專利名稱：用于治療變態(tài)反應(yīng)疾病的基于肽的免疫治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多表位肽，該肽可用于對(duì)變態(tài)反應(yīng)疾病的基于肽的免疫治療方法。
背景技術(shù)：
將變態(tài)反應(yīng)疾病定義為Ⅰ型超敏感(IgE抗體傳導(dǎo)的Ⅰ型免疫應(yīng)答)引起的功能性紊亂或一種由該紊亂誘導(dǎo)的疾病。癥狀包括花粉病、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、變應(yīng)性皮炎、過敏性休克?；ǚ鄄∈谴硇缘淖儜B(tài)反應(yīng)疾病。在日本，約10％的人患有雪松花粉過敏，而且患者的人數(shù)還在增加。在美國，5到15％的人患有短豚草花粉過敏。花粉過敏在社會(huì)和經(jīng)濟(jì)上都是嚴(yán)重的問題，因?yàn)榛颊吆芏嗖⑶宜麄兂惺苤荒苋淌艿陌Y狀如眼睛發(fā)癢，流涕，打噴嚏，鼻塞。而且，一旦患者得了花粉病，該病每年都要發(fā)生。因此，已有人認(rèn)真地探索了花粉病的有效治療方法。
為了理解和治療過敏病病，重要的是理解Ⅰ型過敏應(yīng)答是怎樣發(fā)展而成的。目前的研究重點(diǎn)在闡明變應(yīng)原特異性的免疫應(yīng)答中的起始反應(yīng)，特別是調(diào)節(jié)T-細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的機(jī)制。引發(fā)對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答包括在免疫系統(tǒng)中的依賴于抗原呈遞細(xì)胞的變態(tài)反應(yīng)原?？乖蔬f細(xì)胞(即B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和樹突狀細(xì)胞)接受進(jìn)入，將它們斷裂成抗原肽(T細(xì)胞表位肽)，把該片段放入含有主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類分子(人的Ⅱ類HLA)的α和β鏈的袋中，把片段暴露于細(xì)胞表面，從而把外源抗原呈遞給特異于抗原特異性的CD 4陽性輔助T細(xì)胞(Th細(xì)胞)。一個(gè)HLAⅡ類分子由DR,DQ和DP分子組成。HLA-DRA基因編碼DR分子的α(鏈，HLA-DRB1,-DRB3,DRB4或-DRB5基因編碼其β鏈。HLA-DQA1基因編碼DQ分子的α鏈，HLA-DQB1基因編碼其β鏈。HLA-DPA1基因編碼DP分子的α鏈，HLA-DPB1基因編碼其β鏈。除了HLA-DRA，每個(gè)基因都含有許多等位基因?？乖乃胖玫拇歉叨榷鄳B(tài)性的，而且相互的結(jié)構(gòu)有輕微的區(qū)別。正因?yàn)槿绱耍c袋結(jié)合并呈遞給T細(xì)胞的抗原肽的種類限于那種結(jié)構(gòu)。
一旦Th細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(TCR)接受HLAⅡ類限制性抗原信息，它們被激活后可分泌各種細(xì)胞因子，由此它們發(fā)生自身增殖。同時(shí)，Th細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成等漿細(xì)胞以誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞因子的方式的差別，將抗原刺激激活的Th細(xì)胞分類成能產(chǎn)生干擾素2(IL-2)，干擾素γ(IFN-γ)和淋巴毒素(TNF-β)的Th1細(xì)胞；能產(chǎn)生IL-4,IL-5,IL-6,IL-10和IL-13的Th2細(xì)胞；和能產(chǎn)生兩種細(xì)胞因子的Th0細(xì)胞。IL-4和IL-13促進(jìn)引起變態(tài)反應(yīng)的IgE抗體的產(chǎn)生，但受到IFN-γ的抑制。那就是，Th1細(xì)胞抑制IgE的產(chǎn)生，而Th2細(xì)胞促進(jìn)IgE的產(chǎn)生。換句話說，即變態(tài)反應(yīng)的致敏作用取決于在接觸抗原是Th1細(xì)胞還是Th2細(xì)胞發(fā)生作用。通常我們知道Th2細(xì)胞優(yōu)先在具有變態(tài)反應(yīng)的患者中起作用。變態(tài)反應(yīng)原特異性的IgE抗體附著于外周的嗜堿性細(xì)胞和組織肥大細(xì)胞。隨后的變態(tài)反應(yīng)原的接觸導(dǎo)致IgE抗體通過變態(tài)反應(yīng)原交叉連接到嗜堿細(xì)胞或肥大細(xì)胞上。這釋放炎癥淋巴因子包括組胺，前列腺素，白細(xì)胞三烯，從而引起直接變態(tài)反應(yīng)。對(duì)這些炎癥淋巴因子進(jìn)行應(yīng)答，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞，和嗜酸性細(xì)胞將聚集于組織的炎癥區(qū)并導(dǎo)致淋巴因子的釋放，引起包括紊亂和后期反應(yīng)的各種反應(yīng)。
一個(gè)通過抗原特異性的抑制IgE抗體產(chǎn)生的治療某種變態(tài)反應(yīng)的方法是利用變態(tài)反應(yīng)原蛋白分子的致敏作用治療方法。致敏作用治療方法可以提供化學(xué)治療不能提供的長期效果，所以，它是唯一的接近于有效治療的治療方法。但是，致敏作用治療方法并不常被作為治療變態(tài)反應(yīng)的一般方法，這可能是因?yàn)樗臋C(jī)制和可能的副作用(如局部腫脹或過敏性休克)仍然未知。
除致敏作用治療方法之外，已經(jīng)有人提出了利用含有T細(xì)胞表位的肽抗原的致敏作用機(jī)制。用于這一治療方法的變態(tài)反應(yīng)原分子上的攜帶T細(xì)胞表位的肽片段不含有B細(xì)胞表位，如果有也只是單價(jià)的以致肽不能交叉連接到與肥大細(xì)胞有高親和性的IgE受體上。由于這些原因，用該肽片段給藥的患者將不會(huì)產(chǎn)生副作用如過敏性休克。而且已知當(dāng)體內(nèi)給T細(xì)胞表位時(shí)，T細(xì)胞被抗原特異性地失活(變態(tài)反應(yīng))(La Salle J.M.等J.Exp.Med.176:177-186,1992)。據(jù)報(bào)道，根據(jù)這樣的理論基礎(chǔ)，在實(shí)驗(yàn)用鼠模型中進(jìn)行利用攜帶貓頭皮屑變態(tài)反應(yīng)原Feld1的主要T細(xì)胞表位的肽的致敏作用，在體外誘導(dǎo)了T細(xì)胞變態(tài)反應(yīng)(Briner,T.J.等，美國自然科學(xué)學(xué)術(shù)進(jìn)程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),90:7608-7612,1994)。利用該肽的致敏作用的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行(Norman,PS.等Am.J.Respir.Crit.Care Med.154:1623-1628,1996；Simons,F.E.等Int.Immunol.8:1937-1945,1996)。利用這種在變應(yīng)原分子上攜有主要T細(xì)胞表位的肽的致敏作用治療方法稱為“基于肽的免疫治療”(或“基于肽的致敏作用治療”)。
作為用于選擇適用于基于肽的免疫治療法的T細(xì)胞表位肽的標(biāo)準(zhǔn)，WO94/01560提出了一個(gè)陽性指數(shù)(出現(xiàn)頻率乘以平均T細(xì)胞刺激指數(shù))。另據(jù)報(bào)道，在肽設(shè)計(jì)中，應(yīng)該覆蓋患者群體中HLA單模式(haplotypic)的變異(Wallner,B.P.和Gefter ML變態(tài)反應(yīng)(Allergy),49:302-308,1994)。
本發(fā)明的公開通常，對(duì)于互不相同的兩個(gè)或更多的變態(tài)反應(yīng)原分子中的每一個(gè)，變態(tài)反應(yīng)患者都具有特異的IgE抗體。對(duì)于有效的變態(tài)反應(yīng)治療，開發(fā)有效地用于這些患者的基于肽的免疫治療試劑是重要的。但是，還沒有開發(fā)出這樣一個(gè)免疫治療試劑。甚至在上面的任何文獻(xiàn)中仍沒有公開有關(guān)這種試劑的想法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供甚至對(duì)兩個(gè)或更多不同變態(tài)反應(yīng)原敏感的過敏性患者有效的基于肽的免疫治療試劑。
雪松花粉含有兩個(gè)主要的變態(tài)反應(yīng)原，Cryj1(Yasueda,H.等過敏性臨床免疫反應(yīng)雜志(J.Allergy Clin.Immunol.)。71:77-86,1983)和Cryj2(Taniai,M.等FEBS通信(FEBS Letter)239:329-322,1988；Sakaguchi,M等變態(tài)反應(yīng)(Allergy)45:309-312,1990)。超過90％的帶有雪松花粉過敏的患者具有對(duì)Cryj1和Cryj2特異的IgE抗體；其余患者(稍少于10％)具有或?qū)ryj1或Cryj2的特異IgE抗體(Hashimoto,M.等Clin.Exp.Allergy25:848-852,1995)。預(yù)期使用僅來自Cryj1和Cryj2中某一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位效力更小，因?yàn)閬碜曰颊叩腎gE與Cryj1和Cryj2都反應(yīng)。所以，應(yīng)該選擇同時(shí)來自Cryj1和Cryj2的T細(xì)胞表位以提高用于雪松花粉過敏的基于肽的免疫治療法的效力。所以，本發(fā)明制備了在同一分子中同時(shí)含有Cryj1和Cryj2的T細(xì)胞表位的多表位肽。他們發(fā)現(xiàn)多表位肽在體外激活患花粉病的患者的T細(xì)胞，但不與患者的IgE抗體反應(yīng)。他們也發(fā)現(xiàn)在鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。根據(jù)這些新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多表位肽能有效地作為用于雪松花粉病患者的基于肽的免疫治療試劑。
雪松花粉病的許多情況中顯示了日本柏花粉的臨床癥狀。從這一點(diǎn)和基于上述發(fā)明來看，本發(fā)明人制備了在同一分子中含有日本柏花粉過敏原Chao1的T細(xì)胞表位(日本專利申請(qǐng)?zhí)?Hei8-153527)和雪松花粉過敏原Cryj1的T細(xì)胞表位的多表位肽。多表位肽激活患雪松花粉病的患者和具有日本絲柏花粉病的患者的T細(xì)胞，盡管這些T細(xì)胞不與各個(gè)T細(xì)胞表位反應(yīng)。所以，不僅對(duì)于起源于雪松和日本柏花粉過敏原，而且起源于其它過敏原的T細(xì)胞表位都可以設(shè)計(jì)多表位肽。
在一組患者(包括不同種族)中研究HLA單模式作為判據(jù)用于選擇T細(xì)胞表位以便設(shè)計(jì)對(duì)廣泛范圍的患者有效的多表位。選擇T細(xì)胞表位表明應(yīng)該選擇與其單模式經(jīng)常在人群中出現(xiàn)和在不同的Ⅱ型HLA分子中出現(xiàn)的HLA結(jié)合的那些表位，而不是與相同的HLAⅡ型分子結(jié)合的那些。這樣選定的多表位肽被確定可有效地用于廣泛范圍的患者。
本發(fā)明包括在各個(gè)權(quán)利要求中描述的發(fā)明。
下面將描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)的對(duì)雪松花粉或日本柏花粉敏感的患者或?qū)煞N花粉都敏感的患者有效的多表位肽，但本發(fā)明也適用于對(duì)其它過敏原敏感的患者。本發(fā)明的技術(shù)原理也適用于植物花粉如短豚草(Amb a1,Amb a2,Amb a5,Ambt5,Amb p5)，鴨茅(Dac g2)，和Lolium perenne(Lol p1,Lol p2,Lolp3)；三種花粉如歐洲榿木(Alng1)，疣皮樺(Bet v1,Bet v2)，高山雪松(Juns1)，和圓柏樹(Jun vl)；以及各種其它本文沒有特別說明的過敏原。
本文所用的“多表位肽”指通過線性聯(lián)合含有由不同過敏原分子(有時(shí)指抗原肽或少數(shù)情況下指肽)誘導(dǎo)的T細(xì)胞表位的肽制備的肽分子。在這一肽中，優(yōu)選將體內(nèi)切割的區(qū)域插入在含有T細(xì)胞表位的肽之間以便減少新識(shí)別的表位位點(diǎn)的出現(xiàn)。最后在切割位點(diǎn)將多表位肽斷裂或各個(gè)抗原肽。當(dāng)給藥時(shí)，它能表現(xiàn)出相當(dāng)于用這些各個(gè)抗原肽混合物給藥時(shí)的效果。只要它在體內(nèi)進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)可以采取任何結(jié)構(gòu)。切割位點(diǎn)的例子包括作為組織蛋白酶B識(shí)別序列的精氨酸二聚體和賴氨酸二聚體，組織蛋白酶B是定位于溶酶體中的酶。
參考作為實(shí)施例的雪松花粉過敏原Cryj1和Cryj2將敘述根據(jù)本發(fā)明多表位肽的設(shè)計(jì)。
利用Cryj1或Cryj2刺激從患雪松花粉病的患者收集的外周淋巴細(xì)胞以便生產(chǎn)用于單個(gè)患者的T細(xì)胞系。用約由15個(gè)氨基酸組成的重疊肽刺激所誘導(dǎo)的T細(xì)胞系以鑒定在Cryj1或Cryj2序列中含有T細(xì)胞表位的抗原肽(

圖1和2)，該肽覆蓋Cryj1(WO94/01560)或Cryj2的一級(jí)結(jié)構(gòu)的全長(Komiyama,N.等人(Biochem.Biophys.Res.Cammun)生化生理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)201:1201,1994)。
其次，把這些抗原肽結(jié)合的HLAⅡ類分子進(jìn)行分類。
在人中，存在作為Ⅱ類HLA的基因產(chǎn)物的三個(gè)不同分子，DR,DQ和DP區(qū)。這表明抗原呈遞分子DR,DQ，和DP將限制T細(xì)胞的分化。利用對(duì)每個(gè)患者建立的T細(xì)胞克隆確定究竟是通過哪個(gè)出現(xiàn)座位起源的抗原分子來呈遞Cryj1或Cryj2的抗原肽。他們同時(shí)確定是否通過DR,DQ或DP分子接受抗原肽信息的T細(xì)胞趨向于分化成Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞。利用對(duì)于單個(gè)患者確立的T細(xì)胞克隆進(jìn)行了這樣的分類(圖3和4)。
圖3和4明確表明了HLA分子的特定表位或特定組合不限制由抗原肽刺激產(chǎn)生的T細(xì)胞分化成Th1或Th2還是Th0。在選擇用于設(shè)計(jì)本發(fā)明的多表位肽的肽時(shí)，任何肽都可以作為抗原肽的候選物，因?yàn)槿魏魏蠺細(xì)胞表位的肽都可以刺激T細(xì)胞。
設(shè)計(jì)本發(fā)明的多表位肽的選肽原則如下(1)以陽性指數(shù)的順序選擇肽(WO94/01560)(應(yīng)該選擇陽性指數(shù)在100以上的肽)。
(2)選擇在經(jīng)常作為抗原呈遞分子HLAⅡ類分子上呈遞的肽。
(3)當(dāng)陽性指數(shù)沒有顯著差異時(shí)，選擇不同類型的限制分子呈遞的肽以便增強(qiáng)效果。具體地說，在選擇引起某些過敏疾病的過敏原的T細(xì)胞表位時(shí)，首先應(yīng)檢查在具有變態(tài)反應(yīng)的患者的組中的HLA單模式，并選擇HLA單模式限制的T細(xì)胞表位，該HLA單模式在患者組所屬的人群中具高基因頻率。即最好的選擇在該患者群中才能達(dá)到最好效果。但是，在其他患者組中，這樣選定的T細(xì)胞表位可能是完全無效的。
將HLA單模式DPB1*0501作為一個(gè)例子，據(jù)信在具有某些過敏疾病的日本患者中經(jīng)常觀察到該HLA單模式，選擇限制HLA單模式的T細(xì)胞表位。對(duì)于具有同樣的變態(tài)反應(yīng)的北美患者這樣選定的肽幾乎沒有效果，因?yàn)镠LA單模式的基因頻率在日本患者中有39.0％之多，而在北美的白種美國人中少至1.3％，在非洲裔美國人中少至0.8％。對(duì)于北美患者，應(yīng)該選擇限制的HLA-DPT細(xì)胞表位DPB1*0401(在北美，對(duì)于白種美國患者為30.2％，對(duì)于非洲裔美國患者為11.1％，日本患者為4.8％)。同時(shí)選擇在座位水平有區(qū)別的抗原呈遞分子象DR，DQ或DP呈遞的肽也是重要的；即使座位是相同的，選擇具有不同單模式的抗原呈遞分子呈遞的肽也是重要的。
在這種情況下，優(yōu)選的表位位點(diǎn)不含有半胱氨酸殘基。當(dāng)表位位點(diǎn)含有半胱氨酸殘基時(shí)，該殘基可以非特異地與HLAⅡ類分子結(jié)合。當(dāng)用含有半胱氨酸殘基的抗原肽免疫時(shí)，原來并非抗原的位點(diǎn)可能被識(shí)別為新的表位。當(dāng)這樣的肽被識(shí)別為表位時(shí)，通過第二和第三次重復(fù)給藥會(huì)使該肽識(shí)別含有半胱氨酸的表位，而這種給藥可能引起副作用。
下面將敘述設(shè)計(jì)多表位的具體實(shí)施方案。根據(jù)圖1和2顯示的Cryj1和Cryj2的陽性指數(shù)，Cryj1的T細(xì)胞表位，具有位置211-225的氨基酸的表位NO.43(本文下面縮寫為P211-225)(限制分子DPA1*0101到DPB1*0501)顯示最高的陽性指數(shù)，肽NO.22,P106-120(限制分子DRB 5*0101)顯示次高的陽性指數(shù)。選這兩個(gè)肽作為用于多表位肽的抗原肽。對(duì)于Cryj2,肽NO.14,P66-80(限制分子DRB5*0101)和肽NO.38,P186-190(DRB4*0101)顯示最大的陽性指數(shù)。同樣，這兩個(gè)肽可選為抗原肽。定位在Cryj2中的肽NO.38之前的肽NO.37,P181-195具有高的陽性指數(shù)280，但它的限制分子是DPA1*0101到DPB1*0201，它區(qū)別于肽NO.38的限制分子，因?yàn)橥ㄟ^在NO.38前面加上來自NO.37的10殘基，5殘基，肽NO.38,P181-165與肽NO.38,P186-200可重疊?？梢赃x擇這樣設(shè)計(jì)的肽作為HLA-DP限制肽。如上面選擇的肽不限制DQ。Cryj1的肽NO.4,P16-30的限制分子是DQA 1*0102到DQB1*0602，但表位中心有半胱氨酸殘基。所以，不能選擇肽NO.4。在Cryj2中，對(duì)應(yīng)于肽NOs.69-70的P341-360是出現(xiàn)在DQA1*0102到DQB1*0602上的肽。肽NO.70也含有半胱氨酸，而只有無半胱氨酸的肽NO.69能激活T細(xì)胞。所以，可以選擇12個(gè)殘基，P344-355(ISLKLTSGKIAS)。Cryj1肽NO.22,P106-120在位置107含有半胱氨酸。利用T細(xì)胞克隆確定T細(xì)N胞表位核心序列至少需要九個(gè)殘基P106-117(FIKRVSNVI)。所以，如果除去Pro-Cys殘基，可以使用余下的肽。
在溶酶體中將吸收于抗原呈遞細(xì)胞中的抗原降解。吸收于出現(xiàn)抗原的分子中的外源蛋白質(zhì)如何加工以及他們?nèi)绾闻cHLAⅡ類分子結(jié)合仍然未知。但是，據(jù)報(bào)道，在這一復(fù)雜的機(jī)制中組織蛋白酶B參與了抗原的消化(Katsunuma,N:Nihon Men-Eki Gakkai(日本免疫協(xié)會(huì))24:75,1995)。
關(guān)于幾個(gè)Ⅱ類HLA類型，已經(jīng)確定了抗原肽的結(jié)合HLA的氨基酸基序(motif)。HLAⅡ類分子的結(jié)合有特異性，但如果肽符合某些標(biāo)準(zhǔn)，許多抗原肽都可以與特定的HLAⅡ類分子結(jié)合(Rammensee,HG.等，免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics)41:178-228,1995)。由于這一原因，在結(jié)合抗原肽的位點(diǎn)可能會(huì)產(chǎn)生新識(shí)別的表位位點(diǎn)。為了避免這一點(diǎn)，應(yīng)該設(shè)計(jì)多表位肽以便在抗原呈遞細(xì)胞中切割成各個(gè)抗原肽。組織蛋白酶B識(shí)別的肽序列是Arg-Arg-疏水序列或Lys-Lys-疏水序列。所以，將Arg-Arg或Lys-Lys加到含有表位的肽的后半部分并且在下面的表位序列中，將疏水氨基酸序列放在Arg-Arg或Lys-Lys之后。
由于Arg-Arg是插入在抗原肽之間的，所以認(rèn)為在這一實(shí)施方案中抗原肽的順序是沒有影響的。但當(dāng)Arg與Cryj2的肽NO.14的后半部分連接時(shí)(圖2)，位置73的Tyr變成第一個(gè)錨。加入的Arg殘基變成在DRB 5*0101肽基序中在第9位上的氨基酸殘基并作為第二個(gè)錨。所以，Arg可以作為新的表位識(shí)別。因此，這一序列應(yīng)該定位于多表位肽的末端。
SEQ NO:1顯示了如此得到的多表位肽。這一多表位肽的限制分子是DRB4*0101,DRB5*0101,DPA1*0101-DPB1*0201,DPA1*0101-DPB1*0501，和DQA1*0102-DQB1*0602。在第11次國際組織相容性研討會(huì)上，計(jì)算了日本人口中這些基因的頻率(Tsuji,K.等人HLA 1991，第1卷，1992,牛津大學(xué)出版社)并發(fā)現(xiàn)對(duì)于DRB4*0101基因頻率為0.291，對(duì)于DRB5*0101為0.056(對(duì)于DRB5*0102為0.070),DPB1*0201為0.208，對(duì)于DPB1*0501為0.399，和對(duì)于DQB1*0602為0.053(對(duì)于DQB1*0601為0.204)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，計(jì)算出抗原頻率，對(duì)于DRB4*0101抗原頻率為0.50，對(duì)于DRB5*0101為0.11(對(duì)于DRB5*0102為0.14)，對(duì)DPB1*0201為0.37，對(duì)于DPB1*0501為0.64(按照Hori等人為0.791)，以及對(duì)于DQB1*0602為0.10)(對(duì)于DQB1*0601為0.37)。因?yàn)橛捎谶B鎖不平衡的出現(xiàn)，認(rèn)為DRB5*0101和DQB1*0602是相同的，可以將DRB5*0101的數(shù)據(jù)用于DQB1*0602。計(jì)算得到日本人口中攜帶DPB1*0201和DPB1*0501或任何一個(gè)的可能性是0.85。同樣，計(jì)算得到日本人群中攜帶DRB4*0101和DRB5*0101的可能性是0.56。從這些值來看，估計(jì)約90％的患者識(shí)別包含在SEQ NO:1中的多表位肽中一個(gè)以上的T細(xì)胞表位。但是，還不清楚是否具有這些HLA型的患者具有能夠識(shí)別這些限制分子呈遞的這些表位肽的T細(xì)胞貯藏物(repertory)。另外，引起T細(xì)胞增殖的表位的數(shù)目還是未知(將需要兩個(gè)或更多的表位)。所以，多表位的效率可能會(huì)被降低。在實(shí)踐中，根據(jù)來自17例患者的外周淋巴細(xì)胞的測(cè)試增殖反應(yīng)的結(jié)果，將它假定為約77％是恰當(dāng)?shù)摹?br> 為了增大有效治療的患者的范圍，也可以將多表位肽設(shè)計(jì)成比上面敘述的表位肽攜帶更多的T細(xì)胞表位。這樣的多表位肽的實(shí)施例包括通過組合Cryj1的P213-225和P108-120,Cryj2的P182-200和P79-98，Cryj1的P80-95，和Cryj1的P66-80以這一順序(SEQ NO:2)所制備的一個(gè)，和通過聯(lián)合Cryj1的P213-225和P108-120,Cryj2的P182-200和P79-98,Cryj1的P67-95，和Cryj2的P238-251及P66-80，以這一順序(SEQ NO:3)所制備的一個(gè)。這些多表位肽作為基于肽的免疫治療試劑是有效的，因?yàn)樵撾拇碳碜曰佳┧苫ǚ鄄〉?1個(gè)測(cè)試患者的所有外周淋巴細(xì)胞樣品但不與患者的IgE抗體反應(yīng)。根據(jù)這一原理，通過用實(shí)施例13敘述的方法制備的含有不同種類的過敏原如日本柏花粉過敏原和雪松花粉過敏原的T細(xì)胞表位可以提高效率。
本發(fā)明還包括用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的多表位肽的抗原肽區(qū)域的修飾。用于本文的“修飾”指至少一個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、和插入。通過已知方法可以檢測(cè)在抗原肽中氨基酸以代所導(dǎo)致的T細(xì)胞特性的變化。例如，1)用類似氨基酸替代本發(fā)明的多表位肽的某些氨基酸，如，通過用Glu替代Asp,Gln替代Asn,Arg替代Lys,Tyr替代Phe,Leu替代Ile,Ala替代Gly,Ser替代Thr，以便產(chǎn)生類似肽，它可以與T細(xì)胞中的原始肽就增殖能力或淋巴因子生產(chǎn)能力進(jìn)行比較?？蛇x擇地，2)用非類似氨基酸替代多表位肽的某些氨基酸，例如，通過用疏水氨基酸Ala替代極性氨基酸或親水氨基酸，用親水氨基酸Ser替代疏水氨基酸，并將修飾后的肽的特性與原始肽進(jìn)行比較。本發(fā)明同時(shí)包括這樣制備的多表位肽類似物，他們是陽性指數(shù)和T細(xì)胞活化能力意義上的本發(fā)明的多表位肽的免疫學(xué)等價(jià)物。
大多數(shù)與起源于Cryj1和Cryj2的抗原肽反應(yīng)的T細(xì)胞同時(shí)具有Th2和Th0的特性(圖3和4)。BCG疫苗可以加強(qiáng)細(xì)胞的免疫活性以便防止的感染。為了加強(qiáng)細(xì)胞免疫，應(yīng)該誘導(dǎo)Th1型的T細(xì)胞。據(jù)報(bào)道對(duì)用BCG接種的人T細(xì)胞克隆的特性的研究表明Th1T型細(xì)胞的水平有增加(MatsushitaSho，第45次日本變態(tài)反應(yīng)協(xié)會(huì)，836,1995)。據(jù)Matsushita認(rèn)為存在受HLA-DR 14(DRB1*1405)限制并識(shí)別BCGa蛋白質(zhì)的84-100氨基酸序列(EEYLILSARDVLAVVSK)的Th1克隆。如果選擇60％的日本人口具有的限制HLA單模式DPA1-DPB1*1510的T細(xì)胞表位(例如，圖1顯示的Cryj1的肽NO.43(P211-225)/KSMKVTVAFNQFGPN)，該肽與DRB1*1405限制的tubercle bacillus BCGa蛋白質(zhì)的第84-100 T細(xì)胞表位結(jié)合。如此制備的多表位肽EEYLILSARDVLAVVSKRRMK VTVAFNQFGPN對(duì)攜帶單模式DRB1*1405的患雪松花粉病的患者很有可能是十分有效的。利用這樣一個(gè)多表位肽將通過一個(gè)起源于BCGa抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1淋巴因子，特別是IL-12。已知在人和鼠的幾種情況中，IL-12具有與IL-4的活性相反的活性并作用于T細(xì)胞并誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化成Th1(Manetti,R.，等人實(shí)驗(yàn)方法雜志(J.Exp.Med.),177,1199-1204,1993；Wu,C.，等人免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),151,1938-1949,1993；Hsieh,C.，等人科學(xué)，260,547-549,1993)。特別是，Manetti等人得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，一種螨過敏原的Der P1抗原特異性的T細(xì)胞克隆基本上誘導(dǎo)Th2而存在IL-12時(shí)誘導(dǎo)Th1或Th0。所以，利用通過組合具有Th1誘導(dǎo)活性的T細(xì)胞表位與過敏原反應(yīng)的T細(xì)胞表位制備的多表位肽，會(huì)將本來誘導(dǎo)成Th2的T細(xì)胞誘導(dǎo)成Th1或Th0。
將含有至少一種Cryj1和/或Cryj2的T細(xì)胞表位的本發(fā)明的肽對(duì)鼠皮下給藥時(shí)，然后將鼠與雪松花粉過敏原接觸，T細(xì)胞發(fā)生無變應(yīng)性(圖13和14)與對(duì)照組比較，IL-2生產(chǎn)明顯減少。據(jù)報(bào)道致敏作用治療減少了人體中的IL-2(變態(tài)反應(yīng)臨床免疫學(xué)雜志(J.Allergy Clin.Immunol.)76:188,1985)。另外，本發(fā)明的多表位肽可把各個(gè)肽組成的T細(xì)胞克隆活化成T細(xì)胞表位肽(圖10)，但不與患者的IgE抗體反應(yīng)(圖8)。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的多表位肽可誘導(dǎo)對(duì)過敏原的免疫耐受并且作為基于肽的免疫治療試劑對(duì)變態(tài)反應(yīng)疾病是有效的。本發(fā)明的多表位肽可以與可藥用的載體或稀釋劑一起給藥。根據(jù)患者的對(duì)雪松花粉過敏原的敏感性、年齡、性別和體重和其它因子如肽在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，多表位肽的有效劑量可以變化。
利用包括注射(皮下或靜脈內(nèi))、鼻內(nèi)注射、口服給藥、吸入、經(jīng)皮給藥等給藥途徑以簡(jiǎn)單的方式將多表位肽給藥。
用于本說明書的氨基酸的單字母標(biāo)志和序列表遵照ILUPAC，生化術(shù)語委員會(huì)規(guī)定的定義(參照生物化學(xué)詞典(Biochemical Dictionary)，第二版，1468，表1.1)。
附圖簡(jiǎn)要說明圖1表示起源于患雪松花粉病的患者的細(xì)胞系對(duì)Cryj1重疊肽的平均刺激指數(shù)、出現(xiàn)頻率、和陽性指數(shù)(出現(xiàn)頻率乘以平均刺激指數(shù))。
圖2表示起源于患雪松花粉病的患者的細(xì)胞系對(duì)Cryj2重疊肽的平均刺激指數(shù)、出現(xiàn)頻率、和陽性指數(shù)(出現(xiàn)頻率乘以平均刺激指數(shù))。
圖3顯示識(shí)別Cryj1抗原肽和HLAⅡ類分子之間的復(fù)合物以及Th類型的HLAⅡ類分子的Th類型的T細(xì)胞克隆。
圖4顯示識(shí)別Cryj2抗原肽和HLAⅡ類分子之間的復(fù)合物以及Th類型的HLAⅡ類分子的Th類型的T細(xì)胞克隆。
圖5顯示鑒定能夠與抗原肽在基因座水平結(jié)合的HLAⅡ類分子(DR,DQ和DP)的結(jié)果。
圖6顯示鑒定能夠在各基因座的等位基因水平結(jié)合抗原肽的HLAⅡ類分子的結(jié)果。
圖7顯示用于多表位肽的氨基酸序列。在這一圖中，肽a和b分別對(duì)應(yīng)于Cryj1的肽NOS.43和22；肽c對(duì)應(yīng)于Cryj2的NO.14；肽d和e分別對(duì)應(yīng)于肽NOS.37-38(p181-200)和NOs.69-71(P346-365)。
圖8顯示命名為C.A.#1,C.A.#2,C.A.#3,C.A.#4,C.A.#5和CA.#6的多表位肽與人IgE的反應(yīng)性。
圖9顯示T細(xì)胞克隆識(shí)別包含于多表位肽CA.#4中的T細(xì)胞表位的結(jié)果。
圖10顯示對(duì)用各種濃度的多表位肽(SEQ NO:1)刺激所誘導(dǎo)的患雪松花粉過敏病的患者和健康受試者的外周淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答能力。
圖11顯示對(duì)用多表位肽SEQ NO:1刺激的誘導(dǎo)的兩個(gè)健康受試者和17個(gè)患雪松花粉過敏病的患者的外周淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答能力。
圖12顯示將雪松花粉過敏原Cryj1對(duì)CBF1鼠給藥誘導(dǎo)的免疫耐受性。
圖13顯示將Cryj2的肽NO.14(P66-80)對(duì)CBF1鼠給藥誘導(dǎo)的免疫耐受性。
圖14顯示將Cryj2的肽NO.48(P236-250)對(duì)CBF1鼠給藥誘導(dǎo)的免疫耐受性。
圖15顯示Cryj1的肽NO.22(P106-120)的核心氨基酸序列。
圖16顯示患雪松花粉過敏病的患者和日本扁柏(hinoki)花粉過敏病的患者的T細(xì)胞系與通過將雪松花粉特異性的T細(xì)胞表位肽與日本柏花粉特異性的T細(xì)胞表位肽結(jié)合制備的多表位肽的反應(yīng)性。
圖17顯示T細(xì)胞克隆PJF9對(duì)Cryj1#22核心肽的氨基酸替代類似肽的增殖應(yīng)答和隨后產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量。
圖18顯示T細(xì)胞克隆PB10-18對(duì)如上所述的類似肽的增殖應(yīng)答和隨后產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式實(shí)施例1利用T細(xì)胞系鑒定Cryj1和Cryj2的T細(xì)胞表位用雪松花粉過敏原Cryj1和Cryj2刺激來自患雪松花粉過敏病的18個(gè)患者的淋巴細(xì)胞以便建立能夠特異地識(shí)別相應(yīng)過敏原的各個(gè)患者的T細(xì)胞系。
在用0.2毫升的15％的血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基在96孔培養(yǎng)平板上把用絲裂霉素C處理的自體B細(xì)胞系的5×104細(xì)胞、2微摩爾重疊的肽、和2×104個(gè)T細(xì)胞系的細(xì)胞的混合物溫育兩天。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶后，繼續(xù)溫育18小時(shí)。在利用細(xì)胞收集器在玻璃過濾器上收集細(xì)胞后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中吸收的[3H]胸腺嘧啶的水平。如果刺激指數(shù)在2以上，我們認(rèn)為可將加入的肽識(shí)別為抗原肽。刺激指數(shù)指用沒有肽加入時(shí)細(xì)胞中吸收的[3H]胸腺嘧啶的水平去除加入肽時(shí)細(xì)胞中吸收的[3H]胸腺嘧啶的水平得到的值。
對(duì)于Cryj1，每個(gè)患者識(shí)別的Cryj1分子上的T細(xì)胞表位的數(shù)目平均為9.8，范圍在4到15之間。對(duì)于Cryj2，T細(xì)胞表位的數(shù)目平均為8.7，范圍為2到13。Cryj1含有353個(gè)氨基酸，并且Cryj2含有379個(gè)氨基酸。所以，估計(jì)每100個(gè)氨基酸殘基出現(xiàn)2.3到2.8個(gè)T細(xì)胞表位。
據(jù)信每個(gè)患者中的HLAⅡ的類型是有變化的。所以推測(cè)根據(jù)HLAⅡ類型，所識(shí)別的T細(xì)胞表位將發(fā)生變化。由于這一原因，對(duì)單個(gè)患者所識(shí)別的抗原肽圖譜定位。結(jié)果表明根據(jù)患者不同Cryj1和Cryj2分子上的表位有區(qū)別。在過敏原分子上，根據(jù)個(gè)體的不同，存在作為T細(xì)胞表位的兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)是容易識(shí)別的區(qū)域和幾乎不能識(shí)別的區(qū)域。另外，由于根據(jù)T細(xì)胞表位的不同，T細(xì)胞的增殖速度有變化，單獨(dú)的表位圖譜難以確定應(yīng)該選擇用什么樣的抗原肽來設(shè)計(jì)多表位肽。所以，對(duì)顯示刺激指數(shù)為2以上的抗原肽進(jìn)一步檢測(cè)了十八個(gè)患者。計(jì)算出抗原肽的平均刺激指數(shù)并乘以病人攜帶抗原肽的頻率(出現(xiàn)頻率)以便計(jì)算顯示各個(gè)表位優(yōu)勢(shì)順序的“陽性指數(shù)”(參考WO94/01560)。
圖1和2顯示了結(jié)果。在Cryj1中，肽NO.42(P211-225)顯示最高的陽性指數(shù)679，接著是次高的肽NO.22，陽性指數(shù)為578和肽NO.4，陽性指數(shù)為373。在Cryj2中，肽NO.14顯示最高的陽性指數(shù)(709)。然后接著肽NO.38陽性指數(shù)為680，肽NO.48陽性指數(shù)為370?？梢赃x擇一個(gè)具有高陽性指數(shù)的抗原肽并用于基于肽的免疫治療法。但是，即使是對(duì)于最高的出現(xiàn)頻率，理論上的期望效果只有患者的72％，而真正的效果將更低。為了增大效率，必須使用許多聯(lián)合的T細(xì)胞表位。在這種情況下，選擇高陽性指數(shù)的T細(xì)胞表位作為候選物。但是，如果呈遞作為抗原的這些表位的HLAⅡ類分子是相同的，那么使用具有單獨(dú)高陽性指數(shù)的表位不能增大效率。所以必須鑒定呈遞T細(xì)胞表位肽的HLAⅡ類分子的類型。
實(shí)施例2鑒定T細(xì)胞克隆識(shí)別的T細(xì)胞表位肽從18個(gè)患雪松花粉過敏病的患者中選擇兩個(gè)患者，患者B(PB)和患者J(PJ)，他們識(shí)別Cryj1中顯示高陽性指數(shù)的肽NOs.43和22和三個(gè)患者，PB，患者C(PC)，和患者R(PR)，他們識(shí)別Cryj2中顯示高陽性指數(shù)的肽NOs.14,38,48和69。用Cryj1或Cryj2刺激來自這些患雪松花粉過敏病的外周淋巴細(xì)胞以便建立能識(shí)別Cryj1或Cryj2的T細(xì)胞克隆。下面展示了四個(gè)患者的HLAⅠ類和HLAⅡ類分子的類型。PB:A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1*1501/0901-DRB4*0101-DRB5*0101,DQA1*0102/0301-DQB1*0602/0303-DPA1*0101/0101-DPB1*0505/0201；PJ:A24/--B61/51-Cw3/--DRB1*1501/0802-DRB5*0101,DQA1*0102/0401-DQB1*0602/0402-DPA1*-/--DPB1*0505/0402；PC:A-2/2-B54/51-Cw1/-DRB1*0405/1501-DRB4*0101-DRB5*0101-DQA1*0301/0102-DQB1*0401/0602-DPA1*0202/0202-DPB1*0201/0501；PR:A -11/--B60/35-Cw7/w3-DRB1*0901/1501-DRB4*0101-DRB5*0101-DQA1*0301/0102-DQB1*0303/0602-DPA1*01/0202-DPB1*0201/0201。
從起源于PB的外周淋巴細(xì)胞和14個(gè)來自PJ的同樣的T細(xì)胞克隆建立特異地識(shí)別Cryj1的總共35個(gè)T細(xì)胞克隆。同樣，從分別起源于PB,PC和PR的外周淋巴細(xì)胞建立特異地識(shí)別Cryj2的分別總共31個(gè)T細(xì)胞克隆，10個(gè)T細(xì)胞克隆，和17個(gè)T細(xì)胞克隆。由于這些T細(xì)胞克隆都是CD3+,CD4+,CD8-,TCRαβ+和TCRγδ-，所以發(fā)現(xiàn)限制分子都是HLAⅡ類分子。將前面用絲裂霉素C處理的自5×104個(gè)自體B細(xì)胞系的細(xì)胞，2微摩爾重疊肽，和2×104個(gè)T細(xì)胞克隆的細(xì)胞的混合物在用0.2毫升15％血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基和96孔微型培養(yǎng)平板上溫育2天。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶之后，繼續(xù)溫育18小時(shí)，在利用細(xì)胞收集器，在玻璃過濾器上收集細(xì)胞之后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定吸收于細(xì)胞中的[3H]胸腺嘧啶的水平。通過這一過程，鑒定了各個(gè)T細(xì)胞克隆識(shí)別的T細(xì)胞表位。
在識(shí)別Cryj1的T細(xì)胞克隆中，69％(34/49)顯示了用肽刺激誘導(dǎo)的增殖應(yīng)答，而且，作為結(jié)果，鑒定了該表位。同樣，在識(shí)別Cryj2的T細(xì)胞克隆中的69％(40/58)可以鑒定抗原肽。能夠特異地識(shí)別Cryj1的T細(xì)胞克隆能識(shí)別肽Nos.4,13,19,22,30,31,39,43,51和66，能特異地識(shí)別Cryj2的T細(xì)胞克隆能識(shí)別肽Nos.4,8,14,17,31,38,48,65,66,68,69和70。圖3和4概括了這些結(jié)果。
實(shí)施例3在基因座水平鑒定HLAⅡ類限制分子通過在實(shí)施例2中建立的T細(xì)胞克隆的增殖應(yīng)答系統(tǒng)中加入能與HLAⅡ類分子的DR,DQ或DP特異地反應(yīng)的單克隆抗體從而抑制T細(xì)胞的增殖應(yīng)答，以便在基因座水平鑒定HLAⅡ類限制分子。
在96孔微型培養(yǎng)平板上用0.2毫升15％的血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基中將前面用絲裂霉素C處理的自體B細(xì)胞系的2×104個(gè)細(xì)胞；2微摩爾重疊肽；2微克/毫升抗-DR，-DQ或-DP單克隆抗體(Becton Dickinson公司制造)；和2×104個(gè)T細(xì)胞克隆的細(xì)胞的混合物溫育2天。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶后，繼續(xù)溫育18小時(shí)。在利用細(xì)胞收集器，在玻璃過濾器上收集細(xì)胞之后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中吸收的[3H]胸腺嘧啶的水平。圖5的顯示的結(jié)果表明Cryj1 p106-120,Cryj2 p66-80和Cryj2 p186-200肽的分子是DR；Cryj2 p341-355肽的分子是DQ；和Cryj1 p211-225和Cryj2 p181-195的分子是DP。以同樣的方式分析其他T細(xì)胞的限制分子(參考圖3和4)。
實(shí)施例4鑒定HLAⅡ類限制分子利用T細(xì)胞克隆可以鑒定HLAⅡ類限制分子，該T細(xì)胞克隆的限制分子在HLAⅡ類基因座水平已得到鑒定，并且，作為抗原呈遞細(xì)胞，利用各類DR和B細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的鼠L-細(xì)胞具有同樣的DQ或DP單模式。
在96孔微型培養(yǎng)平板上，用0.2毫升15％的血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基中將前面用絲裂霉素C處理的5×104個(gè)鼠L細(xì)胞或符合單模式的B-細(xì)胞系；2微摩爾重疊肽；3微克/毫升抗-DR,-DQ或-DP單克隆抗體(Becton-Dickinson公司制)；和2×104個(gè)T細(xì)胞克隆的細(xì)胞的混合物溫育2天。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶后，繼續(xù)溫育18小時(shí)。在利用細(xì)胞收集器，在玻璃過濾器上收集細(xì)胞后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中吸收的[3H]胸腺嘧啶的水平。
通過觀察T細(xì)胞克隆的增殖應(yīng)答可以鑒定限制分子。呈遞Cryj1 P106-120肽的限制分子是DRB5*0101，呈遞Cryj1 P211-225肽的限制分子是DRB5*0101,Cryj1 P211-225肽的限制分子是DPA1*0101-DPB1*0501，呈遞Cryj2 P66-80肽的限制的分子是DRB5*0101，呈遞Cryj2 P181-195的限制分子是DPA1*0101-PDB1*0201，呈遞Cryj2 P186-200肽限制分子是DRB4*0101，和呈遞Cryj2 P341-355肽的限制分子是DQA1*0102-DQB1*0602(圖6)。圖3和4顯示了其他表位位點(diǎn)得到的結(jié)果。
實(shí)施例5鑒定T細(xì)胞克隆的Th類型據(jù)信Th2細(xì)胞參與了變態(tài)反應(yīng)的形成。當(dāng)前的研究水平還沒有完全闡明在特定表位肽或在HLAⅡ類基因座水平上抗原刺激后，T細(xì)胞分化成Th1或Th2細(xì)胞是否受到限制。當(dāng)在用肽刺激后優(yōu)先誘導(dǎo)Th2細(xì)胞時(shí)，用該肽給藥很有可能會(huì)使雪松花粉病加劇。用T細(xì)胞識(shí)別的表位肽刺激實(shí)施例2中制備的T細(xì)胞克隆。通過測(cè)量產(chǎn)生的IL-2,IL-4和IFN-γ的量確定該Th類型。
在24孔微型培養(yǎng)平板上，在用1毫升10％人血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基中將前面用絲裂霉素C處理的1×105個(gè)自體B細(xì)胞系的細(xì)胞，和5×105個(gè)T細(xì)胞克隆的細(xì)胞溫育24小時(shí)。通過離心沉淀以便得到培養(yǎng)上清液。利用各個(gè)ELISA商業(yè)可得試劑盒(IL-2試劑盒由R&D公司制造；IL-4試劑盒，由Medgenics公司制造；IFN-γ試劑盒由Otsuka測(cè)試研究實(shí)驗(yàn)室制造)確定上清液中的IL-2,IL-4和IFN-γ。
圖3和4顯示了各個(gè)T細(xì)胞克隆生產(chǎn)的IL-2,IL-4和IFN-γ的量。識(shí)別Cryj1的T細(xì)胞克隆是12個(gè)Th2，一個(gè)Th1，和16個(gè)Th0細(xì)胞，表明存在有比Th1克隆更多的Th2克隆。相反，識(shí)別Cryj2的T細(xì)胞克隆是10個(gè)Th2,8個(gè)Th1，和8個(gè)Th0細(xì)胞，表明Th2克隆的數(shù)目大致與Th1克隆數(shù)目相等。各個(gè)T細(xì)胞克隆、限制分子和Th類型的識(shí)別的T細(xì)胞表位的比較表明Th2、Th1或Th0類型根據(jù)各個(gè)T細(xì)胞克隆而變化。在幾個(gè)識(shí)別同樣表位和同樣抗原呈遞分子的T細(xì)胞克隆中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了Th2細(xì)胞和Th1細(xì)胞。這些結(jié)果表明在用Cryj1和Cryj2刺激后，T細(xì)胞分化成Th2,Th1或Th0并非由特定的T細(xì)胞表位及特定的限制分子的組合所決定的。用另一句話說，所有攜帶T細(xì)胞表位位點(diǎn)的肽都可以是本發(fā)明的多表位肽的候選物。
實(shí)施例6制備多表位肽對(duì)Cryj1和Cryj2的IgE抗體表位位點(diǎn)的鑒定揭示了Cryj1缺乏能夠識(shí)別初級(jí)結(jié)構(gòu)的IgE表位并且至少有4個(gè)IgE抗體表位位點(diǎn)出現(xiàn)在Cryj2上。但是，這些IgE抗體表位位點(diǎn)與T細(xì)胞的表位位點(diǎn)是有區(qū)別的。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，從Cryj1和Cryj2的T細(xì)胞表位中選定了圖7所示的肽。
圖7顯示的肽a和b分別對(duì)應(yīng)于圖1顯示的Cryj1的肽43和42，肽c對(duì)應(yīng)于圖2顯示的Cryj2的No.14，和肽d和e分別含有圖2顯示的Cryj2的部分氨基酸37-38和69-71。
以串聯(lián)的方式將這六個(gè)肽相互聯(lián)結(jié)以便制備本發(fā)明的多表位肽。在這種情況下，先a后b的順序?qū)蓚€(gè)肽a和b聯(lián)結(jié)起來；將余下的三個(gè)肽(肽c.d和e)任意聯(lián)結(jié)。在肽中插入序列Arg-Arg。所以，產(chǎn)生了下面6個(gè)多表位肽C.A.#1.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-c-Arg-Arg-d-Arg-Arg-eC.A.#2.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-c-Arg-Arg-e-Arg-Arg-dC.A.#3.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-d-Arg-Arg-c-Arg-Arg-eC.A.#4.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-d-Arg-Arg-e-Arg-Arg-cC.A.#5.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-e-Arg-Arg-c-Arg-Arg-dC.A.#6.a-Arg-Arg-b-Arg-Arg-e-Arg-Arg-d-Arg-Arg-c實(shí)施例7
多表位肽與人IgE抗體的反應(yīng)性在0.2M乙酸緩沖液(pH4.5)中溶解實(shí)施例6中得到的6個(gè)多表位肽(CA.#1到C.A.#6)。在黑板(Dainihon藥學(xué)有限公司制造)中，以0.1毫升/孔的量分配該溶液，然后4℃過夜。在除去抗原溶液后，用洗滌溶液在4℃洗滌孔3次并在分開的孔中各自加入來自29個(gè)患雪松花粉病的患者和健康個(gè)體的血清(4倍稀釋)。然后在37℃使該系統(tǒng)反應(yīng)4小時(shí)。在除去血清后先用洗滌溶液洗孔3次，然后與抗-人IgE抗體(Pharmacia公司制造)在室溫過夜反應(yīng)。在用洗滌溶液洗3次后，加入含有0.1毫摩爾4-甲基形基-β-D半乳糖基-吡喃糖苷/0.01摩爾磷酸緩沖液(pH7.0),0.1摩爾NaCl,1摩爾MgCl2，0.1％NaN3和0.1％BSA的底物溶液，并在37℃溫育該溶液2小時(shí)。在孔中加入0.1M甘氨酸/NaOH(pH10.3)的溶液以終止反應(yīng)。利用熒光光度計(jì)(Labsystems)測(cè)量熒光強(qiáng)度。作為每個(gè)多表位肽的陽性對(duì)照，用生物素標(biāo)記的兔抗-d表位IgG和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pierce公司制造)進(jìn)行反應(yīng)。
結(jié)果所有來自29個(gè)人體受試者的血清對(duì)所有6個(gè)多表位肽(C.A.#1到#6)(空白3或4)的熒光強(qiáng)度為3到5。相反，當(dāng)利用從雪松花粉提取和純化的抗原Cryj1，在6個(gè)受試者中記錄的熒光強(qiáng)度為1,000或更多，14個(gè)受試者中為100或更多，4個(gè)受試者中為10或更多，在5個(gè)受試者中9或更少。相反，對(duì)應(yīng)于6個(gè)共有過敏原(空白112；230到Cryj1過敏原)，兔抗-d表位肽IgG3,000或更多的熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果表明多表位肽中各個(gè)表位位點(diǎn)連接的順序不影響與人IgE抗體的反應(yīng)性(圖8)。
實(shí)施例8識(shí)別多表位肽中的T細(xì)胞表位檢測(cè)實(shí)施例6中得到的構(gòu)成多位肽C.A.#4的抗原肽以便確定抗原肽是否真正地起T細(xì)胞表位的作用。
在96孔微型培養(yǎng)平板上將前面用絲裂霉素C處理的5×104個(gè)自體B細(xì)胞系的細(xì)胞和T細(xì)胞克隆的2×104個(gè)細(xì)胞在0.2毫升15％的血清補(bǔ)充的RPMI 1640培養(yǎng)基中與作為抗原的50微克/毫升Cryj1和2微克/毫升Cryj2一起溫育2天，多表位肽C.A.#4或10微克//毫升C.A.#4多表位肽的各個(gè)抗原肽由基因表達(dá)產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸苷后，繼續(xù)溫育16小時(shí)。在利用細(xì)胞收集器在玻璃過濾器上收集細(xì)胞后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中[3H]胸苷的吸收水平。結(jié)果如圖9所示。
識(shí)別Cryj1 P106-120的T細(xì)胞克隆PB8-34，識(shí)別Cryj1 P211-225的T細(xì)胞克隆PB 8-34，識(shí)別Cryj2 P66-80的T細(xì)胞克隆PB4-22，識(shí)別Cryj2 P181-195的T細(xì)胞克隆PB14-5，和識(shí)別Cryj2 P186-200的T細(xì)胞克隆PB14-3都與抗原肽反應(yīng)很好。當(dāng)使用表位肽時(shí)，T細(xì)胞克隆增殖應(yīng)答水平在各個(gè)肽之間是可比的。識(shí)別Cryj2 P341-355和T細(xì)胞克隆PB14-19對(duì)多表位肽刺激的增殖應(yīng)答有些微弱。
這些結(jié)果表明包含在多表位肽中的抗原肽能很好地作為表位起作用并保留T細(xì)胞活化能力。
實(shí)施例9多表位肽誘導(dǎo)的來自患雪松花粉過敏病的患者的外周淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答由于多表位肽含有T細(xì)胞表位位點(diǎn)，有必要在應(yīng)用基于肽的免疫治療法時(shí)誘導(dǎo)對(duì)外周淋巴細(xì)胞的增殖應(yīng)答。所以，本發(fā)明人檢測(cè)通過用多表位肽刺激外周淋巴細(xì)胞是否能觀察到增殖應(yīng)答。
在用10％人血清補(bǔ)充的RPMI-1640培養(yǎng)基中懸浮來源于患雪松花粉病的患者或來源于健康受試者的外周淋巴細(xì)胞。以2.5×105個(gè)細(xì)胞/200微升的濃度在帶有圓底的96孔培養(yǎng)平板的每個(gè)孔中分配懸浮液。在每個(gè)孔中加入SEQ NO:1代表的多表位肽(Cryj1或Cryj2)到終濃度為0.001到20微克/毫升，Cryj1為50微克/毫升或Cryj2為2微克/毫升。將平板溫育6天。在培養(yǎng)基中加入0.5微居里[3H]胸苷之后，繼續(xù)溫育16小時(shí)。在利用細(xì)胞收集器，在玻璃過濾器上收集細(xì)胞之后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞中[3H]胸苷的吸收水平。
6個(gè)患者中的5個(gè)其外周淋巴細(xì)胞顯示對(duì)多表位肽的增殖應(yīng)答。來自一個(gè)患者和兩個(gè)健康受試者的外周淋巴細(xì)胞沒有顯示增殖應(yīng)答(圖10)。
用0.1微克/毫升的多表位肽刺激和提高劑量依賴性，外周淋巴細(xì)胞開始發(fā)生增殖應(yīng)答。根據(jù)結(jié)果，誘導(dǎo)體外T細(xì)胞增殖應(yīng)答需要的多表位肽的濃度至少為10微克/毫升。
用10微克/毫升多表位肽刺激來自17個(gè)患雪松花粉病的患者和2個(gè)健康受試者的外周淋巴細(xì)胞以便提高T細(xì)胞應(yīng)答。對(duì)于來自健康受試者的外周淋巴細(xì)胞沒有觀察到對(duì)T細(xì)胞增殖的應(yīng)答。在17個(gè)患者中，觀察到最大為9，652cpm的[3H]胸苷吸收。當(dāng)將沒有抗原刺激的外周淋巴細(xì)胞的[3H]胸苷吸收定為1，用刺激指數(shù)(SI)表示存在抗原時(shí)外周淋巴細(xì)胞對(duì)[3H]胸苷的吸收。結(jié)果如圖11所示。在鑒定T細(xì)胞表位的基礎(chǔ)上，SI＞2被認(rèn)為是陽性的。同樣將SI＞2判斷為對(duì)肽有增殖應(yīng)答。在這一原則下，發(fā)現(xiàn)17個(gè)患者中有13個(gè)(76.5％)有增殖應(yīng)答，從這些結(jié)果來看，當(dāng)在76.5％的雪松花粉患者給藥時(shí)，基于肽的免疫治療是有效的。
當(dāng)利用本發(fā)明的多表位肽對(duì)患雪松花粉病的患者進(jìn)行基于肽的免疫治療時(shí)，可以先測(cè)試來自患者的外周淋巴細(xì)胞對(duì)多表位肽的增殖應(yīng)答能力以選擇有增殖應(yīng)答的患者。這樣的測(cè)試能確定是否可將利用多表位肽的基于肽的治療用于單個(gè)患者。根據(jù)增殖應(yīng)答的水平，也可以在一定程度上預(yù)測(cè)治療效果。
實(shí)施例10通過對(duì)鼠給藥雪松花粉過敏原誘導(dǎo)免疫耐受性通過用雪松花粉過敏原給藥的致敏作用治療的詳細(xì)機(jī)理目前仍然未知。為了闡明這一機(jī)制，利用鼠進(jìn)行試驗(yàn)。在5天的間隔中以300微克/鼠的劑量將雪松花粉過敏原Cryj1皮下對(duì)五個(gè)CBF1雌性鼠給藥2次，對(duì)照使用同樣劑量的PBS皮下對(duì)其它5只雌鼠給藥。5天后，通過皮下注射100微克Cryj1與Alum佐劑使動(dòng)物致敏。10天后，分離淋巴細(xì)胞并合并作為來自對(duì)照的淋巴細(xì)胞和作為來自Cryj1給藥鼠的淋巴細(xì)胞。將Cryj1以0,50和150微克/毫升的劑量加到合并的淋巴細(xì)胞中。進(jìn)行溫育3天，收集培養(yǎng)上清液。用Endogen公司制造的設(shè)備測(cè)量包含在上清液中的IL-2結(jié)果。如圖12所示。在對(duì)照(PBS-給藥)鼠組中，隨著Cryj1的濃度從0增加到50和150微克/毫升，IL-2產(chǎn)量提高。相反，在Cryj1給藥的鼠小組中，與對(duì)照組相比，IL-2生產(chǎn)明顯地減弱，表明通過雪松花粉過敏原的給藥獲得免疫耐受力。結(jié)果證實(shí)目前推行的利用雪松花粉過敏原的致敏作用治療是有效的。
實(shí)施例11鑒定CBF1鼠中的T細(xì)胞表位用10微克的重組Cryj2(rCryj2)在兩星期的間隔與佐劑(Imject Alum,PIerce公司制造)對(duì)8周齡的雄鼠加強(qiáng)給藥三次。在最后加強(qiáng)給藥一周后，從三個(gè)鼠中收集脾細(xì)胞并混合在一起。在96孔平板(Falcon公司制造)的每個(gè)孔中將脾細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞)與0.2毫升RPMI培養(yǎng)基(用10％PCS,2毫摩爾/升L-谷氨酸，50單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素)中的含有15個(gè)殘基的74種Cryj2重疊肽(0.115微摩爾/升)一起培養(yǎng)。對(duì)于對(duì)照，也觀察到了與PBS、50微克/毫升的Cryj1，和0.3微克/毫升的rCryj2的反應(yīng)性。在三個(gè)孔中分配每種試劑并在5％的CO2和37℃溫育3天。在最后6小時(shí)，用0.5微居里/孔的[3H]胸苷進(jìn)行脈沖標(biāo)記。利用細(xì)胞收集器(Inoteck,Bertold日本有限公司)，在玻璃過濾器上收集細(xì)胞。干燥后，利用液體閃爍計(jì)數(shù)器(TR1-CARB 4530,Packard日本KK)確定細(xì)胞中[3H]胸苷的吸收水平。
用rCryj2免疫的CBF 1鼠顯示出與其抗原rCryj2的強(qiáng)烈的反應(yīng)性，但與另一個(gè)主要的雪松花粉過敏原Cryj1不反應(yīng)。這證明該反應(yīng)是抗原特異性的。如圖2所示，在測(cè)試的74個(gè)重疊肽中，用rCryj2免疫的CBF 1鼠顯示了顯著的對(duì)肽Nos.14和48的應(yīng)答。這些結(jié)果表明參與抗原呈遞的肽Nos.14和48是CBF1鼠中主要的T細(xì)胞表位。已知肽NO.14和48也是人體中的主要T細(xì)胞表位肽。所以，CFB1鼠作為動(dòng)物模型可用于判斷對(duì)雪松花粉的基于肽的免疫治療法的肽的效力。
實(shí)施例12抗原肽NO.14的體內(nèi)免疫應(yīng)答將溶解于生理鹽水的肽NO.14(3毫克)溶液皮下注射到各8周齡的雄性CBF1鼠(8個(gè)動(dòng)物/組)中兩次，頭一次注射后5天間隔再注射一次。作為對(duì)照，以同樣方式給對(duì)照組同等體積(100微升)生理鹽水。在第二次將肽給藥后5天，通過皮下注射50微克/鼠的rCryj2與Imject Alum使所有鼠致敏。在致敏后一星期，從每個(gè)鼠中收集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞)與3微克/毫升rCryj2一起在0.2毫升RPMI培養(yǎng)基(用10％FCS.2毫摩爾L-谷氨酸，50單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素補(bǔ)充)中，在96孔平板(Falcon公司制造)的每個(gè)孔中培養(yǎng)。在同樣的沒有rCryj2的條件作比較進(jìn)行溫育。利用[3H]胸苷，以同樣于實(shí)施例1中的方法確定T細(xì)胞增殖。利用通過體外刺激三個(gè)給藥肽的組10.3,1.3和10微克/毫升)和含有0.3微克/毫升的對(duì)照組得到的培養(yǎng)上清液確實(shí)細(xì)胞因子。
前面用NO.14在對(duì)CBF1鼠皮下給藥時(shí)，與生理鹽水組相比，T細(xì)胞對(duì)rCryj2的抗原刺激的免疫應(yīng)答受到明顯的抑制(P＜0.01)(圖.13)。肽給藥組與對(duì)照組的比較表明IL-2生產(chǎn)有明顯的下降。這些結(jié)果揭示，在鼠模型系統(tǒng)中，在基于肽的免疫治療法中肽NO.14表現(xiàn)出對(duì)雪松花粉病的預(yù)防效果。
實(shí)施例13抗原肽NO.48的體內(nèi)免疫應(yīng)答在5天的間隔分別將溶解于生理鹽水中的NO.48(3毫克)的溶液對(duì)6周齡雄性CBF1鼠皮下注射各兩次。作為對(duì)照，以同樣方式給于等體積(200微升)的生理鹽水。在肽給藥組和對(duì)照組分別有8只動(dòng)物。在第二次給藥肽后5天，通過皮下注射50微克/鼠的rCryj2與佐劑(Imject Alum)的混合液使所有鼠致敏。在致敏作用后一周，從每個(gè)鼠中收集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞)與3微克/毫升的rCryj2一起在0.2毫升RPMI培養(yǎng)基(用10％FCS，2毫摩爾/升L一谷氨酸，50單位/毫升青霉素，和50微克/毫升鏈霉素補(bǔ)充)中，在96孔平板(Falcon公司制造)的每個(gè)孔中培養(yǎng)。在沒有rCryj2的同樣條件下也進(jìn)行溫育作為比較。利用[3H]胸苷以與實(shí)施例1相同的方式確定T細(xì)胞增殖。
當(dāng)先將肽NO.48對(duì)CBF1鼠皮下給藥時(shí)，與生理鹽水對(duì)照組比較，T細(xì)胞對(duì)隨后的rCryj2抗原刺激的免疫應(yīng)答受到抑制(P＜0.05)。這一結(jié)果表明在鼠模型系統(tǒng)中，在基于肽的免疫治療中肽NO.48對(duì)雪松花粉病具有預(yù)防效果(圖14)。
上面敘述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用雪松花粉提取物在人體中常規(guī)地進(jìn)行的致敏作用的治療是根據(jù)T細(xì)胞表位調(diào)節(jié)機(jī)制工作的。
實(shí)施例14確定核心序列為了確定T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆增殖應(yīng)答所必需的Cryj1肽NO.22(P106-120)的最小氨基酸序列(核心)，如圖15所示，利用肽合成儀(PSSM-8,Shimadzu Seisakusho有限公司制造)從該肽的N和C末端各刪除一個(gè)氨基酸殘基制備11個(gè)肽，即P107-120(P22-2),P108-120(P22-3),P109-120(P22-4),P110-120(P22-5),P111-120(P22-6),P106-109(P22-7),P106-118(P22-8),P106-117(P22-9),P106-116(P22-10)，和P106-115(P22-11)。以與實(shí)施例1和2相同的方式檢測(cè)了從患雪松花粉病的三個(gè)患者衍生的并與Cryj1肽NO.22 P106-120反應(yīng)的T細(xì)胞系(PJ,PR,PB)及來自患者之一的T細(xì)胞克隆(PB8-3,PB8-2,PB9-39)與這11個(gè)肽的反應(yīng)性。兩個(gè)T細(xì)胞系(PJ,PB)和兩個(gè)T細(xì)胞克隆(PB8-2,PB9-39)識(shí)別P106-120(P22-1)增殖，但一個(gè)T細(xì)胞系和一個(gè)T細(xì)胞克隆不顯示任何增殖應(yīng)答(圖.15)。結(jié)果表明P106-120核心序列含有九個(gè)殘基“FIKRVSNVI”(這九個(gè)殘基被命名為Cryj1#22核心)。
實(shí)施例15含有雪松花粉和日本扁柏(hinoki)花粉過敏原誘導(dǎo)的T細(xì)胞表位的多表位肽通過將肽NO.8(P71-90:IFSKNLNIKLNMPLYIAGNK)，日本扁柏(hinoki)花粉過敏原Chao1的T細(xì)胞表位(日本專利號(hào)Hei.8-153527)，或肽NO.32(P311-330:SSGKNEGTNIYNNNEAFKVE)與利用肽合成儀(PSSM-8,Shimadzu Seisakusho有限公司)在實(shí)施例14中得到的Cryj1#22核心序列“FIKRVSNVI”聯(lián)合合成兩個(gè)肽(Cha o1#8-Cryj1#22核心，Chao1#32-Cryj1#22核心)。將RR序列插入在Cha o1#8和Cryj1#22核心之間和Cha o1#32和Cryj1#22核心之間，即Cha o1#8-Cryj1#22核心(SEQ NO:4)Cha o1#32-Cryj1#22核心(SEQ NO:5)。
分別從患雪松花粉病和日本扁柏花粉病的患者制備Cryj1特異性細(xì)胞系和Cha o1特異性的T細(xì)胞系。Cryj1特異性的T細(xì)胞系和Cha o1特異性的T細(xì)胞系既不與tubercle bacillus抗原(PPD)也不與溶血性生鏈球菌細(xì)胞壁(SCW)抗原反應(yīng)。Cryj1特異性的T細(xì)胞系與Cryj1#22和Cryj1#22核心反應(yīng)，但不與Cha o1#8或與Cha o1#22反應(yīng)。Cha o1特異性的T細(xì)胞系與Chao1#8和#32反應(yīng)但與Cryj1#22或Cryj1#22核心不反應(yīng)(圖16)。但是這些T細(xì)胞系都與多表位肽SEQ NO:4和SEQ NO:5的多表位肽反應(yīng)。這些結(jié)果表明通過聯(lián)合由雪松花粉和日本扁柏花粉過敏原的誘導(dǎo)T細(xì)胞表位制備的多表位肽對(duì)基于肽的免疫治療患雪松花粉病和具有日本扁柏花粉病的患者的治療方法是有效的。
實(shí)施例16由肽的加入導(dǎo)致的增殖應(yīng)答和細(xì)胞因子的產(chǎn)生利用了兩個(gè)克隆，PJ7-9和PB10-18來看通過替代Cryj1#22核心的T細(xì)胞表位肽的氨基酸是否可以改變T細(xì)胞的活性。與Cryj1肽NO.22P106-120反應(yīng)的T細(xì)胞克隆PJ7-9和PB10-12受到DRB5*0101的限制并識(shí)別Cryj1#22核心的九個(gè)殘基。利用同源氨基酸和非同源氨基酸代替包括該九個(gè)殘基的13個(gè)殘基的肽P108-120(VFIKRVSIVVIIHG)中該九個(gè)氨基酸殘基的每一個(gè)殘基以便生產(chǎn)類似肽(圖17和18)。根據(jù)[3H]胸苷的吸收檢測(cè)T細(xì)胞克隆PJ7-9和PB10-18與這些類似肽的反應(yīng)性。利用R&D系統(tǒng)制造的細(xì)胞因子測(cè)試試劑盒測(cè)定反應(yīng)溶液中細(xì)胞因子的濃度。圖17和18顯示了結(jié)果。將上清液中IFN-γ,IL-4,IL-2和IL-5的產(chǎn)生和通過與沒有氨基酸替代的13個(gè)殘基的肽反應(yīng)得到的[3H]胸苷的吸收認(rèn)作100％。在PJ7-9克隆中，[3H]胸苷的吸收和細(xì)胞因子的生產(chǎn)都明顯受到同源和非同源氨基酸或只有非同源氨基酸替代的Cryj1#22核心“FIKRVSNVI”中氨基酸3,4和6，即“K”,“R”,和“S”的替代的抑制(圖17)。因此，對(duì)于通過肽形成HLA和T細(xì)胞受體分子的復(fù)合物，位于這些位置中的氨基酸被認(rèn)為是重要的。即使用同源氨基酸Y替代第一個(gè)氨基酸(F)，不會(huì)觀察到[3H]胸苷的吸收和IL-4和IL-5的產(chǎn)量的變化，但用非同源氨基酸“S”代替就會(huì)發(fā)生IFN-γ和IL-2產(chǎn)量的明顯增加(即使[3H]胸苷的吸收沒有變化)。對(duì)于PB 10-18克隆，[3H]胸苷的吸收受到Cryj1#22核心的氨基酸NO.1,2,3,4,6,7,8的替代的抑制。故認(rèn)為位于這些位置的氨基酸對(duì)于通過肽形成HLA和T細(xì)胞受體分子的復(fù)合物是重要的。進(jìn)一步觀察到與IL-5生產(chǎn)比較，IL-2的生產(chǎn)受到氨基酸NO.6,7，或8的替代的抑制(圖18)。這些結(jié)果表明通過在Cryj1#22核心中用S替代第一個(gè)氨基酸F得到的“SIKRVSNVI”會(huì)增加IFN-γ的生產(chǎn)因而是有效的過敏治療試劑。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的多表位肽含有起源于各不相同的過敏原分子的T細(xì)胞表位。它含有頻繁出現(xiàn)在具有變態(tài)反應(yīng)的患者人群中的基因編碼的HLAⅡ類分子上所具有的肽。它進(jìn)一步含有出現(xiàn)在不同基因座(DR,DQ,DP)上的HLAⅡ類分子上的幾個(gè)肽。利用最小長度的多表位肽可以實(shí)現(xiàn)對(duì)廣泛范圍的患者的有效的基于肽的免疫治療。
當(dāng)利用本發(fā)明的多表位肽對(duì)具有變態(tài)反應(yīng)的患者進(jìn)行基于肽的免疫治療時(shí)，在治療之前可以測(cè)試來自患者的外周淋巴細(xì)胞對(duì)該肽的增殖應(yīng)答，以便選擇產(chǎn)生增殖應(yīng)答的患者。這一測(cè)試能判斷是否將使用多表位肽的基于肽的免疫治療法用于該患者。根據(jù)增殖應(yīng)答的水平也可以在一定程度上預(yù)測(cè)治療效果。序列表SEQ ID NO:1序列長度80序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RISLKLTSGK IASRRVDGII AAYQNPASWK 80SEQ ID NO:2序列長度105序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RWKNNRIWLQ FAKLTGFTLM GRRLKMPMYI 80AGYKTFDGRR VDGIIAAYQN PASWK 105SEQ ID NO:3序列長度134序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述MKVTVAFNQF GPNRRVFIKR VSNVIIHGRR IDIFASKNFH 40LQKNTIGTGR RWKNNRIWLQ FAKLTGFTLM GRRPLWIIFS 80GNMNIKLKMP MYIAGYKTFD GRRAEVSYVH VNGAKFIRRV 120DGIIAAYQNP ASWK 134SEQ ID NO:4序列長度31序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述IFSKNLNIKL NMPLYIAGNK RRFIKRVSNV I31SEQ ID NO:5序列長度31序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述SSGKNEGTNT YNNNEAFKVE RRFTKRVSNV I3權(quán)利要求
1．一種含有有效量的多表位肽的基于肽的免疫治療劑，該多表位肽是由互相連接的不同T細(xì)胞表位組成的線性多肽分子，其中(1)當(dāng)在對(duì)過敏原敏感的患者人群中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，每個(gè)所述T細(xì)胞表位顯示的陽性指數(shù)不低于約100。(2)所說的多表位肽與來自至少不少于70％的對(duì)所述過敏原過敏的患者群體的外周淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)；(3)所說的多表位肽確實(shí)不與對(duì)所述過敏原敏感的患者群體的IgE抗體反應(yīng)。
2．權(quán)利要求1的基于肽的免疫治療劑，其中所說的不同T細(xì)胞表位區(qū)起源于兩個(gè)或更多不同的過敏原分子。
3．權(quán)利要求2的基于肽的免疫治療劑，其中所說不同的過敏原分子是雪松花粉過敏原Cryj1和Cryj2。
4．權(quán)利要求2的基于肽的免疫治療劑，其中將在抗原呈遞細(xì)胞中加工的位點(diǎn)插入在各個(gè)T細(xì)胞表位區(qū)之間。
5．權(quán)利要求4的基于肽的免疫治療劑，其中在抗原呈遞細(xì)胞加工的所說位點(diǎn)是精氨酸二聚體或賴氨酸二聚體。
6．權(quán)利要求3的基于肽的免疫治療劑，其中所說的肽含有SEQ NO:1,SEQ NO:2或SEQ NO:3中任一序列所描述的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求3的基于肽的免疫治療劑，其中所說的肽含有一個(gè)被選自DRB5*0101,DRB4*0101,DQA1*0102-DQB1*0602,DPA1*0101-DPB 1*0501,和DPA 1*0101-DPB1*0201的HLAⅡ類分子中的至少一個(gè)所限制的表位。
8．權(quán)利要求2的基于肽的免疫治療劑，其中所述不同過敏原分子是雪松花粉過敏原Cryj1和日本扁柏花粉過敏原Chao1。
9．權(quán)利要求8的基于肽的免疫治療劑，其中所說的肽含有SEQ NO:4或SEQ NO:5的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過將由不同過敏原分子誘導(dǎo)來的T細(xì)胞表位區(qū)相互連結(jié)所制備的單分子多表位肽。含有有效量的多表位肽的基于肽的免疫治療試劑可以預(yù)防和治療廣泛范圍的過敏疾病。
文檔編號(hào)A61P37/08GK1218412SQ97194541
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月10日
發(fā)明者曾根敏雄, 粂晃智, 大力一雄, 巖間亞希子, 紀(jì)光助 申請(qǐng)人:明治乳業(yè)株式會(huì)社