專利名稱：具有抗病毒和殺精子活性的含有壬苯聚醇的脂囊泡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景本發(fā)明涉及構(gòu)造含有表面活性劑的非-磷脂基脂質(zhì)體(Novasome)的方法，所述表面活性劑為乳膠相容的并且在接觸時可使有包膜病毒和精子滅活。也公開用于避孕套包衣或用于陰道插入的制劑。壬苯聚醇-9為用于此類制劑和方法的優(yōu)選的表面活性劑。
致病性病毒侵入人類的主要入口為粘膜和呼吸道。任何傳染的第一步是粘附或移生，接著是傳染性病原體的侵入和播散。在移生位置滅活潛在的病原體可以預(yù)防許多傳染病。本發(fā)明的目的是使接觸時滅活精子和有包膜病毒。
盡管有一些用脂質(zhì)體作釋放系統(tǒng)傳遞各種物質(zhì)的試驗，但是無成功用脂質(zhì)體或其它的脂囊泡(lipid vesicles)作接觸抗病毒藥物或接觸殺精子劑(spermacide)的報道。主要的問題為相容性和穩(wěn)定性問題，特別是由于所使用的環(huán)境常常是生長的細菌的完美的“實驗室”，所述細菌可以粘附并降解所述制劑。所述制劑必須能夠在廣泛的生理pH范圍和生理溫度下發(fā)揮作用。pH和溫度要求利用了許多磷脂制劑或常規(guī)的脂質(zhì)體，但由于其穩(wěn)定性問題都不適合。而且，用磷脂或非-磷脂的許多制劑是乳膠不相容的，這是如果將該制劑與避孕套一起使用時的一項要求，或者在釋放位置對粘膜產(chǎn)生刺激。這兩種性質(zhì)，即乳膠相容性和無刺激性對于一成功產(chǎn)品而言是很重要的。
近幾年，數(shù)家公司，主要有IGI,Inc.，通過其前身子公司MicroVesicular Systems,Inc.和Nova Vax,Inc.以及L’Oreal已開發(fā)并推廣了非-磷脂脂囊泡及其應(yīng)用。美國專利4911928、美國專利4895452、美國專利5260065和美國專利申請系列號08/482552(在此引入其公開的內(nèi)容作參考)公開了各種制劑和制備脂囊泡的方法，所述脂囊泡可以利用多種非-磷脂物質(zhì)。這些專利和該申請以及對所公開的方法和物質(zhì)的改變已被用于開發(fā)從疫苗到皮膚護理品等各種產(chǎn)品。然而，到目前為止沒有制備出成功滿足乳膠相容且穩(wěn)定的殺精子或抗病毒產(chǎn)品所需的所有要求的制劑。
因此，本發(fā)明的目的是提供接觸滅活病毒的滅活病毒脂囊泡。
本發(fā)明的另一個目的是提供非刺激性的、穩(wěn)定的制劑，該制劑可以滅活病毒，特別是皮膚或粘膜上的有包膜病毒。
本發(fā)明的另外一個目的是提供通過給予受治療者滅活病毒的脂囊泡，在感染的受治療者中預(yù)防病毒感染的方法。
本發(fā)明的再一個目的是通過使精子與殺精子脂囊泡接觸滅活精子的方法。
本發(fā)明的這些目的及特征和其它目的及特征可以從優(yōu)選的實施方案和權(quán)利要求書的描述中顯而易見。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的特征為接觸滅活精于和有包膜病毒例如HIV的方法，以及具有這些性質(zhì)的制劑。本發(fā)明基于(至少在部分上基于)這樣一個發(fā)現(xiàn)，即可以制備具有足夠部分的攜帶于脂質(zhì)雙層的抗病毒或殺精子表面活性劑的脂囊泡制劑，以使該制劑在囊泡不破裂的情況下具有活性。該制劑也比其它制劑刺激性小。
用于本發(fā)明的制劑含有由非離子兩親物、油、甾醇和具有抗有包膜病毒或殺精子活性的表面活性劑組成的脂囊泡。優(yōu)選的表面活性劑為nonoxyphenol表面活性劑，最優(yōu)選壬苯聚醇-9。選擇所述非離子兩親物、油和表面活性劑，以使所述表面活性劑至少部分被攜帶于脂囊泡的外雙層中。
優(yōu)選的非離子兩親物選自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脫水山梨醇脂肪酸醚、最優(yōu)選甘油一硬脂酸酯。所述油為所述表面活性劑在其中具有低溶解性的油，優(yōu)選所述表面活性劑在其中不溶的油。如果用壬苯聚醇-9作表面活性劑，那么優(yōu)選植物油例如大豆油，而不使用礦物油。理論上，如果所述表面活性劑溶于所述油中，那么它不能在脂質(zhì)雙層中，但是如果不溶的話，那么它必定被攜帶于所述雙層表面。
盡管可以使用幾乎任何甾醇，但是優(yōu)選膽甾醇或植物甾醇，例如大豆甾醇。所述囊泡也可以含有電荷產(chǎn)生劑，優(yōu)選負電荷產(chǎn)生劑，例如油酸。所述囊泡可以用藥學上可接受的載體如鹽水制備以供釋放。所述囊泡可以制成乳油，例如適合陰道插入的乳油，或適合用于避孕套上或與避孕套一起使用的乳油。
本發(fā)明的方法使用具有抗有包膜病毒活性或殺精子活性的這類制劑。盡管部分本發(fā)明的制劑具有抗有包膜病毒和殺精子活性，如使用壬苯聚醇-9作為表面活性劑的制劑，但是也可能使用其它的僅具有其中一種性質(zhì)的表面活性劑?？梢允褂玫牟糠制渌谋砻婊钚詣┌═riton-X家族的表面活性劑，已經(jīng)顯示該家族具有部分殺精子性質(zhì)，或用顯示有部分抗病毒性質(zhì)的十六烷基氯化吡啶鎓。簡言之，本發(fā)明的方法使精子或有包膜病毒暴露于所述制劑，并使制劑作用于精子或病毒。由于本發(fā)明的制劑提供快速活性，因此暴露可以非常短暫，可能是數(shù)秒。對于性傳播的病毒和精子而言，本發(fā)明的制劑可以制成陰道乳油或避孕套潤滑劑。對于其它的病毒而言，可以使用其它的劑型，如鼻內(nèi)噴霧劑。
下列描述和權(quán)利要求書將進一步明確本發(fā)明的范圍。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供滅活有包膜病毒和精子的方法以及這些方法中使用的制劑。本發(fā)明使用脂囊泡以提供快速活性而無需該囊泡破裂，該脂囊泡在其外雙層包含殺精子或抗病毒表面活性劑。
本發(fā)明的基本囊泡是由非離子兩親物例如甘油一硬脂酸酯、甾醇例如大豆植物甾醇、顯示抗病毒或殺精子(或兩者兼有)活性的表面活性劑例如壬苯聚醇-9和油如大豆油形成的。選擇所述油、非離子表面活性劑和表面活性劑，以使至少所述表面活性劑的一部分在所述囊泡的外雙層中，由此它可以提供所需的活性而無需該囊泡破裂。這需要所述非離子兩親物和所述表面活性劑之間的相容性，并且它還需要所述表面活性劑不溶于所述油中。任何表面活性劑的選擇需要該表面活性劑能夠用于穩(wěn)定的脂囊泡中，以及相容性試驗，所有這些試驗是本領(lǐng)域標準的。例如，如果所述制劑有待于與乳膠例如與乳膠避孕套一起使用，那么它們必須是乳膠相容的，此項可以用標準的乳膠相容性試驗快速測定。選擇物質(zhì)的適當混合物的方法是利用殺精子活性的篩選測定法；所述脂囊泡必須在20秒之內(nèi)滅活精子。如果所述表面活性劑都不在外雙層中，那么快速殺精子活性不能隨著脂囊泡的溶解立即發(fā)生。殺精子活性和抗病毒活性的試驗在實施例中描述。
通過下列非限定性實施例可以更清楚地理解本發(fā)明。
實施例1-含有壬苯聚醇-9的GNP9SO Novasomes的制備表1含有用于生產(chǎn)GNP9SO Novasomes的物質(zhì)，包括壬苯聚醇-9用作表面活性劑、甘油一硬脂酸酯用作兩親物、大豆油和油酸用作負電荷產(chǎn)生劑。
表1化學成分 重量甘油一硬脂酸酯13.7g大豆甾醇(或膽甾醇)3.8g壬苯聚醇-97.2g大豆油16g油酸 250μl使表1所示成分形成脂質(zhì)-油相，將其于86℃加熱1小時以獲得均一性。將水加熱至65℃。然后通過將該水注入脂質(zhì)相產(chǎn)生GNP9SONovasomes，脂質(zhì)油與水的體積比為13∶37。用往復注射器裝置或連續(xù)流動裝置也可以人工生產(chǎn)GNP9SO Novasomes。
實施例2-壬苯聚醇-9Novasome制劑的鑒定Novasomes產(chǎn)生后，對其進行鑒定研究。測試所有制劑的無菌性和pH。也在有循環(huán)水浴的Coulter LS230 Laser sizing裝置上測定制劑的大小。表2說明所述囊泡的物理特征。表3和4顯示用可使病毒繁殖的細胞系體外試驗抗病毒活性，表5和6說明乳膠相容性，表7說明用Sander-Cramer測定法測定的抗殺精子活性，表8說明口服毒性數(shù)據(jù)。
表2 平均Coulter平均Coulter活性成分 電荷 pH 大小μm 范圍μmGNP9SO Novasomes負 4.52 0.598 0.375-0.839實施例3-抗病毒測定A．HIV-1MN殺病毒測定測試實施例1的Novasomes制劑的抗HIV-1病毒的活性。將100μlHIV-1Mn 1000x沉積病毒Lot#50-013(TCID-50/ml=10-6)與100μl注射用水或100μl Novasome制劑混合30分鐘。然后向每種制劑中加入1.8ml組織培養(yǎng)基。然后系列稀釋10倍(從10-2至10-6)。然后將每一稀釋液0.4ml置于含有C8166細胞(HTLV-1轉(zhuǎn)化的T細胞系)的試管中。然后將這些合并的物質(zhì)于37℃孵育2小時，用磷酸鹽緩沖液洗滌三次，再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，將每種稀釋液置于4個復制孔中。將細胞每周補料兩次。于第7和14天觀察細胞的致細胞病變效應(yīng)，收集上清液進行p24測定證明病毒繁殖。根據(jù)p24測定結(jié)果進行TCID-50計算。
結(jié)果列于表3中。Novasome制劑明顯具有抗-HIV活性。
表3測試物質(zhì)TCID50,1周時 TCID50,2周時水10-4.7510-4.75GNP9SO Novasomes0 0B．殺牛痘WR病毒測定也測試實施例1 Novasome制劑的抗牛痘WR病毒的活性。將100μl牛痘WR1000x沉積病毒Lot#68-016(TCID-50/ml=10-9)與100μl注射用水或100μl Novasome制劑混合30分鐘。然后向每種制劑中加入200μl組織培養(yǎng)基。然后系列稀釋10倍所述病毒和無病毒對照(從10-1至10-6)。然后將每一稀釋液40μl置于含有BSC-1細胞的96孔培養(yǎng)板中。每種稀釋液復制5份，制備復份培養(yǎng)板。然后將這些合并的物質(zhì)于37℃孵育2小時，用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。于第3和7天觀察細胞的致細胞病變效應(yīng)。在3天時對第一塊培養(yǎng)板進行MTS處理；每3天對第二塊板補料，在7天對該板進行MTS處理。
表4說明牛痘WR測定結(jié)果。又一次確定Novasome制劑明顯具有抗病毒活性。
表4測試物質(zhì)TCID50,3天時TCID50,7天時水10-710-7GNP9SO Novasomes00實施例4-乳膠相容性測試也測試實施例1的Novasome制劑的乳膠相容性。在該測定中試驗三種類型的避孕套，Trojan-Enz Non-Lubricated LO316RP、Lifestyles 0602258800和Aladan。用5秒鐘，用柔軟的毛刷將Novasome制劑涂于每個牌子的各13個避孕套上，置于干酪包布上。然后將避孕套于90％RH的潮濕室中、于38℃放置30分鐘。然后洗滌、干燥并測試伸長度和拉伸強度。另外取每個牌子的13個避孕套如上測試，但是置于上述狀態(tài)后直接固定于Airburst測試固定物上并進行測試。將每一牌子的80個避孕套不涂Novasome制劑測試這些性質(zhì)作為對照。表5說明Novasome制劑的乳膠相容性試驗的結(jié)果，而表6說明有Novasome制劑的試驗結(jié)果。很明顯Novasome制劑在短時間內(nèi)的相容性測試中不影響乳膠避孕套性質(zhì)。
表5避孕套牌子 Trojan Enz Non- Lifestyle AladanLubricated伸長度％ 783 827 802拉伸強度，MPa 25.9 29.829.0壓力kPa2.3 1.3 2.2體積，升 39.4 40.736.5表6避孕套牌子Trojan Enz Non- LifestyleAladanLubricated伸長度％ 777 841 848拉伸強度，MPa 26.829.130.2壓力kPa2.1 1.2 1.9體積，升 39.440.736.5實施例5-Sander-Cramer殺精子測定在該實施例中，用Sander-Cramer殺精子測定測試實施例1制劑的殺精子活性。用0.9％鹽水制備受試化合物的系列稀釋液。通過將所述混合物吸入移液管并壓出該混合物，使1ml受試物質(zhì)與0.2ml人精液在13×100mm試管中混合。將該步驟重復6次。制備一懸滴的該混合物，并在低倍下觀察5個區(qū)域。從混合到顯微鏡觀察的整個過程必須在20秒內(nèi)完成。終點是在20秒內(nèi)使精子固定的最高稀釋度。
表7表明Sander-Cramer測定的結(jié)果。本發(fā)明的囊泡不僅使NP-9制劑比標準的DMSO制劑具有更高的濃度，而且它也可以在更高的稀釋度時殺死精子，顯示更高的活性。
表7受試物質(zhì)最高殺精子的 濃度NP-9稀釋度GNP9SO NovasomesTM52832.5mg/mlNP9對照 91 10mg/ml于DMSO中實施例6-大鼠口服毒性研究在該實施例中，測試實施例1制劑的口服毒性。將由5只雄性大鼠和5只雌性大鼠組成的一組Sprague-Dawley大鼠禁食過夜。第二天清晨稱重后，通過管飼法給予每只大鼠3ml的GNP9SO Novasome制劑，為大鼠允許的最大口服劑量。每日觀察動物的疾病和死亡率，在第7天和14天獲得個體的體重。結(jié)果記錄于表8。
表8大鼠平均獲得的總重(第0-14天)雄性126.66g雌性24.13g根據(jù)在所述實施例中顯示的研究結(jié)果，很明顯本發(fā)明的制劑顯示殺精子活性和抗病毒活性，而且是乳膠相容的和口服安全的。這些制劑具體可用于殺精子和殺病毒陰道乳油。
前述制劑和實施例僅僅是說明性的，本發(fā)明的范圍由下列權(quán)利要求書所限定。
權(quán)利要求
1．滅活精子的方法，該方法包括將所述精子暴露于具有局部殺精子(spermacidal)活性的乳膠相容的脂囊泡(lipid vesicle)制劑中的步驟；所述脂囊泡制劑含有由非離子兩親物、油、甾醇和殺精子表面活性劑制備的脂囊泡；選擇所述非離子兩親物、所述油和所述殺精子表面活性劑，以使所述殺精子表面活性劑不溶于所述油申，且至少部分所述殺精子表面活性劑在主要由所述非離子兩親物形成的脂囊泡的外雙層中。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述殺精子表面活性劑包括nonoxyphenol表面活性劑。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述nonoxyphenol表面活性劑包括壬苯聚醇-9。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述非離子兩親物選自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脫水山梨醇脂肪酸醚。
5．權(quán)利要求5的方法，其中所述非離子兩親物包括甘油一硬脂酸酯。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述甾醇選自膽甾醇和植物甾醇。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述甾醇包括的大豆甾醇。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述油包括植物油。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述植物油包括大豆油。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述脂囊泡還包含電荷產(chǎn)生劑。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述電荷產(chǎn)生劑包括負電荷產(chǎn)生劑。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述負電荷產(chǎn)生劑包括油酸。
13．權(quán)利要求1的方法，其中所述制劑還包含藥學上可接受的載體。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述制劑為乳油形式。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述制劑用于陰道插入。
16．權(quán)利要求1的方法，其中所述制劑涂于避孕套上。
17．滅活有包膜病毒的方法，該方法包括將所述有包膜病毒暴露于乳膠相容的脂囊泡制劑中的步驟，所述脂囊泡制劑含有由非離子兩親物、油、甾醇和nonoxyphenol表面活性劑制備的脂囊泡，選擇所述非離子兩親物、所述油和所述nonoxyphenol表面活性劑，以使所述nonoxyphenol表面活性劑不溶于所述油中，且至少部分所述nonoxyphenol表面活性劑在主要由所述非離子兩親物形成的所述脂囊泡的外雙層中。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所述nonoxyphenol表面活性劑包括壬苯聚醇-9。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所述非離子兩親物選自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脫水山梨醇脂肪酸醚。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述非離子兩親物包括甘油一硬脂酸酯。
21．權(quán)利要求17的方法，其中所述甾醇選自膽甾醇和植物甾醇。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述甾醇包括大豆甾醇。
23．權(quán)利要求17的方法，其中所述油包括植物油。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述植物油包括大豆油。
25．權(quán)利要求17的方法，其中所述脂囊泡還包含電荷產(chǎn)生劑。
26．權(quán)利要求25的方法，其中所述電荷產(chǎn)生劑包括負電荷產(chǎn)生劑。
27．權(quán)利要求26的方法，其中所述負電荷產(chǎn)生劑包括油酸。
28．權(quán)利要求17的方法，其中所述制劑還包含藥學上可接受的載體。
29．權(quán)利要求28的方法，其中所述制劑為乳油形式。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述制劑用于陰道插入。
31．權(quán)利要求17的方法，其中所述制劑涂于避孕套上。
32．滅活精子和有包膜病毒的制劑，該制劑包含與乳膠相容的脂囊泡制劑，所述脂囊泡制劑含有由非離子兩親物、油、甾醇和nonoxyphenol表面活性劑制備的脂囊泡，選擇所述非離子兩親物、所述油和所述nonoxyphenol表面活性劑，以使所述nonoxyphenol表面活性劑不溶于所述油中，且至少部分所述nonoxyphenol表面活性劑在主要由所述非離子兩親物形成的所述脂囊泡的外雙層中。
33．權(quán)利要求32的制劑，其中所述nonoxyphenol表面活性劑包括壬苯聚醇-9。
34．權(quán)利要求32的制劑，其中所述非離子兩親物選自脂肪醇的POE醚、脂肪酸的POE酯、甘油一和二月桂酸酯、甘油一和二硬脂酸酯和POE脫水山梨醇脂肪酸醚。
35．權(quán)利要求34的制劑，其中所述非離子兩親物包括甘油一硬脂酸酯。
36．權(quán)利要求32的制劑，其中所述甾醇選自膽甾醇和植物甾醇。
37．權(quán)利要求36的制劑，其中所述甾醇包括大豆甾醇。
38．權(quán)利要求32的制劑，其中所述油包括植物油。
39．權(quán)利要求38的制劑，其中所述植物油包括大豆油。
40．權(quán)利要求32的制劑，其中所述脂囊泡還包含電荷產(chǎn)生劑。
41．權(quán)利要求40的制劑，其中所述電荷產(chǎn)生劑包括負電荷產(chǎn)生劑。
42．權(quán)利要求41的制劑，其中所述負電荷產(chǎn)生劑包括油酸。
43．權(quán)利要求32的制劑，其中所述制劑還包含藥學上可接受的載體。
44．權(quán)利要求43的制劑，其中所述所述制劑為乳油形式。
45．權(quán)利要求44的制劑，其中所述制劑特別用于陰道插入。
46．權(quán)利要求32的制劑，其中所述制劑特別用于涂于避孕套上。
47．具有殺精子和滅活有包膜病毒活性包衣的避孕套，所述避孕套上具有權(quán)利要求32的制劑。
全文摘要
開發(fā)具有抗病毒和殺精子性質(zhì)的新制劑。該制劑含有由非離子兩親物、具有殺精子和/或抗病毒活性的表面活性劑、油和甾醇形成的脂囊泡。本發(fā)明的制劑和方法特別適用于粘膜如陰道粘膜并試驗用于抗病毒例如HIV和牛痘。
文檔編號A61K9/00GK1226924SQ97196929
公開日1999年8月25日 申請日期1997年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者C·D·賴特 申請人:諾瓦瓦克斯有限公司