)應(yīng)于HIV-1的rev反應(yīng)元件(RRE)的由最適于表達(dá)的密碼子用法組成的DNA區(qū)段?！癇”形式在gp120/gp41接點(diǎn)處保留已知的蛋白質(zhì)水解切割位點(diǎn)。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAG AAGAGTGGTG CAGAGAGAGA101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC
gp32(opt)這是從AvrⅡ位點(diǎn)(緊接RRE末端開始)到gp143末端的由最適于表達(dá)的密碼子用法構(gòu)成的gp32基因區(qū)段。1 CCTAGGCA TCTGGGGCTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT51 GCCCTGGAAT GCCTCCTGGT CCAACAAGAG CCTGGAGCAA ATCTGGAACA101 ACATGACCTG GATGGAGTGG GACAGAGAGA TCAACAACTA CACCTCCCTG151 ATCCACTCCC TGATTGAGGA GTCCCAGAAC CAGCAGGAGA AGAATGAGCA201 GGAGCTGCTG GAGCTGGACA AGTGGGCCTC CCTGTGGAAC TGGTTCAACA251 TCACCAACTG GCTGTGGTAC ATCAAAATCT TCATCATGAT TGTGGGGGGC301 CTGGTGGGGC TGCGGATTGT CTTTGCTGTG CTGTCCATTG TGAACCGGGT351 GAGACAGGGC TACTCCCCCT AATAAGCCCG GGCGATATC
SRV-1 CTE(A)這是對(duì)應(yīng)于來(lái)自猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒-1基因組的3’-UTP的合成基因區(qū)段。該DNA按下面的方向置于HIV基因的3’末端，以增加不依賴rev的表達(dá)。
SrfⅠ EcoRV5′ -GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACAGCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGGGCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATGTATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGTTTTATATATA TTTAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATGATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′EcoRV SrfⅠ
SRV-1 CTE(B)此合成基因區(qū)段與上文所示SRV-1 CET(A)相同，區(qū)別是使用一個(gè)單核苷酸突變(用粗體表示)以消除一段ATTTA序列。此序列與較高的mRNA更新有關(guān)。
SrfⅠ EcoRV5′-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACAGCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGGGCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATGTATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGTTTTATATATA TTAAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATGATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′EcoRV SrfⅠ實(shí)施例11體外gp120疫苗的表達(dá)在轉(zhuǎn)染的人類橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞中測(cè)試這些構(gòu)成物的體外表達(dá)。從轉(zhuǎn)染的RD細(xì)胞分泌的tPA-gp120定量研究表明V1Jns-tPA-gp120載體產(chǎn)生分泌型gp120。體內(nèi)gp120疫苗參見(jiàn)圖12(小鼠數(shù)據(jù))V1Jns-tPA-gp120MNPNV誘導(dǎo)型Ⅱ類MHC限制性T淋巴細(xì)胞的gp120特異性抗原反應(yīng)性。處死已用200μg V1Jns-tPA-gp120MN疫苗接種兩次的Balb/c小鼠，取其脾臟以在體外測(cè)定輔助T淋巴細(xì)胞對(duì)重組gp120的反應(yīng)性。用PBMC(外周血單核細(xì)胞)用5μg/ml重組gp120ⅢB(Repligen，目錄號(hào)#RP1016-20)與4×105個(gè)細(xì)胞/ml進(jìn)行T細(xì)胞增殖檢驗(yàn)。通過(guò)在單獨(dú)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞來(lái)獲得這些細(xì)胞攝入3H-胸苷的基礎(chǔ)水平，同時(shí)用2μg/ml的ConA刺激誘導(dǎo)最大增殖。ConA誘導(dǎo)的反應(yīng)峰出現(xiàn)于大約第3天(at～3days)，并在此時(shí)刻與培養(yǎng)基對(duì)照樣本一起收獲，而用抗原處理的樣本與另一種培養(yǎng)基對(duì)照在第5天收獲。接種疫苗的小鼠的反應(yīng)與天然的、年齡相匹配的同種系小鼠相比較。正如所期望的那樣，天然和免疫小鼠中的ConA陽(yáng)性對(duì)照都產(chǎn)生很高的增殖。在接種疫苗的小鼠中用gp120處理得到非常強(qiáng)的輔助T細(xì)胞記憶反應(yīng)，而天然小鼠中卻沒(méi)有反應(yīng)(特異性反應(yīng)性的閾值是＞3-4的刺激指數(shù)(SI)；SI值通按樣本cpm/培養(yǎng)基cpm的比值計(jì)算)。分別與抗gp120ELISA效價(jià)5643和11,900比較，接種疫苗的小鼠得到的SI分別是65和14。令人感興趣的是，對(duì)這兩種小鼠而言，對(duì)抗體較高的應(yīng)答者比抗體效價(jià)較低的那些小鼠給出顯著低的T細(xì)胞反應(yīng)性。此實(shí)驗(yàn)表明分泌型gp120載體在體內(nèi)有效地激活輔助T細(xì)胞和產(chǎn)生強(qiáng)抗體反應(yīng)。此外，這些免疫應(yīng)答的每一個(gè)均可用抗原測(cè)定，該抗原與那些由接種PNV(ⅢB對(duì)MN)編碼抗原相比是異源性的。
實(shí)施例12gp160疫苗除了分泌型gp120構(gòu)成物以外，我們已制備了用于全長(zhǎng)的膜結(jié)合gp160的表達(dá)構(gòu)成物。除了gp120以外，gp160構(gòu)成物的基本原理是(1)可利用更多的抗原決定基用于CTL刺激和包括gp41在內(nèi)的中和抗體的產(chǎn)生，將有效的HIV中和單克隆抗體(2F5，見(jiàn)上文)導(dǎo)向所述抗原決定基；(2)可以得到與病毒產(chǎn)生的gp160相關(guān)的更天然的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；(3)膜結(jié)合的流感HA構(gòu)成物免疫原性的成功[Ulmer等，Science 259:1745-1749,1993；Montgomery,D.等，DNA and Cell Biol.,12:777-783,1993]。gp160即使具有異源性前導(dǎo)肽序列，仍保留了實(shí)質(zhì)的rev依賴性，因此制備進(jìn)一步的構(gòu)成物以在缺乏rev時(shí)增加表達(dá)。
實(shí)施例13Hiv細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的測(cè)定本節(jié)描述的方法闡明用于接種疫苗小鼠的測(cè)定?；绢愃频姆治隹梢杂糜陟`長(zhǎng)類，除了必須建立同源B細(xì)胞系以用作每種動(dòng)物的靶細(xì)胞。這在人類可通過(guò)用EB病毒，而在恒河猴可用乙型皰疹病毒而完成。
外周血單核細(xì)胞(PBMNC)或來(lái)源于新鮮抽取的血液或來(lái)源脾臟，用Ficoll-Hypaque離心從白細(xì)胞中分離紅細(xì)胞；而對(duì)小鼠也可取用淋巴結(jié)?；蛲ㄟ^(guò)體外在IL-2(20U/ml)和伴刀豆球蛋白A(2μg/ml)中培養(yǎng)6-12天或者使用特異性抗原，用等量的輻射抗原提呈細(xì)胞由PBMC中制備效應(yīng)CTL。特異性抗原可以或者由合成肽(通常為9-15個(gè)氨基酸)組成，所述肽是CTL識(shí)別所用動(dòng)物的MXC單倍型的已知抗原決定基；或者由設(shè)計(jì)表達(dá)合適抗原的痘苗病毒構(gòu)成物組成。靶細(xì)胞不是同源細(xì)胞系，就是單倍型匹配的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系已經(jīng)過(guò)處理而呈現(xiàn)所述的合適抗原，用于體外刺激CTL。對(duì)Balb/c小鼠，P18肽(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn,SEQ.ID:51:，用于HIV MN毒株)可以以10μM的濃度使用，以在體外用放射性同源脾細(xì)胞來(lái)再刺激CTL，并可以在細(xì)胞毒性分析中，在分析前通過(guò)在37℃培養(yǎng)約2小時(shí)而用于以1-10μM致敏靶細(xì)胞。對(duì)這些H-2dMHC單倍型小鼠而言，鼠肥大細(xì)胞系P815提供良好的靶細(xì)胞。通過(guò)在37℃下培養(yǎng)靶細(xì)胞1-2小時(shí)(～5×106細(xì)胞0.2mCi)，隨后清洗幾次靶細(xì)胞，抗原致敏的靶細(xì)胞中負(fù)載有在CTL殺傷時(shí)從靶細(xì)胞內(nèi)部釋放的Na51CrO4。CTL群體與靶細(xì)胞按效應(yīng)物與靶細(xì)胞的不同比例比例(例如100∶1、50∶1、25∶1等等)混合，一起沉淀，在收獲上清液前于37℃培養(yǎng)4-6小時(shí)，然后用r計(jì)數(shù)器檢驗(yàn)上清液中放射性釋放量。細(xì)胞毒性以靶細(xì)胞(用0.2％TritonX-100處理得到)的總釋放量的百分率計(jì)算，這些靶細(xì)胞的自發(fā)釋放量已被扣除。
實(shí)施例14HIV專一性抗體的檢驗(yàn)設(shè)計(jì)ELISA法，不是用特定的重組蛋白就是用合成肽作為底物抗原，來(lái)檢測(cè)針對(duì)HIV產(chǎn)生的抗體。用PBS(磷酸緩沖鹽水)溶液中的2μg/ml重組抗原，按每孔50μl于40℃在搖床上過(guò)夜包被96孔微量孔板?；蛘哂煽乖兄亟M蛋白(gp120,rev:Replign Corp；gp180,gp41:AmericanBio-technologies,Inc.)或者由合成肽(來(lái)源于ⅢB等的與病毒分離物序列相應(yīng)的V3肽American Bio-technologies,Inc.；對(duì)于單克隆抗體2F5的gp41抗原決定基)?？装逵们逑淳徶幸?PBS/0.05％吐溫20)沖洗4次，隨后加入200μl/孔封閉緩沖液(PBS/0.05％吐溫20中的1％石竹乳(Camation milk)溶液)于室溫下?lián)u動(dòng)約1小時(shí)。免疫前血清和免疫血清在封閉緩沖液中按所需要的稀釋范圍進(jìn)行稀釋并在每孔加入100μl。孔板在室溫下?lián)u動(dòng)保溫1小時(shí)，再用洗滌緩沖液洗4次。第二抗體與用封閉緩沖液按1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(抗恒河猴Ig,SouththernBiotechnology Associates；抗鼠Ig和抗免Ig,Jackson Immuno Research)結(jié)合，再以100μl/孔加入每個(gè)樣本中，于室溫下?lián)u動(dòng)保溫1小時(shí)?？装逵孟礈炀彌_液洗4次，再按100μl/孔加入在100mM pH4.5的檸檬酸鹽緩沖液中1mg/ml的鄰苯二胺(o-PD,Calbiochem)溶液繼續(xù)反應(yīng)?？装逶?50nm處在動(dòng)力學(xué)上(反應(yīng)的最初10分鐘)和10與30分鐘的終點(diǎn)時(shí)讀出吸光度(Thermomax微孔板讀板儀，Molecular Devices)。
實(shí)施例15HIV中和抗體的檢驗(yàn)使用來(lái)源于接種疫苗的動(dòng)物血清如下在體外進(jìn)行HIV分離物中和作用測(cè)定待測(cè)血清和免疫前血清在使用前在56℃加熱60分鐘滅活。將已知效價(jià)量的HIV-1在向96孔微量孔板中的105MT-4人類淋巴細(xì)胞加入之前，加到待測(cè)血清的1∶2系列稀釋液中，然后于室溫下孵育60分鐘。病毒/細(xì)胞混合物在37℃時(shí)孵育7天，再用四唑鎓染料對(duì)培養(yǎng)物染色以檢定病毒介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。病毒的中和可通過(guò)防止病毒介導(dǎo)的細(xì)胞死亡觀測(cè)到。
實(shí)施例16臨床Hiv分離物基因的分離從用ConA處理而激活的受感染PBMC中克隆HIV病毒基因。獲得所屬病毒基因的優(yōu)選方法是使用所需基因側(cè)翼的特定寡聚物，從感染的細(xì)胞基因組中用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。第二種獲得病毒基因的方法是從感染細(xì)胞的上清液中純化病毒RNA，并從這些材料中制備cDNA再進(jìn)行PCR。此方法與上述克隆鼠B7基因的方法極相似，區(qū)別是使用的PCR寡聚物，使用隨機(jī)的六聚體而非特殊的引物寡聚物以制備cDNA。
從感染細(xì)胞沉淀通過(guò)將其在STE溶液(10mM NaCl,10mMEDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0)中裂解純化基因組DNA,STE溶液中加入的蛋白酶K和SDS的終濃度分別為0.1mg/ml和0.5％。此混合物于56℃過(guò)夜孵育，再用0.5體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提。通過(guò)加入終濃度為0.3M的醋酸鈉和2倍體積冷乙醇來(lái)沉淀水相。從溶液中沉淀DNA后，將該DNA再懸浮于0.1X TE溶液中(1X TE=10mMTris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)。此刻加入終濃度為0.1％的SDS和2U RNA酶A，于37℃孵育30分鐘。此溶液依上法用苯酚/氯仿/異戊醇抽提，然后用乙醇沉淀。將DNA懸浮于0.1X TE中并在260nm處通過(guò)測(cè)量其紫外吸收而定量。樣本貯存于-20℃貯存直至用于PCR。
用Perkin-Elmer Cetus試劑盒和方法進(jìn)行PCR，所用的gp160有義和反義寡聚物分別是5’-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAATGA-3’和5’-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCCGGG C ATG TGG-3’，這些寡聚物在所形成的DNA片段3’末端加入一個(gè)SrfⅠ位點(diǎn)。產(chǎn)生于PCR的區(qū)段克隆入或是V1Jns或是V1R疫苗接種載體中，通過(guò)DNA序列分析證實(shí)V3區(qū)域以及連接接點(diǎn)。
實(shí)施例17T細(xì)胞增殖檢驗(yàn)得到PBMCs并檢驗(yàn)通過(guò)PBMC群落中的增殖測(cè)定而測(cè)試對(duì)特定抗原的回憶反應(yīng)。用在收獲前加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中保溫最后18-24小時(shí)的3H-胸苷來(lái)監(jiān)測(cè)增殖。如果增殖已發(fā)生，細(xì)胞收獲物在濾膜上保留含同位素的DNA，而休眠的細(xì)胞沒(méi)有加入同位素，同位素以游離形式不保留在濾膜上。將嚙齒類或靈長(zhǎng)類物種的4×105細(xì)胞鋪在96孔微量滴定板上中總共200μl的完全培養(yǎng)基(RPMI/10％胎牛血清)中。用PBMC和單獨(dú)的培養(yǎng)基確定背景增殖反應(yīng)，同時(shí)利用1-5μl/ml濃度的凝集素(例如植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白(ConA))以作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)產(chǎn)生非專一性反應(yīng)。專一性抗原由或已知肽抗原決定基、純化的蛋白質(zhì)，或滅活病毒組成?？乖瓭舛确秶鷮?duì)肽為1-10μM，對(duì)蛋白質(zhì)為1-10μg/ml。凝集素誘導(dǎo)的增殖在細(xì)胞培養(yǎng)保溫的第3-5天到達(dá)最高點(diǎn)，而抗原專一性反應(yīng)在第5-7天到達(dá)最高點(diǎn)。當(dāng)?shù)玫街辽俑哂谂囵B(yǎng)基背景三倍的輻射計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)生特異性增殖，輻射計(jì)數(shù)常給出與背景之比值，或刺激指數(shù)(SI)。已知HIV gp160包含幾個(gè)已知引起gp160/gp120免疫的或HIV感染的個(gè)體的T細(xì)胞增殖的幾種肽。這些肽中最常用的是T1(LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla)；T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys)；和TH4(AspArgValIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg)。已證實(shí)這些肽刺激來(lái)自于抗原致敏的小鼠、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的PBMC增殖。
實(shí)施例18載體V1R的制備在繼續(xù)優(yōu)化我們的基礎(chǔ)接種疫苗載體的努力中，我們制備了一個(gè)命名為V1R的V1Jns衍生物。構(gòu)建這一載體的目的是為了獲得最小尺寸的疫苗載體，即沒(méi)有不必要的DAN序列，這個(gè)載體仍保留V1J和V1Jns提供的總體最佳化的異源基因表達(dá)特征和高的質(zhì)粒產(chǎn)量。我們從文獻(xiàn)和通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定(1)可以除掉該pUC骨架之中的包含大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的區(qū)域，而不影響來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒產(chǎn)量；(2)如果插入一細(xì)菌終止子替代卡那霉素開放閱讀框架后的Kanr基因的3’區(qū)域，該區(qū)域可以去除掉，并且(3)來(lái)自BGH終止子的3’一半的大約300bp可以去除，而不影響它的調(diào)節(jié)功能(在BGH元件之中的原始KpnⅠ限制性酶切位點(diǎn)后面)。
通過(guò)利用PCR來(lái)分別合成源于V1Jns代表CMVintA啟動(dòng)子/BGH終止子、復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性元件的三個(gè)DNA區(qū)段，來(lái)構(gòu)建V1R。用所述PCR寡聚物將用于每一區(qū)段的獨(dú)特限制性酶切位點(diǎn)加入每一片段末端SspⅠ和XholⅠ用于CMVintA/BGH；EcoRV和BamHI用于Kanr基因；和BclⅠ和SalⅠ用于Orir。選擇這些酶切位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S定向連接PCR衍生的每個(gè)DNA區(qū)段，隨后喪失每一位點(diǎn)EcoRV和SspⅠ留下適宜連接的平端DNA，而BamHI和BclⅠ留下互補(bǔ)的突出，SalⅠ和Xhol也一樣。通過(guò)PCR獲得這些區(qū)段后，用上面所提到的合適的限制性內(nèi)切酶消化每一區(qū)段，然后在含有全部三種DNA區(qū)段的單一反應(yīng)混合物中將每一區(qū)段連接起來(lái)。將Orir的5’末端設(shè)計(jì)成包括通常在這一區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不依賴T2 rho的終止子序列，以至于它能夠提供卡那酶素抗性基因的終止信息。用限制性酶消化(＞8種酶)和通過(guò)連接位點(diǎn)的DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)該連接產(chǎn)物。產(chǎn)生DNA質(zhì)粒，用V1R之中的病毒基因的異源性表達(dá)似乎類似于V1Jns。獲得的載體大小上的凈降低值是1346bp(V1Jns=4.86kb；V1R=3.52kb)，見(jiàn)圖11,SEQ.ID:45:。
用來(lái)合成V1R的PCR寡聚物序列(下劃線的是選擇性酶切位點(diǎn)，并序列后的括號(hào)中鑒定)
(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TACG-3′[SspⅠ],SEQ.ID:,(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGCACC-3′[XhoⅠ],SEQ.ID::
(用于CMVintA/BGH區(qū)段)(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCAAAA TC-3′[EcoRV],SEQ.ID::
(4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTTACA ACC-3′[BamHI],SEQ.ID::
(用于卡那霉素抗性基因區(qū)段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATCTTC TTG-3′[BclⅠ],SEQ.ID::,(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGCTGG-3′[SalⅠ],SEQ.ID::
(用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn))用下面的寡聚物對(duì)V1R的連接接點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序5’-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3’,SEQ.ID::[CMVintA/kanr接點(diǎn)]5’-CAA TAG CAG GCA TGC-3’,SEQ.ID::[BGM/ori接點(diǎn)]5’-G CAA GCA GCA GAT TAC-3’,SEQ.ID::[ori/kanr接點(diǎn)]實(shí)施例19HIV晚期基因產(chǎn)物的異源性表達(dá)例如env和gag的HIV結(jié)構(gòu)基因需要HIV調(diào)節(jié)基因rev的表達(dá)，以有效地生產(chǎn)全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。我們已發(fā)現(xiàn)rev依賴性的gag表達(dá)產(chǎn)生低水平的蛋白質(zhì)，且rev自身對(duì)細(xì)胞是有毒性的。盡管我們得到了體外相對(duì)高水平的rev依賴性的gp160表達(dá)，但在體內(nèi)用rev/gp160 DNA免疫后，這個(gè)疫苗誘出低水平的針對(duì)gp160的抗體。這可能是因?yàn)橐阎膔ev細(xì)胞毒性和在含有數(shù)以百計(jì)的核的肌小管中獲得rev功能的日益增加的困難(rev蛋白需要與rev依賴性轉(zhuǎn)錄物在同一核中，以便表達(dá)gag或env蛋白)。然而，用選擇性修飾的env基因來(lái)獲得不依賴rev的表達(dá)已是可能的。1．不依賴rev的env表達(dá)一般來(lái)說(shuō)，我們的疫苗已利用了原始HIV(ⅢB)的env和gag基因，來(lái)使我們泛化的疫苗接種載體V1Jns的表達(dá)最佳化，V1Jns是由一CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子、一BGH來(lái)源的多腺苷酸化和翻譯終止序列以及pUC骨架組成。根據(jù)所用的是多大的基因區(qū)段(例如gp120對(duì)gp160)，通過(guò)用從組織專一性血纖維蛋白質(zhì)溶酶激活子(tPA)基因的前導(dǎo)肽取代它的天然分泌性前導(dǎo)肽，并在具有CMV內(nèi)含子A的CMVIE啟動(dòng)子后面表達(dá)產(chǎn)生的嵌合基因，可以得到不依賴rev的env表達(dá)的不同效率。tPA-gp120是以該方式構(gòu)建的分泌型gp120載體的一個(gè)實(shí)例，它所起的作用足以在接種疫苗的小鼠和猴中引起抗gp120的免疫應(yīng)答。
因?yàn)閾?jù)報(bào)道膜固定的蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)與分泌型蛋白質(zhì)相比，實(shí)質(zhì)得多的(并可能對(duì)HIV中和更專一性)的抗體反應(yīng)和得到額外的抗原決定基，我們制備了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫印跡分析所顯示的，不加入rev，該tPA-gp160載體產(chǎn)生可檢測(cè)量的gp160和gp120，盡管表達(dá)水平比從rev依賴型gp160-表達(dá)質(zhì)粒rev/gp160得到的低得多。這可能是因?yàn)橘x予rev對(duì)gp160轉(zhuǎn)錄物依賴性的抑制區(qū)域出現(xiàn)在包括在gp41的COOH末端的gp160之中的多位點(diǎn)上。制備一COOH末端截短形式的tPA-gp160(tPA-gp143)載體，設(shè)計(jì)該載體以通過(guò)消除這些抑制序列來(lái)提高env的總體表達(dá)水平。該gp143載體還消除包含已知引起膜蛋白轉(zhuǎn)移到溶酶體上而不是細(xì)胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞內(nèi)gp41區(qū)域。這樣，與全長(zhǎng)gp160相比，可期望gp143表達(dá)env蛋白質(zhì)的水平提高(通過(guò)降低rev依賴性)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面的效率更大，在那里在DNA疫苗接種后，這些蛋白質(zhì)可能更能夠誘出抗gp160抗體。通過(guò)廣泛地沉默誘變r(jià)ev反應(yīng)元件(RRE)序列(350bp)來(lái)消除另外的表達(dá)抑制序列，以進(jìn)一步修飾tPA-gp143。構(gòu)成物gp143/mutRRE以兩種形式制備或消除(形式A)或保留(形式B)gp120/41的蛋白水解切割位點(diǎn)。制備了兩種形式，因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)道用在牛痘中表達(dá)的不可切割的gp160疫苗接種小鼠誘出的抗體水平比可切割形式高得多。
開發(fā)了用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染物中g(shù)p160/gp120表達(dá)的定量ELISA，來(lái)確定這些載體的相對(duì)表達(dá)能力。在體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后定量測(cè)定細(xì)胞結(jié)合型對(duì)分泌/釋放型gp120產(chǎn)生下列結(jié)果(1)tPA-gp160表達(dá)的gp120比rev/gp160少5-10倍，胞內(nèi)對(duì)從細(xì)胞表面釋放的比例與此相似。(2)tPA-gp143產(chǎn)生的gp120分泌比rev/gp160大3-6倍，僅具有低水平的細(xì)胞結(jié)合gp143，這證明gp160的胞質(zhì)尾部引起gp160的胞內(nèi)滯留，這一現(xiàn)象能通過(guò)部分缺失這一序列來(lái)克服；并且(3)tPA-gp143/mutRRE A和B產(chǎn)生的蛋白表達(dá)水平比親本tPA-gp143大～10倍，同時(shí)證明消除形式A的蛋白酶解加工。
因此，我們?cè)黾硬灰蕾噐ev的表達(dá)的策略已導(dǎo)致了在總體表達(dá)水平上的逐漸增加，并使膜固定的gp143遠(yuǎn)離溶酶體、重導(dǎo)向細(xì)胞表面上。重要的是注意到這是一種種屬構(gòu)成物，在該構(gòu)成物的載體盒中應(yīng)該可能插入得自不同原始病毒分離物的gp120序列，所述載體盒含有或在NH2末端(tPA前導(dǎo)序列)或在COOH末端(gp41)存在的這些修飾，在NH2末端和COOH末端不同的病毒毒株間幾乎沒(méi)有抗原差異。2．得自臨床分離物的gp120的表達(dá)為將這些表達(dá)策略應(yīng)用到與疫苗目的有關(guān)的病毒上，并證明我們方法的通用性，我們還制備了得自原始HIV分離物(含有北美人的共有V3肽環(huán)；巨噬細(xì)胞向性的和非合胞體誘導(dǎo)表型)的一tPAgp120載體。這個(gè)載體在被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中給出gp120的高度表達(dá)/分泌，并在鼠中誘出抗gp120抗體，因此表明它是以功能形式克隆的。也將原始分離物gp160基因以與得自實(shí)驗(yàn)室毒株的gp160的同樣方式用于表達(dá)。B．對(duì)HIV1 env多核苷酸疫苗的免疫應(yīng)答小鼠中疫苗接種途徑對(duì)免疫應(yīng)答的作用在努力提高gp160表達(dá)的同時(shí)，我們利用了tPAgp120 DNA構(gòu)成物來(lái)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答和擴(kuò)大它們的方式。在小鼠中以100、10、和1μg的劑量比較了該載體肌內(nèi)(i.m.)和皮內(nèi)(i.d.)接種疫苗的途徑。在所有三種劑量水平接種2-3次后的所有接受者中，兩種途徑的疫苗接種都誘出抗體反應(yīng)(GMT=103-104)。每條途徑誘出具有清楚的劑量依賴型反應(yīng)的相似的抗gp120抗體效價(jià)。然而，我們觀察到i.d.疫苗接種的反應(yīng)變異性較大，特別是在初次接種后的低劑量時(shí)。而且，正如用在體外抗原專一性增殖和細(xì)胞因子分泌測(cè)定的，輔助T細(xì)胞反應(yīng)在i.m.接種疫苗后比i.d.接種疫苗的反應(yīng)高。我們的結(jié)論是與i.m.接種相比，該疫苗的i.d.接種不提供任何益處。2．在小鼠中g(shù)p120 DNA疫苗介導(dǎo)的輔助T細(xì)胞免疫gp120 DNA疫苗接種在所有被檢驗(yàn)的淋巴區(qū)(脾臟、血液、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和髂骨淋巴結(jié))產(chǎn)生強(qiáng)有力的輔助T細(xì)胞反應(yīng)，并具有TH1樣的細(xì)胞因子分泌特征(即產(chǎn)生g-干擾素和IL-2，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有IL-4)。這些細(xì)胞因子一般促進(jìn)強(qiáng)細(xì)胞免疫，并與維持HIV陽(yáng)性血清病人的無(wú)病狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。已經(jīng)表明淋巴結(jié)是HIV復(fù)制的主要部位，即使當(dāng)在血液中不容易檢測(cè)到病毒時(shí)，淋巴結(jié)仍含有大儲(chǔ)藏量的病毒。一個(gè)能夠在許多淋巴部位誘出抗HIV免疫應(yīng)答的疫苗，例如我們用我們的DNA疫苗顯示的，可以有助于阻止初次感染后淋巴管的成功移生。3．env DNA疫苗介導(dǎo)的抗體反應(yīng)接受gp120 DNA疫苗的非洲綠猴(ACGM)和恒河猴(RHM)在接種疫苗2-3次后，顯示低水平的中和抗體，這不能通過(guò)另外的疫苗接種來(lái)增加。這些結(jié)果和在HIV疫苗領(lǐng)域日益增加的認(rèn)識(shí)引導(dǎo)我們致力于得到基于gp160的載體(見(jiàn)上面)的有效表達(dá)，所述認(rèn)識(shí)是對(duì)于誘出中和抗體，寡聚gp160可能是一比gp120單體更合適的靶抗原。小鼠和AGM也用原始分離物來(lái)源的tPA-gp120疫苗來(lái)接種。這些動(dòng)物顯示出的抗V3肽(用同源性序列)交互終點(diǎn)抗體效價(jià)的范圍為500～5000，這證實(shí)這個(gè)疫苗設(shè)計(jì)對(duì)于臨床有關(guān)的病毒分離物是有作用的。
基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中不能持續(xù)地誘出抗體反應(yīng)，或產(chǎn)生低的抗體效價(jià)。我們用tPA-gp143質(zhì)粒的最初結(jié)果在鼠中和AGM中兩次接種后，產(chǎn)生的幾何平均效價(jià)(GMT)＞103。這些數(shù)據(jù)提示我們通過(guò)提高表達(dá)水平和更有效地將env胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面上，已顯著改善了gp160樣疫苗的免疫原性。這個(gè)構(gòu)成物和tPA-gp143/mutRRE A和B載體，將繼續(xù)記述其抗體反應(yīng)特征，特別是病毒中和特征。4．在猴中env DNA疫苗介導(dǎo)的CTL反應(yīng)我們繼續(xù)闡明已用gp120和gp160/IRES/rev DNA疫苗免疫的RHM的CTL反應(yīng)特征。接受這一疫苗的所有的四只猴子在兩次接種后顯示顯著的Ⅰ類MHC限制的CTL活性(在效應(yīng)物/靶=20下20％-35％的專一性殺傷)。在第四次接種疫苗后，在類似的試驗(yàn)條件下，這些活性增加到50-60％殺傷力，這表明額外的疫苗接種明顯地加強(qiáng)反應(yīng)。CTL活性在最后一次接種后，在它們的峰值水平的約50％處保持至少7個(gè)月，這表明已建立了長(zhǎng)期記憶。
權(quán)利要求
1．合成的多核苷酸，包含編碼HIV env蛋白或其片段的DNA序列，該DNA序列包含最適宜在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)的密碼子。
2．權(quán)利要求1的多核苷酸，它選自V1Jns-tPA-HIVMNgp120；V1Jns-tPA-HIVⅢBgp120；V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp140/opt30-A；V1Jns-tPA-gp140/opt30-B；V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；V1Jns-rev/env:；V1Jns-gp160；V1Jns-tPA-gp160；V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A；V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B；V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143；V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A；V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B；V1Jns-tPA-gp143/opt32-A；V1Jns-tPA-gp143/opt32-B；V1Jns-tPA-gp143/SRV-13′-UTR；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB:V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB；和它們的組合物。
3．權(quán)利要求1的多核苷酸，它導(dǎo)入包括人組織的脊椎動(dòng)物組織時(shí)，誘導(dǎo)抗-HIV中和抗體、HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答或體內(nèi)保護(hù)性免疫應(yīng)答，其中該多核苷酸包含編碼HIV gag、gag-蛋白酶或env基因產(chǎn)物的基因。
4．在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)HIV抗原決定基的免疫應(yīng)答的方法，它包括將1ng-100mg的權(quán)利要求1的多核苷酸導(dǎo)入該脊椎動(dòng)物的組織中。
5．在脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)HIV毒性毒株引起的感染或疾病的免疫應(yīng)答的方法，它包括將權(quán)利要求1的多核苷酸導(dǎo)入脊椎動(dòng)物的組織中。
6．權(quán)利要求5的方法，它還包括給予減毒的HIV、殺死的HIV、HIV env蛋白、HIV gag蛋白、HIV pol蛋白和它們的組合物。
7．針對(duì)HIV感染的疫苗，它包含權(quán)利要求1的多核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體。
8．在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)抗-HIV免疫應(yīng)答的方法，它包括將權(quán)利要求1的多核苷酸導(dǎo)入該靈長(zhǎng)類動(dòng)物的組織中，并同時(shí)胃腸外給予白細(xì)胞介素12。
9．誘導(dǎo)刺激細(xì)胞毒性的輔助T-細(xì)胞增殖的抗原提呈細(xì)胞的效應(yīng)物功能(包括對(duì)HIV抗原專一性的淋巴因子分泌)的方法，它包括將脊椎動(dòng)物的細(xì)胞在體內(nèi)顯露于權(quán)利要求1的多核苷酸。
10．增加編碼HIV蛋白或其片段的DNA表達(dá)的方法，包括(a)鑒定適宜的開放閱讀框架的密碼子的位置；(b)比較野生型密碼子觀察到的人類基因所使用的頻率；(c)用最適于人類基因高表達(dá)的密碼子取代野生型的密碼子；并(d)檢測(cè)提高的表達(dá)。
全文摘要
提供編碼HIV基因的合成DNA分子和HIV基因的修飾。所述合成分子的密碼子用預(yù)定宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。所述合成分子可作為多核苷酸疫苗使用,這種疫苗通過(guò)中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫,來(lái)提供針對(duì)HIV感染的有效免疫預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K31/711GK1216064SQ97193817
公開日1999年5月5日 申請(qǐng)日期1997年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月22日
發(fā)明者J·W·施維爾, M·E·達(dá)維斯, D·C·弗雷德, M·A·劉, H·C·佩爾賴 申請(qǐng)人:麥克公司