專利名稱：提高體外受精后的植入率的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種提高體外受精(IVF)后的植入率的方法，該方法用于治療婦女不育癥，用于治療和預(yù)防婦女早期妊娠失敗，該方法使用一種氧化氮合成酶底物(L-精氨酸)、一種氧化氮原料物質(zhì)或兩者都用，單獨(dú)或與黃體酮和/或雌激素結(jié)合使用。本發(fā)明還涉及新的節(jié)育方法，該方法是以抑制子宮內(nèi)膜的接受能力、防止植入和用NOS抑制劑誘發(fā)月經(jīng)為基礎(chǔ)的，NOS抑制劑優(yōu)選iNOS抑制劑，并結(jié)合使用黃體酮拮抗劑和/或黃體酮合成酶抑制劑。
人類體外受精是非常不成功的。在美國(guó)，每個(gè)IVF治療周期的總出生率約為14％(國(guó)際醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)研究會(huì)(SART)，美國(guó)生育學(xué)會(huì)(1992)，《生育與不育》5:15)，在英國(guó)，這個(gè)數(shù)字為12.5％(《人類受精與胚胎學(xué)權(quán)威年報(bào)》，倫敦1992)。
當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)移一個(gè)以上的胚胎時(shí)，成功率會(huì)更高一些。不過，多個(gè)胚胎的同時(shí)轉(zhuǎn)移提高了多胎妊娠的發(fā)生率和流產(chǎn)與早產(chǎn)的可能性。IVF后妊娠率低的原因尚不完全為人所知。胚胎與子宮環(huán)境的質(zhì)量影響著成功率。一般來說，處于生育周期的婦女自發(fā)的早期流產(chǎn)率較高。自然懷孕后，多達(dá)50-60％可能性的早期妊娠是失敗的(Winston ML,Handyside AH(1993)，“人類體外受精所面臨的新的挑戰(zhàn)”，《科學(xué)》260:932-935)。這可歸因于胚胎轉(zhuǎn)移時(shí)的孕體異常和發(fā)生在胚胎與子宮內(nèi)膜之間的不同步。
既然IVF后胚胎轉(zhuǎn)移的成功率降低而授精后的時(shí)間增加，因此大多數(shù)妊娠失敗都可歸因于孕體異常或培養(yǎng)條件不適(Winston ML,Handyside AH(1993)，“人類體外受精所面臨的新的挑戰(zhàn)”，《科學(xué)》260:932-935)。
為了克服培養(yǎng)介質(zhì)中可能存在的不足，已經(jīng)在具有完整輸卵管的婦女體內(nèi)直接將卵母細(xì)胞或受精卵轉(zhuǎn)移至輸卵管(配子的輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移-GIFT或受精卵的輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移-ZIFT)。不過，這些努力僅僅稍微提高了IVF后的生育力和出生率(Edwards RG(1995)，“人類植入法過程中提高子宮接受能力的臨床方法”，《人類繁殖》10增刊3:60-67)。
子宮環(huán)境對(duì)IVF后生育率的作用同樣重要。已充分證實(shí)，胚胎轉(zhuǎn)移后妊娠成功的確定既需要健康的胚泡，也需要具有接受能力的子宮。轉(zhuǎn)移至一個(gè)易感性不足的子宮中的胚胎是不可能植入的。在所有哺乳動(dòng)物中，子宮內(nèi)膜僅在排卵后的特定時(shí)間階段對(duì)植入具有接受能力。該黃體期被稱為“植入窗”。就婦女而言，僅在組織學(xué)上定義的28天周期中的第15-20天之間、也就是在黃體酮水平最高的階段，植入才能成功(Navot D,Scott RT,Droesch KD,Veeck LL,Hung Ching Liu,Rosenvaks Z(1991)，“胚胎轉(zhuǎn)移的窗口與人類體外受孕的效率”，《生育與不育》55:114-118)。植入所需的最佳條件確定為正常周期的第20-22天，即LH波動(dòng)后7天(Bergh PA,Navot D(1992)，“胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜成熟對(duì)植入時(shí)機(jī)的影響”，《生育與不育》58:537-542)。
子宮內(nèi)膜具有足夠的黃體酮易感性對(duì)成功的植入來說是必要的，因此在黃體期用一種抗孕酮處理將會(huì)完全防止植入(Chwalisz K,Stckemann K,Fuhrmann U,Fritzemeier KH,Einspanier A,GarfieldRE(1995)，“妊娠子宮中抗孕酮的作用機(jī)制”，Henderson D,PhilibertD,Roy AK,Teutsch G(eds)，“類固醇受體和抗激素”，《紐約科學(xué)會(huì)年鑒》761:202-224)。在生育周期中，黃體酮調(diào)節(jié)受精卵通過輸卵管的轉(zhuǎn)運(yùn)，誘發(fā)植入子宮內(nèi)膜所需的分泌改變。哺乳動(dòng)物中，植入是精確計(jì)時(shí)的事件。所分泌的子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)(Beier HM,Elger W,Hegele-Hartung C,Mootz U,Beier-Hellwig K(1992)，“人類植入法中黃體、子宮內(nèi)膜和胚泡的分化研究”，《生育與繁殖雜志》92:511-523)，可能還有其他細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，如子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受黃體酮刺激而產(chǎn)生的整聯(lián)蛋白、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，是實(shí)施植入法所必需的(Edwards RG(1995)，“人類植入法的生理與分子面面觀”，《人類繁殖》10增刊2:1-14)。
以前，胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜發(fā)育之間的不同步性被認(rèn)為是可能引起IVF后植入失敗的原因之一(Beier HM,Elger W,Hegele-Hartung C,Mootz U,Beier-Hellwig K(1992)，“人類植入法中黃體、子宮內(nèi)膜和胚泡的分化研究”，《生育與繁殖雜志》92:511-523)。不過，迄今尚不能得到提高植入率的有效方法。人類植入法最先進(jìn)的階段的特征在于滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入蛻膜和血管生成(Loke YW,King A(1995)，“人類植入法”，《細(xì)胞生物學(xué)與免疫學(xué)》，劍橋大學(xué)出版社)。由于黃體酮拮抗劑也干擾早期妊娠，該階段也是依賴于黃體酮的(Chwalisz K,Stckemann K,Fuhrmann U,Fritzemeier KH,Einspanier A,GarfieldRE(1995)，“妊娠子宮中抗孕酮的作用機(jī)制”，Henderson D,PhilibertD,Roy AK,Teutsch G(eds)，“類固醇受體和抗激素”，《紐約科學(xué)會(huì)年鑒》761:202-224)。在早期妊娠過程中，足夠的血液流向子宮對(duì)胚胎發(fā)育來說是必要的。流向子宮的血液不足會(huì)危及妊娠(EdwardsRG(1995)，“人類植入法過程中提高子宮接受能力的臨床方法”，《人類繁殖》10增刊3:60-67)。向血流不暢的患者給予阿斯匹林以改善血流。小劑量的阿斯匹林被認(rèn)為可提高前列環(huán)素與凝血噁烷A2的比例，藉此提高胎盤的灌流。不過，阿斯匹林對(duì)子宮血流的作用僅僅是次要的(Goswamy RK,Williams G,Steptoe PC(1988)，“子宮灌流降低-不育癥的一個(gè)原因”，《人類繁殖》3955-959；Wada I,Hsu CC；Williams G,Macnamee MC,Brinsden PR(1994)，“子宮灌流不足的婦女在輔助懷孕過程中進(jìn)行小劑量阿斯匹林療法的好處”，《人類繁殖》9:1954-1957)。
有進(jìn)一步改進(jìn)避孕方法的需要。對(duì)于進(jìn)一步減少避孕藥的每月總劑量和攝入頻率應(yīng)當(dāng)給予特別關(guān)注。近十年來，有人建議了用抗孕酮節(jié)育的幾種可能性，這些方法是以在性交后或黃體初期處理后抑制排卵或防止植入為基礎(chǔ)的(Spitz IM,Bardin CV(1993)，“RU 486-一種抗孕酮和抗糖皮質(zhì)激素的臨床藥理學(xué)”，《避孕》48:403-444)。不過，只有在性交后用米非司酮處理(Glasier A,Thong KJ,Dewar M,Mackie M,Baird DT(1992)，“米非司酮(RU 486)與大劑量雌激素及孕激素用于性交后緊急避孕的比較”，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》327:1041-4)和在黃體初期LH+2給藥(Gemzell-Danielsson K,Westlund P,Johannisson E,Swahn ML,Bygdeman M,Seppl(1966)，“每周小劑量的米非司酮對(duì)卵巢功能和子宮內(nèi)膜發(fā)育的作用”，《人類繁殖》11:256-264)已被證實(shí)對(duì)婦女有效。這些方法中米非司酮的避孕作用很可能是由其對(duì)子宮內(nèi)膜的作用所產(chǎn)生的。性交后用米非司酮處理的方法只能偶爾使用，否則會(huì)干擾排卵和誘發(fā)閉經(jīng)。在LH+2時(shí)使用米非司酮尤其不方便，因?yàn)樵诿總€(gè)周期中都必須對(duì)LH波動(dòng)進(jìn)行判斷?？傻玫降年P(guān)于抗孕酮的數(shù)據(jù)建議，有可能研制出一種誘發(fā)月經(jīng)和避孕的每月服用一次的藥丸。這樣一種方法能用于緊急情況，但也可用于平時(shí)。性交后立即給以抗孕酮RU 486，發(fā)現(xiàn)其對(duì)植入的抑制是高效的(Glasier A,Thong KJ,Dewar M,Mackie M,Baird DT(1992)，“米非司酮(RU 486)與大劑量雌激素及孕激素用于性交后緊急避孕的比較”，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》327:1041-4)。不過，作為一種每月服用一次的避孕藥，在黃體后期單獨(dú)給以RU 486(即，不給以前列腺素)并不有效中止妊娠(Couzinet B,le Strat N,Silvestre L,Schaison G.(1990)，“對(duì)正常婦女在黃體后期給以抗黃體酮RU 486對(duì)月經(jīng)周期和節(jié)育的影響的長(zhǎng)期研究”，《生育與不育》54:1039-1044)。不考慮劑量的話，單用RU 486中止妊娠的功效在停經(jīng)后10天內(nèi)約為80-85％，在閉經(jīng)的56天內(nèi)約為65％，在之后的抗妊娠階段小于40％(Van LookPFA,Bygdeman M(1989)，“抗妊娠類固醇人節(jié)育的新尺度”，《牛津生殖生物學(xué)評(píng)論》11:1-60)。對(duì)閉經(jīng)7周或不到7周的妊娠婦女給以RU 486誘發(fā)了65-85％治療者的完全流產(chǎn)。不過，前列腺素的加入使功效提高到95％以上(Van Look PFA,BygdemanM(1989)，“抗妊娠類固醇人節(jié)育的新尺度”，《牛津生殖生物學(xué)評(píng)論》11:1-60,Aubeny E,Baulieu EE(1991)，“RU 486和口服活性前列腺素結(jié)合使用的抗妊娠活性，《Comptes Rendus deL’Academie des Science》312:539-45)。這些研究表明，另外采用前列腺素治療提高了抗孕酮中止稍后階段的妊娠的功效。不過，在早期妊娠過程中、即閉經(jīng)的第一周內(nèi)是否也能達(dá)到同樣的協(xié)同作用尚不清楚。此外，已知前列腺素可誘發(fā)胃腸道副作用，這在避孕的規(guī)則用藥中是不能接受的。
最近，最令人激動(dòng)的生物學(xué)與醫(yī)學(xué)進(jìn)展之一是發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮，而且該氧化氮參與調(diào)節(jié)血管狀況、血小板的聚集作用、神經(jīng)傳遞和免疫的激活作用。氧化氮是一種重要的肌肉平滑肌的松弛介質(zhì)，以前被認(rèn)為是EDRF(內(nèi)皮產(chǎn)生的松弛因子)(Furchgott RF和ZawadzkiJV(1980)，“內(nèi)皮細(xì)胞通過乙酰膽堿在松弛動(dòng)脈平滑肌中的必不可少的作用”，《自然》288:373-376；Moncada S,Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)”，《藥理學(xué)評(píng)論》43:109-142)。在至少三種不同異構(gòu)體的含核黃素的酶、氧化氮合成酶的作用下，通過L-精氨酸的胍基氮的氧化脫氨基作用合成氧化氮(Moncada S,Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)”，《藥理學(xué)評(píng)論》43:109-142)。已表明，下列L-精氨酸類似物競(jìng)爭(zhēng)性抑制氧化氮的合成NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、NG-單乙基-L-精氨酸(LMMA)、N-亞氨乙基-L-鳥氨酸(L-NIO)、L-單甲基-L-精氨酸(L-NNMA)、L-NG-甲基精氨酸(LNMA)和Nw-硝基-L-精氨酸(L-NA)。
氧化氮升高血管平滑肌內(nèi)cGMP(單磷酸1,4,5-環(huán)鳥苷)的水平，從而產(chǎn)生松弛作用和降低血管緊張(Moncada S,Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)”，《藥理學(xué)評(píng)論》43:109-142)。這些化合物被認(rèn)為是氧化氮?，F(xiàn)在將硝基血管舒張劑歸屬于氧化氮原料物質(zhì)類，因?yàn)樗鼈儽淮x或自發(fā)釋放出氧化氮(Moncada S,Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)”，《藥理學(xué)評(píng)論》43:109-142)。長(zhǎng)期使用的硝基血管舒張劑可被認(rèn)為是失敗的生理學(xué)機(jī)制的替代療法。氧化氮也可由巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生。
已分離鑒定出三種密切相關(guān)的NOS酶。它們包括內(nèi)皮NOS(e-NOS,Ⅲ型)、神經(jīng)元NOS(n-NOS,Ⅱ型)和可誘導(dǎo)NOS(i-NOS,Ⅰ型)(Knowles RG和Moncada S(1994)，“哺乳動(dòng)物中的氧化氮合成酶”，《生物化學(xué)雜志》298:249-258；Sessa WC.(1994)，“氧化氮合成酶類蛋白質(zhì)”，《血管研究雜志》1994；31:131-143；Nathan C(1992)，“作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌產(chǎn)物的氧化氮”，《美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)會(huì)志》(FASEBJ)6:301-3064)。結(jié)構(gòu)異構(gòu)體e-NOS和b-NOS最初分別在內(nèi)皮組織和神經(jīng)元組織中被鑒別，它們?cè)趬A性條件下迅速、短暫地產(chǎn)生少量NO。i-NOS異構(gòu)體是可被細(xì)胞因子或內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的，它以與Ca2+無關(guān)的方式數(shù)小時(shí)或數(shù)天產(chǎn)生大量的NO。在堿性條件下，細(xì)胞在表達(dá)iNOS時(shí)并不產(chǎn)生NO。e-NOS形式的酶在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血小板和某些神經(jīng)元中表達(dá)。e-NOS產(chǎn)生的NO是最重要的血管舒張劑。它以較低水平釋放，保持恒定的血管舒張和正常的血壓。n-NOS被認(rèn)為起到神經(jīng)遞質(zhì)的作用。它被認(rèn)為在參與實(shí)現(xiàn)胃腸道能動(dòng)性和陰莖勃起等功能中起到重要作用。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出的一個(gè)具體證據(jù)表明，氧化氮的缺乏是大量疾病的病機(jī)，如高血壓、動(dòng)脈硬化癥和糖尿病(Moncada S,Palmer RMG和Higgs EA(1991)，“氧化氮生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)”，《藥理學(xué)評(píng)論》43:109-142)。最近的多項(xiàng)研究表明，抑制氧化氮合成酶會(huì)急驟地升高血壓。用氧化氮合成酶抑制劑對(duì)妊娠大鼠和豚鼠給藥，產(chǎn)生與驚厥前期相同的癥狀(Chwalisz K和Garfield RE(1994)，“黃體酮在妊娠過程中的作用分娩和驚厥前期的模型”，《Z.Geburtsh.u.Perinat》198:170-180)。驚厥前期的特征在于血壓及外周血管阻力升高、胎兒生長(zhǎng)遲緩、蛋白尿和浮腫。在人類中，組織病理學(xué)與臨床的證據(jù)(胎兒生長(zhǎng)遲緩、胎兒死亡)說明，胎盤灌流降低是驚厥前期中觀察到的最早和最主要的一致性改變(Roberts JM和RedmanCWG(1993)，“驚厥前期不僅僅是妊娠誘發(fā)的高血壓”，341:1447-1451；Friedman EA(1988)，“驚厥前期前列腺素的作用評(píng)論”，《婦產(chǎn)科學(xué)》71:122-137)。
L-精氨酸-NO系統(tǒng)存在于子宮中(Garfield RE和YallampalliC(1993)，“子宮肌層收縮性的調(diào)節(jié)與分娩”，《足月與提前出生調(diào)節(jié)的基本機(jī)制》，K.Chwalisz,RE Garfield編，紐約Springer-Verlag出版公司，PP.1-29；Chwalisz K和Garfield RE(1994)，“在誘發(fā)分娩中的抗孕酮”，《紐約科學(xué)會(huì)年鑒》734:387-413；BuhimschiI,Yallampalli C,Dong Y-L和Garfield RE(1995)，“氧化氮-單磷酸環(huán)鳥苷參與調(diào)節(jié)妊娠期人子宮收縮性”，《美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)雜志》172:1577-1584；Sladek SM,Regenstrin AC,Lykins D等(1993)，“妊娠兔子宮中氧化氮合成酶的活性在妊娠的最后一天降低”，《美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)雜志》169:1285-1291)。該系統(tǒng)在調(diào)節(jié)子宮收縮性、維持妊娠、引發(fā)分娩以及胎兒灌流中扮演重要角色。L-精氨酸和硝酸引起接近妊娠期中期的大鼠子宮磨帶(uterine strips)自發(fā)活性的快速和真正的松弛(Buhimschi I,Yallampalli C,Dong Y-L和Garfield RE(1995)，“氧化氮-單磷酸環(huán)鳥苷參與調(diào)節(jié)妊娠期人子宮收縮性”，《美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)雜志》172:1577-1584；Garfield RE和YallampalliC(1993)，“子宮肌層收縮性的調(diào)節(jié)與分娩”，《足月與提前出生調(diào)節(jié)的基本機(jī)制》，K.Chwalisz,RE Garfield編，紐約Springer-Verlag出版公司，pp.1-29；Sladek SM,Regenstrin AC,Lykins D等(1993)，“妊娠兔子宮中氧化氮合成酶的活性在妊娠的最后一天降低”，《美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)雜志》169:1285-1291；Natuzzi ES,Ursell PC,Harrison M.等(1993)，“妊娠子宮中氧化氮合成酶的活性在分娩時(shí)降低”，《生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊》194:108-114；JenningsRW,MacGillvray TE和Harrison MR.(1995)，“氧化氮抑制恒河猴提前分娩”，《J Mat Fet Med》2:170-175)。
使用單克隆抗體，用免疫印跡法研究大鼠子宮中NOS酶的表達(dá)。在子宮(子宮肌層)中檢測(cè)到了i-NOS和e-NOS。處于足月和早產(chǎn)的動(dòng)物在分娩過程中，子宮內(nèi)的子宮i-NOS酶降低。而在子宮頸中觀察到了相反的變化(Buhimschi I,Ali M,Jain V,Chwalisz K和GarfieldRE(1996)，“妊娠和分娩過程中氧化氮在子宮和子宮頸中的不同調(diào)節(jié)作用”，《Human Reproduction(人類繁殖)》(印刷中))。
NOS也存在于胎盤組織和子宮動(dòng)脈中。利用免疫及組織化學(xué)的方法，對(duì)妊娠豚鼠體內(nèi)滋養(yǎng)層侵入與NO合成酶異構(gòu)體表達(dá)有關(guān)的子宮胎盤動(dòng)脈，和動(dòng)脈擴(kuò)張術(shù)進(jìn)行了對(duì)比研究。所宣稱的子宮胎盤動(dòng)脈擴(kuò)張開始于妊娠中期，直至妊娠結(jié)束(Nanaev A,Chwalisz K,Frank H-G,Kohnen G,Hartung C-H和Kaufmann P(1995)，“豚鼠子宮胎盤動(dòng)脈的生理學(xué)擴(kuò)張取決于絨毛外滋養(yǎng)層(extravillous prophoblast)的氧化氮合成酶活性”，《細(xì)胞組織研究》282:407-421)。這項(xiàng)研究證明，若在血管附近發(fā)現(xiàn)有共同表達(dá)內(nèi)皮及巨噬細(xì)胞氧化氮合成酶(eNOS及iNOS)的將要侵入的滋養(yǎng)層細(xì)胞，也就是說在滋養(yǎng)層侵入動(dòng)脈壁之前，即可以看到子宮胎盤動(dòng)脈的擴(kuò)張。Conrad等(1993)將NOS定位于人胎盤的合胞體滋養(yǎng)層(syncythiotrophoblast)細(xì)胞中(Conrad KP,Vill M,Mcguire PG,Dail WG,Davis AK(1993)，“人胎盤絨毛中通過合胞體滋養(yǎng)層的氧化氮合成酶的表達(dá)”，《美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)會(huì)志》7:1269-1276)。Morris等(1993)證實(shí)了人胎盤絨毛和基板中鈣依賴型與鈣獨(dú)立型活性(Morris NH,Sooranna SR,Eaton BM,SteerPJ(1993)，“血壓正常的妊娠婦女胎盤床與組織中的NO合成酶活性”，《柳葉刀》342:679-680)，Myatt等(1993)說明了胎盤絨毛樹合成了NOS的鈣依賴型異構(gòu)體(Myatt L,Brockman DE,Langdon G,Pollock JS(1993)，“人胎盤絨毛血管樹中氧化氮合成酶的鈣依賴型結(jié)構(gòu)異構(gòu)體”，《胎盤》14:373-383；Myatt L,Brockman DE,EisAL,Pollock JS(1993)，“人胎盤中氧化氮合成酶的免疫組織化學(xué)定位”，《胎盤》14:487-495)。此外，Buttery等(1994)說明了足孕的內(nèi)皮NOS局限在臍帶動(dòng)脈及靜脈內(nèi)皮中和胎盤合胞體滋養(yǎng)層中(Buttery LDK,McCarthy A,Springall A等(1994)，“人胎盤中的內(nèi)皮氧化氮合成酶在胎兒-母體界面的區(qū)域分布和建議的調(diào)節(jié)作用”，《胎盤》15:257-267)。而且，Moorhead等(1995)已說明，NADPH心肌黃酶(非特異性反應(yīng)鑒別氧化氮合成酶)在妊娠早期以各種子宮成分存在(Moorhead CS,Lawhun M,Nieder GL(1995)，“妊娠前半階段和人工誘導(dǎo)的蛻膜細(xì)胞反應(yīng)過程中NADPH心肌黃酶在小鼠子宮中的定位”，《組織化學(xué)細(xì)胞化學(xué)雜志》43:1053-1060)。最后，Toth等(1995)證實(shí)，NOS活性存在于處于妊娠首三月的人胎盤勻漿中(Toth M,Kukor Z,Romero R,Hertelendy F(1995)，“妊娠首三月的人胎盤中的氧化氮合成酶特征化鑒定和亞細(xì)胞分布”，《高血壓妊娠》14/3:287-300)。
這些結(jié)果表明，在妊娠過程中，氧化氮是調(diào)節(jié)胎盤血流和子宮肌層靜止期的重要因素。不過，迄今尚沒有公開的研究證明，IVF后或早期妊娠失敗的婦女中，NOS抑制對(duì)植入的有害作用或者是氧化氮原料物質(zhì)或底物對(duì)植入的有益作用。相反，Haddad等(1995)提出，氧化氮的生成量增加與小鼠早期胚胎喪失有關(guān)，iNOS抑制劑可用于治療早期流產(chǎn)(Haddad EK,Duclos AJ,Baines MG(1995)，“早期胚胎喪失與蛻膜單核細(xì)胞局部產(chǎn)生氧化氮有關(guān)”，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》182:1143-51)。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于提高IVF后植入率的方法，該方法包括將一種氧化氮底物和/或原料物質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療和預(yù)防不育癥或早期妊娠失敗的方法，該方法包括將一種氧化氮底物和/或原料物質(zhì)對(duì)早期妊娠的哺乳動(dòng)物給藥。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種用于提高植入率、治療和預(yù)防不育癥或早期妊娠失敗的方法，該方法包括將一種氧化氮底物和/或原料物質(zhì)給藥，其中該氧化氮底物和/或原料物質(zhì)結(jié)合使用黃體酮或一種孕激素試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于雌性哺乳動(dòng)物提高植入率、治療和預(yù)防不育癥或早期妊娠失敗的方法，該方法中將一種孕激素試劑與一種雌激素試劑結(jié)合一種氧化氮底物和/或氧化氮原料物質(zhì)給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種節(jié)育方法，該方法包括將抗孕酮(例如米非司酮、ORG31710、ORG33628、J867、CDB2914、ZK137316)和/或黃體酮合成酶抑制劑(例如環(huán)氧司坦、曲洛司坦)結(jié)合一種氧化氮合成酶抑制劑給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種節(jié)育方法，該方法包括將一種抗孕酮和/或黃體酮合成酶抑制劑結(jié)合一種氧化氮合成酶抑制劑給藥，用于每月一次的避孕。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種節(jié)育方法，該方法包括將一種抗孕酮結(jié)合一種氧化氮合成酶抑制劑給藥，用于中止早期妊娠。
進(jìn)一步的目的是提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的藥物組合物。在研究了本說明書和所附權(quán)利要求書的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的進(jìn)一步目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將變得顯而易見。
發(fā)明概述以一種方法的方式，本發(fā)明涉及一種提高IVF后植入率或治療早期妊娠失敗的方法，該方法包括將一種氧化氮底物和一種氧化氮原料物質(zhì)之一或兩者單獨(dú)或僅結(jié)合黃體酮或進(jìn)一步結(jié)合雌激素，以有效改善癥狀的量對(duì)有癥狀表現(xiàn)的個(gè)體給藥，通過升高女性血液循環(huán)中的L-精氨酸的血液濃度，該氧化氮合成酶底物和氧化氮原料物質(zhì)或兩者的量足以有效提高植入率和出生率，組合物對(duì)該女性的給藥量為高出正常的50至1000微摩爾循環(huán)濃度至少10至500微摩爾，或者將氧化氮原料物質(zhì)濃度升高至約10nM至100μM(微摩爾)，孕激素試劑的給藥量為10-300mg注射黃體酮的生物當(dāng)量，雌激素的給藥量為每天約2mg雌二醇(戊酸雌二醇R,Schering)的生物當(dāng)量。
以一種方法的方式，本發(fā)明涉及一種節(jié)育方法，該方法包括將一種氧化氮抑制劑和一種抗孕酮單獨(dú)或結(jié)合一種黃體酮合成酶抑制劑對(duì)雌性哺乳動(dòng)物給藥。該節(jié)育方法的一種實(shí)施方式是在植入前進(jìn)行。氧化氮抑制劑優(yōu)選為iNOS抑制劑，可結(jié)合一種抗孕酮用于在排卵周期附近抑制給藥后植入(LH峰+/-4天)，作為緊急避孕法(即，在沒有采取防護(hù)措施的性交后72小時(shí)內(nèi))，用連續(xù)的每天處理的方式用于抑制子宮內(nèi)膜的接受能力，用每周一次的處理方式用于抑制子宮內(nèi)膜的接受能力，用于誘發(fā)月經(jīng)(即，生育周期中閉經(jīng)的第一周內(nèi))，或用于誘發(fā)每28+/-3天一次規(guī)則的月經(jīng)。
以一種產(chǎn)品的方式，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該組合物含有至少一種氧化氮合成酶底物(L-精氨酸)和一種氧化氮原料物質(zhì)(例如硝普鈉或三硝酸甘油)，單用或進(jìn)一步結(jié)合一或多種黃體酮/孕酮和/或雌二醇/雌激素，每單位劑量中該氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物質(zhì)或兩者的量相當(dāng)于將循環(huán)中的L-精氨酸血液濃度升高至高出正常的50至1000μM循環(huán)濃度至少10至500μM，或者將氧化氮原料物質(zhì)濃度升高至約10nM至100μM，雌激素的量為約2mg雌二醇(例如戊酸雌二醇R,Schering)的生物當(dāng)量，黃體酮的量為5至300mg注射黃體酮的生物當(dāng)量。
以一種產(chǎn)品的方式，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該組合物含有至少一種有效劑量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑(例如L-NMMA、L-NIO、L-NIL、氨基胍、AMT、4-甲基-2-氨基吡啶(piridine)、6,4-二甲基-2-氨基吡啶或2-氨基吡啶)，結(jié)合單獨(dú)一種抗孕酮或/和進(jìn)一步結(jié)合一種黃體酮合成酶抑制劑。
公開內(nèi)容詳述本發(fā)明的方法提高了表現(xiàn)出其癥狀的妊娠女性IVF后植入率和出生率，治療早期妊娠失敗。
氧化氮合成不足或低于正常以下，使子宮對(duì)胎體的血液供應(yīng)不足，這會(huì)產(chǎn)生或加重植入率降低及出生率降低和早期妊娠失敗，因此，氧化氮合成酶底物、例如L-精氨酸，和氧化氮原料物質(zhì)、例如硝普鈉、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯、二硝酸異山梨酯和二乙撐三胺/NO(DETA/NO)，可用于改善癥狀，本發(fā)明方法的一個(gè)方面即是這兩種物質(zhì)的組合使用。
若將一種孕激素試劑和/或雌激素試劑與氧化氮底物和/或氧化氮原料物質(zhì)同時(shí)給藥，會(huì)實(shí)現(xiàn)附加的作用。在雌性哺乳動(dòng)物的情況下，孕激素試劑可以與雌激素同時(shí)給藥或代替雌激素給藥。
因此，本發(fā)明的方法方式和本發(fā)明的藥物組合物方式使用了氧化氮底物和氧化氮原料物質(zhì)之一或兩者都使用了，以及可選的一或多種雌激素(例如戊酸雌二醇R,Schering)或孕酮(例如黃體酮或羥基黃體酮己酸酯(己酸羥孕酮RDepot)等)。
在本發(fā)明有關(guān)節(jié)育的方法方式中，若將一種黃體酮受體拮抗劑(抗孕酮)和/或一種黃體酮合成酶抑制劑與一種氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑同時(shí)給藥，會(huì)實(shí)現(xiàn)協(xié)同或附加作用。
典型NO-底物和NO-原料物質(zhì)的(口服)劑量范圍實(shí)例為總劑量L-精氨酸 500mg-10g口服硝普鈉500-2000μg/kg/天硝酸甘油 0.5-10mg單硝酸異山梨酯10-100mg二硝酸異山梨酯10-100mg能與氧化氮底物和/或氧化氮原料物質(zhì)同時(shí)給藥的活性試劑的組合實(shí)例為下列雌激素與孕酮，以及雌激素與孕酮活性試劑和氧化氮底物或原料物質(zhì)的典型的口服劑量范圍。
雌激素每日劑量的生物當(dāng)量約為每天1至2mg，例如，馬雌激素(Premarin)R,Wyeth-Ayerst,0.625mg/天，雌二醇25-100μg/天，透皮或陰道給藥的雌二醇凝膠或乳膏。
孕酮每日劑量的生物當(dāng)量約為50-300mg黃體酮/天，例如，己酸羥基黃體酮肌肉注射，使其每周劑量為100-1000mg，或者以片劑或糖衣丸給藥，提供微粉化黃體酮的有效口服劑量，或者以黃體酮的陰道凝膠給藥，每日劑量為2-300mg/天。
下面列出孕酮的實(shí)例產(chǎn)品 組成 劑量己酸羥孕酮RDepot(Schering) 己酸羥基黃體酮250-1000mg/周肌肉注射黃體酮-Depot(Jenapharm)己酸羥基黃體酮250-1000mg/周肌肉注射下面列出雌激素的實(shí)例產(chǎn)品 組成 劑量Climaval(Sandoz)戊酸雌二醇0.5-4mg戊酸雌二醇(Schering)戊酸雌二醇0.5-4mg下面列出抗孕酮的實(shí)例11β-[4-N,N-(二甲氨基)苯基]-17a-羥基-17β-(3-羥丙基)-13a-甲基-4,9(10)-甾二烯-3-酮，11β-(4-乙酰苯基)-17β-羥基-17a-(3-羥基丙-1(Z)-烯基)-4,9(10)-雌二烯-3-酮(EP-A 0 190 759)，11β,19-[4-(氰基苯基)-o-亞苯基]-17b-羥基-17a-(3-羥基丙-1(Z)-烯基)-4-雄烯-3-酮(WO-A 93/23020)，11β,19-[4-(3-吡啶基)-o-亞苯基]-17β-羥基-17a-(3-羥基丙-1(Z)-烯基)-4-雄烯-3-酮(WO-A 93/23020)。
下面列出iNOS抑制劑的實(shí)例劑量L-NMMA(NG-單甲基-L-精氨酸) 1-1000mg/天L-NIO(L-N5-(1-亞氨乙基)鳥氨酸) 1-1000mg/天L-NIL(L-N6-(1-亞氨乙基)賴氨酸) 1-1000mg/天氨基胍 1-1000mg/天AMT(2-氨基-5,6-二氫-6-甲基-4H-1,3-噻嗪)(Abbott) 0.1-100mg/天4-甲基-2-氨基吡啶0.1-100mg/天6,4-二甲基-2-氨基吡啶0.1-100mg/天2-氨基吡啶 0.1-100mg/天本發(fā)明所用的藥理活性試劑可與常規(guī)賦形劑混合后給藥，也就是藥學(xué)上可接受的液體、半液體或固體的有機(jī)或無機(jī)載體，例如適用于胃腸外或腸內(nèi)用藥的載體，它們不和與它們混合的活性化合物發(fā)生有害的反應(yīng)。適用的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于水、鹽溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸單甘油酯及二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
可對(duì)藥物制劑進(jìn)行滅菌，如果需要的話與助劑混合，例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、矯味劑和/或芳香物質(zhì)及諸如此類，這些助劑不與活性化合物發(fā)生有害的反應(yīng)。
就胃腸外用藥而言，特別適用的是溶液，優(yōu)選油溶液或水溶液，以及懸液、乳劑或植入劑，包括栓劑、透皮貼劑、和陰道凝膠、乳膏和泡沫。安瓿對(duì)單位劑量來說是方便的。
本發(fā)明組合物優(yōu)選的方式是適合于攝取的形式。
就腸內(nèi)用藥而言，特別適用的是單位劑型，例如片劑、糖衣丸或膠囊，含有滑石和/或碳水化合物載體或粘合劑或諸如此類，載體優(yōu)選為乳糖和/或玉米淀粉和/或馬鈴薯淀粉；固體微粒劑，例如膠囊；液體和半液體劑型，例如糖漿和酏劑或諸如此類，其中使用一種具有甜味的賦形劑。可配制成持續(xù)釋放的組合物，其中將活性化合物用降解程度有差異的包衣保護(hù)起來，例如通過微囊法、多層包衣法等。
其中尤其適用于口服給藥的是片劑、糖衣丸、膠囊、丸劑、顆粒劑、懸液和溶液。每單位劑量、例如每羹匙液體或每片或每糖衣丸，含有例如5-5000mg的每種活性試劑。
其中尤其適用于透皮用藥的是透皮貼劑和凝膠。
用于胃腸外給藥的溶液例如含有0.01-1％的每種活性試劑的水溶液或醇溶液。
氧化氮底物和/或原料物質(zhì)可作為與雌激素和/或孕激素試劑以及任何其他可選的活性試劑的混合物給藥，或作為分離的單位劑型彼此同時(shí)或在一天中的不同時(shí)間給藥。
活性試劑的組合的給藥方式優(yōu)選為每天至少一次(除非給藥劑型是連續(xù)釋放活性試劑的)，更優(yōu)選為每天若干次，例如分2至6次劑量。劑量一般約為每種活性試劑0.5至1000mg，不過某些活性小的試劑、例如L-精氨酸，需要更高的口服劑量，例如500至10000mg，其他的、例如硝普鈉，需要較低的劑量，例如500-2000μg/kg/天。硝酸甘油的劑量一般為口服每天2.6mg×2，舌下給藥每天0.8mg×1-4，透皮給藥0.2-0.5mg/小時(shí)。優(yōu)選的給藥方式是透皮給藥。由于這些活性試劑的LD50劑量多數(shù)是現(xiàn)有技術(shù)已知的，開始可以使用較低的劑量療法，然后升高劑量，直至出現(xiàn)陽性反應(yīng)，或者開始可以使用較高的劑量療法，例如處于危險(xiǎn)狀況，然后隨著癥狀的減緩將劑量向下調(diào)整。既可以連續(xù)地使用試劑的組合，也可以順序地使用試劑的組合。
人體中，L-精氨酸與黃體酮(或生物當(dāng)量的另一種孕酮)的給藥比例所產(chǎn)生的血漿濃度應(yīng)為50-5000微摩爾L-精氨酸、10-100納摩爾雌二醇和100至1000納摩爾黃體酮。
氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑，可作為與抗孕酮和/或黃體酮合成酶抑制劑(例如環(huán)氧司坦、曲洛司坦)以及任何其他可選的活性試劑的混合物給藥，或作為分離的單位劑型彼此同時(shí)或在一天中的不同時(shí)間給藥。
附圖的簡(jiǎn)要說明結(jié)合附圖考慮，將對(duì)本發(fā)明各種其他目的、特征和伴隨的優(yōu)點(diǎn)有更好的理解和更完全的正確認(rèn)識(shí)，幾幅圖中相似的參考字母指的是相同或相似的部分內(nèi)容，其中
圖1圖1表示L-NAME(NOS抑制劑)對(duì)大鼠植入的作用。從動(dòng)物交配后(記為p.c.)第1天至第7天p.c.，以連續(xù)的方式皮下輸注給以25和50mg/動(dòng)物/天的L-NAME。在第12天p.c.進(jìn)行尸體解剖。圖2圖2表示L-NAME(NOS抑制劑)對(duì)大鼠植入的作用。在第5至7天(p.c.)，以連續(xù)的方式皮下輸注法給以25和50mg/動(dòng)物/天的L-NAME。在第9天p.c.或第12天p.c.進(jìn)行尸體解剖。圖3圖3表示單用L-NAME(NOS抑制劑；50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)皮下輸注法給藥)、單用小劑量阿那司酮(onapristone)(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)和L-NAME(50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)皮下輸注法給藥)加小劑量阿那司酮(onapristone)(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)的組合對(duì)大鼠植入的作用。動(dòng)物在第5-8天p.c.、也就是早期植入期間給藥。在第9天p.c.進(jìn)行尸體解剖。注意到病理植入部位(小的血染色的部位)有顯著(p＜0.05)增加，而在用L-NAME加onapristone治療后植入部位的大小和重量均減小了。圖4圖4表示如圖3所述單用L-NAME(NOS抑制劑；50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)皮下輸注法給藥)、單用小劑量onapristone(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)和結(jié)合使用L-NAME(50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)輸注法皮下給藥)加小劑量onapristone(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)治療的不同組中的黃體酮濃度。圖5圖5表示單用L-NAME(NOS抑制劑；50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)皮下輸注法給藥)、單用小劑量onapristone(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)和L-NAME(50mg/動(dòng)物/天；連續(xù)皮下輸注法給藥)加小劑量onapristone(0.3mg/動(dòng)物，油注射液皮下給藥)的組合對(duì)大鼠植入的作用。動(dòng)物在第1-4天p.c.、也就是在接受前期給藥。在第9天p.c.進(jìn)行尸體解剖。注意到在用L-NAME加onapristone治療后子宮內(nèi)膜的接受能力被顯著(p＜0.05)抑制了(6/7動(dòng)物中無植入部位)，而植入部位的大小和重量均明顯地地減小了(1/7動(dòng)物中)。
實(shí)施例的詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)1在交配后(p.c.)第1-7天L-NAME對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜接受能力和早期植入的作用該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，從第1天p.c.直至第7天p.c.、也就是在植入前階段和早期植入(大鼠體內(nèi)植入發(fā)生在第5天p.c.)過程中，用25和50mg/動(dòng)物/天的L-NAME治療妊娠大鼠(n=6/組)。對(duì)照動(dòng)物給以賦形劑。尸體解剖(第9天p.c.(研究的第1部分)和第12天p.c.(研究的第2部分)；每部分中n=6/組)過程中，用肉眼確定植入部位，測(cè)量其直徑，記錄分離的植入部位(胚胎和胎盤組織)的重量。
實(shí)驗(yàn)2在第5-7天p.c.治療后L-NAME對(duì)大鼠早期植入的作用圖2代表妊娠大鼠第二項(xiàng)研究的結(jié)果，其中在第5-7天p.c.進(jìn)行L-NAME治療(25和50mg/動(dòng)物/天)，也就是在發(fā)生著床后不久。在第12天p.c.進(jìn)行尸體解剖。將表現(xiàn)為出血改變的植入定義為病理植入部位。從這些結(jié)果可以得出的結(jié)論是，氧化氮合成酶抑制劑L-NAME對(duì)植入具有深刻的影響。對(duì)植入部位的大小和重量存在劑量依賴的抑制作用。此外，L-NAME誘發(fā)了植入部位的病理改變(主要為出血)。
實(shí)驗(yàn)3L-NAME結(jié)合小劑量抗孕酮(onapristone)在第5-8天p.c.治療大鼠后對(duì)早期植入的作用該研究的目的是在大鼠早期植入過程中評(píng)價(jià)氧化氮與黃體酮是否具有相互作用。大鼠(n=8/組)在第5-8天p.c.接受下列治療L-NAME(50mg/天，皮下輸注法)、墮胎下劑量(皮下0.3mg/天)的onapristone(黃體酮拮抗劑)、L-NAME加當(dāng)量劑量的onapristone以及賦形劑(對(duì)照)。在第9天p.c.除去子宮進(jìn)行植入部位的形態(tài)測(cè)定和組織學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果在早期妊娠過程中給藥時(shí)，L-NAME和小劑量的onapristone均顯著(α=0.05)減小了植入部位的直徑和重量(圖3)。蛻膜組織的范圍在L-NAME和onapristone治療后也減小了。不過，正常的子宮肌層及抗子宮肌層蛻膜作用得以保持。L-NAME和onapristone的組合顯著地減小了植入部位的直徑和重量，同時(shí)還顯著地減小了蛻膜化范圍，后者是蛻膜細(xì)胞和胚胎的壞死。兩種治療方案對(duì)血清黃體酮濃度均沒有任何明顯影響(圖4)，這說明L-NAME加onapristone對(duì)植入的作用是一種直接作用的結(jié)果。結(jié)論NOS的抑制作用不改變子宮內(nèi)膜的接受能力。不過，當(dāng)在早期妊娠過程中給藥時(shí)，NOS的抑制作用與極低劑量的onapristone治療作用單獨(dú)削弱了蛻膜化過程，阻礙了植入部位的發(fā)育。組合療法產(chǎn)生協(xié)同作用，基本上削弱了植入。
實(shí)驗(yàn)4L-NAME結(jié)合小劑量抗孕酮(onapristone)在第1-4天p.c.治療大鼠后對(duì)子宮內(nèi)膜接受能力的作用該研究中，在第1-4天p.c.的接受前期用L-NAME(50mg/動(dòng)物/天，皮下輸注法)結(jié)合及不結(jié)合小劑量onapristone(0.3mg/動(dòng)物/天)治療妊娠大鼠(n=7/組)。在第9天p.c.進(jìn)行尸體解剖。研究結(jié)果見圖5。對(duì)照動(dòng)物(n=7)用賦形劑治療。在賦形劑對(duì)照組中，所有動(dòng)物(7/7)表現(xiàn)了正常的植入部位。單用L-NAME治療對(duì)子宮內(nèi)膜接受胚胎植入的能力幾乎沒有作用，尸體解剖過程中所有動(dòng)物(7/7)均肉眼可見正常的植入部位。單用onapristone治療減少了植入部位的數(shù)量，大多數(shù)動(dòng)物(5/7)根本沒有植入。與之形成對(duì)比的是，用L-NAME加onapristone治療完全防止了6/7動(dòng)物的植入。其余兩只動(dòng)物(2/7)中，一只動(dòng)物植入部位在形態(tài)學(xué)上是正常的，但是它們的大小非常小(圖5)。第二只動(dòng)物的植入部位形態(tài)學(xué)異常(出血)，且極小。從該研究可以得出結(jié)論，若在接受前期給藥，L-NAME加onapristone的組合療法防止了植入(抑制了子宮對(duì)胚胎植入的接受能力)。
實(shí)驗(yàn)5氧化氮合成酶(NOS)異構(gòu)體在小鼠植入部位的時(shí)空分布該研究的目的是檢測(cè)在小鼠著床過程中三種主要的NOS異構(gòu)體(iNOS、ecNOS和bcNOS)存在與否。檢查從妊娠第4天中午到第7天中午的植入部位，以確定NOS異構(gòu)體的存在。將小鼠麻醉，除去植入部位，固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蠟中，用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行切片和染色。使用抗iNOS、ecNOS和bcNOS的多克隆抗體(轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室)。在所有進(jìn)行觀察的時(shí)間點(diǎn)，iNOS在子宮肌層的內(nèi)層肌肉層與外層肌肉層之間的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中的染色是最明顯的。蛻膜也表現(xiàn)出來散布于組織中的陽性染色反應(yīng)。朝向植入部位，對(duì)iNOS呈陽性的細(xì)胞增加了。ecNOS在鄰近胚胎抗子宮系膜孔的初級(jí)蛻膜區(qū)的染色在第6和第7天最為突出。在所有時(shí)間點(diǎn)，子宮肌層血管也被染色，以及在植入前，腔上皮細(xì)胞基部也被染色。特別針對(duì)bcNOS的染色主要位于子宮肌層的外層肌肉層，而在子宮系膜內(nèi)，在所檢查的時(shí)間框架中染色沒有明顯的區(qū)別。陰性及陽性對(duì)照所顯示的染色是適當(dāng)?shù)摹＝Y(jié)論是這些數(shù)據(jù)表明，iNOS和ecNOS都提高了小鼠近植入期的表達(dá)。
這些研究的結(jié)果(既從功能上又從組織化學(xué)上)說明，氧化氮在植入過程中起到關(guān)鍵作用。它對(duì)整個(gè)植入過程中的胎盤灌流來說似乎是重要的。子宮中缺乏氧化氮會(huì)導(dǎo)致植入部位的再吸收或自發(fā)吸收。因此，單用氧化氮原料物質(zhì)或底物或者結(jié)合一種類固醇激素(黃體酮雌二醇)對(duì)提高植入率和治療不育癥及早期妊娠失敗將被證明是有效的。而且，氧化氮抑制劑與抗孕酮和/或黃體酮合成酶抑制劑的組合將對(duì)防止或干擾妊娠有效。例1體外受精后用氧化氮底物提高植入率。將L-精氨酸對(duì)接受IVF的婦女(50-90kg)給藥，在妊娠的頭2-6周或更長(zhǎng)時(shí)間每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。例2體外受精后用氧化氮原料物質(zhì)提高植入率。在妊娠的頭2-6周或更長(zhǎng)時(shí)間將硝酸甘油(5-15mg/天)對(duì)接受IVF的婦女(50-90kg)透皮給藥。例3用氧化氮底物治療不育癥。將L-精氨酸對(duì)不育婦女(50-90kg)給藥，每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。例4用氧化氮原料物質(zhì)治療不育癥。將硝酸甘油(5-15mg/天)對(duì)不育婦女(50-90kg)透皮給藥。例5體外受精后用氧化氮底物結(jié)合黃體酮提高植入率。在妊娠的頭2-6周或更長(zhǎng)時(shí)間將透皮給藥的硝酸甘油(5-15mg/天)結(jié)合黃體酮(己酸羥孕酮RDepot(Schering)250-1000mg/周，肌注)對(duì)接受IVF的婦女(50-90kg)給藥。例6用氧化氮底物結(jié)合氧化氮底物治療不育癥。將透皮給藥的硝酸甘油(5-15mg/天)結(jié)合L-精氨酸對(duì)不育婦女(50-90kg)給藥，每日分三次口服0.5至20g L-精氨酸。例7體外受精后用氧化氮底物結(jié)合黃體酮和雌二醇提高植入率。在妊娠的頭2-6周或更長(zhǎng)時(shí)間將透皮給藥的硝酸甘油(5-15mg/天)結(jié)合黃體酮(己酸羥孕酮RDepot(Schering)250-1000mg/周，肌注)和戊酸雌二醇酯0.5-4mg/天對(duì)不育婦女(50-90kg)給藥。例8性交后用氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合抗孕酮避孕。在性交后72小時(shí)內(nèi)將0.5-400mg抗孕酮/天(例如米非司酮)結(jié)合有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。例9每日給以氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合抗孕酮進(jìn)行子宮內(nèi)膜避孕。將每日劑量不會(huì)抑制排卵(例如0.1-1mg/天米非司酮)的抗孕酮結(jié)合有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。例10每周一次給以氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合抗孕酮進(jìn)行子宮內(nèi)膜避孕。每周一次將劑量不會(huì)抑制排卵(例如5-20mg/周米非司酮)的抗孕酮結(jié)合有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。例11用氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合抗孕酮誘發(fā)月經(jīng)。在月經(jīng)周期的第28+/-3天將0.5-400mg/天的抗孕酮(例如米非司酮)結(jié)合有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。例12用氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合黃體酮合成酶抑制劑誘發(fā)月經(jīng)。在月經(jīng)周期的第28+/-3天將1-600mg/天的黃體酮合成酶抑制劑(例如環(huán)氧司坦)結(jié)合有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。例13用氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合抗孕酮、進(jìn)一步結(jié)合黃體酮合成酶抑制劑誘發(fā)月經(jīng)。在月經(jīng)周期的第28+/-3天將0.5-400mg/天的抗孕酮(例如米非司酮)結(jié)合1-600mg/天的黃體酮合成酶抑制劑(例如環(huán)氧司坦)以及有效量的氧化氮合成酶抑制劑、優(yōu)選為iNOS抑制劑給藥。
通過替換概述或具體描述的試劑和/或本發(fā)明用于前述實(shí)施例所用的操作條件，可同樣成功地重復(fù)實(shí)施前述實(shí)施例。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員從上述說明可以很容易地確定本發(fā)明的必要技術(shù)特征，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明作出各種變化和修改，使其適合于各種用途和條件。
權(quán)利要求
1．一種提高妊娠雌性哺乳動(dòng)物體外受精后的植入率的方法，該方法包括將一定量的一種氧化氮合成酶底物、一種氧化氮原料物質(zhì)、或兩者對(duì)受治療雌性動(dòng)物給藥，給藥量使循環(huán)中的L-精氨酸的血液濃度升高至高出正常的50-1000微摩爾循環(huán)濃度至少約50-5000微摩爾，可選還將一種孕酮、或一種雌激素與一種孕酮給藥，給藥量可有效提高妊娠率。
2．權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是患有不育癥的沒有妊娠的婦女，或患有習(xí)慣性流產(chǎn)的妊娠婦女或表現(xiàn)有流產(chǎn)先兆癥狀的妊娠婦女。
3．權(quán)利要求1的方法，其中氧化氮底物是L-精氨酸。
4．權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，將氧化氮原料物質(zhì)對(duì)其給藥。
5．權(quán)利要求4的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是硝普鈉、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯或硝酸異山梨酯。
6．權(quán)利要求4的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是口服給藥的。
7．權(quán)利要求4的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是透皮給藥的。
8．權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，氧化氮底物或原料物質(zhì)是結(jié)合黃體酮對(duì)其給藥的。
9．權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，氧化氮底物或原料物質(zhì)是結(jié)合黃體酮和/或雌二醇對(duì)其給藥的。
10．權(quán)利要求8的方法，其中孕酮是黃體酮或羥基黃體酮己酸酯。
11．權(quán)利要求9的方法，其中雌激素是戊酸雌二醇酯。
12．用一種氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合一種抗孕酮節(jié)育的方法。
13．權(quán)利要求12的方法，其中抗孕酮是米非司酮、ORG 31710、ORG 33628、J867、CDB 2914或ZK 137316。
14．權(quán)利要求12的方法，其中治療是在性交后進(jìn)行的。
15．一種含有下列成分混合物的藥物組合物(a)一種氧化氮合成底物，(b)一種氧化氮原料物質(zhì)或兩者，可選還含有至少一種(c)一種孕酮和(d)一種雌激素，其含量可有效提高妊娠或不育的雌性哺乳動(dòng)物的妊娠率或改善其流產(chǎn)先兆癥狀，雌激素的給藥劑量為相當(dāng)于1-2mg雌二醇的當(dāng)量，孕酮為50-300mg注射黃體酮生物當(dāng)量，氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物質(zhì)或兩者的量為使循環(huán)中的L-精氨酸的血液濃度高出正常的50-1000微摩爾循環(huán)濃度至少約50-5000微摩爾，或使氧化氮原料物質(zhì)濃度升高至約10nM至100微摩爾。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中(a)是一種氧化氮合成底物。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中氧化氮合成底物(b)是L-精氨酸。
18．根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中(b)是一種氧化氮原料物質(zhì)。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中氧化氮原料物質(zhì)是硝普鈉、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯或二硝酸異山梨酯。
20．根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中孕酮(d)是黃體酮或羥基黃體酮己酸酯。
21．根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中雌激素(c)是戊酸雌二醇酯。
22．權(quán)利要求12的方法，其中NOS抑制劑是L-NMMA、L-NIO、L-NIL、氨基胍、AMT、4-甲基-氨基吡啶、6,4-二甲基-2-氨基吡啶或2-氨基吡啶。
23．權(quán)利要求12的方法，其中用于節(jié)育的藥物組合物含有a)氧化氮抑制劑和b)抗孕酮的混合物。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中NOS抑制劑是L-NMMA、L-NIO、L-NIL、氨基胍、AMT、4-甲基-氨基吡啶、6,4-二甲基-2-氨基吡啶或2-氨基吡啶。
25．一種提高雌性哺乳動(dòng)物植入率和/或妊娠率的方法，該方法包括將有效量的下列成分對(duì)需要懷孕的雌性哺乳動(dòng)物給藥a)一種氧化氮合成酶底物、一種氧化氮原料物質(zhì)或兩者，可選結(jié)合b)一種孕酮，和c)可選進(jìn)一步結(jié)合一種雌激素。
26．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是患有不育癥的沒有妊娠的婦女、患有習(xí)慣性流產(chǎn)的妊娠婦女或表現(xiàn)有即將流產(chǎn)癥狀的妊娠婦女。
27．權(quán)利要求25的方法，其中氧化氮合成酶底物是L-精氨酸。
28．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，將氧化氮原料物質(zhì)對(duì)其給藥。
29．權(quán)利要求28的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是硝普鈉、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯或二硝酸異山梨酯。
30．權(quán)利要求28的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是口服給藥的。
31．權(quán)利要求28的方法，其中氧化氮原料物質(zhì)是透皮給藥的。
32．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，氧化氮底物或原料物質(zhì)是結(jié)合一種孕酮對(duì)其給藥的。
33．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是妊娠婦女，氧化氮底物或原料物質(zhì)是結(jié)合一種孕酮與一種雌激素對(duì)其給藥的。
34．權(quán)利要求32的方法，其中孕酮是黃體酮或羥基黃體酮己酸酯。
35．權(quán)利要求33的方法，其中雌激素是戊酸雌二醇酯。
36．一種用于雌性哺乳動(dòng)物的節(jié)育方法，該方法包括將一種有效量的氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合一種抗孕酮對(duì)不需要妊娠且有妊娠風(fēng)險(xiǎn)的雌性哺乳動(dòng)物給藥。
37．權(quán)利要求36的方法，其中抗孕酮是米非司酮、ORG 31710、ORG 33628、J867、CDB 2914或ZK 137316。
38．權(quán)利要求36的方法，其中該方法是在性交后進(jìn)行的。
39．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是婦女，氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物質(zhì)或兩者的給藥量可有效地將所述婦女的循環(huán)中的L-精氨酸的血液濃度升高至至少約為50-5000微摩爾的循環(huán)濃度。
40．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是婦女，氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物質(zhì)或兩者的給藥量可有效地將氧化氮原料物質(zhì)濃度升高至1-1000納摩爾。
41．權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物是婦女，孕酮的給藥量是50-300mg注射黃體酮的生物當(dāng)量，如果有的話，雌激素的給藥量是1-2mg雌二醇的生物當(dāng)量。
42．一種藥物組合物，該組合物含有有效量的下列成分的混合物a)一種氧化氮合成底物、一種氧化氮原料物質(zhì)或兩者；和b)一種孕酮，和可選的c)一種雌激素，其含量可有效升高妊娠雌性哺乳動(dòng)物或生育力低下的雌性哺乳動(dòng)物的妊娠率或改善其即將流產(chǎn)的癥狀，其中氧化氮合成酶底物、氧化氮原料物質(zhì)或兩者的給藥量可有效升高所述接受該組合物給藥的哺乳動(dòng)物循環(huán)中的L-精氨酸的血液濃度，使高出正常的50-1000微摩爾循環(huán)濃度至少50-5000微摩爾，和/或有效將氧化氮原料物質(zhì)濃度升高至1-1000納摩爾；孕酮的給藥量是50-300mg注射黃體酮的生物當(dāng)量；如果有的話，雌激素的給藥量是1-2mg雌二醇的生物當(dāng)量。
43．權(quán)利要求42的組合物，其中(a)是一種氧化氮合成酶底物。
44．權(quán)利要求43的組合物，其中氧化氮合成底物是L-精氨酸。
45．權(quán)利要求42的組合物，其中(a)是一種氧化氮原料物質(zhì)。
46．權(quán)利要求45的組合物，其中氧化氮原料物質(zhì)是硝普鈉、硝酸甘油、三硝酸甘油、SIN-1、單硝酸異山梨酯或二硝酸異山梨酯。
47．權(quán)利要求42的組合物，其中(b)是黃體酮或羥基黃體酮己酸酯。
48．權(quán)利要求42的組合物，其中(c)是戊酸雌二醇酯。
49．權(quán)利要求25的方法，其中成分(a)和(b)是連續(xù)給藥的。
50．權(quán)利要求25的方法，其中成分(a)和(b)是同時(shí)給藥的。
全文摘要
提供了一種用于提高雌性哺乳動(dòng)物植入率和/或妊娠率的方法,該方法包括對(duì)需要妊娠的雌性哺乳動(dòng)物給以有效量的:(a)一種氧化氮合成酶底物、一種氧化氮原料物質(zhì)或兩者,可選地結(jié)合(b)一種孕酮,和(c)可選進(jìn)一步結(jié)合一種雌激素。也提供了一種用于雌性哺乳動(dòng)物節(jié)育的方法,該方法包括對(duì)不需要妊娠且有妊娠風(fēng)險(xiǎn)的雌性哺乳動(dòng)物給以一種有效量的氧化氮合成酶抑制劑結(jié)合一種抗孕酮。也提供了藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P15/00GK1218402SQ97194452
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月7日
發(fā)明者K·切瓦斯, R·E·加菲爾德 申請(qǐng)人:舍林股份公司